JPH01273587A - アルカリセルラーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ａ業上の利用分野） 本発明は新規なセルラーゼに関し、更に詳細にはアルカ
リ側に最適ｐＨを有する新規なアルカリセルラーゼおよ
びその製造法に関する。

（従来の技術） セルラーゼはセルロースとその類似多糖をグルコース、
セロビオース又はセロオリゴ糖まで分解する酵素反応を
触媒する複雑な酵素系から成り、その作用機構により、
Ｃ８酵素、Ｃ８酵素、エキソ−β−グルカナーゼ、エン
ド−β−グルカナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナ
ーゼ（ＥＣ３，２，１，４）　（カルボキシメチルセル
ラーゼ（ＣＭＣアーゼ）又はＣ，セルラーゼ〕、エキソ
−β−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ３，２，１，９１）
　　（Ｃ＋セルラーゼ又はセロビオヒドロラーゼ）、β
−１，４−グルコシダーゼ（ＥＣ３，２，１，２１）　
　（セロビオース又はβ−グルコシダーゼ）などの名称
で呼ばれる酵素の総称と理解されている。長年、セルラ
ーゼ研究の歴史は専らバイオマス資源の有効利用を図る
目的から進められてきており、例えばトリコデルマ属、
アスペルギルス属、アクレモニウム属、フミコーラ属な
どのカビの類にその供給源を求めてきた。然るに、カビ
を含めて微生物起源のセルラーゼには、その構成酵素群
の作用特異性や物理化学的諸性質等の多様性が有り、そ
の実態は未だ明確化されたとは言い難い。

最近、セルラーゼの新規な産業用途として、例えば、衣
料用洗浄剤組成物の添加成分としての用途が開発されつ
つある。しかしながら、自然界において微生物の産生ず
るセルラーゼは、上述の微生物起源のものをみるかぎり
、大部分がアルカリｐＨにおいて失活する、いわゆる酸
性セルラーゼ（最適作用ｐＨが４〜６）でありて、衣料
用洗浄剤組成物の要件であるアルカリ側で最大活性を有
し、且つ耐性を有する、いわゆるアルカリセルラーゼの
存在は極めて少ないのが実情であった。

すなわち、衣料用洗浄剤組成物として使用し得るアルカ
リセルラーゼに関しては、好アルカリ性微生物起源のア
ルカリセルラーゼを生産する方法として、バチルスに属
する細菌を培養して培地よりセルラーゼＡを採取する方
法（特公昭５０−２８５１５号公報）、セルロモナス属
に属する好アルカリ性細菌を培養してアルカリセルラー
ゼ３０１−Ａを生産する方法（特開昭５８−２２４５８
６号公報）、好アルカリ性バチルスＮｏ、１１３９を培
養してカルボキシメチルセルラーゼを生産する方法（１
＋ｏｒｉｋｏｓｈｉ　ら、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、、　１３１巻、　３３３９頁（１９８５年）
〕、及びストレプトマイセス属の種を用いてアルカリセ
ルラーゼを生産する方法（特開昭８１−１９４８３号公
報）が知られているにすぎない。

（発明が解決しようとする課題〕 従って、アルカリ側において至適ｐＨを有し、衣料洗浄
用酵素としての機能を有するアルカリセルラーゼを新た
に提供することが要望されていた。

（課題を解決するための手段〕 本発明者は、アルカリセルラーゼを生産する微生物を自
然界に求め、鋭意探索を続けて来たが、今般、栃木県芳
賀郡の土壌より採取したバチルス属に属する微生物が、
衣料用洗浄剤組成物の添加成分として有効な新規なアル
カリセルラーゼを生産することを見出し、本発明を完成
した。

したがって、本発明は新規なアルカリセルラーゼ及び分
子量的に多成分性を有するアルカリセルラーゼの製造法
を提供するものである。

本発明のアルカリセルラーゼを生産する上記微生物は、
次のような菌学的性状を示す。なお、以下において菌株
の分類に用いた培地は次の培地Ａ−Ｘの２４種類であり
、これらは何れも別途滅菌した炭酸ナトリウム（Ｎａｚ
ＣＯｓ）を１．０％含有する。

使用した培地の組成（表示は重量％）二培地Ａ：バクト
ベブトン、　０．５　　、肉エキス。

０．３；バクト寒天、１．５ 培地Ｂ：バクトペプトン、　０．５　　、肉エキス。

０．３ 培地Ｃ：バクトベプトン、　０．５　　、肉エキス。

０．３：食塩、７．０ 培地Ｄ＝バクトベブトン、　０．５　　、肉エキス。

０．３；バクトゼラチン、　２０．０ 培地Ｅ：バクトリトマスミルク、　　１０．５培地Ｆ：
バクトベブトン、　０．５　　；肉エキス。

０．３；にＮＯ３，０，１ 培地Ｇ：バクトベブトン、　０．７　　、グルコース、
　０．５　、食塩、０．５ 培地Ｈ：バクトベブトン、　３．Ｑ　　、肉エキス。

０．３；チオ硫酸ナトリウム、　０．００５；塩酸シス
ティン＋、　０．０２　；クエン酸鉄アンモニウム、０
．０５．バクト寒天。

０゜５ 培地■：バタトペブトン、　１．ｓ　　；肉エキス。

０．４；乳糖、１．０　　；　＋１ｔ［、１，０、クル
コース、　１．０　　、食塩、　０．５　　、チオ硫酸
ナトリム、　ｏ、ｏｏａ　　；亜硫酸ナトリウム、０．
０４；硫酸第一鉄、　０．０２゜フェノール・レッド、
　Ｏ，ＱＯ２；バクト寒天、１．５ 培地Ｊ：バクトベブトン、　１．５　　、酵母エキス、
　０．５　　、可溶性澱粉、　２．０　。

に２ＨＰＯ４，０，１、バクト寒天、　１．５　　。

１４ｇＳＯ４・７１（２０、０、０２ 培地にニリン酸アンモニウム、　０．１　　：塩化カリ
ウム、０．０２．酵母エキス、　０．０５゜ＭｇＳＯ４
・、７Ｈ２０，０，０２；糖類、　ｉ、ｏ（濾過滅菌） 培地Ｌニリン酸−水素カリウム、　０．１　　、リン酸
二水素アンモニウム、　０．１　　、クエン酸ナトリウ
ム、　０．２；　Ｍｇ５ｏ４・７）１２ｏ。

０、Ｑ３　、食塩、　０．５　　、ブロム・チモール・
ブルー、　０．００２４；バクト寒天。

１．５ 培地Ｍ：酵母エキス、０．０５．塩酸システィン、　０
．０１．クエン酸ナトリウム。

０．３；食塩、　０．５　　、チオ硫酸ナトリウム、　
ｏ、ｏｏａ　　；クエン酸鉄アンモニウム、０．０４；
グルコース、０．０２；リン酸二水素カリウム、０．１
５．フェノール・レッド、　０．０Ｑ１２；バクト寒天
、１．５ 培地Ｎニリン酸アンモニウム、　０．１　　；リン酸二
水素カリウム、０．０５４クエン酸ナトリウム、　０．
２　　、バクト寒天、　１．５゜Ｍｇ５Ｏａ・７Ｈ，０
，０，０２ 培地０；酵母エキス、　０．０５；　ＮａＳＯ４，０，
１；にＨ２ＰＯ４，０，１；グルコース、　１．０　　
。

無機窒素源、適当量 ◆硝酸ナトリウムは０．２５％、亜硝酸ナトリウムは０
．２０２５％、塩化アンモニウムはｏ、ｉｓａ％、リン
酸アンモニウムは０．１９５％（各々０．０４１２Ｎ％
に相当）になるように加えた。

培地Ｐ：酵母エキス、　０．０５　；　Ｎａ２ＳＯｓ、
　０．１　　：ＫＨ２ＰＯ４，０，１；グルコース、　
１．０　　；無機窒素源、適当量　；ＣａＣ１，２・２
Ｈ２０゜０．０５　；　ＭｎＳＯ４”　４〜６　）１２
０．０．００１　；ＦｅＳＯ４１Ｈ２０，０，００１（
濾過滅菌）；ＭｇＳＯ４・７１（２０，０，０２（濾過
滅菌）争す硝酸ナトリウムは０．２５％、亜硝酸ナトリ
ウムは０．２０２５％、塩化アンモニウムは０．１５８
％、リン酸アンモニウムは０．１９５％（各々０．０４
１２Ｎ％に相当）になるように加えた。

培地Ｑ；キングＡ培地°゛宋研”　（宋研化学社製）、
指示量 培地Ｒ：キングＢ培地“栄研”　（栄研化学社製）、指
示量 培地Ｓ：ポテトデキストロース寒天培地“宋研”　（宋
研化学社製）、指示量 培地Ｔ：バタトベブトン、　０．２５．食塩。

０．２５　；酵母エキス、０．２５；マンニラ１−．０
．５　　；バクト寒天、２．０培地Ｕ：尿素培地“栄研
”　（宋研化学社製）。

指示量 培地Ｖ；バクトペブトン、　Ｑ、１　　、食塩、Ｑ、５
゜にＨ２ＰＯ，、０，２；酵母エキス、０．０５゜グル
コース、　０．１　　、尿素、　２．０　　、フェノー
ル・レッド、　０．００１ 培地Ｗ：バタトベブトン、　０．５　　、酵母エキス、
　０．５　　、に２）ＩｒＯ２，０，１；グルコース、
　１．０　、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，０，０２培地Ｘ
：酵母エキス、　Ｑ、５　　、グルコース。

１．０；カゼイン（バーマーシュタイ ン、メルク社製）、０．５；に２ＨＰＯ４゜０．１　　
、　ＭｇＳＯ４・７１，０．０．０２．バクト寒天、１
．５ （菌学的性状） １、顕微鏡的観察結果 末菌体は０．５〜１．２９ｍ　Ｘ　　１．５〜４．０　
μｒｎの大ぎさの桿菌であり、菌体の一端に内生胞子（
０，７〜１．２　ｔｔｔｎ　ｘ　　１．０〜２．０　μ
ｍｌを形成する。

又、周鞭毛を有して運動性があり、ダラム染色では陽性
を示す。

２、各種培地における生育状態 ■　肉汁寒天培地（培地Ａ） 集落の形状は円形であり、集落の表面は偏平状である。

又、集落の色調は白色乃至黄色の半透明であり、光沢が
ある。

■　肉汁液体培地（培地Ｂ） 生育し、混濁する。培地を中性ｐＨにすると、はとんど
生育しない。

■　７％食塩肉汁液体培地（培地Ｃ） 生育し、混濁する。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養（培地Ｄ） 生育しない。

■　リドマスミルク培地（培地Ｅ） ミルクの凝固、ペプトン化は詔められず、又培地Ｅがア
ルカリ性のため、リドマスの変色は無い。

３、生理学的性質 ■　硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地Ｆ）硝酸還元する
が、脱窒反応は陰性。

■　ＭＲテスト（培地Ｇ） 培地がアルカリ性のため、メチルレッドの変化は認めら
れない。

■　ｖｐテスト（培地Ｇ） 陽性。

■　インドールの生成（培地Ｈ） インドール産生試験用濾紙（「ニラサン」。

日永製薬社製）に対する反応、コバツクの試薬に対する
呈色のいずれに対しても陰性。

■　硫化水素の生成（培地工） 陰性。

■　澱粉の加水分解 平板寒天培地、培地Ｊを４Ｎ塩酸で酸性にしても通常の
ヨウ素反応による検出法では陰性といえる。又、液体培
地Ｋにおいても可溶性澱粉の資化性は認められない。

■　クエン酸の利用 培地に；クエン酸を利用する。

コーチ（シモンズ）のクエン酸寒天平板培地（培地Ｌ）
；生育せず、培地りから寒天を除き０．０５％の酵母エ
キスを加えた液体培地では、クエン酸の資化が認めら れる。

クリステンセンの寒天平板培地（培地Ｍ）；生育するが
、アルカリ性のためフェ ノールレッドの変化なし。

培地Ｎ；クエン酸を利用しない。培地Ｎから寒天を除き
０．０５％の酵母エキスを加えた液体培地では、クエン
酸の資化 が認められる。

■　無機窒素源の利用 培地０；硝酸、亜硝酸、アンモニアのいずれも陰性ない
し微弱である。

培地Ｐ；硝酸と亜硝酸は旺盛に資化される。

一方、塩化アンモニウムの利用性は 微弱であるが、リン酸アンモニウム は利用する。

■　色素の生、成 キングＡ培地（培地Ｑ）では生育しない。

キングＢ培地（培地Ｒ）では淡黄色を呈するが、蛍光性
はない。又、ポテトデキストロース寒天培地（培地Ｓ）
とマンニット酵母エキス寒天培地（培地Ｔ）では生育す
るが、色素の生成は認められない。

［相］　ウレアーゼ 培地Ｕ；生育せず。培地Ｕからフェノール・レッドを除
き、本面を培養後、ネス ラー試薬でアンモニアの生成を確認 したが、陰性。

培地Ｖ（クリステンセンの尿素培地に酵母エキスを添加
）；培地からフェノール・レッドを除き、本面を培養後
、ネスラー試 薬でアンモニアの生成を確認した が、陰性。培地■の尿素濃度を０．１゜０．２．０．５
．１．０．２．０％と変化させて試験しても、ウレアー
ゼ活性は陰性 を示す。

■　オキシダーゼ 陽性、陰性ははっきりしない。

＠　カタラーゼ 陽性。

■　生育の範囲（培地Ｗ） 生育温度範囲は２０〜４５℃にあり、生育最適温度範囲
は２９〜３７℃である。

培地Ｗの初発ｐｏをＮａ、ＣＯ，で変化させると、生育
ｐ８範囲は８〜１１にあり、生育最適ｐ）Ｉは９．５〜
１Ｏ９２にある。一方、Ｋ２ＣＯ２で培地のｐ）Ｉを調
整すると、生育量は著しく少なく、生育至適ｐＨは、約
９である。

［相］　酸素に対する態度 好気的。

［相］　Ｏ−Ｆテスト アルカリ性のため変色せず。好気のみ生育する。

＠　糖類の利用性（培地Ｋ） 利用できる炭素源：Ｄ−リボース、し−アラビノース、
Ｄ−キシロース、Ｄ−グ ルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラ クトース、麦芽糖、ショ糖、トレハロ ース、Ｄ−マンニット、イノジット、 グリセリン。

利用できない炭素源：Ｄ−ガラクトース、乳糖、Ｄ−ソ
ルビット、デンプン、デ キストリン、ラフィノース。

■　ガゼインの加水分解（培地Ｘ） 寒天平板培地Ｘに、菌を生育せしめ、３０％トリクロロ
酢酸処理による菌体集落周囲の透明帯形成は認められず
、カゼインの分解性は陰性と思われる。

［相］　栄養要求性 ビオチン（又はデスチオビオチン）を生育に必要とする
。

［相］　ＧＣＣ含量Ｔｍ法） 本発明にかかる菌のＧＣ含量は約３９．５ｍｏｌ蛮であ
る。

以上の菌学的性質について、バーシーズ・マニュアル・
オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロジ−（Ｂｅｒ
ｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版を参照
した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ）属の一種であると認められる。

しかし、本菌株は中性ｐＨでは生育できず、専ら高アル
カリｐＨで良好な生育を示すことから、最近、掘越と秋
葉（＾１ｋａｌｏｐｈｉ　ｌｉｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｓ″、　Ｊａｐａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５
ｏｃｉｅｔｙＰｒｅｓｓ（Ｔｏｋｙｏ）、　１９８２年
刊）の主張する、いわゆる好アルカリ性（ａｌｋａｌｏ
ｐｈｉｌｉｃ）微生物に属し、従来の中性で生育するバ
チルスと区別される。

そして、本菌株の上記菌学的性質は、公知の好アルカリ
性バチルスのいずれとも一致しないので、これを新規菌
株と判断して、バチルスエスピー　に５Ｍ−６３５と命
名し、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄
第１４８５号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４８５）として寄託
した。

本発明のアルカリセルラーゼは、例えば、上記の好アル
カリ性バチルス　エスピー　ＫＳＭ−６３’５　（ＦＥ
ＲＭ　ＢＰ−１４８５）を用いる発酵法により製造する
ことができる。

本発明方法には、上記微生物のほかに、これより高力価
の当該酵素生産性を有する各種突然変異株を使用するこ
ともできる。

本発明方法を実施するには、適当な培地を加熱等により
殺菌し、これにバチルス　エスピーＫＳＭ−６３５を接
種し、２２℃〜４０℃、好ましくは２６℃〜３７℃で、
１〜４日間振盪又は通気攪拌培養する。培地のｐＨは８
〜１１に調整するのが好ましい。培養中に発泡すること
があるが、これは適当な消泡剤を添加することによって
解消される。

培養培地としては、責化し得る窒素源と炭素源を適宜組
み合わせて含有せしめたものが使用される。両栄養源は
特に制限されず、例えば、窒素源としては、硝安、硫安
、塩安、リン酸アンモニウム、硝゛酸ソーダ、コーング
ルテンミール、大豆粉、コーンスチーブリカー、カザミ
ノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、
肉エキス、ペプトン、バイブロ、アジパワー、コーンソ
イビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ
、アジブロン、ゼストなどが；また炭素源としては、′
ａ殻、麩、濾紙、一般紙頚、おが屑などの植物繊維質、
廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ
）　、アビセル、セルロース綿、キシラン、ペクチン、
リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ａ　芽ｍ　、　ショ糖、トレ
ハロース、マンニット、イノジット、グリセリン、酢酸
、クエン酸などが挙げられる。すなわち、本発明方法で
は、ビオチン又はその話導体を含有する培地であれば、
これらの窒素源と炭素源を適宜組み合わせたいかなる培
地も使用できる。その他に、リン酸、　Ｍｇ２″″、　
　Ｃａ”、　Ｍｎ”、　　Ｚｎ”、　　Ｇｏ”、　　Ｎ
ａ◆、　Ｋ中などの無機塩や、必要であれば、無機、有
機微量栄養源を添加することもできる。

斯くして得られた培養物中から目的物買のアルカリセル
ラーゼを一！ＩＬＩｌ！、収得するには、後記実施例に
示す如く、一般の酵素の分離及び精製手段が採用される
。

例えば、培養物を遠心分離又は濾過等によって菌体と培
養濾液に分離し、その菌体及び培養濾液から通常の分離
手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒沈澱法（メ
タノール、エタノール、イソプロパツール等）などによ
って蛋白を沈澱させる方法、また限外濾過（例えばダイ
アフローメンブレンＹ０１　アミコン社製）により濃縮
させる方法などによってアルカリセルラーゼを分Ｍ採取
する。塩析法としては硫安法（３０〜７０％飽和画分）
、溶媒沈澱法としてはエタノール法（７５％濃度）が好
ましい。斯くして沈澱させたアルカリセルラーゼは？！
！過、遠心分離などによって採取し、脱塩後凍結乾燥な
どによって乾燥する。脱塩には、透析、セファデックス
Ｇ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方法が採用さ
れる。

更にアルカリセルラーゼを精製するには、例えばヒドロ
キシアパタイトクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファ
デックス又はＤＥＡＥ−セルロース等のイオン交換クロ
マトグラフィー及びセファデックス、バイオゲルのよう
な分子篩ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて行
うことができる。

斯くして得られた本発明のアルカリセルラーゼは、以下
に示すような物理化学的性質を有する。

（１）作用 本酵素は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）　に
作用するＣｘ酵素活性を有する。更に、リン酸膨潤セル
ロース、セルロース綿、アビセル、濾紙にも作用する。

セロビオース、セロオリゴ糖、人工基質であるｐ−ニト
ロフェニルセロビオシト等を若干ながら氷解する。

（２）基質特異性 アルカリセルラーゼの基質特異性の一例を第１表に示し
た。本発明のアルカリセルラーゼは、ＣＭＣに対して主
たる活性を有するが、アビセル（ＳＦ）　、濾紙、セル
ロース綿、リン酸膨潤セルロース、ペクチン（Ｃｉｔｒ
ｕｓ）　％可溶性澱粉（ジャガイモ）およびパラニトロ
フェニル−β−Ｄ−セロビオシドに対しても若干の氷解
酵素活性を有する。

第１表 孝パラニトロフェニルーβ−Ｄ−セロビオシド一方、ア
ルカリ（Ｎａｓｔｙ）膨潤セルロース、キシラン（カラ
マツ）、イヌリン（ダリャの塊茎）、カードラン（Ａｌ
ｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆｅａｃａｌｉｓｖａｒ、　ｍｙ
ｘｏｇｅｎｅｓ）　、デキストリン（トウモロコシ）及
びパラニトロフェニル−β−Ｄ−グルコシドに対しては
、はとんど氷解活性を有しない。

（３）作用ｐｏ及び至適作用ｐ）１ 本酵素の作用ｐＨは４〜１２、至適作用ｐ）Ｉは火元９
〜１０である。

（４）安定ｐ）ｌ ｐＨの異なる緩衝液の下、４０℃で１０分間及び３０分
間放置した時の安定＋１）１は、それぞれ４．５〜１０
．５及び６．８〜１０である（第２図）。５℃で放置す
ると、ｐＨ４〜１１で少なくても一ヶ月は安定である。

（５）作用温度範囲及び作用至適温度 本酵素は低温で１０℃、高温で６５℃の広い範囲で作用
するが、グリシン緩衝液（ｐｔ（９）の下で２０分間反
応させた時の作用至適温度は約４０℃である（第３図）
。

（６）熱安定性 グリシン緩衝液（ｐＨ９）の下で、各温度で２０分間加
熱処理した結果、本酵素は約４０℃では全く失活せず、
６０℃で約５０％、７０℃で約２５％の残存活性を有す
る（第４図）。

（ア）酵素活性測定法 ■　ＣＭＣアーゼ活性 （：ＭＧ（２，５％）　０．２ｍｆｔ、　０．５Ｍグリ
シン緩衝液（ｐＨ９，０）　０．１＋ｎｆｌ及び脱イオ
ン水０．Ｉｎ＋４２からなる基質溶液に酵素液０．１ｍ
ｊｌを加え、４０℃、２０分間反応させ、反応後、３゜
５−ジニトロ−サリチル酸（ＤＮＳ）法にて還元糖の定
量を行った。すなわち、反応液０．５ｍｕにｌｌｌＮ５
試薬１　　ｍＪＺを加え、５分間１００℃で加熱発色さ
せ、冷却後、４．５ｍＡの脱イオン水を加えて希釈し、
これを波長５３５ｎｍで比色定量した。酵素力価は、上
記の条件下で１分間に１μｍａｆｌのグルコースに相当
する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

■　ｐ−ニトロフェニルセロビオシド分解活性 １００μｍｏＩＬリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）、０、ｌ
　μｍｏｎ　ｐ−ニトロフェ、ニルセロビオシド（シグ
マ社）を含む反応Ｑｉ１．Ｏｍｕ中に適当量の本酵素を
３０℃で作用させた後、１ＭＮ８２ＣＯｓを０．３ａ＋
Ｑ、脱イオン水を１．７ｍｆｔ順次加え、遊離するｐ−
ニトロフェノールを４００ｎｍで比色定量した。この条
件で１分間に１μｍｏｊｌのｐ−二トロフェノールを遊
離させる酵素量を１！＃位とした。

■　アビセラーゼ及びＦＰアーゼ活性 アビセル（メルク社）又は塊状にした幅０．５ｃｍ　、
長さ５ｃｍの濾紙片（セルラーゼ活性度検定用濾紙、東
洋Ｎｏ、５１−特）２０ｍｇを水０．８ｍ℃に加えたも
の、０．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９，ｏ）　０．４ｍ
ｆ１．、及び脱イオン水０．４ｍ、ｔ２からなる基質溶
液に酵素液０．４ｍｆｔを加え、４０℃で２０分間反応
させた。この反応液を、■のＣＭＣアーゼ活性の測定と
同様に操作してアビラーゼ及びＦＰアーゼ活性を測定し
た。この条件で１分間にグルコース換算で１μｍｏＩｌ
の還元糖を遊離させる酵素量を１車位とした。

■　その他の活性は、■に準じて測定した。

■　蛋白定量法は、バイオ・ラド　プロティン　アッセ
イ　キット（バイオ・ラド社）を用いて、生血清アルビ
ミンを標準蛋白として算出した。

（８）キレート剤の影響 洗浄剤用酵素として、その反応組成物であるビルダーの
中でキレート剤に対する耐性は最も重要な因子である。

アルカリセルラーゼをＥＤＴＡ　（０，５ｍＭ）、ＥＧ
ＴＡ　（０，５ｍＭ）、ＮＴＡ　（０，５ｍＭ）、ゼオ
ライト　（Ｏ，ＯＳ％）、トリポリリン酸（（１，（１
５％）で前処理した後、残存活性を測定したところ、全
く阻害は認められない。

（９）プロテアーゼの影響 洗浄組成物として、プロテアーゼは洗浄力を向上せしめ
る作用がある。従フて、プロテアーゼ入り洗浄剤にセル
ラーゼを共存させて、更なる洗浄力の向上を求めるのは
当然である。このためには洗浄剤用セルラーゼがプロテ
アーゼで加水分解せず、活性が安定に保持される要件を
みたす必要がある。アルカリセルラーゼは実用されてい
る洗浄剤用プロテアーゼ（例えば、ＡＰＩ−２１、マク
サターゼ、アルカラーゼ等）や一般のプロテアーゼ（例
えば、パパイン、トリプシン、プロナーゼ）に対して強
力な耐性を有している（第２表）。

第２表 で３０分間前処理した後、算定した。

（ｌＯ）金属等の影響 適当な濃度の２価の金属イオン（Ｈｇ２“、にｕ”等）
は阻害効果を与える。モノヨード酢酸、パラマーキュリ
安息香酸によって若干の阻害を受ける。

（１１）界面活性剤の影響 アルカリセルラーゼは０．５％の各種界面活性剤、例え
ば、線状アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡ
Ｓ）　、アルキル硫酸エステルナトリウム塩（ＥＳ）、
ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩
（ＥＳ）、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム（ＡＯ
５）、α−スルフォン化脂肪酸エステルナトリウム塩（
α−５ＦＥ）、アルキルスルホン酸ナトリウム（５ＡＳ
）、ポリオキシエチレンセカンダリ−アルキルエーテル
、脂肪酸塩（ナトリウム塩）及びジメチルジアルキルア
ンモニウムクロライド等の界面活性剤によって殆んど活
性阻害は受けない。

（１２）　　分子量 本発明のアルカリセルラーゼの分子量は、分子篩ゲルク
ロマトグラフィーによれば、約３万、４．５万、９万、
１５万、１８万、２１万、２４万または３０万である。

本発明にかかる微生物は、このように分子量的に多成分
性のアルカリセルラーゼを生産する。この分子量的多成
分性は、　（１）高分子量セルラーゼが分解されること
によるものか、　（１１）個々が異種蛋白であるか、　
（１１ｉ）低分子量セルラーゼの会合によるものか、　
（ＩＶ）異種蛋白の会合によるものかのいずれかによる
ものであると考えられる。本酵素は、ポリアクリルアミ
ド電気泳動的に単一なＣＭＣアーゼＩ（分子量１４５，
０００±１０，０００）とＣＭＣアーゼＩ■（分子量１
７０，０００±２０，０００）　　（特願昭６１．２５
７７７７号および特願昭８１−２５７７７８号）を含有
するが、通常の５０５電気泳動を行うと第６図に示した
ように、更に３０，０００±２，０００〜１２０，００
０±１５，０００の範囲に入る分子量の蛋白が多数階段
状（ｌａｄｄｅｒ）に染色される。一方、アルカリセル
ラーゼの標品をポリアクリルアミド電気泳動にかけた後
、ＣＭＣとコンゴーレッドを含む寒天平板にレプリカさ
せると、ＣＭＣアーゼ活性部位は少なくとも５個以上の
透明帯として検出される（第７図）。第７図は、本発明
のアルカリセルラーゼの多成分性を示すものである。

上記した、本発明のアルカリセルラーゼの諸性質を公知
のセルラーゼと比較すれば次の通りである。

木アルカリセルラーゼは、高ｐｌ（領域に最適ｐ８を有
するものであり、トリコデルマ属、ペニシリウム属、ア
スペルギルス属（西沢−俊、「セルラーゼ」　（東京南
江堂、昭和４９年刊））、アクレモニウム属（特公昭５
９−１８８０８１号）、フミコーラ属（特公昭６１−１
６３１６号）などに代表されるカビの中性ないし酸性側
に最適ｐＨを有するセルラーゼと区別される。

また、特公昭５０−２８５１５号に開示のアルカリセル
ラーゼと比較した場合は、本アルカリセルラーゼが分子
量的に３０万〜３万の少なくとも５種以上の多成分性を
有するものであるのに対し、上記セルラーゼの分子量が
１，５万ないし３万、バチルスＮｏ、１１３９のセルラ
ーゼの分子量が９．２万である点並びに他の物理化学的
性質が異なる点において明らかに区別される。

〔作用及び発明の効果〕

本発明のアルカリセルラーゼは、ｐＨ１ｌにおいても最
適ｐＨの約７５〜８０％の相対活性を有しており、過去
に研究されたアルカリセルラーゼの中でも最もアルカリ
側で充分活性が発揮される酵素群であることがわかる。

又、最適ＰＨが高アルカリ側に強く発揮されるにも拘ら
ず、ｐＨ４前後の強酸性側でも活性を有するという点で
も特異的である。このように広いｐＨ領域において安定
なセルラーゼは従来存在しないものである。また、この
ものは低温でも充分活性を発揮する特徴を有する。更に
、界面活性剤及びキレート剤や、各種プロテアーゼに対
して強力な耐性を併せ有するアルカリセルラーゼは本発
明により初めて提供されるものである。

したがって、本発明のアルカリセルラーゼは、衣料用洗
浄剤添加酵素を始め、バイオマスその他の用途に有効に
利用することができるものである。

〔実施例〕

次に参考例及び実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
する。

参考例１゜ 栃木県芳賀郡市貝町の土壌１ｇを滅菌生理食塩水１０　
ｍｌに懸濁し、８０℃で３０分間熱処理した。この熱処
理液を適当に希釈してマスタープレート〔肉エキス（オ
キソイド社製）１％、バタトベブトン（デイフコ社製）
１％、ＮａＣｎ　１％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、Ｎａ２
ＧＯ３０，５％、バクト寒天１．５％〕に塗抹し３０℃
で３日間培養し、集落を形成させた。レプリカ法により
、マスタープレートと同じ組成の培地に２％ＣＭｃを加
えた滅菌寒天培地に穆植し、３０℃で３〜４日間培養し
て集落を形成させた後、コンゴーレッド色素溶液を流し
込み、寒天が赤色化した中で周囲が染色されない集落を
検出した。当該する集落をマスタープレートから選出し
、高力価ＣＭＣアーゼ生産菌をスクリーニングした。

上述の手法により、本発明のバチルス　エスピー　ＫＳ
Ｍ−６３５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４８５）を取得するこ
とができた。

叉ｍｉｌ＋Ｎユ バチルス　エスピーにＳＭ−６３５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−
１４８５）を１．５％肉エキス、０．５％酵母エキス、
１％ＣＭＧ　、　０．１％ＫＨ，Ｐ０４と０．７５％Ｎ
ａ２ＣＯ３からなるン夜体培地中で、３４℃にて２日間
好気培養した。

その培養土清液ＩＩＬに対して３℃の冷エタノール（−
１０℃）を徐々に加えて蛋白沈澱を生じさせ、得られる
沈澱物を最小量の滅菌脱イオン水に溶解し、希酢酸で中
和した後、流水に対して１５時間透析し、凍結乾燥粉末
としてアルカリセルラーゼ９．８ｇを得た。

実施例２゜ ＣＭＣ１％、ポリペプトン２％、にＨ２ＰＯ４０，１％
、酵母エキス０．１％、Ｎａ２ＣＯ３０，７５％を含む
培地１００ｍ１を５００ｍｕ容三角フラスコに入れ、常
法により殺菌後、バチルス　エスピーＫＳＭ−６３５（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４８５）を接種し、３０℃で４日間
振盪培養した。培養後、遠心分離により菌体を除去した
上清についてＣＭＣアーゼ活性を測定した結果、３　、
１．００単位／ｆＬであった。

この上清を実施例１と同様に処理してアルカリセルラー
ゼ９，２ｇを得た。

実施例３゜ ＣＭ　Ｃを４％庶糖におきかえ、実施例２に従ってバチ
ルス　エスピーＫＳＭ−６３５（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１４
８５）を３０℃で２日間振盪培養する操作を４回行い、
それぞれの培養液を遠心分離して、上清標品Ｉ、ＩＩ、
ＩＩＩ、ＩＶを得た。あらかじめ調製してありたセファ
クリルＳ−３００のカラム（１，Ｏｘ　１１５ｃｍ）を
用い、これらの標品を個別にゲル濾過（流速１３　　ｍ
Ｉｌ／　ｃｍ２・ｈｒ）　Ｌ／、溶出活性画分と分子量
の相関を観察した。標準蛋白として、フェリチン（分子
量４４０，０００）　、カタラーゼ（分子量２３２．０
００）、アルドラーゼ（分子量１５８，０００）　。

アルブミン（分子ｉ６７．０００）　、オバルブミン（
分子量４３，０００）　、キモトリフロシノーゲンＡ（
分子量２５，０００）　、　　リボヌクレアーゼＡ（分
子−１３Ｈ１３，７００）を用いて、溶出量と分子量の
関係を示す標準曲線を作製した。その結果、第５図に示
すようなアルカリセルラーゼの溶出プロフィールを得た
。

実施例４゜ 実施例３と同様にして上清液Ａ、Ｂ、Ｃを得た。この上
清液Ａ、Ｂ及びＣを１２％ポリアクリルアミドゲル（７
，３ｘ　１０．３ｃｍ）を用いてスラブ電気泳動（定電
流２０ｍＡ）を行った後、ゲルを２％ＣＭＧ　、　　１
００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩マ對イ夜（ｐＨ９，０）
及び５００　ｍＭ　ＮａＣ１を含む０．８％の寒天平板
上にレプリカした。これを３０℃で１時間保温した後、
ゲルをはずした寒天平板をコンゴーレッド法に従って１
　ｍｇ／−ｍｆｌコンゴーレッド水溶液で１５分間染色
し、更に１．　Ｍ　ＮａＣｆ１水溶液で１５分間洗浄す
ることによってセルラーゼのザイモダラムを得た（第７
図）。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明アルカリセルラーゼの反応ｐ）Ｉと相対
活性を示す図面、第２図は熱処理ｐＨと残存活性の関係
を示す図面、第３図は本発明アルカリセルラーゼの反応
温度と相対活性の関係を示す図面、第４図は処理温度と
相対活性の関係を示す図面、第５図はセファクリルＳ　
−３００ゲルクロマトグラフイー法における分画と活性
の関係を示す図面、第６図はアルカリセルラーゼ成分の
ＣＭＣアーゼＩとＣＭＣアーゼＩＩのＳＤＳ電気沫動の
結果を示す図面、第７図は本発明のアルカリセルラーゼ
をスラブ電気泳動した後、ＣＭＣとコンゴーレッドを含
む寒天平板にレプリカして得られる透明帯を示す活性染
色の図面である。 以　　上 第１図 第２区 熱処理ｐＨ 第３図 反応温度（０Ｃ） 処理温Ｋ　（’Ｃ） 溶出量（罰） 第６図 分子量マーカー　　Ｉ＋　　　１　　　　分子量で一つ
−２０００００−コ ロ２乙 ＋ ＝；ｔｘｘｖ：ｘ　１−３１０００ ＢＰＢ　　−−□ 第７図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の物理化学的性質を有するアルカリセルラーゼ。 （１）作用 カルボキシメチルセルロースに作用するＣ＿ｘ酵素活性
   を有するほか、弱いＣ＿１酵素活性、β−グルコシダー
   ゼ活性を有する。 （２）基質特異性 カルボキシメチルセルロース、セルロース 綿、アビセル、濾紙、セロビオース及びｐ−ニトロフェ
   ニルセロビオシドに対して作用する。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ 作用ｐＨは４〜１２、至適ｐＨは９〜１０である。 （４）安定ｐＨ ４０℃で１０分間及び３０分間放置した時 の安定ｐＨはそれぞれ、４．５〜１０．５及び６．８〜
   １０である。 （５）作用温度範囲及び作用至適温度 １０〜６５℃の広い範囲で作用するが、作 用至適温度は約４０℃である。 （６）キレート剤の影響 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＴＡ、ＳＴＰＰ及びゼオライト
   は活性を阻害しない。 （７）界面活性剤の影響 線状アルキルベンゼスルホン酸ナトリウ ム、アルキル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエ
   チレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフ
   ィンスルホン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エ
   ステルナトリウム塩、アルキルスルホン酸ナトリウム、
   ポリオキシエチレンセカンダリーアルキルエーテル、脂
   肪酸ナトリウム及びジメチルジアルキルアンモニウムク
   ロライド等の界面活性剤によって殆んど活性阻害は受け
   ない。 （８）プロテアーゼの影響 プロテアーゼに対し、強い耐性を有する。 （９）分子量 分子篩ゲルクロマトグラフィーによる分子 量は約３万、４．５万、９万、２１万、２４万または３
   ０万である。 ２、バチルスエスビーＫＳＭ−６３５の培養物より分離
   取得されたものである特許請求の範囲第１項記載のアル
   カリセルラーゼ。 ３、バチルス属に属し、エンドセルラーゼ （ＣＭＣａｓｅ）活性として分子量的に多成分性を有す
   るアルカリセルラーゼを生産する微生物を培養し、その
   培養物から該アルカリセルラーゼを取得することを特徴
   とするエンドセルラーゼ（ＣＭＣａｓｅ）活性として分
   子量的に多成分性を有するアルカリセルラーゼの製造法
   。