JPH01273592A - 新規な抗生物質カムノシンおよびその生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、カム／シンと称される新規な抗生物質、Ａ　
Ｄ　Ｓ　Ｍ　４３２９として１９８７年１２月２３日に
Ｄｅｕｔｓｏｈｅ　８ａｎｍｌｕｎｇ　ｆｕｒ　Ｍｉｋ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ドイツ微生物コレクション
）に寄託されたストレプトミセス菌ｆｍＹ−８４，３６
２１０からのその生産方法、その変異菌または突然変異
菌および薬剤としてのカム／シンの使用に関するもので
ある。

ス）Ｌ／ブトミセスｍ種Ｙ−８４，３６２１０は、イン
ド、マハラストラ、ポーチで果めた土壌試料カラ単８　
サｈりｏ　ｊ９１ｍＡＨＩＬ　Ｙ−８４，３６２１０の
変異菌および突然変異菌は、既知の方法で例えばＮ−メ
チル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジンまたは紫
外線のような変異誘発要因の使用によって得ることがで
きる。微生物ストレプトミセス菌種Ｙ−８４，３６２１
０は、放射菌目のストレプトミセス科のストレプトミセ
ス属に属する。

ストレプトミセス菌４Ｙ−８４，３６２１０は、以下の
記載から明らかであるように、若干の形態学的、培養学
的および生理学的性質において既知の菌株と異なるため
に、新規な菌株とみなされる。それが新規な菌株とみな
される他の理由は、それが本発明が関係するカム／シン
と称される以下の記載において示した特性を有する新規
な抗生物質複合体を生産するということである。

本発明の以下の詳細な記載から明らかであるように、本
発明のカム／シンは、はプチド抗生物質であるけれども
、アクチノマイシン、ピリドグリセイン、パリノマイシ
ン、チノマイシン、サイクロスポリン、ポリミキシンま
たはアムホマイシンのようなすべての既知のペプチド抗
生物質と異なっている。他の既知のペプチドまたはペプ
チド−含有抗生物質とは著しく異なって、カム／シンは
抗菌作用を示すために少なくとも約１０ｍＭのカルシウ
ムイオンを必要とする。これは、抗菌作用を示すために
必要なカルシウムイオンの必要量がより低い１．０ｍＭ
であるアムホマイシン、ダルママイシン、ザオマイシン
およびＡ２１９７８Ｃａ合体のような他の既知の抗生物
質とは著しく異なっている。アムホマイシン、ダルママ
イシンおよびザオマイシンは、フロリダのボカラトンの
ＣＲＣ社のジャノス・バーデイ著の”　ＣＲＣＨａｎｄ
ｂｏｏｋ　ｏｆ　ａｎｔｉｂＬｏｔｉｏ　ｏｏｍｐｏｕ
ｎｄｓ”■巻１部３１３−３２７頁（１９８０年）に述
べられている環式リボペプチド抗生物質の級に属する。

同様に、環式リボぼプチド抗生物質であるＡ２１９７８
（４合体はＪ、　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｏｓ　４０巻７６
１−７７７頁（１９８７年）に記載されている。

更に、本発明は、好気的条件下において好適には約６と
９との間のｐＨの炭素、窒素源および鉱物質を含有する
水性栄養培地中で好適には約１８℃と６７℃との間の温
度でストレプトミセス菌種Ｙ−８４，５６２１０、また
は、その変異菌および突然変異菌を培養しそして抗生物
質複合体を栄養培地から得ることからなる新規な抗生物
質偵合体力ムノシンの生産方法に関するものである。

本発明の新規な抗生物質は、試験・Ｕ内で、カルシウム
イオンの存在下においてのみであるが、多数のグラム−
陽性菌に対して活性である。同様に、それは免疫モジュ
ーレーター物質（ｉｎｍｕｎｏ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ
　５ｕｂｓｔａｎｃｅ　）として活性でありそしてそれ
故にヒト医薬に使用することができる。

更に、本発明は、既知の方法で好適には約６．５と８．
５との間のｐＨを有する栄養浴液の使用を必要とする土
壌からのストレプトミセス菌種Ｙ−８４，３６２１００
単離方法に関するものである。

土壌からの微生物の単ＲＫ対して使用される栄養溶液は
、炭素および窒素源および無機栄養塩および固化剤から
なる。好適な炭素源の例は、グルコース、澱粉、デキス
トリン、グリセロール、シュクロースまたは糖蜜である
。好適な窒素源は、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、
麦芽エキス、カゼインまたはアルギニンまたはアスパラ
ギンのようなアミノ酸である。使用できる固化剤の例は
、寒天である。適轟なそして好適な無機栄養塩は、燐酸
または硫酸のナトリウム、カリウム、マグネシウムまた
はカルシウム塩である。

本発明の微生物は、分枝した基菌糸から無色の気菌糸が
突出している。胞子のスパイラル鎮が気菌糸上に形成さ
れる。スパイラルは、１ｊｌｉ状である。ＲＡセクショ
ンを示す胞子の短鎖は、同様に１普通である。輪生体ま
たは子のう胞子の形成は、何れも観察されない。胞子の
成熟頑は、１瑣当り３０〜５０の胞子を有している。種
種な寒天培地上で培養した場合の微生物の性質は以下の
通り記載される。〔英国のロンドンのオキソイドリミテ
ッドによって発行されたＴｈｅＯｘｏｉｄ　Ｍａｎｕａ
ｌ　（１９７２年、第２版）または米国のミシガン州の
デトロイトのシフフラボラドリーズによって発行された
Ｄｉｆｃｏ　Ｍａｎｕａｌ　（１９７７年、第９版）を
参照されたい〕。

１、酵母エキス／ｉ芽エキス苺天 生長：良好、毛皮状、乾燥している 気菌糸：良好、粉状、淡い帯青色の灰色底　ｌｆｉ：黒
色／紫色 ｏＪ溶性色素：褐色／紫色 ２、オートミル寒天 生　長：豊５１平担、乾燥している。

気菌糸：豊ｄ１粉状、淡灰色 底　而：暗褐色／紫色 可溶性色素：褐色／索色 ６、無機塩／殿粉寒天 生　長：豊冨、もりあがり、乾燥している。

気菌糸：良好、粉状、淡い帯青色の灰色底　面：暗い帯
黒色の紫色 可溶性色素：淡いふじ色４ ４、グリセロール／アスパラギンキ天 生　長：良好、もりあがり、乾燥している。

気菌糸：良好、粉状、帯灰色のピンク色底　面：黒色／
紫色 可溶性色素：淡い帯紫色の褐色 ５、スプトン／酵母エキス／鉄寒天 生　長：良好、毛皮状、湿っている。

気菌糸：なし 底　面：黒 可溶性色素：淡褐色 ＆チロシン寒天 生　長：豊ｇ１毛皮状、乾燥している。

気菌糸：豊謬、粉状、淡い帯灰色の９色底　面：暗い帯
黒色の紫色 可溶性色素：淡い帯褐色の“紫色 Ｚシュクロース／硝酸塩寒天 生　長：豊謬、平担、乾燥している。

気菌糸：良好、粉状、淡い帯−４色の灰色Ｊ戊　而：淡
黄色 １２Ｔ溶性色索：淡紫色 ８、ペプトン／肉エキス寒天（栄ＡＶ天）生　長：中程
度、もつあがり、乾燥している気菌糸：軟弱、粉状、暗
灰色 底　而：帯灰色のピンク色 可溶性色素ニー 可溶性色素は、ｐＨ指示薬であり、それは酸性培地中で
帯ピンク色の赤色となりそしてアルカリ性範囲で帯青色
の紫色となる。

本発明の微生物が生長する最適の温度範囲は、約２５〜
３５℃である。微生物は、グルコース／にプトン／ゼラ
チン培地中でゼラチンを液化し１無機塩／殿粉寒天中で
殿粉を加水分解しそして脱脂乳を凝固する。ストレプト
ミセス菌種Ｙ−８４，３６２１０は、ツアはツク寒天溶
液（０：ｃｏｉｄＭａｎｕａｌを参照された）上でよく
生長する。

暗色の色素の非常に貧弱な形成がチロシン寒天にお−・
てのみ観察される。はプトン、酵母エキス、鉄寒天また
はトリプトン／酵母エキスプロスにおいて色素形成はな
い。

炭素源に対するこの微生物の同化図式（ブリドハムーゴ
ットリーブ培地中における）は、以下の通りである。

陽性：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロ
ース、１−イノシトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−フラ
クトース、ラムノース、カラクトース、マルトース、七
ロビオース、グルタミン酸ナトリウム、マンノース、ラ
クトース 凝わしい；シュクロース、サリシン 陰性：ラフイノース、セルローズ、ジュルシトール ストレプトミセス菌、ｄＹ−８４，３６２１０は、１．
６μｇ／ｍ１以上の濃度のストレプトマイシンによつ工
阻害され、約７〜１０チのＮａＣ２濃度を許容しそして
約５．５〜９０のｐＨ許容範囲を有す。

既知の微生物の培養学的および生理学的性質について発
表されたデータは、本発明による微生物とは顕著な差異
を示す。

更に、ストレプトミセス菌種は、それを醗酵させた場合
に、新規な抗生物質複合体力ムノシンを生産する。

前述した観察に基づき、本発明の微生物は新規なストレ
プトミセス菌種としてみなすことができる。

当業者に自明であるように、本発明は、前述した特定の
微生物に限定されるものでなく、前述した微生物から誘
導されたそして新規な抗生物質複合体力ムノシンを形成
する能力を有するすべての自然および人工の突然変異菌
および変異菌を包含する。

更に、本発明は、好気的条件下において炭素および窒素
源および無機栄養塩およびホ櫨の元素を含有する栄養培
地中で好適には約６．０〜９０　　　゛のｐＨでそして
好適には約１８〜６７℃の温度で１４によりストレプト
ミセス菌種ｙ−８４，５６２１０を培養しそして本明細
書に記載するように既知の方法で化合物を培養プロスか
ら単離することからなるカムノシンの生産方法に関する
ものである。

新規な抗生物質の製造に使用される栄養培地の」当な且
つ好適な炭素源の例は、グルコース、殿粉、デキストリ
ン、グリセロール、シュクロース、糖蜜または油である
。新規な抗生物質の製造のための栄養培地中の適当な且
つ好適な窒素源は０、大豆粉、酵母エキス、肉エキス、
麦芽エキス、とうもろこし浸出ｉ＆　、ペプトンまたは
カゼインである。新規な抗生物質の製造のための栄養培
地に使用される適当な無・餞栄Ａ塩／鉱物質塩は、好適
には、塩化す）　ＩＪウム、硫酸マグネシウム、硫酸ア
ンモニウムまたは炭酸カルシウムである。好適に使用さ
れる微量の元素は、鉄、マンガン、Ｍ、ｊＪｆｊ−鉛ま
たはコバルトである。

本発明の好適な実施、態様においては、ストレプトミセ
ス菌種ｙ−８４，３６２１０は、約２６〜２８°Ｃおよ
び約６．４〜６．６のｐＨで培養される。化合物のもつ
とも高い収］は、醗酵を約４０〜４５時間持続した後に
得られる。醗酵は、好適には、深部醗酵の形態で行われ
る。醗酵の進行過程および新規な抗生物質痩合体の形成
は、３０ｍＭの塩化カルシウムを含有する寒天培地中に
おけるスタフイロコツ力スオーレウス２０９ＰＫ対する
培養液体および菌糸の抗菌活性によって追跡することが
できる。

適当である場合は、培４菌の醗酵中に例えばデスモフエ
ン（Ｒ）　（レバークセンのバイエル社カらのポリオー
ル）のような旧止め剤を栄養培地に添加することができ
る。

カムノシンは、例えば適当な吸着剤上の直接的な）吸着
によってまたは溶剤抽出次いで吸百によって培養ブロス
から得ることができる。好適な溶剤は、酢酸エチルまた
はクロロホルムとｎ−プロパツールとの混合物ありそし
て特に好適なものは、酢酸エチル／ｎ−プロパツール混
合物（２：１）である。例えば、培養ｆ１ダまたは本発
明の化合物を含有する培」よＰ液の溶剤抽出液を、活性
炭、例えばダイアイオン（Ｒ）ｕｐ−２ｏ　（８本国の
三菱化成工業）またはアンバーライト（Ｒ）ＸＡＤ　（
米国のローム・アンド・ハス社の４Ｏ−２２５Ｘ１０　
　ｍの平均孔直径を有するポリスチレン、アクリレート
またはアミンオキシドのマトリックスからなる重合体吸
着剤）のような重合体ＶＡ着剤上に１吸着させることが
できる。溶剤抽出液は、好適には、濃縮して沼バ１］を
除去しそして次に吸着剤上でクロマトグラフィー処理す
る。本発明の化合物を、例えば、クロロホルム、メタノ
ールまたはアセトンのような適当な移動…を使用してま
たはこれらの溶剤の相互の混合物またはこれらの溶剤と
水との混合物を使用してｌＪ＆着剤から溶通しそして次
に溶離液を蒸発乾固することができる。好適に使用され
る溶離液は、メタノールである。

カムノシンは、また、イオン交換クロマトグラフィーの
使用によって培養戸液から単離することもできる。適当
な樹脂の例は、例えばダウエックス（Ｒ）（米国のダウ
ケミカル社）またはアンバーライ−）工ＲＡ６８（米国
のローム・アンド・ハス社）のような弱塩基性ポリスチ
レン、ポリアミンまたは交叉結合したアミノアルコール
ポリアクリレート型の陰イオン交換樹脂である。好適に
使用されるイオン交換体は、アンバーライト（Ｒ）ＩＲ
Ａ　６　Ｂ　（アクリル型、第６級アミン官能性）であ
る。この方法においては、好適には、陰イオン交換樹脂
であるアン・ζ−ライト（Ｒ）ＩＲＡ６８　（Ｃ１−）
を使用して培養１Ｐａをカラムクロマトグラフィーに受
けしめる。本発明の化合物を、初期にイオン交換体に吸
着させそして次に例えば水性またはメタノール件塩化す
）　ＩＪウムまたは塩化カリウム溶成または捕塩酸また
は水酸化す）　ＩＪウム溶液のような適当な移動相を使
用して溶離する。好適には、２Ｍ　ＮａＣ２溶液が使用
される。活性な溶離液を合しそして前述した吸着クロマ
トグラフィーを使用して塩を除去することができる。塩
を除去しそしてこのＺ法で得られた活性溶離液を集めそ
して濃縮する。

前述した濃縮されたカムノシンー含有溶離液を、更に、
種々な方法で精製することができる。

例えば、活性炭、例えばアンパーラライト（Ｒ）ｎＤ−
４（平均孔直径４０Ｘ１０　　ｍのポリスチレンマトリ
ックスからなる）および７（米国のローム・アンド・ハ
ス社の平均孔直径９０Ｘ１０　　ｍのアクリレートマト
リックスからなる）、ダイアイオン（Ｒ）ＨＰ　−２０
（日本国の三菱化成工業）のような重合体吸着剤を使用
する再吸着および溶離、例えばセファデックス（Ｒ）Ｌ
Ｈ−２０およびａ−系ゲル（スエーデンのファルマシア
・ファイン・ケミカルスＡＢ　）および均等な物質のよ
うな親油性ゲル濾過物質によるゲル濾過ならびに例えば
セファデックス（Ｒ）ＤＥＡＥゲル（スエーデンのファ
ルマシア・ファイン・ケミカルスＡ３）のようなジエチ
ルアミノエチル（ＤｇＡＥ　）官能性を有するゲルによ
るイオン交換ゲル濾過およびアルミナおよびシリカゲル
上の吸着クロマトグラフィーを、更に精製するために満
足に一緒にすることができる。更にまた、シリカゲルお
よび変性したシリカゲル０１８（例えばオクタデシルト
リクロロシランとシリカゲルとの反応によって得ること
ができる）のような適当な吸着剤および適当な溶離剤を
使用する薄層クロマトグラフィー、中圧および高圧液体
クロマトグラフィーを使用することもできる。前記の目
的は、更に、限定された溶剤系を使用する向流クロマト
グラフィーによって満足に達成される。

カムノシンは、無色の無定形の粉末であって、これは水
、メタノール、エタノール、プロピレングリコールおよ
びジメチルスルホキシドに可溶性である。それは、アセ
トン、塩化メチレン、酢酸メチレン、酢酸エチル、クロ
ロホルム、ヘキサンおよび石油エーテル（４０〜６０’
）に離溶性または不溶性である。それは、ニンヒドリン
色試験において陰性反応を示す。

以下に示す１１１４クロマトグラフイー（ＴＬＣ）系に
おけるカムノシンに対する一値は、以下の通りである。

ＴＬＣプレート：予１１ｉｉ１１！したシリカゲルプレ
ート、ダルマスタットのＥ、メルクがらのＡｒｔｉｏｌ
ｓＡ５５５４゜ ＥｔＯＡｃ：ＭｅＱＨ：Ｈ２Ｏブタ／−ル：ＡＯＯＨ：
Ｈ２Ｏ４：　　４　：１　　４：４：１ カムノシンＲｆｏ、４７０．６９ 第１図は、移動相：　ＥｔＯＡｃ！ＭｅＯＨｉＨ２０（
４：　４　：　１　）を使用したＴＬＣを示す。２５４
　ｎｍで検出。

第２図は、分析用の間圧液体クロマトグラフ−（ＨＰＬ
Ｃ）を示す。Ｅ（ＰＬＯは以下の通り実施された。

カラムバッキング：　０ＤＳ−ハイパーシル（Ｒ）（１
０μ、４Ｘ１２０ｆｌ）（米国のシャントンがらのオク
タデシルトリクロロシラ７基を有 するＨＰＬＣ物質） 流速：　　０．５ｍ／／分 検出：２３４ｎｍ 溶剤：　ＭｅＯＨ：　１１強度の水性酢Ｍ（ｓｓ：４５
）カムノシンは、２７ｏ℃（分解）の融点を有す。

カムノシンに対する分光分析データは、以下に記載する
通りである。

１　約２２４．２８０および３４５　ｎｍにおけるメタ
ノール中のＵＶｍａｘ−第３図を参照されたい。カムノ
シンのＵＶ吸収極大は、１を肖り０．２７の１度で」定
した。１吸収スはクトルは、エビコン８１ｏスペクトロ
ホトメーターを使用して２００〜８００　ｎｍの範囲で
記録した。

２、　　ＩＲスペクトル（ＫＢｒディスク）は、バーキ
ン・エルマーＰ、Ｅ、５２１スにクトロメーターヲ使用
して記録したー第４図を参照されたい。

前述した分光分析データおよび実施例６に記載した分光
分析の分析は、カムノシンが関連したはプチド抗生物質
の複合体であることを示す。

カムノシンの独特の特性は、それがカルシウムイオンの
存在下においてのみグラム−陽性細菌に対するその抗生
物質の作用を示すということである。例えばナトリウム
、カリウム、バリウム、ルビジウムおよびマグネシウム
のような他の金属イオンは、同じ効果を有しない。これ
は、少なくとも約１０ｍＭの塩化カルシウムを含有する
寒天培地中でカムノシンを試験する理由である。

前述したカルシウムに膓んだ寒天培地中における試験管
内のカムノシンは、感受性および耐性のスタフイロコツ
力スオーレウスおよびストレプトミセスフエー力リス菌
株に対しておよびバチルスサブチリス、サルシナルテア
、ストレプトコッカスピオゲネスおよびミクロコツカス
ルテウスに対して作用を示す。種々の微生物に対スるカ
ムノシンの最低阻止濃度（ＭＩＣ’）を、測定した。結
果は、次の第１表に示す通りである。

免疫モジューレーテイング作用 カムノシンの免疫モジュレーティング作用は以下のよう
にして試験した。

溶血プラーグ試験（ＰＦＣ） １６〜１８ｇの体重を有する雌のスイスマウス（１群当
り６匹）を羊の赤血球（５Ｘ１０８細胞）の腹腔内注射
によって感作化する。５日後にマウスを頚部脱臼によっ
て１牲にしそして牌を除去しそして水冷ダルベコ溶液中
に貯蔵する。牌を微細なメツシュのワイヤーグリッド上
で注意深く破壊して牌細胞を得る。それらの生存性を測
定しそしてその量を約６×１０６．細胞／−に調節する
。

次に、この牌細胞を５％のＣ’０２下６７℃のカニング
ハムチェンバー（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ　ｃｈａｍｂｅ
ｒ　）中で補体の存在下において羊の赤血球と反応させ
る。形成したプラーグを、２時間後に計算する。

カムノシンを、感作日から毎日５．１０および２０η／
ｋｇまたは１０η／神の投与量で腹腔内的または皮下的
に注射する。化合物の最後の投与量は、動物を１牲にす
る１時間前５日に投与した。

結果は第２表に示す通りである。

第２表 ５．０　　　　　腹腔内　　　　　３ｔ２０ｉｏ、ｏ　
　　　　腹腔内　　　４０．６６±４．６７２０．０　
　　　腹腔内　　　４１４±４．８９１０．０　　　皮
下　　３８．４ これらの結果は、カムノシンが免疫抑制作用を有しそし
てその結果例えば移植における免疫抑制剤として使用で
きるということを示す。

薬理学的性質は、本発明の化合物を治療剤として使用す
るのＩｃ　ｋＴ格あるものにする。従って、本発明は、
また、慣習的なそして一般に知られている補助剤および
（または）（ヒクルのほかにカムノシンを含有する薬剤
ならびにそれ自体既知の方法での抗生物質の作用および
（または）免疫抑制作用を有する薬剤の製造に対するカ
ムノシンの使用に関するものである。

本発明を、若干の好適な実施例を基にして詳細に説明す
るけれども、本発明がこれらの実施例に限定されるもの
としてみなされるべきではない。

実施例　１ 上りからのストレプトミセス菌４Ｙ−８４，３＋５２１
０の単離 （ａ）　　単離栄養培地の製造 培地１ニゲルコース　　　　　　　１．０９グリセロー
ル　　　　　　　　１０９ Ｌ−アルギニン　　　　　　　　０．３９に２ＨＰＯ４
０，３り Ｍ、ｇｓＯ４・７Ｈ２００，２９ ＮａＣ１Ｏ，３り 酵母エキス　　　　　　　　０．２り Ｆｅ２（ＳＯ２）３　　　　　　　　１　ｏ、ｏｑＣｕ
ＳＯ４・５Ｈ２０１Ｗ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２０１１１ｖ ＭｎＳＯ４・７Ｈ２０１”１ 寒天　　　　　　　　１５．０ｇ 蒸溜水　　　　　　　１ｔ ｐＨ６，５ 培地２ニゲルコース　　　　　　　２．０９Ｌ−アスパ
ラギン　　　　　　　１．０ｇＫ２ＨＰＯ４０，５り Ｍｇ５ｏ４・７Ｈ２００，５り 土壌エキス　　　　　　　２００ゴ 寒天　　　　　　　　ｊ５．Ｉｌ 蒸溜水　　　　　　　８００ｍ１ ｐＨ８，０ 培地６；澱粉　　　　　　　　ｉｏ、ｏｐカゼイン　　
　　　　　　０．５９ ＫＮＯ３２，０９ ＮａＣｔ　　　　　　　　　　　　　　　２．０ｇＫ２
ＨＰＯ４２，０り ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５り ＣａＣＯ３０，０２９ ＦｅＳＯ４０，０１シ 寒天　　　　　　　　１５．１１’ 蒸溜水　　　　　　　　１ｔ ｐＨ７，２〜Ｚ５ 培地を１２１°Ｃで６０分滅菌する。それぞれの場合に
おいて、滅・盾した培地４５℃に冷却し、はトリー皿忙
入れそして固化させる。

（ｂ）　　土壌懸濁液の製造 土壌１ｇを、熱空気かま中で１１０℃で１時間加熱する
。土壌を冷却した後、それを蒸留水に懸濁しそして十分
に振盪する。土壓を沈降させそして上泄蔽を使用して前
述した単離栄養培地のそれぞれの１つの培地に接種する
。

（ｃ）　　単離培地の接種 土壌懸濁液１ゴを、それぞれの皿が前述・した単離培地
の何れかの培地５０−を含有するぼトリ皿に移す。

（ｄ）　　ストレプトミセス菌種Ｙ−８４，３６２１０
の単離 接種したベトリ皿を６７℃で１０日間培養しそして次に
ストレプトミセス１４　Ｙ−８４，３６２１０を生長し
た微生物から単離する。

実施例　２ 醗酵によってカムノシンを製造するためのストレプトミ
セス―種Ｙ−８４，３６２１０の培養ストレプトミセス
菌ａ１Ｍ−８４，５６２１０を次の組成の酵母／麦芽寒
天上で培養する。

麦芽エキス　　　　　　　　１０．０９＃母エキス　　
　　　　　　　４．０９グルコース　　　　　　　　　
４．０ｇ寒天　　　　　　　　　１５．０り 蒸溜水　　　　　　　　　１ｔ ｐＨ７０ 培地゛と試験・げに入れそして１２１℃で６０分滅菌す
る。試＃蕾を傾斜位置で冷却して寒天斜面培養基を製造
する。この寒天斜面培養基に培養菌を接種しそして２８
℃で１０〜１５日培養する。

その後満足な生長および胞子形成が１１５！祭される。

４溜水中の１つの寒天斜面培養基からの胞子の懸濁液を
、それぞれが種子培養用地１ｏｏｒｎｔを含有スる５本
の５００ｍ／のエルレンマイヤーフラスコまたは同じ種
子培養培地１ｔを含有する５Ｌの１吸引フラスヨに接種
するために使用する。

４子培養培地の組成 グルコース　　　　　　　　　１５．０９大豆粉　　　
　　　　　１５゜０り とうもろこし浸出液　　　　　　　５．０２ＣａＣＯ３
２，０９ ＮａＣＬ　　　　　　　　　　　　　　　　　５．０ｇ
蒸溜水　　　　　　　　　１ｔ ｐＨ６，５ 前述した培地をそれぞれの５００ｍ１のエルレンマイヤ
ーフラスコに１００−づつまたはそれぞれの５ｔの吸引
フラスコに１ｔづつ入れそして１２０℃で３０分滅菌す
る。フラスコを冷却し、胞子懸ン蜀訣を接通しそして２
７　’Ｃ（±１℃）および５．８ｃ＋＋＋（１５吋）の
半振喝を有する回転振盪機の２４　Ｏｒｐｍで７２時間
振盪する。この方法で生長した培テ１菌を使用して、第
２段階の種子培養菌を製造するため種子培養培地１０ｔ
を含有する２つの１５Ｌのザラス醗酵器に接４（８〜１
０容量チ）する。醗酵は、２７°Ｃ（±１℃）、１８０
〜２００　ｒｐｍの攪拌および６〜７　Ａｐｒｎの通気
速度で２４時間実施する。この方法で得られたよく生長
した第２段階の種子培養菌を使用して生産培地に接種す
る。

生産培地の組成 グルコース　　　　　　　　１５．（Ｈ’町可溶殿扮　
　　　　　　　２０．０９ソイアト：ｙ　（Ｓｏｙａｔ
ｏｎｅ　）　　　　　３．０りはプトン　　　　　　　
　６．０ｇ ＣａＣＯ３２，０ｇ ＮａＣ１２，０９ とうもろこし浸出液　　　　　　　２．０ｇ（ＮＨ４）
　２ＳＯ４０，５９ 蒸溜水　　　　　　　　　１ｔ ｐＨ６，５ ０，０２５％のデスモフエンを、泡止剤として醗酵姦の
内容物に加える。

前記培地２８０ｔの醗酵タンクに入れる。培地を間接的
または直接的な蒸気によって１２１℃で２８分滅菌する
。醗酵タンクを冷却しそして第２設す皆の（１子培養菌
（容１よで７チ）を接種する。

醗酵は、２７°Ｃ（±１℃）および１００〜１２０　ｒ
ｐｍの攪拌下で実施する。通気速度は、１分当り１７０
ｔである。４０〜４５時間後に醗酵を終了した場合、カ
ルシウムを６．５〜６．９の培ｉ液のｐＨにおいて加え
た（　３０　ｍＭ　）寒天を使用して培養Ｐ液を寒天ウ
ェル法（直径６１１２Ｉ）によって試験したときに、ス
タフイロコツ力スオーレウス２０９Ｐの阻止帯域直径は
２０ｆｌである。

パックした細胞容量は２０チである。

抗生物質複合体を含有する得られた培養プロスを、遠心
分離して培４液体から菌糸を分離しそして更に実施例４
に記載したように処理する。

実施例　３ 醗酵によってカムノシンを製造するためのストレプトミ
セス菌種Ｙ−８４，３６２１０の培養次の条件下で実施
例２に記載した方法を反復する。

ストレプトミセス菌種Ｙ−８４，３６２ｊＯを、次の組
成を有する寒天培地上で培ゴオする。

殿粉（可溶性）　　　　　　１ｏ、ｏｐＫ２ＨＰＯ４ｔ
　Ｏり ＭｇＳＯ４拳７Ｈ２０１，０り ＮａＣｔｌ、０り （ＮＨ４）　２８０４　　　　　　２．　Ｏりｃａｃｏ
ｓ　　　　　　　　　２．０９ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００
，１’９ ＭｏＣｔ２・４Ｈ２００，１’ｊ’ ＺｎＳ○４・７Ｈ２００，ＩＩＩｖ 寒天　　　　　　　　１５．０ｇ 蒸溜水　　　　　　　　１ｔ ｐＨ７２ 種子層４場地の組成は１．Ａ雁例２に記載したものと同
じである。

生産培地の組成 グルコース　　　　　　　　２０．０９大豆扮　　　　
　　　　１αｏ９゜ ＣａＣ○３０゜２ｇ ｃｏｃｚ２・６Ｈ２０１，０〜 蒸溜水　　　　　　　　　１ｔ ｐＨ７，０ 前記培地１００ｔを、１５０ｔのＯ酵タンクに入れる。

培地を、間接的または直接的蒸気によって１２１℃で２
８分滅菌する。醗酵タンクを冷却しそして第２段階の種
子培養菌（９容量％）を接種する。醗酵を２７°Ｃ（±
１℃）、８０〜９０　ｒｐｍの攪拌および１分当り６０
〜７０１の通気速度で実施する。４０〜４５時間後に醗
酵を終了した場合、培養ブロスのｐＨは６．４５であり
、そしてカルシウムを添加した（３０ｍＭ）寒天を使用
して寒天ウェル法（直径６騙）によって培養Ｆ液を試験
したときスタフイロコツ力スオーレウス２０９Ｐの阻止
帯域の直径は２２朋である。メックした細胞容量は、１
２容ロチである。パックした細ｊ把容量は、更に実施例
５に記載したように処理する。

実施例　４ 実施例２におけるようにして得られた培餐戸液２４０ゴ
を、陰イオン交換樹脂アンバーライト（８）ＩＲＡ　６
　ａ　（ｃｔ−＞　（ポリスチレン／ポリアミン官能性
を有する交侠樹ＩＪ）６　Ｌを含有するカラム上に充填
する。カラムを成鉱物質した水４０１で洗浄した後、ｐ
Ｈ８，５（アンモニアでａ′ｇ：ｊ　Ｊｊ　）の水性２
．０ＭＮａＣ２溶液で溶離する。錫られた活性溶離７ｆ
（３０ｔ）を、ｐＩ（をＨＣｌで４０に調節した泌、酢
酸エチル：ｎ−プロパツール（２：　１　）　ｔｍ合物
で３−抽出する。この抽出液全真空濃縮しそしてこの方
法で得られた濃縮ｇ（６Ａ９）をシリカゲルクロマトグ
ラフィー（粒子サイズ０．０６２〜０．０３７ａｍ（２
３０〜４００メ：、／シュ）、６００９）にうけしめそ
してクロロホルム〜クロロホルム：メタノール（１：１
）の勾配をもって溶離する。合したｄ縮した活性フラク
ション（６９）を、飽和ＮａＨＣＯ４水溶液で抽出しそ
して次に抽出液のｐＨをＨＣｌで４．０に調節し、その
後酢酸エチル：ｎ−プロパツール２：１混合物による再
抽出を実施する。抽出液を真空濃縮して化合物１．８７
を得、これを次にシリカゲルクロマトグラフィー〔粒子
サイズ０．０６２〜０．０３７４（２６０〜４００メツ
シユ）、３６０９〕にうけしめる。溶離を、酢酸エチル
〜酢酸エチル：メタノール（１：１）の勾配をもって実
施しそして濃縮によって活性物質８６０■を得る。この
物質を、６つの部分に分離しそして別々にメタノール中
にセファデックｘ（Ｒ）ＬＨ−２０（、ｍ油性ゲルＰａ
Ｔｈ質）５０９＆含有する力２ムに充填する。メタノー
ルを溶離剤として使用する。カムノシン５６０■が、こ
の方法で得られる。

実施例　５ 実施例３における２回の醗酵パッチがらの培ｄＰ喉を、
合して１８５ｔの容量を得る。この遣を、アンバーライ
）（Ｒ）工ＲＡ−６８（Ｃ２−）　４ｔヲ含有するカラ
ムに充填し、カラムを成鉱物質した水２０ｔで洗浄しそ
してアンモニアでｐＨ８，５に調節した２、０Ｍ塩化ナ
トリウム水浴液で溶離する。得られた活性＠離ｒａ４７
ｔをダイアイオン（Ｒ）ＨＰ−２０（日本国、三菱化成
工Ｊ）３ｔを含有するカラムに充填し、カラムを脱鉄４
勿質した水７ｔで洗浄し次にメタノールで溶ｉ、１する
。活性なメタノール浴掘成を真空６１縮しそしてこの方
法で得られた水浴液を蒸溜水でうすめる。ｐＨｆ　ＨＣ
ｌで３．０に、／１節しそして４孜をダイアイオンＥ（
Ｐ−２０２ｔを含有するカラムに充填−ｆる。カラムを
、成鉱物質した水で、洗浄水がクロライドイオンを含有
しなくなるまで、洗浄する。カムノシンをメタノールで
溶離し、メタノール溶離該を真空濃縮しそして次に凍結
乾燥する。この方法で、粗製抗生物質複合体２１ｇが得
られる。

この粗製抗生物質複合体を、アンモニアでｐＨ１，７に
した二重に蒸溜した水に溶解しそして溶液を２つの等容
量に分割しそしてサイズが６．４Ｘ８４ｏ＋＋でありそ
して二重に蒸留した水中のセファデックス（Ｒ）　Ｌ　
Ｈ−２０を含有する２つのカラム上に充填する。カラム
を、１分当り０．５−の流速で二重に蒸溜した水で溶離
しそして溶離液２Ｏｍづつのフラクションで集める。全
体で活性溶１ｉｉＩＩ液を凍結乾燥して抗生物質榎合体
８ｇを得る。この物質を、更に、前述した方法でセファ
デックス（Ｒ）ＬＨ−２０を含有するカラム上の再クロ
マトグラフィーによって精製して牛−純粋な抗生物質榎
合体４，４５りを得る。

この半純粋な抗生物質４合体を、二重に蒸溜した水２０
０ｄに溶解しそして二重に蒸溜した水中のＤＥＡＥ−セ
ファデックス（Ｒ）Ａ−２５（：）エチルアミノエチル
官能性を有するイオン交換体）を含有するカラム（＜Ｓ
、２Ｘ２６α）上に充填する。カラムを水で洗浄しそし
て次に５分段階の段階的勾配で増加したモル濃度を有す
るＮａＣ２水溶液で溶離する。抗生物質相合体は、１．
５　Ｍ　ＮａＣ２溶故６ｔおよび２ＭＮａＣ２溶？＆５
を中に溶離される。次に、ｐＨをＨＣｌで２．０に調節
した合した溶、ｎ液を、ダイアイオン（Ｒ’ＨＰ−２０
の２ｔを含何するカラム上に充填し、カラムを水で、洗
液がもはやクロライドイオンを含有しなくなるまで、洗
浄し、そして次にメタノールで溶離する。メタノールを
真空蒸溜によって除去しそして残留水溶液を凍結乾燥し
て純粋なカムｌシン７００ｍｑを得る。

１分当り０．５−の流速および２５４　ｎｍにおける検
出でＭθＯＨおよび１チ水性酢酸（５５：４５）からな
る溶離剤混合物を使用したサイズが４Ｘ１２０＋ｌ１ｍ
でありそして○ＤＳ−ハイパーシル（Ｒ）（１０μ）を
含有するカラム上の純粋な抗生物質榎合体のＨＰＬＣは
、カムｌシンが第２図に示されるように微小不埒−混合
物即ち関連した抗生物質化合物の復合体であるというこ
とを示す。

カムｌシンを６ＮＨＣＬで加水分解しそしてこの方法で
得られた加水分解物を、メチル化およびトリフルオロア
セチル化後、ＤＳ−５０８Ｍオン−ラインデータシステ
ムでＡＥＩＭＳ−９０２５質はスペクトロメーターに接
続したガスクロモンＱカラム足６％０■−１を使用した
パーキンエルマーガスクロマトグラフを使用して、ＧＣ
−ＥＩＭＳ（ガスクロマトグラフィー／電子衝撃質量ス
ペクトロメトリー）およびＣ）Ｃ−ＣＩＭＳ　（化学的
イオン化によるガスクロマトグラフィー／質量スペクト
ロスコピー）の手段によって分析する。これは、次のア
ミノ酸の存在を示す。

主構成成分：　α−アミノアジピン酸 アスパラギン酸 グリシン ４−ヒドロキシフェニルグリシン セリン 副次的構成成分：　グルタミン酸 ６−ヒドロキシアスパラギン酸 ロイシン Ｎ−メチルフェニルグリシン プロリン スレオニン 前記データから６１き出される４吉、１ンは、カムｌシ
ンがペプチド抗生物質１Ｊ合体であるということである
。

【図面の簡単な説明】

第１図はカムｌシンの薄層クロマトグラフィー　（ＴＬ
Ｃ）の結果を、第２図はカムｌシンの変圧液体クロマト
グラフィーの結果を、第６図は力ムノシンのメタノール
中のＵＶ吸収スペクトルを、そして第４図はカムｌシン
のＫＢｒ中のＩＲ吸収スペクトルを示す。 特許出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外
２名 ＦＩＧ、１ ＦＩＣ，２ 分　　６６４２　　　　　ロ ＦＩ（，３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）第３図において示されるように約２３４ｎｍ、２８
   ０ｎｍおよび３４０ｎｍに吸収帯を有するメタノール中
   のＵＶスペクトルおよび第４図において示されるように
   約３４００ｃｍ＾−＾１、１６８０ｃｍ＾−＾１、１５
   ５９ｃｍ＾−＾１、１２５０ｃｍ＾−＾１および６００
   ｃｍ＾−＾１に吸収帯を有するＫＢｒ中のＩＲスペクト
   ルを有するカムノシン。 ２）ストレプトミセス菌種Ｙ−８４，３６２１０（ＤＳ
   Ｍ４３２９）で得ることのできる請求項１記載のカムノ
   シン。 ３）好気的条件下において炭素および窒素源および栄養
   塩および適当である場合は微量元素を含有する栄養培地
   中でストレプトミセス菌種Ｙ−８４，３６２１０（ＤＳ
   Ｍ４３２９）またはその変異菌または突然変異菌の１つ
   の菌を培養することからなる請求項１または２記載の化
   合物の生産方法。 ４）培養を約１８〜３７℃の間の温度でおよび約６〜９
   のｐＨで実施する請求項３記載の方法。 ５）培養を約２６〜２８℃の温度でおよび約６．４〜６
   ．６のｐＨで実施する請求項３または４記載の方法。 ６）培養を約４０〜４５時間実施する請求項５記載の方
   法。 ７）深部培養を実施する請求項３〜６の１またはそれ以
   上の項記載の方法。 ８）慣習的な補助剤および（または）ベヒクルのほかに
   請求項１または２記載のカムノシンを含有する薬剤。 ９）抗生物質の作用および（または）免疫抑制作用を有
   する薬剤の製造に対する請求項１または２記載のカムノ
   シンの使用。 １０）ストレプトミセス菌種Ｙ−８４，３６２１０（Ｄ
   ＳＭ４３２９）。