JPH0523751B2 - - Google Patents
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- JPH0523751B2 JPH0523751B2 JP58025398A JP2539883A JPH0523751B2 JP H0523751 B2 JPH0523751 B2 JP H0523751B2 JP 58025398 A JP58025398 A JP 58025398A JP 2539883 A JP2539883 A JP 2539883A JP H0523751 B2 JPH0523751 B2 JP H0523751B2
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Description
本発明は遺伝子の新規形質発現方法によりトリ
プトフアンを製造する方法に関する。さらに詳細
には本発明はアンスラニル酸合成酵素をコードす
る遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組
換え体DNAを用いコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれ
る宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を
培地に培養し、培養物中にトリプトフアンを生成
蓄積せしめ、該培養物からトリプトフアンを採取
することを特徴とするトリプトフアンの製造法に
関する。 従来コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌におけるトリプトフアンの生産につい
てはこれらの栄養要求株、トリプトフアンアナロ
グ耐性株などの突然変異株を用いる方法が知られ
ている。（特公昭47−4505、特公昭51−19037） コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物を宿主として用い、これに該
宿主に対して外来性であるところの目的遺伝子ま
たはベクターを含む組み換え体DNAを導入して
該目的遺伝子の形質を発現させた例は今まで全く
知られていない。コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物を宿主とする
組換えDNA技法においても、これら微生物中で
自律複製し、選択可能な表現型を有し、多くの遺
伝子のクローニングを用いうるベクター系の造成
と、効率のよい形質転換系の確立が必要である。
さらに発現に際して現れる種々の障壁の解消方法
の確立が必要である。 本発明者らは先にコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物中で自律複
製し、選択可能な表現型と適当なクローニング部
位を有するプラスミドベクターを造成する一方効
率の高い形質転換系を開発し特許出願を行つた
（特開昭57−183799、同57−186492、同57−
186489）。また本発明者らは該プラスミドベクタ
ーに既に知られているインビトロにおける組換え
DNA技法（U.S.Patent 4237224）を用い、グル
タミン酸、リジンなどのアミノ酸の生合成に関与
する外来性遺伝子を含むDNA断片を連結し、開
発した形質転換系を用いてコリネバクテリウム・
グルタミクムＬ−22株またはその誘導株を形質転
換したところ、該外来性遺伝子が該宿主中で形質
を発現され、該アミノ酸の生産の増大に利用する
ことができることを見出し特許出願を行つた（特
願昭56−211908）。 さらに研究の結果、トリプトフアンに関しても
同様の方法によつて得られた菌株が著量のトリプ
トフアンを培地に蓄積できることを見出し本発明
を完成するに至つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明はアンスラニル酸合成酵素をコードする
遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組換
え体DNAを用いコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる
宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培
地に培養し、トリプトフアンを製造する方法を提
供する。 本発明に用いる遺伝子を含むDNA断片として
は、真核生物、原核生物、ウイルス、バクテリオ
フアージまたはプラスミドに由来しトリプトフア
ン生成に関与する遺伝子を含むDNA断片があげ
られる。原核生物に由来する遺伝子としては細菌
とくにエツシエリヒア属、コリネバクテリウム
属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、スタフ
イロコツカス属またはセラチア属に属する細菌の
菌株に由来する遺伝子で、トリプトフアンの生成
ならびにその生成に関与する代謝系に係る遺伝子
が好適にあげられる。 本発明に用いるベクターとしては、宿主菌細胞
内で自律増殖できるものでなくてはならない。具
体例としては本発明者らがコリネバクテリウム属
に属する微生物から採取した、または採取したも
のから誘導して造成したpCG1（特開昭57−
134500）、pCG2（特願昭56−133557）、pCG4（特開
昭57−183799）、pCE52，pCE53，pCE54，
pCG11，pCB101などがあげられる。 これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下
記の寄託番号で工業技術院微生物工業技術研究所
ならびに米国アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨンに寄託されている。 プラスミド FERM−Ｐ ATCC pCG1 5865 31808 pCG2 5954 31832 pCG4 5939 31830 pCE54 − 39019 pCG11 − 39022 pCB101 − 39020 好適にはpCE52，pCE53が用いられる。 pCE52およびpCE53は次のようにして作成する
ことができる。まず、pCG1をその保有菌コリネ
バクテリウム・グルタミクム225−57株（FERM
−P5865，ATCC31808）の培養菌体から前記の
特許出願明細書に開示した方法で、pGA22をそ
の保有大腸菌の培養菌体から通常用いられる方法
で濃縮単離する。プラスミドpCG1上に１個所あ
るBg1切断部位とpGA22上に２個所ある
BamH切断部位の一方の切断部位のみを両制
限酵素Bg1，BamHでそれぞれ消化して直鎖
状化した後、プラスミド分子の両端に単鎖として
突き出た同一接着末端で両DNA分子が連結した
和合分子を生成させるためにT4フアージDNAリ
ガーゼを作用させる。このDNA混成物中からの
両プラスミド分子の和合連結した組換え体プラス
ミドの取得は、一旦、pGA22に由来する薬剤耐
性で選択されるコリネバクテリウム属あるいはブ
レビバクテリウム属菌種の形質転換株を分離し、
これら形質転換株の保有するプラスミドを解析す
ることによつて達成される。 DNA混成物による形質転換は、本発明者らが
先に特許出願したコリネバクテリウム属およびブ
レビバクテリウム属菌種のプロトプラストを使用
する形質転換法（特開昭57−186492および特開昭
57−186489）により実施することができる。選択
に用いる薬剤はpGA22に由来する薬剤耐性遺伝
子のうち、挿入不活化される耐性遺伝子を除いた
他の耐性遺伝子に対応する薬剤を使用すればよ
い。形質転換株はDNA無添加系で受容菌プロト
プラストが正常細胞へ復帰増殖できない濃度の薬
剤〔通常、テトラサイクリン（Tc）0.4−1.6μg／
ml、クロラムフエニコール（Cm）2.5−5μg／ml
およびカナマイシン（Km）100−800μg／ml〕
を含む高張寒天培地上で形成されるコロニーを分
離するか、あるいは、一旦非選択的に再生培地上
で正常細胞に復帰増殖させた後にかき集め、この
懸濁液を受容菌正常細胞が生育できない濃度の薬
剤（通常、Tc0.5−4μg／ml，Cm2−15μg／mlお
よびKm2−25μg／ml）を含む寒天培地上で生育
するコロニーを分離することによつて得られる。
テトラサイクリン、クロラムフエニコールあるい
はカナマイシン耐性（TcR，CmR，KmRとそれぞ
れいう）により選択された形質転換株の中には、
pGA22由来の他の薬剤耐性形質をも同時に獲得
しているものがある。 こうして得られる形質転換株の保有するプラス
ミドDNAは、本発明者らが特開昭57−134500お
よび特開昭57−186489に開示した方法で培養菌体
から単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化し
て生成するDNA断片をアガロースゲル電気泳動
で解析する常法により構造を知ることができる。
形質転換株から分離されたプラスミドがpCE52，
pCE53である。 pCE52およびpCE53は大きさ約10.9Kbのプラス
ミドで、制限部位としてEcoRI，Sa1I，SmaI，
XhoIなどを有し、pCE52はCmR，KmRの表現型
を、pCE53はTcR，CmR，KmRの表現型を与え
る。XhoIはKmR遺伝子にあり、いわゆる挿入不
活化（DNA断片の挿入により当該表現型の発現
が妨げられる現象）による選択も可能である。 プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取
は、たとえば特開昭57−134500、同57−183799お
よび特願昭56−133557に記載の方法に従つて行え
ばよい。 遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組
み換え体の作製は、公知の試験管内組み換え
DNA技法を駆使することにより実施できる。 試験管内のDNA組み換えは、通常、目的の遺
伝子を含む供与体DNAとベクターDNAの切断と
結合（リガーゼ反応）により行われる（特願昭56
−211908号、USP4237224参照）。 リガーゼ反応により目的の組み換え体以外に他
の組み換え体も生成するが、目的の組み換え体を
取得するにはこのDNA混成液を用いてコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種を
直接形質転換し、目的の遺伝子の遺伝情報に由来
する遺伝形質を付与された形質転換株を選択分離
し、その培養菌体から抽出単離することによつて
達成できる。コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属菌種を直接形質転換しないで例え
ば大腸菌のような他の微生物の宿主ベクター系に
て目的の遺伝子を一旦クローン化し、しかる後に
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属菌種のベクターとの組み換え体を試験管内で作
製してからコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種を形質転換し前記と同様に形質
転換株を選択分離しても組み換え体を取得でき
る。 組み換え体製造のためには下記文献の記載が広
く応用できる。 S.N.Cohen，et al，U.S.Patent 4237224、遺
伝子操作実験法〔高木康敬編著、講談社サイエン
テイフイツク（1980）〕、Method in
Enzymology 68，Recombinant DNA，edited
by Ray Wu，Academic Press 1979、特願昭56
−211908. 本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属に属しDNA
取り込み能を有する菌株ならばいかなる菌株を用
いてもよい。好適には本発明者らが先に発明し特
願昭56−151464において開示したリゾチーム感受
性微生物を用いる。具体的な菌株の一例としては
次の菌株があげられる。 寄 託 番 号 FERM−Ｐ ATCC コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−15
5946 31834 コリネバクテリウム・グルタミクムLA−105 コリネバクテリウム・ハーキユリスＬ−103
5947 31866 ブレビバクテリウム・デイバリカツムＬ−204
5948 31867 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムＬ
−312 5949 31868 宿主微生物の組み換え体DNAによる形質転換
は１培養細胞からのプロトプラストの調製、２プ
ロトプラストの組み換え体DNAによる形質転換
処理、３プロトプラストの正常細胞への復帰再生
と形質転換株の選択、からなる工程にて行われ
る。具体的方法の例を以下に示す。 １ 培養細胞からのプロトプラストの調製 プロトプラスト形成は、微生物を細胞壁溶解酵
素リゾチームに感受性にする条件下で増殖させ、
この培養細胞を高張液中でリゾチーム作用させ細
胞壁を溶解除去することによつて行われる。微生
物をリゾチーム感受性型細胞にするには各種細胞
壁合成阻害剤が用いられる。例えば、微生物培養
の対数増殖期の中途で生育を抑制しないかあるい
は半抑制する濃度のペニシリンを添加し、さらに
数世代増殖させることによつて微生物細胞をリゾ
チーム感受性にすることができる。 このとき使用する培地は微生物が増殖できる培
地であればよく、例えば栄養培地NB（粉末ブイ
ヨン20g、酵母エキス5gを純水１に含み、PH7.2
に調整した培地）あるいは半合成培地SSM〔グル
コース10g，NH4Cl 4g、尿素2g、酵母エキス1g，
KH2PO4 1g，K2HPO4 3g，MgCl2・6H2Ｏ
0.4g，FeSO4・7H2Ｏ 10mg，MnSO4・４〜6H2
Ｏ 0.2mg，ZnSO4・7H2O0.9mg，CuSO4・5H2Ｏ
0.4mg，Na2B4O7・10H2Ｏ 0.09mg，（NH4）6
Mo7O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオチン30μg、サイ
アミン塩酸塩１mgを水１に含み、PH7.2に調整
した培地〕などが用いられる。 この培地に微生物を接種し、振盪培養する。 比色計によつて660nmにおける吸光度（OD）
を測定し対数増殖期の初期（0D＝0.1〜0.4）に培
養液中0.1〜2.0単位／mlの濃度になるようにペニ
シリンＧなどのペニシリン類を添加する。培養を
さらに続けて、ODが0.3〜0.5に増加したところ
で細胞を集菌しSSM培地で洗滌する。次いで細
胞を適当な高張培地、例えばPFM培地（SSM2
倍希釈液中にシヨ糖0.4M，MgCl2・6H2Ｏ
0.01Mを含み、PH7.0〜8.5に調整した培地）ある
いはRCG培地〔グルコース5g、カゼイン加水分
解物5g、酵母エキス2.5g，K2HPO4 3.5g，KH2
PO4 1.5g，MgCl2・6H2Ｏ 0.41g，FeSO4・
7H2Ｏ 10mg，MnSO4・４〜6H2Ｏ ２mg，
ZnSO4・7H2Ｏ 0.9mg，CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg，
Na2B4O7・10H2Ｏ 0.09mg，（NH4）6Mo7O24・
4H2Ｏ 0.04mg、ピオチン30μg、サイアミン塩酸
塩２mg、コハク酸二ナトリウム135gを水１に
含み、PH7.0〜8.5に調整した培地〕に再懸濁す
る。この細胞懸濁液に最終濃度0.2〜10mg／mlと
なるようにリゾチームを加え30〜37℃で反応す
る。プロトプラスト化は反応時間が進むにつれて
進行し、その経過は光学顕微鏡で観察できる。顕
微鏡下ではほとんどの細胞がプロトプラスト化さ
れるに要する時間は、細胞培養時の添加ペニシリ
ン濃度および用いるリゾチームの濃度によつて変
わるが、前記条件にて３〜24時間である。 生成したプロトプラストは低張条件で破裂死す
るので、プロトプラストの形成度は低張条件で生
残する正常細胞の残存度で間接的に知ることがで
きる。通常、正常細胞はリゾチーム処理供試正常
細胞の約10-4の残存度に抑えることができる。 このようにして調製したプロトプラストは適当
な高張寒天培地上でコロニー形成能（再生能）を
有する。この寒天培地としては栄養培地、半合成
培地あるいは数種類のアミノ酸を補充した合成培
地に0.3〜0.8Mコハク酸二ナトリウムおよび0.5〜
６％ポリビニルピロリドン（分子量10000あるい
は40000）を含有せしめたものが好適に用いられ
る。 通常、半合成培地RCGP培地〔RCG培地に３
％のポリビニルピロリドン（分子量10000）と1.4
％の寒天を添加した培地、PH7.2〕を用いること
ができる。培養は25〜35℃で行うのが好ましい。
再生コロニーの出現が認められるのに要する培養
日数は菌株により差があるが、釣菌できるまでの
大きさになるのは10日〜14日である。RCGP培地
でのプロトプラストの再生は菌種、培養中途ペニ
シリン添加濃度およびリゾチーム処理濃度によつ
て異なるが、リゾチーム処理供試正常細胞あたり
10-2〜10-4の効率である。 ２ ロトプラストの組み換え体DNAによる形質
転換 プロトプラストへの組み換え体DNAの取り込
みは細胞がプロトプラスト状態を保持できる高張
液中でプロトプラストと組み換え体DNAとを混
合し、これにDNA取り込み媒介作用のあるポリ
エチレングリコール（PEG、平均分子量1540〜
6000）あるいはポリビニルアルコール（PVA、
重合度500〜1500）と二価金属陽イオンを加えて
処理することによつて行われる。高張条件を与え
る安定化剤としては、微生物のプロトプラストの
保持に一般に使われるものでよく、例えばシヨ糖
やコハク酸二ナトリウムを用いることができる。
PEGおよびPVAの使用可能な濃度範囲は最終濃
度で各々５〜60％，１〜20％である。二価金属陽
イオンは最終濃度１〜100mMの、たとえば
Ca，Mg，Mn，Ba，Srなどが効果的
で単独あるいは併用することができる。処理の温
度は０〜25℃が好適である。 ３ プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形
質転換株の選択 組み換え体DNAで形質転換処理したプロトプ
ラストの再生は、前記のプロトプラストの再生と
同様に、コハク酸二ナトリウムとポリビニルピロ
リドンを含有する高張寒天培地（例えばRCGP培
地）上にプロトプラストを塗布し、正常細胞が生
育できる温度、一般に25〜35℃で培養することに
よつて行われる。形質転換株は供与DNAに由来
する遺伝子が菌に付与する形質について選択する
ことによつて取得できる。この特徴的形質獲得に
基づく選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行
つてもよく、あるいは一旦非選択的に再生させて
から再生正常細胞を集め普通の低張寒天培地上で
行つてもよい。 本発明における具体的に好適な宿主菌株として
示したリゾチーム感受性菌株を用いる場合には形
質転換は上記工程(1)におけるペニシリン処理を行
わずに単に培養増殖させた細胞を直接リゾチーム
処理する以外は上記工程(1)〜(3)と同様に行えばよ
い。リゾチーム感受性微生物を用いる場合の形質
転換株は再生菌あたり10-2〜10-4の高頻度で得ら
れる。 形質転換株は通常の栄養培地に培養することに
より導入した組み換え体DNAの形質を発現させ
ることができる。組み換え体DNAに遺伝子DNA
またはベクターDNA由来の性質が付与されてい
る場合は、その性質にあわせて培地に薬剤を補給
するときもある。 かくして得られた形質転換株を、従来発酵法に
よるトリプトフアン製造に用いられる培養方法に
より培養することによつて、トリプトフアンを製
造することができる。すなわち、該形質転換株を
炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンな
どを含有する通常の培地中、好気的条件下、温
度，PHなどを調節しつつ培養を行えば、培養物中
にトリプトフアンが生成蓄積するので、これを採
取する。 炭素源としてはグルコース、フラクトース、シ
ユークロース、マルトース、マンノース、ソルビ
トール、マニトールなどの炭水化物、糖アルコー
ル、グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜
などが使用でき、またピルビン酸、乳酸、酢酸、
フマール酸、グルコン酸などの各種有機酸、エタ
ノールなど低級アルコールも使用可能である。 窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、
酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アン
モニウム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物
質ならびにペプトン、NZ−アミン、肉エキス、
酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイ
ン加水分解物、フイツシユミールあるいはその消
化物、蛹加水分解物などの窒素性有機物など種々
のものが使用可能である。 さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウ
ム、燐酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよ
び炭酸カルシウムなどを使用する。微生物の生育
に必要とするビタミン、アミノ酸源などは、前記
したような他の培地成分に従つて培地に供給され
れば特に加えなくてもよい。 培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好
気的条件下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が
好適である。培養中の培地のPHは中性付近に維持
することが望ましい。培養期間は通常２〜５日間
で培地中に著量のトリプトフアンが蓄積する。 培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオ
ン交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からト
リプトフアンが回収される。 グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしてい
るにもかかわらず、産業上の重要性から各研究者
により、種々の菌名が付されており属名までもコ
リネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム
属などさまざまである。しかしながら、これらの
菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やDNAの塩基組
成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌
種間には、70〜80％以上のDNAの相同性がある
ことが明らかにされ、非常に近縁な微生物である
ことが明白である〔Komatsu，Y.：Report of
the Fermentative Research Institute，No.55，
１（1980）、および、Suzuki，K.，Kaneko，T.，
and Komagata，K.：Int.J.Syst.Bacteriol.，31，
131（1981）参照〕。本明細書では組み換えDNA実
験に使用できる宿主が規制されているため、本発
明の有用性はコリネバクテリウム・グルタミクム
Ｌ−22の誘導株を宿主として示したが上記の事実
を踏まえれば、グルタミン酸生産菌全般にそのま
ま適用できることが容易に類推される。組み換え
DNAがこれら菌種において安定に保持され、発
現されるためにはDNAの相同性など宿主菌の性
質における若干の相違は問題でなく、これら菌種
が当該プラスミドの自律複製と導入遺伝子の発現
を可能ならしめる機能を有していればよい。しか
るに、これらの菌種がこの両機能を共有している
ことは、本発明者らが、先に特許出願（特開昭57
−183799）したコリネバクテリウム・グルタミウ
ム225−250から分離され、ストレプトマイシンお
よび／またはスペクチノマイシン耐性遺伝子を有
するプラスミドpCG4がコリネバクテリウム属お
よびブレビバクテリウム属菌種など、グルタミン
酸生産菌内で同じく複製でき、また、その耐性遺
伝子が発現される（特開昭57−186492）ことから
あきらかである。従つて、本発明を適用し得る宿
主菌としては、コリネバクテリウム・グルタミク
ムに限らず、コリネバクテリウム属およびブレビ
バクテリウム属菌種を含むグルタミン酸生産菌全
てが包括される。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067の
アンスラニル酸合成酵素遺伝子のコリネバクテリ
ウム・グルタミクムでのクローン化とトリプトフ
アンの生産： (1) 染色体DNAとプラスミドpCE53の調製法： ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067の
染色体DNAを以下の方法で調製する。 400ml半合成培地SSM〔グルコース20g，（NH4）
2SO410g、尿素3g、酵母エキス1g，KH2PO4
1g，MgCl2・6H2Ｏ 0.4g，FeSO4・7H2Ｏ 10
mg，MnSO4・４〜6H2Ｏ 0.2mg，ZnSO4／7H2
Ｏ 0.9mg，CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg，Na2B4O7・
10H2Ｏ 0.09mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04
mg、ビオチン30μg、サイアミン塩酸塩１mgを水
１に含みPH7.2に調整した培地〕に種培養を接
種して30℃で振盪培養する。種培養はNB培地を
用いる。東京光電比色計で660nmにおける吸光度
（OD）を測定し、OD0.2になつた時点で培養液中
0.5単位／mlの濃度となるようにペニシリンＧを
添加する。さらに培養を継続しOD約0.6になるま
で生育させる。 培養液から菌体を集菌し、TBS緩衝液〔0.03M
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−HCl
（以下トリスと略す），0.005MEDTA，
0.05MNaCl：PH8.0〕で洗浄後、リゾチーム液
（25％シヨ糖、0.1MNaCl，0.05Mトリス、0.8
mg／mlリゾチーム：PH8.0以下同じ）で10mlに懸
濁し37℃で４時間反応させる。集菌した菌体から
斎藤らの方法〔Saito，H.et al：Biochim.
Biophys.Acta，72 619（1963）〕に従つて高分子
染色体DNAを単離する。 ベクターとして用いるpCE53は次の方法でその
保有株コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22
株の培養菌体から単離する。 400mlNB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス
5gを水１に含みPH7.2に調整した培地）で30℃
で振盪培養しOD約0.7になるまで生育させる。菌
体を集菌し、TES緩衝液で洗浄後、リゾチーム
液10mlに懸濁し、37℃で２時間反応させる。反応
液に5MNaCl2.4ml、0.5MEDTA（PH8.5）0.6ml，
４％ラウリル硫酸ナトリウムと0.7MNaClからな
る溶液4.4mlを順次添加し、緩やかに混和してか
ら氷水中に15時間置く。 溶菌物全体を遠心管に移し４℃で60分間69400
×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。これに
重量百分率10％相当のポリエチレングリコール
（PBG）6000（半井化学薬品社製）を加え、静か
に混和して溶解後、氷水中に置く。10時間後1500
×ｇで10分間遠心分離してペレツトを回収する。
TES緩衝液５mlを加えてペレツトを静かに再溶
解してから1.5mg／mlエチジウムブロマイド2.0ml
を添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶
解し密度を1.580に合わせる。この溶液を105000
×ｇ，18℃で48時間超遠心分離にかける。この密
度勾配遠心により共有結合で閉じられた環状の
DNAは紫外線照射下に遠心チユーブ中下方の密
度の高いバンドとして見出される。このバンド画
分を注射器で遠心チユーブの側面から抜きとるこ
とによつてpCE53DNAが分離される。次いで分
画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量
百分率90％イソプロピルアルコール、10％TES
緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウム
を含む）〕で５回処理してエチジウムブロマイド
を抽出除去し、しかる後にTES緩衝液に対して
透析する。 pCE53は本発明者らが先に特許出願したコリネ
バクテリウム・グルタミクムのプラスミドpCG1
（特開昭57−134500）と大腸菌のプラスミド
pGA22（An，G.et al：J.Bacteriol.）140，400
（1979）参照〕を和合連結せしめたプラスミドで
ある。詳しくはpCG1上に１カ所しかないBgl
切断部位とpGA22上に２カ所あるBamH切断
部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内でない
BamH切断部位とで、両制限酵素の同一接着
末端を利用して連結したものである。pCE53は
pGA22由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選
択マーカーを有し、制限酵素Salに対する切断
部位は１カ所である。 (2) アンスラニル酸合成酵素遺伝子のクローン
化： 上記で調製したpCE53プラスミドDNA3μgおよ
び染色体DNA9μgを含む制限酵素 Sal反応液200μlに10単位のSalを添加し、
37℃で60分間反応後、65℃で10分間加温して反応
を停止させる。この混合消化物にT4リガーゼ用
緩衝液（トリス660mM，MgCl266mM、ジチオ
スレイトール100mM，PH7.6）40μl，ATP
（5mM）40μl，T4リガーゼ（宝酒造社製、１単
位／μl）0.4μlおよびH2Ｏ 120μlを加え、12℃で
16時間反応させる。 (3) 組み換え体プラスミドの形質転換： このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。 形質転換する受容菌としてコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＬ−22株から誘導されたアンス
ラニル酸要求性変異株LA105（アンスラニル酸合
成酵素欠損変異株）を用いる。アンスラニル酸要
求性変異株は、常法の変異処理により、M1寒天
培地〔グルコース10g，NH4H2PO4 1g，KCL
0.2g，MgSO4・7H2Ｏ 0.2g，FeSO4・7H2Ｏ
10mg，MnSO4・４〜6H2Ｏ 0.2mg，ZnSO4・
7H2Ｏ 0.9mg，CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg，Na2B4
O7・10H2Ｏ 0.09mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ
0.04mg、ビオチン50μg，Ｐ−アミノ安息香酸2.5
mg、サイアミン塩酸塩１mg、寒天16gを１中に
含みPH7.2に調整した培地〕上で生育できず、ア
ンスラニル酸（30μg／ml相当）を補つたM1寒天
培地上で生育できる菌を選択することによつて取
得される。LA105株のプロトプラストの調製およ
び形質転換は、生育培地に生育したLA105の菌体
NBに100μg／ml相当のアンスラニル酸を補つた
培地を使用して以下のとおりに行う。 LA105株の種培養をNB培地に植菌し30℃で振
盪培養する。OD0.6になつた時点で集菌し、該細
胞をRCGP培地〔グルコース5g、カザミノ酸5g、
酵母エキス2.5g，K2HPO4 3.5g，KH2PO4
1.5g，MgCl2・6H2Ｏ 0.41g，FeSO4・7H2Ｏ
10mg，MnSO4・４〜6H2Ｏ ２mg，ZnSO4・7H2
Ｏ 0.9mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04mg，ビ
オチン30μg、サイアミン塩酸塩２mg、コハク酸
二ナトリウム135g、ポリビニルピロリドン（分
子量10000）30gを水１に含む培地〕に１mg／
mlのリゾチームを含む液（PH7.6）に約109細胞／
mlとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して30℃
で５時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化
する。 このプロトプラスト懸濁液0.5mlを小試験管に
とり2500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝
液（10mM塩化マグネシウム、30mM塩化カルシ
ウム、50mMトリス、400mMシヨ糖、PH7.5）１
mlに再懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1ml
に再懸濁する。この懸濁液に２倍濃度のTSMC
緩衝液と上記リガーゼ反応DNA混合物の１対１
混合液100μlを加えて混和し、次いでTSMC緩衝
液中に20％PEG6000を含む液0.8mlを添加して混
合する。３分後、RCGP培地（PH7.2）２mlを添
加し、2500×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み
液を除去し、沈降したプロトプラストを１mlの
RCGP培地に懸濁してから0.2mlをカナマイシン
300μg／mlを含むRCGP寒天培地（RCGP培地に
1.4％寒天を含む培地、PH7.2）に塗抹し、30℃で
７日間培養する。 選択プレート上に生育したカナマイシン耐性コ
ロニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心
洗浄後、カナマイシン20μg／mlを含む最小寒天
培地M1に塗布して30℃で２日間培養し、カナマ
イシン耐性でかつアンスラニル酸非要求性となつ
た形質転換株を選択する。 これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様
にプラスミドDNAを単離する。形質転換株の一
株から得られたプラスミドpTrp2−３を各種制限
酵素消化後アガロースゲル電気泳動で解析した結
果、pCE53の唯一のSal切断部位に約7.1Kbの
SalDNA切断片が挿入されたプラスミドである
ことがわかつた。 pTrp2−３を用い、同様な方法でLA105株を再
形質転換したところ、トリプトフアン100μg／ml
およびカナマイシン400μg／mlを含むRCGP寒天
培地上で生育するコロニーは、同時にアンスラニ
ル酸非要求性となり、それらは、Salの切断様
式で判定されるpTrp2−３と同一のプラスミドを
保有している。 以上の結果は、クローン化された約7.1Kbの
SalDNA切断片にはブレビバクテリウム・フラ
バムATCC14067のアンスラニル酸合成酵素をコ
ードする遺伝子が存在し、それがコリネバクテリ
ウム・グルタミクムLA105株中で発現しているこ
とを示す。 pTrp2−３保有菌株は米国アメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨンに
Corynebacteriumglutamicum K20，
ATCC39035として寄託されている。 (4) 形質転換株によるトリプトフアンの生産： プラスミドpCE52を用いて上記と同様の処理を
行い、ブレビバクテリウム・フラバム
ATCC14067のアンスラニル酸合成酵素をコード
する遺伝子を有するプラスミドpTrp4−３を得
る。 pCE52は本発明者らが先に特許出願したコリネ
バクテリウム・グルタミクムのプラスミドpCG1
（特開昭57−134500）と大腸菌のプラスミド
pGA22〔An，G.et al：J.Bacteriol.140，400
（1979）参照〕を和合連結せしめたプラスミドで
ある。詳しくはpCG1上に１カ所しかないBgl
切断部位とpGA22上に２カ所あるBamH切断
部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内の
BamH切断部位とで、両制限酵素の同一接着
末端を利用して連結したものである。pCE52は
pGA22由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選
択マーカーを有し、制限酵素Salに対する切断
部位は１カ所である。 pCE52保有株コリネバクテリウム・グルタミク
ムＬ−22株の培養菌体から次の方法でpCE52を単
離する。 400mlNB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス
5gを水１に含みPH7.2に調整した培地）で30℃
で振盪培養しOD約0.7になるまで生育させる。菌
体を集菌し、TES緩衝液で洗浄後、リゾチーム
液10mlに懸濁し、37℃で２時間反応させる。反応
液に5MNaCl 2.4ml，0.5MEDTA（PH8.5）0.6ml、
４％ラウリル硫酸ナトリウムと0.7MNaClからな
る溶液4.4mlを順次添加し、緩やかに混和してか
ら氷水中に15時間置く。 溶菌物全体を遠心管に移し４℃で60分間69400
×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。これに
重量百分率10％相当のポリエチレングリコール
（PEG）6000（半井化学薬品社製）を加え、静か
に混和して溶解後、氷水中に置く。10時間後1500
×ｇで10分間遠心分離してペレツトを回収する。
TES緩衝液５mlを加えてペレツトを静かに再溶
解してから1.5mg／mlエチジウムブロマイド2.0ml
を添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶
解し密度を1580に合わせる。この溶液を105000×
ｇ，18℃で48時間超遠心分離にかける。この密度
勾配遠心により共有結合で閉じられた環状の
DNAは紫外線照射することによつて遠心チユー
ブ中下方の密度の高いバンドとして見出される。
このバンドを注射器で遠心チユーブの側面から抜
きとることによつてpCE52DNAが分離される。
次いで分画液を等容量のイソプロピルアルコール
液〔容量百分率90％イソプロピルアルコール、10
％TES緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化
セシウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブ
ロマイドを抽出除去し，しかる後にTES緩衝液
に対して透析する。 上記と同様にトリプトフアン生産性のコリネバ
クテリウム・グルタミクムLAR−１株（FERM
Ｐ−6908）をpTrp4−３で形質転換する。得られ
た形質転換株は米国アメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに
CorynebacteriumglutamicumK31，ATCC39280
として寄託されている。 pTrp2−３保有株コリネバクテリウム・グルタ
ミクムK20，ATCC39035およびpTrp4−３保有
株同K31ATCC39280によるＬ−トリプトフアン
生産試験を下記のとおり行う。 菌株をNB液体培地中で30℃，16時間振盪培養
した菌液0.5mlを５mlの生産培地P4〔廃糖密100g／
，（NH4）2SO4 20g／，Ｋml2PO40.5g／，
K2HPO4 0.5g／，MgSO4・7H2Ｏ 0.25g／
，CaCO3 20g／，PH7.2〕の入つた試験管に
植菌し、30℃で96時間振盪培養する。 培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフイ
ーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して、
Ｌ−トリプトフアンの生成量を測定する。 対照として、LA−105株およびLAR−１株を
同様に処理する。 結果を第１表に示す。
プトフアンを製造する方法に関する。さらに詳細
には本発明はアンスラニル酸合成酵素をコードす
る遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組
換え体DNAを用いコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物から選ばれ
る宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を
培地に培養し、培養物中にトリプトフアンを生成
蓄積せしめ、該培養物からトリプトフアンを採取
することを特徴とするトリプトフアンの製造法に
関する。 従来コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属菌におけるトリプトフアンの生産につい
てはこれらの栄養要求株、トリプトフアンアナロ
グ耐性株などの突然変異株を用いる方法が知られ
ている。（特公昭47−4505、特公昭51−19037） コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物を宿主として用い、これに該
宿主に対して外来性であるところの目的遺伝子ま
たはベクターを含む組み換え体DNAを導入して
該目的遺伝子の形質を発現させた例は今まで全く
知られていない。コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物を宿主とする
組換えDNA技法においても、これら微生物中で
自律複製し、選択可能な表現型を有し、多くの遺
伝子のクローニングを用いうるベクター系の造成
と、効率のよい形質転換系の確立が必要である。
さらに発現に際して現れる種々の障壁の解消方法
の確立が必要である。 本発明者らは先にコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属する微生物中で自律複
製し、選択可能な表現型と適当なクローニング部
位を有するプラスミドベクターを造成する一方効
率の高い形質転換系を開発し特許出願を行つた
（特開昭57−183799、同57−186492、同57−
186489）。また本発明者らは該プラスミドベクタ
ーに既に知られているインビトロにおける組換え
DNA技法（U.S.Patent 4237224）を用い、グル
タミン酸、リジンなどのアミノ酸の生合成に関与
する外来性遺伝子を含むDNA断片を連結し、開
発した形質転換系を用いてコリネバクテリウム・
グルタミクムＬ−22株またはその誘導株を形質転
換したところ、該外来性遺伝子が該宿主中で形質
を発現され、該アミノ酸の生産の増大に利用する
ことができることを見出し特許出願を行つた（特
願昭56−211908）。 さらに研究の結果、トリプトフアンに関しても
同様の方法によつて得られた菌株が著量のトリプ
トフアンを培地に蓄積できることを見出し本発明
を完成するに至つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明はアンスラニル酸合成酵素をコードする
遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組換
え体DNAを用いコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物から選ばれる
宿主菌株を形質転換して得られる形質転換株を培
地に培養し、トリプトフアンを製造する方法を提
供する。 本発明に用いる遺伝子を含むDNA断片として
は、真核生物、原核生物、ウイルス、バクテリオ
フアージまたはプラスミドに由来しトリプトフア
ン生成に関与する遺伝子を含むDNA断片があげ
られる。原核生物に由来する遺伝子としては細菌
とくにエツシエリヒア属、コリネバクテリウム
属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、スタフ
イロコツカス属またはセラチア属に属する細菌の
菌株に由来する遺伝子で、トリプトフアンの生成
ならびにその生成に関与する代謝系に係る遺伝子
が好適にあげられる。 本発明に用いるベクターとしては、宿主菌細胞
内で自律増殖できるものでなくてはならない。具
体例としては本発明者らがコリネバクテリウム属
に属する微生物から採取した、または採取したも
のから誘導して造成したpCG1（特開昭57−
134500）、pCG2（特願昭56−133557）、pCG4（特開
昭57−183799）、pCE52，pCE53，pCE54，
pCG11，pCB101などがあげられる。 これらプラスミドを保有する菌株はそれぞれ下
記の寄託番号で工業技術院微生物工業技術研究所
ならびに米国アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨンに寄託されている。 プラスミド FERM−Ｐ ATCC pCG1 5865 31808 pCG2 5954 31832 pCG4 5939 31830 pCE54 − 39019 pCG11 − 39022 pCB101 − 39020 好適にはpCE52，pCE53が用いられる。 pCE52およびpCE53は次のようにして作成する
ことができる。まず、pCG1をその保有菌コリネ
バクテリウム・グルタミクム225−57株（FERM
−P5865，ATCC31808）の培養菌体から前記の
特許出願明細書に開示した方法で、pGA22をそ
の保有大腸菌の培養菌体から通常用いられる方法
で濃縮単離する。プラスミドpCG1上に１個所あ
るBg1切断部位とpGA22上に２個所ある
BamH切断部位の一方の切断部位のみを両制
限酵素Bg1，BamHでそれぞれ消化して直鎖
状化した後、プラスミド分子の両端に単鎖として
突き出た同一接着末端で両DNA分子が連結した
和合分子を生成させるためにT4フアージDNAリ
ガーゼを作用させる。このDNA混成物中からの
両プラスミド分子の和合連結した組換え体プラス
ミドの取得は、一旦、pGA22に由来する薬剤耐
性で選択されるコリネバクテリウム属あるいはブ
レビバクテリウム属菌種の形質転換株を分離し、
これら形質転換株の保有するプラスミドを解析す
ることによつて達成される。 DNA混成物による形質転換は、本発明者らが
先に特許出願したコリネバクテリウム属およびブ
レビバクテリウム属菌種のプロトプラストを使用
する形質転換法（特開昭57−186492および特開昭
57−186489）により実施することができる。選択
に用いる薬剤はpGA22に由来する薬剤耐性遺伝
子のうち、挿入不活化される耐性遺伝子を除いた
他の耐性遺伝子に対応する薬剤を使用すればよ
い。形質転換株はDNA無添加系で受容菌プロト
プラストが正常細胞へ復帰増殖できない濃度の薬
剤〔通常、テトラサイクリン（Tc）0.4−1.6μg／
ml、クロラムフエニコール（Cm）2.5−5μg／ml
およびカナマイシン（Km）100−800μg／ml〕
を含む高張寒天培地上で形成されるコロニーを分
離するか、あるいは、一旦非選択的に再生培地上
で正常細胞に復帰増殖させた後にかき集め、この
懸濁液を受容菌正常細胞が生育できない濃度の薬
剤（通常、Tc0.5−4μg／ml，Cm2−15μg／mlお
よびKm2−25μg／ml）を含む寒天培地上で生育
するコロニーを分離することによつて得られる。
テトラサイクリン、クロラムフエニコールあるい
はカナマイシン耐性（TcR，CmR，KmRとそれぞ
れいう）により選択された形質転換株の中には、
pGA22由来の他の薬剤耐性形質をも同時に獲得
しているものがある。 こうして得られる形質転換株の保有するプラス
ミドDNAは、本発明者らが特開昭57−134500お
よび特開昭57−186489に開示した方法で培養菌体
から単離精製でき、さらに各種制限酵素で消化し
て生成するDNA断片をアガロースゲル電気泳動
で解析する常法により構造を知ることができる。
形質転換株から分離されたプラスミドがpCE52，
pCE53である。 pCE52およびpCE53は大きさ約10.9Kbのプラス
ミドで、制限部位としてEcoRI，Sa1I，SmaI，
XhoIなどを有し、pCE52はCmR，KmRの表現型
を、pCE53はTcR，CmR，KmRの表現型を与え
る。XhoIはKmR遺伝子にあり、いわゆる挿入不
活化（DNA断片の挿入により当該表現型の発現
が妨げられる現象）による選択も可能である。 プラスミド保有菌株からのプラスミドの採取
は、たとえば特開昭57−134500、同57−183799お
よび特願昭56−133557に記載の方法に従つて行え
ばよい。 遺伝子を含むDNA断片とベクターDNAとの組
み換え体の作製は、公知の試験管内組み換え
DNA技法を駆使することにより実施できる。 試験管内のDNA組み換えは、通常、目的の遺
伝子を含む供与体DNAとベクターDNAの切断と
結合（リガーゼ反応）により行われる（特願昭56
−211908号、USP4237224参照）。 リガーゼ反応により目的の組み換え体以外に他
の組み換え体も生成するが、目的の組み換え体を
取得するにはこのDNA混成液を用いてコリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種を
直接形質転換し、目的の遺伝子の遺伝情報に由来
する遺伝形質を付与された形質転換株を選択分離
し、その培養菌体から抽出単離することによつて
達成できる。コリネバクテリウム属またはブレビ
バクテリウム属菌種を直接形質転換しないで例え
ば大腸菌のような他の微生物の宿主ベクター系に
て目的の遺伝子を一旦クローン化し、しかる後に
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属菌種のベクターとの組み換え体を試験管内で作
製してからコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種を形質転換し前記と同様に形質
転換株を選択分離しても組み換え体を取得でき
る。 組み換え体製造のためには下記文献の記載が広
く応用できる。 S.N.Cohen，et al，U.S.Patent 4237224、遺
伝子操作実験法〔高木康敬編著、講談社サイエン
テイフイツク（1980）〕、Method in
Enzymology 68，Recombinant DNA，edited
by Ray Wu，Academic Press 1979、特願昭56
−211908. 本発明の宿主微生物としては、コリネバクテリ
ウム属またはブレビバクテリウム属に属しDNA
取り込み能を有する菌株ならばいかなる菌株を用
いてもよい。好適には本発明者らが先に発明し特
願昭56−151464において開示したリゾチーム感受
性微生物を用いる。具体的な菌株の一例としては
次の菌株があげられる。 寄 託 番 号 FERM−Ｐ ATCC コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−15
5946 31834 コリネバクテリウム・グルタミクムLA−105 コリネバクテリウム・ハーキユリスＬ−103
5947 31866 ブレビバクテリウム・デイバリカツムＬ−204
5948 31867 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムＬ
−312 5949 31868 宿主微生物の組み換え体DNAによる形質転換
は１培養細胞からのプロトプラストの調製、２プ
ロトプラストの組み換え体DNAによる形質転換
処理、３プロトプラストの正常細胞への復帰再生
と形質転換株の選択、からなる工程にて行われ
る。具体的方法の例を以下に示す。 １ 培養細胞からのプロトプラストの調製 プロトプラスト形成は、微生物を細胞壁溶解酵
素リゾチームに感受性にする条件下で増殖させ、
この培養細胞を高張液中でリゾチーム作用させ細
胞壁を溶解除去することによつて行われる。微生
物をリゾチーム感受性型細胞にするには各種細胞
壁合成阻害剤が用いられる。例えば、微生物培養
の対数増殖期の中途で生育を抑制しないかあるい
は半抑制する濃度のペニシリンを添加し、さらに
数世代増殖させることによつて微生物細胞をリゾ
チーム感受性にすることができる。 このとき使用する培地は微生物が増殖できる培
地であればよく、例えば栄養培地NB（粉末ブイ
ヨン20g、酵母エキス5gを純水１に含み、PH7.2
に調整した培地）あるいは半合成培地SSM〔グル
コース10g，NH4Cl 4g、尿素2g、酵母エキス1g，
KH2PO4 1g，K2HPO4 3g，MgCl2・6H2Ｏ
0.4g，FeSO4・7H2Ｏ 10mg，MnSO4・４〜6H2
Ｏ 0.2mg，ZnSO4・7H2O0.9mg，CuSO4・5H2Ｏ
0.4mg，Na2B4O7・10H2Ｏ 0.09mg，（NH4）6
Mo7O24・4H2Ｏ 0.04mg、ビオチン30μg、サイ
アミン塩酸塩１mgを水１に含み、PH7.2に調整
した培地〕などが用いられる。 この培地に微生物を接種し、振盪培養する。 比色計によつて660nmにおける吸光度（OD）
を測定し対数増殖期の初期（0D＝0.1〜0.4）に培
養液中0.1〜2.0単位／mlの濃度になるようにペニ
シリンＧなどのペニシリン類を添加する。培養を
さらに続けて、ODが0.3〜0.5に増加したところ
で細胞を集菌しSSM培地で洗滌する。次いで細
胞を適当な高張培地、例えばPFM培地（SSM2
倍希釈液中にシヨ糖0.4M，MgCl2・6H2Ｏ
0.01Mを含み、PH7.0〜8.5に調整した培地）ある
いはRCG培地〔グルコース5g、カゼイン加水分
解物5g、酵母エキス2.5g，K2HPO4 3.5g，KH2
PO4 1.5g，MgCl2・6H2Ｏ 0.41g，FeSO4・
7H2Ｏ 10mg，MnSO4・４〜6H2Ｏ ２mg，
ZnSO4・7H2Ｏ 0.9mg，CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg，
Na2B4O7・10H2Ｏ 0.09mg，（NH4）6Mo7O24・
4H2Ｏ 0.04mg、ピオチン30μg、サイアミン塩酸
塩２mg、コハク酸二ナトリウム135gを水１に
含み、PH7.0〜8.5に調整した培地〕に再懸濁す
る。この細胞懸濁液に最終濃度0.2〜10mg／mlと
なるようにリゾチームを加え30〜37℃で反応す
る。プロトプラスト化は反応時間が進むにつれて
進行し、その経過は光学顕微鏡で観察できる。顕
微鏡下ではほとんどの細胞がプロトプラスト化さ
れるに要する時間は、細胞培養時の添加ペニシリ
ン濃度および用いるリゾチームの濃度によつて変
わるが、前記条件にて３〜24時間である。 生成したプロトプラストは低張条件で破裂死す
るので、プロトプラストの形成度は低張条件で生
残する正常細胞の残存度で間接的に知ることがで
きる。通常、正常細胞はリゾチーム処理供試正常
細胞の約10-4の残存度に抑えることができる。 このようにして調製したプロトプラストは適当
な高張寒天培地上でコロニー形成能（再生能）を
有する。この寒天培地としては栄養培地、半合成
培地あるいは数種類のアミノ酸を補充した合成培
地に0.3〜0.8Mコハク酸二ナトリウムおよび0.5〜
６％ポリビニルピロリドン（分子量10000あるい
は40000）を含有せしめたものが好適に用いられ
る。 通常、半合成培地RCGP培地〔RCG培地に３
％のポリビニルピロリドン（分子量10000）と1.4
％の寒天を添加した培地、PH7.2〕を用いること
ができる。培養は25〜35℃で行うのが好ましい。
再生コロニーの出現が認められるのに要する培養
日数は菌株により差があるが、釣菌できるまでの
大きさになるのは10日〜14日である。RCGP培地
でのプロトプラストの再生は菌種、培養中途ペニ
シリン添加濃度およびリゾチーム処理濃度によつ
て異なるが、リゾチーム処理供試正常細胞あたり
10-2〜10-4の効率である。 ２ ロトプラストの組み換え体DNAによる形質
転換 プロトプラストへの組み換え体DNAの取り込
みは細胞がプロトプラスト状態を保持できる高張
液中でプロトプラストと組み換え体DNAとを混
合し、これにDNA取り込み媒介作用のあるポリ
エチレングリコール（PEG、平均分子量1540〜
6000）あるいはポリビニルアルコール（PVA、
重合度500〜1500）と二価金属陽イオンを加えて
処理することによつて行われる。高張条件を与え
る安定化剤としては、微生物のプロトプラストの
保持に一般に使われるものでよく、例えばシヨ糖
やコハク酸二ナトリウムを用いることができる。
PEGおよびPVAの使用可能な濃度範囲は最終濃
度で各々５〜60％，１〜20％である。二価金属陽
イオンは最終濃度１〜100mMの、たとえば
Ca，Mg，Mn，Ba，Srなどが効果的
で単独あるいは併用することができる。処理の温
度は０〜25℃が好適である。 ３ プロトプラストの正常細胞への復帰再生と形
質転換株の選択 組み換え体DNAで形質転換処理したプロトプ
ラストの再生は、前記のプロトプラストの再生と
同様に、コハク酸二ナトリウムとポリビニルピロ
リドンを含有する高張寒天培地（例えばRCGP培
地）上にプロトプラストを塗布し、正常細胞が生
育できる温度、一般に25〜35℃で培養することに
よつて行われる。形質転換株は供与DNAに由来
する遺伝子が菌に付与する形質について選択する
ことによつて取得できる。この特徴的形質獲得に
基づく選択は、高張寒天培地上で再生と同時に行
つてもよく、あるいは一旦非選択的に再生させて
から再生正常細胞を集め普通の低張寒天培地上で
行つてもよい。 本発明における具体的に好適な宿主菌株として
示したリゾチーム感受性菌株を用いる場合には形
質転換は上記工程(1)におけるペニシリン処理を行
わずに単に培養増殖させた細胞を直接リゾチーム
処理する以外は上記工程(1)〜(3)と同様に行えばよ
い。リゾチーム感受性微生物を用いる場合の形質
転換株は再生菌あたり10-2〜10-4の高頻度で得ら
れる。 形質転換株は通常の栄養培地に培養することに
より導入した組み換え体DNAの形質を発現させ
ることができる。組み換え体DNAに遺伝子DNA
またはベクターDNA由来の性質が付与されてい
る場合は、その性質にあわせて培地に薬剤を補給
するときもある。 かくして得られた形質転換株を、従来発酵法に
よるトリプトフアン製造に用いられる培養方法に
より培養することによつて、トリプトフアンを製
造することができる。すなわち、該形質転換株を
炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンな
どを含有する通常の培地中、好気的条件下、温
度，PHなどを調節しつつ培養を行えば、培養物中
にトリプトフアンが生成蓄積するので、これを採
取する。 炭素源としてはグルコース、フラクトース、シ
ユークロース、マルトース、マンノース、ソルビ
トール、マニトールなどの炭水化物、糖アルコー
ル、グリセロール、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜
などが使用でき、またピルビン酸、乳酸、酢酸、
フマール酸、グルコン酸などの各種有機酸、エタ
ノールなど低級アルコールも使用可能である。 窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、
酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アン
モニウム塩類あるいは尿素および他の窒素含有物
質ならびにペプトン、NZ−アミン、肉エキス、
酵母エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイ
ン加水分解物、フイツシユミールあるいはその消
化物、蛹加水分解物などの窒素性有機物など種々
のものが使用可能である。 さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウ
ム、燐酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンおよ
び炭酸カルシウムなどを使用する。微生物の生育
に必要とするビタミン、アミノ酸源などは、前記
したような他の培地成分に従つて培地に供給され
れば特に加えなくてもよい。 培養は振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好
気的条件下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が
好適である。培養中の培地のPHは中性付近に維持
することが望ましい。培養期間は通常２〜５日間
で培地中に著量のトリプトフアンが蓄積する。 培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオ
ン交換樹脂処理などの公知の方法で培養液からト
リプトフアンが回収される。 グルタミン酸高生産能を有するいわゆるグルタ
ミン酸生産菌は、主な菌学的性質を同じくしてい
るにもかかわらず、産業上の重要性から各研究者
により、種々の菌名が付されており属名までもコ
リネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム
属などさまざまである。しかしながら、これらの
菌群は、細胞壁のアミノ酸構成やDNAの塩基組
成が画一的であることから、同一の菌種であるこ
とが指摘されていた。さらに、最近、これらの菌
種間には、70〜80％以上のDNAの相同性がある
ことが明らかにされ、非常に近縁な微生物である
ことが明白である〔Komatsu，Y.：Report of
the Fermentative Research Institute，No.55，
１（1980）、および、Suzuki，K.，Kaneko，T.，
and Komagata，K.：Int.J.Syst.Bacteriol.，31，
131（1981）参照〕。本明細書では組み換えDNA実
験に使用できる宿主が規制されているため、本発
明の有用性はコリネバクテリウム・グルタミクム
Ｌ−22の誘導株を宿主として示したが上記の事実
を踏まえれば、グルタミン酸生産菌全般にそのま
ま適用できることが容易に類推される。組み換え
DNAがこれら菌種において安定に保持され、発
現されるためにはDNAの相同性など宿主菌の性
質における若干の相違は問題でなく、これら菌種
が当該プラスミドの自律複製と導入遺伝子の発現
を可能ならしめる機能を有していればよい。しか
るに、これらの菌種がこの両機能を共有している
ことは、本発明者らが、先に特許出願（特開昭57
−183799）したコリネバクテリウム・グルタミウ
ム225−250から分離され、ストレプトマイシンお
よび／またはスペクチノマイシン耐性遺伝子を有
するプラスミドpCG4がコリネバクテリウム属お
よびブレビバクテリウム属菌種など、グルタミン
酸生産菌内で同じく複製でき、また、その耐性遺
伝子が発現される（特開昭57−186492）ことから
あきらかである。従つて、本発明を適用し得る宿
主菌としては、コリネバクテリウム・グルタミク
ムに限らず、コリネバクテリウム属およびブレビ
バクテリウム属菌種を含むグルタミン酸生産菌全
てが包括される。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067の
アンスラニル酸合成酵素遺伝子のコリネバクテリ
ウム・グルタミクムでのクローン化とトリプトフ
アンの生産： (1) 染色体DNAとプラスミドpCE53の調製法： ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067の
染色体DNAを以下の方法で調製する。 400ml半合成培地SSM〔グルコース20g，（NH4）
2SO410g、尿素3g、酵母エキス1g，KH2PO4
1g，MgCl2・6H2Ｏ 0.4g，FeSO4・7H2Ｏ 10
mg，MnSO4・４〜6H2Ｏ 0.2mg，ZnSO4／7H2
Ｏ 0.9mg，CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg，Na2B4O7・
10H2Ｏ 0.09mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04
mg、ビオチン30μg、サイアミン塩酸塩１mgを水
１に含みPH7.2に調整した培地〕に種培養を接
種して30℃で振盪培養する。種培養はNB培地を
用いる。東京光電比色計で660nmにおける吸光度
（OD）を測定し、OD0.2になつた時点で培養液中
0.5単位／mlの濃度となるようにペニシリンＧを
添加する。さらに培養を継続しOD約0.6になるま
で生育させる。 培養液から菌体を集菌し、TBS緩衝液〔0.03M
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−HCl
（以下トリスと略す），0.005MEDTA，
0.05MNaCl：PH8.0〕で洗浄後、リゾチーム液
（25％シヨ糖、0.1MNaCl，0.05Mトリス、0.8
mg／mlリゾチーム：PH8.0以下同じ）で10mlに懸
濁し37℃で４時間反応させる。集菌した菌体から
斎藤らの方法〔Saito，H.et al：Biochim.
Biophys.Acta，72 619（1963）〕に従つて高分子
染色体DNAを単離する。 ベクターとして用いるpCE53は次の方法でその
保有株コリネバクテリウム・グルタミクムＬ−22
株の培養菌体から単離する。 400mlNB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス
5gを水１に含みPH7.2に調整した培地）で30℃
で振盪培養しOD約0.7になるまで生育させる。菌
体を集菌し、TES緩衝液で洗浄後、リゾチーム
液10mlに懸濁し、37℃で２時間反応させる。反応
液に5MNaCl2.4ml、0.5MEDTA（PH8.5）0.6ml，
４％ラウリル硫酸ナトリウムと0.7MNaClからな
る溶液4.4mlを順次添加し、緩やかに混和してか
ら氷水中に15時間置く。 溶菌物全体を遠心管に移し４℃で60分間69400
×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。これに
重量百分率10％相当のポリエチレングリコール
（PBG）6000（半井化学薬品社製）を加え、静か
に混和して溶解後、氷水中に置く。10時間後1500
×ｇで10分間遠心分離してペレツトを回収する。
TES緩衝液５mlを加えてペレツトを静かに再溶
解してから1.5mg／mlエチジウムブロマイド2.0ml
を添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶
解し密度を1.580に合わせる。この溶液を105000
×ｇ，18℃で48時間超遠心分離にかける。この密
度勾配遠心により共有結合で閉じられた環状の
DNAは紫外線照射下に遠心チユーブ中下方の密
度の高いバンドとして見出される。このバンド画
分を注射器で遠心チユーブの側面から抜きとるこ
とによつてpCE53DNAが分離される。次いで分
画液を等容量のイソプロピルアルコール液〔容量
百分率90％イソプロピルアルコール、10％TES
緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セシウム
を含む）〕で５回処理してエチジウムブロマイド
を抽出除去し、しかる後にTES緩衝液に対して
透析する。 pCE53は本発明者らが先に特許出願したコリネ
バクテリウム・グルタミクムのプラスミドpCG1
（特開昭57−134500）と大腸菌のプラスミド
pGA22（An，G.et al：J.Bacteriol.）140，400
（1979）参照〕を和合連結せしめたプラスミドで
ある。詳しくはpCG1上に１カ所しかないBgl
切断部位とpGA22上に２カ所あるBamH切断
部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内でない
BamH切断部位とで、両制限酵素の同一接着
末端を利用して連結したものである。pCE53は
pGA22由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選
択マーカーを有し、制限酵素Salに対する切断
部位は１カ所である。 (2) アンスラニル酸合成酵素遺伝子のクローン
化： 上記で調製したpCE53プラスミドDNA3μgおよ
び染色体DNA9μgを含む制限酵素 Sal反応液200μlに10単位のSalを添加し、
37℃で60分間反応後、65℃で10分間加温して反応
を停止させる。この混合消化物にT4リガーゼ用
緩衝液（トリス660mM，MgCl266mM、ジチオ
スレイトール100mM，PH7.6）40μl，ATP
（5mM）40μl，T4リガーゼ（宝酒造社製、１単
位／μl）0.4μlおよびH2Ｏ 120μlを加え、12℃で
16時間反応させる。 (3) 組み換え体プラスミドの形質転換： このリガーゼ反応混合物を形質転換に供する。 形質転換する受容菌としてコリネバクテリウ
ム・グルタミクムＬ−22株から誘導されたアンス
ラニル酸要求性変異株LA105（アンスラニル酸合
成酵素欠損変異株）を用いる。アンスラニル酸要
求性変異株は、常法の変異処理により、M1寒天
培地〔グルコース10g，NH4H2PO4 1g，KCL
0.2g，MgSO4・7H2Ｏ 0.2g，FeSO4・7H2Ｏ
10mg，MnSO4・４〜6H2Ｏ 0.2mg，ZnSO4・
7H2Ｏ 0.9mg，CuSO4・5H2Ｏ 0.4mg，Na2B4
O7・10H2Ｏ 0.09mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ
0.04mg、ビオチン50μg，Ｐ−アミノ安息香酸2.5
mg、サイアミン塩酸塩１mg、寒天16gを１中に
含みPH7.2に調整した培地〕上で生育できず、ア
ンスラニル酸（30μg／ml相当）を補つたM1寒天
培地上で生育できる菌を選択することによつて取
得される。LA105株のプロトプラストの調製およ
び形質転換は、生育培地に生育したLA105の菌体
NBに100μg／ml相当のアンスラニル酸を補つた
培地を使用して以下のとおりに行う。 LA105株の種培養をNB培地に植菌し30℃で振
盪培養する。OD0.6になつた時点で集菌し、該細
胞をRCGP培地〔グルコース5g、カザミノ酸5g、
酵母エキス2.5g，K2HPO4 3.5g，KH2PO4
1.5g，MgCl2・6H2Ｏ 0.41g，FeSO4・7H2Ｏ
10mg，MnSO4・４〜6H2Ｏ ２mg，ZnSO4・7H2
Ｏ 0.9mg，（NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 0.04mg，ビ
オチン30μg、サイアミン塩酸塩２mg、コハク酸
二ナトリウム135g、ポリビニルピロリドン（分
子量10000）30gを水１に含む培地〕に１mg／
mlのリゾチームを含む液（PH7.6）に約109細胞／
mlとなるように懸濁し、Ｌ型試験管に移して30℃
で５時間緩やかに振盪反応してプロトプラスト化
する。 このプロトプラスト懸濁液0.5mlを小試験管に
とり2500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC緩衝
液（10mM塩化マグネシウム、30mM塩化カルシ
ウム、50mMトリス、400mMシヨ糖、PH7.5）１
mlに再懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液0.1ml
に再懸濁する。この懸濁液に２倍濃度のTSMC
緩衝液と上記リガーゼ反応DNA混合物の１対１
混合液100μlを加えて混和し、次いでTSMC緩衝
液中に20％PEG6000を含む液0.8mlを添加して混
合する。３分後、RCGP培地（PH7.2）２mlを添
加し、2500×ｇで５分間遠心分離にかけて上澄み
液を除去し、沈降したプロトプラストを１mlの
RCGP培地に懸濁してから0.2mlをカナマイシン
300μg／mlを含むRCGP寒天培地（RCGP培地に
1.4％寒天を含む培地、PH7.2）に塗抹し、30℃で
７日間培養する。 選択プレート上に生育したカナマイシン耐性コ
ロニーをかき集め、生理食塩水を用いて２回遠心
洗浄後、カナマイシン20μg／mlを含む最小寒天
培地M1に塗布して30℃で２日間培養し、カナマ
イシン耐性でかつアンスラニル酸非要求性となつ
た形質転換株を選択する。 これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様
にプラスミドDNAを単離する。形質転換株の一
株から得られたプラスミドpTrp2−３を各種制限
酵素消化後アガロースゲル電気泳動で解析した結
果、pCE53の唯一のSal切断部位に約7.1Kbの
SalDNA切断片が挿入されたプラスミドである
ことがわかつた。 pTrp2−３を用い、同様な方法でLA105株を再
形質転換したところ、トリプトフアン100μg／ml
およびカナマイシン400μg／mlを含むRCGP寒天
培地上で生育するコロニーは、同時にアンスラニ
ル酸非要求性となり、それらは、Salの切断様
式で判定されるpTrp2−３と同一のプラスミドを
保有している。 以上の結果は、クローン化された約7.1Kbの
SalDNA切断片にはブレビバクテリウム・フラ
バムATCC14067のアンスラニル酸合成酵素をコ
ードする遺伝子が存在し、それがコリネバクテリ
ウム・グルタミクムLA105株中で発現しているこ
とを示す。 pTrp2−３保有菌株は米国アメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨンに
Corynebacteriumglutamicum K20，
ATCC39035として寄託されている。 (4) 形質転換株によるトリプトフアンの生産： プラスミドpCE52を用いて上記と同様の処理を
行い、ブレビバクテリウム・フラバム
ATCC14067のアンスラニル酸合成酵素をコード
する遺伝子を有するプラスミドpTrp4−３を得
る。 pCE52は本発明者らが先に特許出願したコリネ
バクテリウム・グルタミクムのプラスミドpCG1
（特開昭57−134500）と大腸菌のプラスミド
pGA22〔An，G.et al：J.Bacteriol.140，400
（1979）参照〕を和合連結せしめたプラスミドで
ある。詳しくはpCG1上に１カ所しかないBgl
切断部位とpGA22上に２カ所あるBamH切断
部位のうちテトラサイクリン耐性遺伝子内の
BamH切断部位とで、両制限酵素の同一接着
末端を利用して連結したものである。pCE52は
pGA22由来のカナマイシン耐性遺伝子などの選
択マーカーを有し、制限酵素Salに対する切断
部位は１カ所である。 pCE52保有株コリネバクテリウム・グルタミク
ムＬ−22株の培養菌体から次の方法でpCE52を単
離する。 400mlNB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス
5gを水１に含みPH7.2に調整した培地）で30℃
で振盪培養しOD約0.7になるまで生育させる。菌
体を集菌し、TES緩衝液で洗浄後、リゾチーム
液10mlに懸濁し、37℃で２時間反応させる。反応
液に5MNaCl 2.4ml，0.5MEDTA（PH8.5）0.6ml、
４％ラウリル硫酸ナトリウムと0.7MNaClからな
る溶液4.4mlを順次添加し、緩やかに混和してか
ら氷水中に15時間置く。 溶菌物全体を遠心管に移し４℃で60分間69400
×ｇの遠心分離にかけ上澄液を回収する。これに
重量百分率10％相当のポリエチレングリコール
（PEG）6000（半井化学薬品社製）を加え、静か
に混和して溶解後、氷水中に置く。10時間後1500
×ｇで10分間遠心分離してペレツトを回収する。
TES緩衝液５mlを加えてペレツトを静かに再溶
解してから1.5mg／mlエチジウムブロマイド2.0ml
を添加し、これに塩化セシウムを加えて静かに溶
解し密度を1580に合わせる。この溶液を105000×
ｇ，18℃で48時間超遠心分離にかける。この密度
勾配遠心により共有結合で閉じられた環状の
DNAは紫外線照射することによつて遠心チユー
ブ中下方の密度の高いバンドとして見出される。
このバンドを注射器で遠心チユーブの側面から抜
きとることによつてpCE52DNAが分離される。
次いで分画液を等容量のイソプロピルアルコール
液〔容量百分率90％イソプロピルアルコール、10
％TES緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化
セシウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブ
ロマイドを抽出除去し，しかる後にTES緩衝液
に対して透析する。 上記と同様にトリプトフアン生産性のコリネバ
クテリウム・グルタミクムLAR−１株（FERM
Ｐ−6908）をpTrp4−３で形質転換する。得られ
た形質転換株は米国アメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに
CorynebacteriumglutamicumK31，ATCC39280
として寄託されている。 pTrp2−３保有株コリネバクテリウム・グルタ
ミクムK20，ATCC39035およびpTrp4−３保有
株同K31ATCC39280によるＬ−トリプトフアン
生産試験を下記のとおり行う。 菌株をNB液体培地中で30℃，16時間振盪培養
した菌液0.5mlを５mlの生産培地P4〔廃糖密100g／
，（NH4）2SO4 20g／，Ｋml2PO40.5g／，
K2HPO4 0.5g／，MgSO4・7H2Ｏ 0.25g／
，CaCO3 20g／，PH7.2〕の入つた試験管に
植菌し、30℃で96時間振盪培養する。 培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフイ
ーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して、
Ｌ−トリプトフアンの生成量を測定する。 対照として、LA−105株およびLAR−１株を
同様に処理する。 結果を第１表に示す。
【表】
実施例 ２
コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032のアンスラニル酸合成酵素遺伝子の
コリネバクテリウム・グルタミクムでのクローン
化とトリプトフアンの生産： (1) 染色体DNAの調製法： コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032の染色体DNAを以下の方法で調製す
る。 ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067に
替えて、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を用いる以外は実施例１(1)と同様に
行つて、染色体DNAを調製する。 (2) アンスラニル酸合成酵素遺伝子のクローン
化： 実施例１(4)で調製したpCE52プラスミド
DNA3μgおよび上記で調製した染色体DNA9μg
を用いる以外は実施例１(2)と同様に行つてリガー
ゼ反応混合物を得る。 (3) 組み換え体プラスミドの形質転換： 上記で得られたリガーゼ反応混合物を用い、実
施例１(3)と同様に行つて形質転換株を得る。 これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様
にプラスミドDNAを単離する。形質転換株の一
株から得られたプラスミドpTrp9−１を各種制限
酵素消化後アガロースゲル電気泳動で解析した結
果、pCE52の唯一のSal切断部位に約7.3Kbの
SalDNA切断片が挿入されたプラスミドである
ことがわかつた。 pTrp9−１を用い、同様な方法でLA105株を再
形質転換したところ、トリプトフアン100μg／ml
およびカナマイシン400μg／mlを含むRCGP寒天
培地上で生育するコロニーは、同時にアンスラニ
ル酸非要求性となり、それらは、Salの切断様
式で判定されるpTrp9−１と同一のプラスミドを
保有している。 以上の結果は、クローン化された約7.3Kbの
SalDNA切断片にはコリネバクテリウム・グル
タミクムATCC13032のアンスラニル酸合成酵素
をコードする遺伝子が存在し、それがコリネバク
テリウム・グルタミクムLA105株中で発現してい
ることを示す。 (4) pTrp9−１保有株からのトリプトフアンアナ
ログ耐性プラスミドpTrp13−２の取得： pTrp9−１を保有するLA−105株を、カナマイ
シン10μg／mlを含むNB培地で対数増殖の後期ま
で増殖させる。菌体を50mMトリス・マレイン酸
緩衝液（PH6.0）で２回遠心洗浄後、Ｎ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン400μg／
mlを含む50mMトリス・マレイン酸緩衝液（PH
6.0）中で、室温で30分間処理する。処理菌体を
50mMトリス・マレイン酸緩衝液（PH6.0）で２
回遠心洗浄後、洗浄菌体をカナマイシン10μg／
mlを含むNB培地中、30℃で16時間培養し、実施
例１と同様の方法でプラスミドDNAを単離する。 単離したプラスミドを用いLA−105株を実施例
１と同様の方法で形質転換する。形質転換株の選
択は、４−メチルトリプトフアン0.5mg／mlある
いは６−フルオロトリプトフアン0.5mg／mlを
各々単独、あるいはカナマイシン200μg／mlを同
時に含むRCGP寒天培地上で行う。 出現したコロニーから、各々対応するトリプト
フアンアナログ0.5mg／mlを含むM1寒天培地およ
びカナマイシン10μg／mlを含むNB寒天培地上で
生育できるコロニーを選択する。 このようにして得た形質転換株は、トリプトフ
アン非感受性のアンスラニル酸合成酵素をコード
する遺伝子を持つプラスミドを有する。このよう
なプラスミドの一つpTrp13−２がコードするア
ンスラニル酸合成酵素の50％阻害トリプトフアン
濃度は0.25mMで、pTrp9−１のコードするアン
スラニル酸合成酵素の50％阻害トリプトフアン濃
度0.006mMと比較して約40倍トリプトフアン非
感受性である。 実施例１と同様にしてコリネバクテリウム
LAR−１をpTrp13−２で形質転換する。得られ
た形質転換株は米国アメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンにCorynebacterium
glutamicumK37，ATCC39285として寄託されて
いる。 (5) 形質転換株によるトリプトフアンの生産： pTrp13−２保有株コリネバクテリウム・グル
タミクムK37，ATCC39285によるＬ−トリプト
フアン生産試験を下記のとおり行う。 菌株をNB液体培地中で30℃，16時間振盪培養
した菌液0.5mlを５mlの生産培地P4〔廃糖蜜100g／
，（NH4）2SO4 20g／，KH2PO4 0.5g／
，K2HPO4 0.5g／，MgSo4・7H2Ｏ
0.25g／，CaCO3 20g／，PH7.2〕の入つた
試験管に植菌し、30℃で96時間振盪培養する。 培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフイ
ーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して、
Ｌ−トリプトフアンの生成量を測定する。 対照として、LAR−１株とLAR−１／pTrp9
−１株を同様に処理する。LAR−１／pTrp9−
１は、pTrp9−１でLAR−１株を形質転換して
上記と同様に作製する。 結果を第２表に示す。
ATCC13032のアンスラニル酸合成酵素遺伝子の
コリネバクテリウム・グルタミクムでのクローン
化とトリプトフアンの生産： (1) 染色体DNAの調製法： コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032の染色体DNAを以下の方法で調製す
る。 ブレビバクテリウム・フラバムATCC14067に
替えて、コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032を用いる以外は実施例１(1)と同様に
行つて、染色体DNAを調製する。 (2) アンスラニル酸合成酵素遺伝子のクローン
化： 実施例１(4)で調製したpCE52プラスミド
DNA3μgおよび上記で調製した染色体DNA9μg
を用いる以外は実施例１(2)と同様に行つてリガー
ゼ反応混合物を得る。 (3) 組み換え体プラスミドの形質転換： 上記で得られたリガーゼ反応混合物を用い、実
施例１(3)と同様に行つて形質転換株を得る。 これらの形質転換株の培養菌体から前記と同様
にプラスミドDNAを単離する。形質転換株の一
株から得られたプラスミドpTrp9−１を各種制限
酵素消化後アガロースゲル電気泳動で解析した結
果、pCE52の唯一のSal切断部位に約7.3Kbの
SalDNA切断片が挿入されたプラスミドである
ことがわかつた。 pTrp9−１を用い、同様な方法でLA105株を再
形質転換したところ、トリプトフアン100μg／ml
およびカナマイシン400μg／mlを含むRCGP寒天
培地上で生育するコロニーは、同時にアンスラニ
ル酸非要求性となり、それらは、Salの切断様
式で判定されるpTrp9−１と同一のプラスミドを
保有している。 以上の結果は、クローン化された約7.3Kbの
SalDNA切断片にはコリネバクテリウム・グル
タミクムATCC13032のアンスラニル酸合成酵素
をコードする遺伝子が存在し、それがコリネバク
テリウム・グルタミクムLA105株中で発現してい
ることを示す。 (4) pTrp9−１保有株からのトリプトフアンアナ
ログ耐性プラスミドpTrp13−２の取得： pTrp9−１を保有するLA−105株を、カナマイ
シン10μg／mlを含むNB培地で対数増殖の後期ま
で増殖させる。菌体を50mMトリス・マレイン酸
緩衝液（PH6.0）で２回遠心洗浄後、Ｎ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン400μg／
mlを含む50mMトリス・マレイン酸緩衝液（PH
6.0）中で、室温で30分間処理する。処理菌体を
50mMトリス・マレイン酸緩衝液（PH6.0）で２
回遠心洗浄後、洗浄菌体をカナマイシン10μg／
mlを含むNB培地中、30℃で16時間培養し、実施
例１と同様の方法でプラスミドDNAを単離する。 単離したプラスミドを用いLA−105株を実施例
１と同様の方法で形質転換する。形質転換株の選
択は、４−メチルトリプトフアン0.5mg／mlある
いは６−フルオロトリプトフアン0.5mg／mlを
各々単独、あるいはカナマイシン200μg／mlを同
時に含むRCGP寒天培地上で行う。 出現したコロニーから、各々対応するトリプト
フアンアナログ0.5mg／mlを含むM1寒天培地およ
びカナマイシン10μg／mlを含むNB寒天培地上で
生育できるコロニーを選択する。 このようにして得た形質転換株は、トリプトフ
アン非感受性のアンスラニル酸合成酵素をコード
する遺伝子を持つプラスミドを有する。このよう
なプラスミドの一つpTrp13−２がコードするア
ンスラニル酸合成酵素の50％阻害トリプトフアン
濃度は0.25mMで、pTrp9−１のコードするアン
スラニル酸合成酵素の50％阻害トリプトフアン濃
度0.006mMと比較して約40倍トリプトフアン非
感受性である。 実施例１と同様にしてコリネバクテリウム
LAR−１をpTrp13−２で形質転換する。得られ
た形質転換株は米国アメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンにCorynebacterium
glutamicumK37，ATCC39285として寄託されて
いる。 (5) 形質転換株によるトリプトフアンの生産： pTrp13−２保有株コリネバクテリウム・グル
タミクムK37，ATCC39285によるＬ−トリプト
フアン生産試験を下記のとおり行う。 菌株をNB液体培地中で30℃，16時間振盪培養
した菌液0.5mlを５mlの生産培地P4〔廃糖蜜100g／
，（NH4）2SO4 20g／，KH2PO4 0.5g／
，K2HPO4 0.5g／，MgSo4・7H2Ｏ
0.25g／，CaCO3 20g／，PH7.2〕の入つた
試験管に植菌し、30℃で96時間振盪培養する。 培養後、培養濾液をペーパークロマトグラフイ
ーにかけ、ニンヒドリン発色後、比色定量して、
Ｌ−トリプトフアンの生成量を測定する。 対照として、LAR−１株とLAR−１／pTrp9
−１株を同様に処理する。LAR−１／pTrp9−
１は、pTrp9−１でLAR−１株を形質転換して
上記と同様に作製する。 結果を第２表に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物由来のアンスラニル酸合成
酵素をコードする遺伝子を含むDNA断片とベク
ターDNAとの組換え体DNAを用いコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属に属する微
生物から選ばれる宿主微生物を形質転換して得ら
れる形質転換株を培地に培養し、培養物中にトリ
プトフアンを生成蓄積せしめ、該培養物からトリ
プトフアンを採取することを特徴とするトリプト
フアンの製造法。 ２ DNA断片の由来微生物がトリプトフアンア
ナログに耐性であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法。 ３ 該アンスラニル酸合成酵素のトリプトフアン
ならびにトリプトフアンアナログ阻害が解除され
ていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ４ 該DNA断片が宿主微生物にトリプトフアン
アナログ耐性を与えることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ５ 該トリプトフアンアナログが４−メチルトリ
プトフアン、５−メチルトリプトフアンおよび６
−メチルトリプトフアンから選ばれることを特徴
とする特許請求の範囲第２，３または４項記載の
方法。 ６ 該ベクターがコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属細菌中で自律複製できる微生
物由来のプラスミド、フアージまたはその誘導体
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ７ 該プラスミドおよびその誘導体がコリネバク
テリウム属に属する微生物由来のpCG1，pCG2，
pCG4，pCE52，pCE53，pCE54，pCG11または
pCB101と名付けたプラスミドであることを特徴
とする特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 該宿主微生物がコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属に属し、かつリゾチーム感
受性であることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ９ 該宿主微生物がコリネバクテリウム・グルタ
ミクムＬ−22またはその誘導体であることを特徴
とする特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０ 該形質転換株が、コリネバクテリウム・グ
ルタミクムK20（ATCC39035）、コリネバクテリ
ウム・グルタミクムK31（ATCC39280）またはコ
リネバクテリウム・グルタミクムK37
（ATCC39285）である特許請求の範囲第１項記載
の方法。
Priority Applications (26)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58025398A JPS59156292A (ja) | 1983-02-17 | 1983-02-17 | トリプトフアンの製造法 |
| CA000447442A CA1225051A (en) | 1983-02-17 | 1984-02-15 | Process for producing tryptophan |
| DE89108171T DE3486232T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Arginin. |
| DE89108172T DE3486188T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Tyrosin. |
| EP89108165A EP0336452B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-phenylalanine |
| IT67150/84A IT1178858B (it) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Procedimento per la produzione di triptofano |
| DE89108164T DE3486147T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Isoleucin. |
| EP89108171A EP0332233B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing L-arginine |
| DE1984900870 DE136359T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Herstellungsverfahren fuer aminosaeuren. |
| AT84900870T ATE62272T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Herstellungsverfahren fuer l-histidin. |
| PCT/JP1984/000047 WO1984003301A1 (fr) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Procede de preparation d'acide amine |
| EP84900870A EP0136359B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-histidine |
| DE89108165T DE3486229T2 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin. |
| AU25721/84A AU568340B2 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing amino acid |
| AT89108172T ATE92103T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur herstellung von l-tyrosin. |
| AT89108171T ATE96170T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur herstellung von l-arginin. |
| AT89108165T ATE95838T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur herstellung von l-phenylalanin. |
| EP89108164A EP0334391B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-isoleucine |
| DE8484900870T DE3484378D1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Herstellungsverfahren fuer l-histidin. |
| EP89108172A EP0332234B1 (en) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Process for preparing l-tyrosine |
| AT89108164T ATE89316T1 (de) | 1983-02-17 | 1984-02-16 | Verfahren zur herstellung von l-isoleucin. |
| ES529851A ES529851A0 (es) | 1983-02-17 | 1984-02-17 | Un procedimiento para la produccion de triptofano |
| MX84101939U MX7668E (es) | 1983-02-17 | 1984-02-17 | Procedimiento biotecnologico para la produccion de triptofano |
| IL71145A IL71145A (en) | 1983-02-17 | 1984-03-04 | Process for producing l-tryptophan by corynebacterium and brevibacterium and bacteria used therein |
| CA000454602A CA1218818A (en) | 1983-02-17 | 1984-05-17 | Process for production of heat-resistant, fiber- reinforced plastic |
| US07/073,888 US4874698A (en) | 1983-02-17 | 1987-07-16 | Process for producing tryptophan |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58025398A JPS59156292A (ja) | 1983-02-17 | 1983-02-17 | トリプトフアンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59156292A JPS59156292A (ja) | 1984-09-05 |
| JPH0523751B2 true JPH0523751B2 (ja) | 1993-04-05 |
Family
ID=12164789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58025398A Granted JPS59156292A (ja) | 1983-02-17 | 1983-02-17 | トリプトフアンの製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4874698A (ja) |
| JP (1) | JPS59156292A (ja) |
| CA (2) | CA1225051A (ja) |
| ES (1) | ES529851A0 (ja) |
| IL (1) | IL71145A (ja) |
| IT (1) | IT1178858B (ja) |
| MX (1) | MX7668E (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JPS59196098A (ja) * | 1983-04-23 | 1984-11-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
| JPH0746994B2 (ja) * | 1984-10-04 | 1995-05-24 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 |
| JPS6251980A (ja) * | 1985-08-30 | 1987-03-06 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 |
| JPS61149082A (ja) * | 1984-12-25 | 1986-07-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 |
| JPS6279775A (ja) * | 1985-10-04 | 1987-04-13 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるレートリプトファンの製造法 |
| JP2656300B2 (ja) * | 1988-04-18 | 1997-09-24 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
| JP2678995B2 (ja) * | 1988-09-08 | 1997-11-19 | 三菱化学株式会社 | トリプトフアンシンターゼの製造法 |
| JP3078312B2 (ja) * | 1990-11-22 | 2000-08-21 | 協和醗酵工業株式会社 | 物質の製造法 |
| JP3369231B2 (ja) * | 1992-12-03 | 2003-01-20 | 協和醗酵工業株式会社 | 芳香族アミノ酸の製造法 |
| JPH06327480A (ja) * | 1993-05-20 | 1994-11-29 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | プラスミドの自律複製を司る機能に関与する遺伝子を含むｄｎａ断片 |
| JP4245746B2 (ja) | 1999-09-20 | 2009-04-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 発酵法によるアミノ酸の製造法 |
| CA2319283A1 (en) | 1999-09-20 | 2001-03-20 | Kuniki Kino | Method for producing l-amino acids by fermentation |
| WO2010080489A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-07-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Ozone treatment of biomass to enhance enzymatic saccharification |
| KR102141210B1 (ko) * | 2018-12-20 | 2020-08-04 | 대상 주식회사 | L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 l-트립토판의 생산 방법 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2076853B (en) * | 1980-04-17 | 1983-12-21 | Ajinomoto Kk | L-glutamic acid producing microorganisms |
| US4371614A (en) * | 1980-08-22 | 1983-02-01 | Ajinomoto Co., Inc. | E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan |
| JPS57134500A (en) * | 1981-02-12 | 1982-08-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Plasmid pcg1 |
| JPS57183799A (en) * | 1981-04-17 | 1982-11-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Novel plasmid |
| JPS57186496A (en) * | 1981-05-11 | 1982-11-16 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-threonine by fermentation |
| JPS58893A (ja) * | 1981-06-25 | 1983-01-06 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
| JPH0691827B2 (ja) * | 1981-12-17 | 1994-11-16 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規ベクタ−プラスミド |
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