JPH01287462A - 液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム - Google Patents
液体クロマトグラフィー用充填材及びカラムInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、炭酸根を含有したヒドロキシアパタイトから
なる液体クロマトグラフィー用充填材、及びこれを充填
してなるカラムに関するものである。 〔発明の背景〕 アパタイトとは広義には、下記（１）式の一般式で表わ
される化合物をいい、この式でＭはＣａ、 Ｐｂ。 Ｂａ、 Ｓｒ、 Ｍｇ、ＮＬ Ｈａｓ Ｋ、Ｆｅ、ｌｌ
ｊ！その他の金属原子を、ｚ０４は’Ｏａ 、Ａｓ０４
、ＶＯ４、ＳＯａ 、Ｓｉｎｇ、ＣＯｓその他の酸根を
、ＹはＦ、０１（ＳＣＩ！、、Ｂｒ５Ｏ１Ｃ０３その他
の陰イオン性原子（団）を示す広範囲な化合物群の総称
である。 Ｍ”＋ｅ（ＺＯ’−ａ）＊Ｙ−ｘ ・−＝−−（１）
本発明においては、上記（１）式においてＭが実質的に
Ｃａであり、ｚ０４が実質的にＰＯ２であり、Ｙが実質
的にＯＨである化合物をヒドロキシアパタイトと呼ぶ、
そして、ここでＺＯａまたは／及びＹの一部がＣＯｓで
置換されたものを炭酸含有ヒドロキシアパタイトと呼ぶ
。 ヒドロキシアパタイト（以下ＨＡｐと略記する）は、天
然歯や天然骨と同じ化学組成を持つ無機化合物であると
ころから、生体親和性に優れていることが知られており
、この性質から、■＾ｐは蛋白質、核酸、酵素等の生体
高分子物質の分離・精製に最も適した物質であり、従っ
て、この分離・精製を目的とした液体クロマトグラフィ
ー（以下、ＬＣと略記する）用カラムの充填材として好
適に使用されている。さらに、近年高速液体クロマトグ
ラフイー（以下ＨＰＬＣと略記する）の普及により少量
の試料を短時間で処理すること（微量分析）、あるいは
大量の試料を一度に処理すること（大量分取）が可能と
なり、ＨＡｐのこの分野への応用は今後共々広がること
が予想される。従って、ＬＣ用のカラム充填材として、
更に高性能でかつ使用しやすい）ＩＡｐの開発が望まれ
ている。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕従来の
ＬＣ用のカラム充填材に使用される１ｌＡｐは、＾、Ｔ
ｉｘｓｌｉｕｓ＋ｅｔ、ａ１．＋により発表された、水
溶性のカルシウム塩と水溶性の燐酸塩を反応させる湿式
合成法（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 ＋６５＋ １３２（１９５６））をもとに適宜改良
を加えた方法で製造されたものが一般的であった。これ
らの方法で得られたＨＡ９は現在のところ、ＬＣ用カラ
ム充填材としての性能がすぐれているといわれているも
のであって、次のような物性を示すのが通常である。 Ｃａ／ｌ’ｌｔ １．４〜１．５５Ｘ線回折
回折ピークが弱い。 Ｃ０ｗ含有量 ０．１重量％未満 しかしながらＨＡｐを製造する上記従来の方法は、原料
の調整、ｐＨ管理、撹拌状態、温度管理等の反応及びそ
の後の処理等に非常に煩雑な操作を必要とする。 しかも、この方法は得られたＨＡｐが品質的に再現性が
乏しく、ＨＡｐを合成することさえ非常に困難であるこ
とも事実である。更には、この方法を工業的にスケール
アップすると、小型スケールと比較してその再現性が著
しく乏しくなり、工業的実施には不向きな方法である。 その上、得られた前記物性の１ｌＡｐは、燐酸ナトリウ
ム緩衝液中で冷所保存しなければ、その物性を維持でき
ないという問題もある。 以上述べたようにＨＡｐはＬＣＣ用カラム充填材として
生体高分子の分離・精製に優れた性能を発揮するにも拘
らず、従来公知の方法では再現性よく製造することが困
難であり、この点から）ＩＡｐは高価なものとなってい
る。そのため、ＨＡｐは生体高分子の分離・精製のため
のＬＣ用カラム充填材として他の充填材と比較して使用
頻度が極度に少なく、限られた分野で使用されているの
が実情である。 〔課題を解決するための手段〕 本発明者らはこれら種々の問題を解決するために鋭意検
討を重ねた結果、ＨＡｐ中に炭酸根を含有させることで
、再現性よ＜１ＩＡｐを製造することができ、かつ、こ
の炭酸根をＣｏｗ として０．５重量％以上含有したＨ
Ａｐ （以下、炭酸根を含有したＨＡｐを炭酸含有ヒド
ロキシアパタイトと称し、ＣＯ＾ρと略記する）は、生
体高分子の分離能力がＨＡｐより更に優れていることを
見出し、本発明を完成するに至ったものである。 即ち本発明の第１は、炭酸根をＣＯ３として０．５重量
％以上含有したヒドロキシアパタイトからなることを特
徴とする液体クロマトグラフィー用充填材であり、第２
は炭酸根をＣＯｉとして０．５重量％以上含有したヒド
ロキシアパタイトを充填してなることを特徴とする液体
クロマトグラフィー用カラムの発明である。 〔発明の詳細な開示〕 以下、本発明の詳細な説明する。 尚、炭酸根をＣＯＳとし０．５重量％以上含有したＣＯ
ｉｐを、ＬＣ用のカラム充填材として使用した例は未だ
知られていない。 本発明で用いられるＣ０Ａｐの製造方法には特に制限は
なく、従来公知の方法、例えば第二燐酸カルシウムと炭
酸カルシウムをアンモニア水中で反応させる方法（特公
昭５８−３０２４４号公報の方法）や、第二燐酸カルシ
ウム２水塩と炭酸カルシウムとを水中で反応させる方法
（特開昭６０−５００９号公報の方法）、本発明者らが
先に提案した、有機溶媒を含む反応媒体中で燐酸または
／及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウムとを反応させ
る方法（特開昭５９−１０７９１２号公報）など、いず
れの方法でも得ることができる。 しかし、本発明に使用するＣ０Ａｐ中には、炭酸根がＣ
Ｏｉとして０．５重量％以上含有していなければならな
い、従うて、本発明においてはｃｏａｐは燐酸または／
及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウムとを、アンモニ
ア水、水、有ａｔ８媒の何れかの媒体中で下記する如き
モル比で反応させて得ることができる。 即ち、反応槽にアンモニア水、水、有機溶媒の何れかを
媒体として仕込み、これに燐酸または／及びそのカルシ
ウム塩出炭酸カルシウム塩を加えて、通常大気圧下にて
媒体を加熱し、蒸発した媒体は還流させる方法で反応さ
せる。尚、この際の燐酸または／及びそのカルシウム塩
と炭酸カルシウムの割合はカルシウムと燐の原子比がＣ
ａ／Ｐとして１．３０〜１．９０好ましくは１．４５〜
１．７５の範囲で、また、炭酸根と燐の割合はＣ０３／
ＰＯ４として０．０１５〜１．９０の範囲で実施される
０反応時間は、媒体がアンモニア水または水の場合は概
ね５〜８時間必要であり、媒体が有機溶媒を含有する場
合は約２時間もあれば十分である。 加熱終了後は生成したｃｏａｐが析出しスラリー状とな
っているので、これを通常公知の方法で濾別・分離し、
乾燥すれば良い。 Ｃ０Ａｐの原子比（’Ｃａ／Ｐ）は、理論的には５／３
であるのでカルシウムと燐との反応時における原子比も
５７３ζ１．６７が最適であるはずであるが、実際の反
応に際しては、原子比が上記の範囲内にあれば好適にＣ
０Ａｐを合成することができる。 上記反応の原料として使用する燐酸または／及びそのカ
ルシウム塩としては、ＨｘＰＯａ 、ＨａＰ＊Ｏｔ、Ｈ
ＰＯｓ、Ｐ、０２、Ｃａ（ＨｔＰＯ４）ｔ ＨＨｔＯ、
Ｃａ（ＰＯｓ）＊、ＣａＨＰＯｎ、ＣａＨＰＯｎ ・２
ＨｘＯ１ＣａｚＰｓＯｙ、Ｃａ２（ＰＯｎ）ｔ、Ｃａ５
Ｈｘ（ＰＯａ）ｈ・５ＨｘＯ１等が使用可能である。し
がしながら、これらの化合物は本発明において使用可能
な原料の一部であって、これらに限定する必要はない、
また、これらの化合物は特に高純度のものを使用する必
要はなく、通常市販の工業用のもので十分である。今一
つの原料である炭酸カルシウムも同様に、工業用のもの
で十分である。 カルシウム源として、上記の如き燐酸のカルシウム塩の
外にＣａＯ、Ｃａ（ＯＲ）ｚ 、ＣａＣ１，Ｃａ（ＮＯ
＋）ｘ、（ＣＨｓＣＯＯ） １Ｃａ等のカルシウムの酸
化物、水酸化物及び無機酸並びに有機酸のカルシウム塩
を使用することも可能である。 また、炭酸源として、本発明ではカルシウム原子の補給
にもなるので炭酸カルシウムを使用するがＫｔＣＯｌ
、ＫＨＣＯｓ 、ＮａｚＣＯ，、ＮａＨＣＯ，、（ＮＨ
ａ） ｚｃＯｓ、ＮＨａｌｌＣＯｓ等の炭酸塩や炭酸ガ
スを使用しても差支えない。 本発明においては、炭酸カルシウムと上記の如き燐酸ま
たは／及びそのカルシウム塩の一種類以上を適宜選択し
て、カルシウムと燐の原子比Ｃａ／Ｐが１．３０−１．
９０、好ましくは１．４５〜１．７５となるように反応
槽に投入すればよい、また、上記炭酸カルシウムの投入
量を変化させることにより、生成するＣ０１ｐ中に含有
する炭酸根の含有量を調節することが可能であり、この
方法により炭酸根をＣＯｌとして７．０重量％以下の範
囲で調節することができる。 本発明において、媒体の使用量はその種類、反応時の原
料の種類、反応時の撹拌状態などによりそれぞれ適性値
が異なるが、いずれの条件においてもスラリー濃度とし
て５〜６０重量％となる量が好ましい。 本発明において、Ｃ０Ａｐの製造の際に媒体としてアン
モニア水を使用する場合は、濃度が５〜２８重量％のも
のを使用する。また有機溶媒を媒体として使用する場合
はその有機溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレ
ン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン
、各種石油ナフサや工業用ガソリン等の芳香族及び脂肪
族炭化水素類Ｈｉｓｏ−７’チルアルコール、ｎ−７ミ
ルアルコール等のアルコール類；トリエチルアミン、ト
リブチルアミン、エタノールアミン等のアミン類；エチ
ルエーテル、エチルブチルエーテルや各種セルソルブ、
カルピトール等のエーテル類；メチルエチルケトン、メ
チルイソブチルケトン等のケトン類が挙げられる。しか
しこれらは本発明においては使用可能な有機溶媒の一例
にすぎない。 かくして得られたｃｏＡｐは、液体クロマトグラフィー
用、特に高速液体クロマトグラフィー用充填として使用
した場合、生体高分子物質の分離・精製に、従来のＨＡ
ｐを使用した場合よりも更に優れた性能を示す。 本発明においては、二〇ＣＯＡ、をカラムに充填して液
体クロマトグラフィー用カラムとするが、Ｃ０Ａｐをカ
ラムに充填する方法は、従来公知の湿式充填法（スラリ
ー法）で行なう。 即ち、湿式充填法には平衡密度法、非平衡密度法、高粘
度法などがあるが、これらの中から充填材であるｃｏＡ
ｐの粒径または／及び物理的強度を考慮し、適宜好まし
い充填法を選択すればよい。 Ｃ０Ａｐをカラムに充填するには、パッカーと呼ばれる
充填容器と高圧ポンプが必要である。また、充填には溶
媒を用い、Ｃ０Ａｐはこの溶媒の１〜２０重量％のスラ
リーとして上記パッカーに流し込み、７０〜３５０ｋｇ
／ｃｊの間の一定圧力で充填するのが望ましい。 上記の溶媒としてはテトラブロモエタン、テトラクロロ
エチレン、四塩化炭素、メチル７ ル：ｌ−ル、エチル
アルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルア
ルコール、水、アセトン、ジオキサン、クロロホルム、
テトラヒドロフラン、シクロヘキサノール、エチレング
リコールなどが挙げられる。そして、これらの溶媒の一
種または二種以上を組み合わせればよい。 カラムの大きさについても、分析用の小型（内径１１程
度）から工業用の大型（内径１００ｍ１以上）まで適用
することができる。 尚、本発明ではＣ０ＡｐをＨＰＬＣ用のカラムに充填す
る場合には、充填密度を０．５８／ Ｃ−以上とすると
、分離性能が更に向上するので好ましい。 〔実施例〕 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。尚
、以下において％は重量％を表す。 製造例１ 蒸留水２ Ｉｔ、 Ｃａ（ＯＢ）ｚ粉末７４ｇ及びＣａ
ＣＯ５粉末６８ｇを、撹拌機及び還流冷却器を備えた有
効容積３Ｉｌのセパラブルフラスコに仕込み、撹拌しな
がら更に濃度４０％のＨｚＰＯｎ水溶液２００ ｄを１
５分間で添加した後、加熱して沸騰温度（約９８°Ｃ）
で５時間反応させた。 反応終了後は生成物を冷却後、加圧濾過機で濾過・水洗
し、次いで１３０℃で１６時間乾燥して白色の粉末を８
３ｇ得た。 この粉末のＸ線回折図を第１図に示す。 第１ｒＥＪより明らかなようにＸ線回折図は回折角度２
θ−３１，７，３２，２，３２，８に主ピークを有し、
ＡＳＴＭカード９−４３２に記載のＣ０Ａｐの特性回折
ピークと一敗した。また赤外吸収スペクトルを第２図に
示す、第２図より明らかなように１４５０Ｃ１１−’、
８７０Ｃ１”’付近にＣ−０の吸収ピークが観察され
た。またこのｃｏＡｐの物性分析結果を第１表に示す。 製造例２ Ｃａ（ＮＯｘ）ｚ粉末８３．６ｇを溶解した水溶液１ｊ
！に濃度２８％のアンモニヤ水を加えてｐ旧Ｏに調整し
た後、これを製造例１で使用したセパラブルフラスコに
仕込みよく撹拌した。 次いで、この水溶液に（ＮＨ４） を肝０４粉末３９．
６ｇとＮＨ４ＨＣＯ３粉末１１．９ｇを溶解させた混合
水溶液１１を５〜１０ ｄ ／ｓ ｉ ｎ、の速度で徐
々に添加した。しかる後これを撹拌しながら加熱し、沸
騰温度（約９８°Ｃ）で５時間反応させた。 反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色の粉末を３８ｇ得た。この粉末のＸ線回折図
を第３図に示す。 第３図より明らかなようにＸ線回折図の回折角度は第１
図と同じ主ピークを有し、Ｃ０Ａｐと特定される。また
赤外吸収スペクトルを第４図に示す。 第４図より明らかなように第２図と同様のＣ−Ｏの吸収
ピークが観察された。またこのＣ０Ａｐの物性分析結果
を第１表に示す。 製造例３ Ｃａ（ＨｉＰＯｇ）ｘ ・ＨｉＯ７５，６ｇ 、 Ｃａ
ＣＯ５７０，Ｏｇ 、水１００ｇ及びｎ−ヘキサン３５
０ｇを、撹拌機及び還流冷却器を備えた有効容積ＩＩｌ
のセパラブルフラスコに仕込み、撹拌しながら昇温させ
還流温度（６３℃）以下で約２時間加熱し反応させたの
ち、セパラブルフラスコ内の水分とｎ−ヘキサンを蒸発
させ、留出したｎ−へキサンと水に相当する容量のｎ−
ヘキサンを系内に加えながら加熱を行った。操作が進行
するに従ってセパラブルフラスコ内の温度が上昇し、内
温か６８℃を越えた時点で加熱を中止して、生成物を製
造例１と同様に濾過・乾燥して白色の粉末を得た。 この粉末について、製造例１と同様にＸ′線回折及び赤
外吸収スペクトルによってＣ０Ａｐであることを確認し
た。 製造例４ Ｃａ）ＩＰＯ４８１，６ｇ５ＣａＣＯｚ ４０．Ｏｇ
、水２００ｇ及び濃度２８％のアンモニア水Ｌｏｇを、
製造例３で使用したセパラブルフラスコに仕込みよ（撹
拌した。しかる後、これを撹拌しながら昇温し、８０〜
１００℃の温度で５時間反応させた。 反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色粉末状のＣ０Ａｐを１１０ｇを得た。 二〇Ｃ０Ａｐの物性分析結果を第１表に示す。 製造例５〜８ Ｃａ（ＨｚＰＯａ）ｔ−ＨｉＯ、ＣａＨＰＯ４・２Ｈ＊
０１ＣａＨＰＯａ、ＣａＣＯ５の各粉末、水及び有ＩＩ
ａ溶媒を第２表に示した条件でセパラブルフラスコに仕
込み、第２表に示した以外の条件については、実施例１
と同様な操作により白色粉末状のＣ０Ａｐを第２表に示
す量を得た。このＣ０Ａｐの物性分析結果を第１表に示
す。 製造例９ 製造例２を５０倍にスケールアップしてその再現性を確
認した。即ち、Ｃａ （ＮＯｘ） ！粉末４．１８ｋｇ
を溶解した水溶液５０ｊ！に濃度２８％のアンモニヤ水
を加えてｐＨ０に調整した後、これを撹拌機及び還流冷
却器を備えた有効容積５０２のステンレス製反応槽へ仕
込みよく撹拌した。 次いで、この水溶液に（ＮＨ４） １ｔｌＰＯ４粉末１
．９８ｋｇとＮ）１４ＨＣＯ３粉末５９５ｇを溶解させ
た混合水溶液５０１を２５０〜５００ ｄ／騙ｉｎ、の
速度で徐々に添加した。以下、製造例２と同様の操作を
行い、白色粉末状のＣ０Ａ９を第２表に示す量得た。こ
のＣ０Ａｐの物性を第１表に示す。 比較製造例１ 従来法によるＨＡｐ合成法（Ａ、ティセリウス（＾。 Ｔｉ５ｅｌｉｕｓ））らの方法Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅ＋ｗ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 。 ６５、１３２（１９５６）） 。 有効容積３１のフラスコへ濃度０．５ｍｏｌ／ ｊ！の
ＣａＣ１，ｚ水溶液１ｆｆｉと濃度０．５ａ＋ｏｌ／
１のＮａｚＨＰＯ４水溶液１１を毎分１２０滴の割合で
同時に滴下し、撹拌棒でゆっくりと撹拌しながら反応を
行なった、滴下終了後、上澄み液をデカンテーションに
より除去し、残留した沈殿物を４回、各々２２の蒸留水
で洗浄した０次にこの沈殿物に２１の蒸留水を加え、更
に濃度４０％のＮａＯＨ水溶液を５０１加えた後１時間
沸騰した。 反応液を冷却後再びデカンテーションにより上澄液を除
き、再度２１の蒸留水で４回洗浄した。 次にｐＨ６，８で濃度０．０１ｓ＋ｏｌ／ Ｉｔの燐酸
ナトリウム緩衝液を２２加え沸騰する直前まで加熱した
。この操作を２度繰返すが、沸騰時間は各々５分と１５
分にした。次に、１１１１６．８で濃度０．０１ｍｏｌ
／ １の燐酸ナトリウム緩衝液を２２加え２度沸騰（各
１５分間）させて第１表に示す量のＩ）Ａｐ ３６．を
得た。 このようにして得られたＨＡｐはｐＨ６，８で濃度０．
００１ ｍｏｌ／ｆｆｉの燐酸ナトリウムＨｄｊ液に入
れ、冷蔵庫にて保存した。 その結果第１表に示す物性のＨＡｐを得た。またこのＨ
Ａｐの赤外吸収スペクトルを第５図に示すが、第５図か
らも明らかなように、炭酸根（Ｃ−０）の吸収スペクト
ル（１４５０ｃ＋ａ−’、８７０ ｃ＋ａ−’付近）は
見られなかった。 実施例１〜２ 内径７．６ ｎｕ＋、長さ１１００ＩＩのＨＰＬＣ用金
属カラムへ、製造例１及び２により得られたＣ０Ａｐを
定常の方法により１０ ｋｇ／ｃ＋ａ−Ｇの圧力でそれ
ぞれ充填し、充填終了後ＨＰＬＣ装置にこのカラムを装
着した。充填密度は０．５２ｇ／ｃｊであった。 また、カラムの分離能の評価を行なうためトリプトファ
ン（０，１６％）、牛血清アルブミン（４，６％）、リ
ゾチウム（２，０％）、チトクロムＣ（１，０％）を含
有する混合溶液を標準試料として用いて展開を行なった
。展開は、燐酸緩衝液１０ｎＭ（ｐＨ６，８）と３５０
ｍＭ（ｐＨ６，８）による直線濃度勾配法により行な
い、上記標準試料を１０．０μ！注入した。また、流速
は１０１１ ／ｌｌ１ｉｎになるように７．５ｋｇ／ｃ
ｄの展開圧とした。 タンパク質の検出は、２８０ｎｍの吸光度を測定した。 二〇カラムにより得られたクロマトグラムを第６図及び
第７図に示す。第６図及び第７図からも明らかなように
、主なピークが４カ所にあられれており、標準試料であ
る４次分がきれいに分離されていることがわかる。各ピ
ークは左側からトリプトファン、牛血清アルブミン、リ
ゾチウム、チトクロムＣに対応するピークであることを
ｔｉｌｌした。尚、チトクロムＣには、２種の異性体が
ありピークが２つに分離している。 実施例３〜４ 製造例２及び９で得られたＣ０Ａｐを用い、以下に示す
カラムクロマトの操作手順に従って牛血清アルブミンの
分離を行なった。即ち、Ｃ０Ａｐ各ｌｏｇを５００ ｄ
のビーカーにとり、イオン交換水（以下単に水と略記す
る）を静かに加え、ゆっくり撹拌する。１０分間静置後
デカンテーシッンする。この操作を上澄みが清澄になる
まで繰り返す。その後直径１０ｍ＋ｍのクロマトグラフ
ィー用（ＬＣ用）のガラスカラムに懸濁したＣ０Ａｐを
重層する（充填高さ１００〜１２０ｍｍ ） 、その後
ガラスカラムの洗浄を水で行ない、同時に流速の測定を
行なう（約１０ｄ／Ｉｔになるように充填する）０次に
濃度が１％になるように水に溶かした牛血清アルブミン
をｌ ｄｃＯＡｐカラムに吸着させる。この時の操作は
すべて室温で行なう。次に吸着させた生血端アルブミン
を分離するため、燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）
で展開を行なう、溶出液は重量分画型のフラクションコ
レクターで収集する（ｌ試験管あたり２．５ｇの溶出液
）、得られた溶出液の吸光度は紫外部 ２Ｂ０ｎｍで測
定した。これにより得られた結果を第８図及び第９図に
示す。第８図、第９図から本発明のＣ０Ａｐはすぐれた
分解能を示し、吸脱着に優れているのがわかる。 実施例５ 内径７．６ ｓ＋ｓ、長さ１００ｍｍのＨＰＬＣ用カラ
用心ラム０ｋｇ／ ｃｄ−Ｇの圧力で製造例３により得
られたＣ０Ａｐを、実施例１及び２と同様の方法で充填
し、それ以降の操作は、実施例１及び２と同様にして）
ＩＰＬｃ用カラムの操作を行なった。充填密度は０．５
２ｇ／ｃｄであった。各ピークの保持時間及び半値幅に
よりその結果を第３表に示す。第３表かられかる通り実
施例１及び２で得られたクロマトグラムと同じ結果を示
した。 実施例６ 内径７．６■、長さ１００ｍ＋ｗのＨＰＬＣ用カラ用心
ラム０ｋｇ／ ｃｆｆｌの圧力で製造例６により得られ
たＣ０Ａｐを充填し、それ以降の操作は、実施例１及び
２と同様にしてＨＰＬＣ用カラム操作を行なった。充填
密度は０．６０ｇ／ａｊであった。その結果を実施例５
と同様に第３表に示す、第３表からもわかる通り、実施
例１及び２で得られたクロマトグラムと同じ結果を示し
た。 実施例７ 実施例６で使用したカラムに対し、標準試料の分離を３
００回行なった。３００回目に得られたクロマトグラム
の結果を実施例５と同様に第３表に示す、第３表からも
わかる通り、本発明のカラムは３００回の繰返し使用に
対しても良い分離能を示し、優れた耐久性をもっている
ことがわかる。 実施例８ 内径７．６ ｍｔｍ、長さ１００ｍｍの１（ＰＬＣ用カ
シカラム５００ｋｇ／ｃｄ−Ｇの圧力で製造例７により
得られたＣＯ＾ｐを密度１．０３ｇ／ｃ＋４に充填し、
それ以降の操作は実施例１及び２と同様な操作でＨＰＬ
Ｃ用カラ用心ラムを行なった。その結果を実施例５と同
様に第３表に示す。 第３表から、高い圧力でｃｏｎｐをカラムへ充填してい
るにも拘らず、実施例５及び６で得られたクロマトグラ
ムと同じ結果を示し、耐圧性に優れていることがわかる
。 実施例９ 内径２１１．長さ２５〇−鋼の分取用カラムに、８０ｋ
ｇ／ｄ−Ｇの圧力で、製造例５に従って得たｃｏａｐを
密度０．６２１／ｃ−に充填し、操作法は実施例１及び
２と同様な方法でＨＰＬＣ用カラムの操作を行なった。 ただし標準試料は７０μｌ注入した。これにより得られ
たクロマトグラムの結果を実施例５と同様に第３表に示
す、第３表の結果から本発明のカラムによれば通常のＨ
ＰＬＣと同じ結果が得られ、分取用としても十分使用可
能であることがわかる。 実施例１０ 内径７．６ ＋＋ｎ、長さ１００ｍ翔のＨＰＬＣ用カラ
ムに、８０ｋｇ／ｃｄ−Ｇの圧力で、製造例７に従って
得たＣ０Ａｐを密度０．５８ｇ／ｃｊに充填し、それ以
降の操作は実施例１及び２と同様に行なった。ただし展
開中の流速が３ 、４ ｄ ／ｌａ ｉ ｎ、になるよ
うに圧力を５０ｋｇ／ｃｄ−Ｇに調整した。これにより
得られたクロマトグラムの結果を実施例５と同様に第３
表に示す、第３表からもわかる通り、分離を短時間で行
なわれたにも拘らず、各々の４つのピークがきれいに分
離していることがわかる。 実施例１１ 実施例５で使用したＨＰＬＣカラムを用い、核酸に対す
る分離能の評価を炭酸塩を展開液として行なった。 核酸のサンプルには米国シグマ社製の子牛胸腺デオキシ
リボ核酸（ＯＮ＾）を使用し、展開は蒸留水と炭酸水素
アンモニウム水溶液２Ｍ （ｐｌ＋７．８）による直線
濃度勾配法により行ない、上記サンプルを１０．０μ２
注入した。また、流速は１ｍ／ａｋｉｎ、になるように
７．５ｋｇ／ｃ＋ｉ−Ｇの展開圧とした。 核酸の検出は２６０ｎａ＋の吸光度を測定した。このカ
ラムにより得られたクロマトグラムを第１０図に示す、
第１Ｏ図からもわかるように主なピークが２カ所にあら
れれ、一部熱処理を行ない一本鎖となった核酸が、二本
鎖のそれときれいに分離されていることがわかる。さら
にそれぞれのピーク分取液にエタノールを加え、核酸を
糸状沈殿物として直接回収した。 実施例１２ 標準試料による分離能評価を終えた実施例６で使用した
カラムについて、実施例１１の操作を５０回行なった０
本操作終了後、再度、標準試料による分離能評価を行な
ったところ、カラムの劣化は全く見られなかった。 比較例１ 比較製造例１に従って得たＨＡｐを用い、以下、実施例
３及び４と全く同一の方法で、牛血清アルブミンの分離
を行なった。得られた結果を第１１図に示す。 実施例３及び４ではすぐれた分離能を示し、吸脱着にす
ぐれているのに対し、比較製造例１に従って得た炭酸根
を含有していないＲＡＰは、第１１図から回収量が劣る
ことがわかる。 比較列２ 比較製造例１に従って得たｎａｐを内径７．６ ｍｍ、
長さ１００１のカラムに充填し、その後の操作は実施例
４と同様な操作で標準試料の分離を行った。 尚、この時の充填密度は０．２８ｇ／ｃ＋４であった。 また流速をｌ ａｔ／ｓｉｎ、にするため、Ｉｋｇ／ｃ
ｄ−Ｇの圧力になるように調整を行なったが、ＨＰＬＣ
としては低圧になるため、操作に困難をきたした。 これにより得られたクロマトグラムを第１２図に示す、
第１２図と第６図及び第７図との比較からもわかる通り
、従来法に従って得たＨＡｐを充填したものは、全体的
にブロードなピークを示した。 比較例３ 比較製造例１に従って得たＨＡｐを、内径７．６ ＋ｕ
＋、長さ１ｏｏｎ＋ｍのカラムに充填圧力１５ｋｇ／ｄ
−Ｇで充填した。しかし内部で結晶が破壊され目づまり
が生じ、展開を行うことができなかった。 比較例４ 比較製造例１に従って得た１ＩＡｐを、内径７．６ ｍ
ｍ、長さ１００１１１１のカラムに充填して、実施例１
２と同様な操作を行なったが、五回目でカラム圧力が上
昇し展開が不可能となった。 〔発明の効果］ 以上詳細に説明したように、本発明は炭酸根をＣＯ３と
して０．５％以上含存したｃｏＡｐをＬＣ用または）Ｉ
ＰＬＣ用カラムの充填剤として使用する、また、このＣ
ＯＡρを充填してなるカラムの発明である。 従来ＬＣ用またはＨＰＬＣ用カラムは充填材が）ＩＡｐ
であるので、分離能にやや問題があると共に、耐圧・耐
久性に劣るという問題があった。また、ＨＡｐが品質的
に再現性良く製造できないという重大な問題もあった。 これに対し本発明の充填材はＣ０Ａｐであるので分離能
が優れており、また結晶の強度が大きいため耐圧・耐久
性にも優れている。従って、２００回以上の繰返し使用
が可能で、優れた耐久性を持っている３以上のことから
、本発明のＣ０ＡＰは特にＨＰＬＣ用充填材として使用
した場合、充填密度を０．５ｇ／Ｃ−以上とすることが
できるので、ＨＰＬＣ特有の展開条件下で一層向上した
分離能を示すのである。 さらに、従来のＨＰＬＣ用カラムは耐圧・耐久性に劣る
のに対し、本発明のカラムにおいてはＣ０Ａｐ結晶が破
壊されにくく、従って、容易に０．５ｇ／ｃ−以上の密
度で充填することができ、カラムの強度も大で少なくと
も１（ＰＬＣの実質的な充填圧力である１０ｋｇ）ｄを
満足し、さらに５００ｋｇ／ｃ＋ａ以上の高い圧力をか
けても充填材であるＣ０Ａｐ自体には全く支障がない。 また、本発明のＣ０Ａｐは従来のＨＡｐと異なり結晶を
配向させながらＨＰＬＣ用カラムに充填するという煩雑
な操作を必要としないので、簡単にカラム充填が行なえ
るという利点がある。さらに圧力の調整により流速制御
ができるので展開液も従来品に比べ少量で済むという利
点もある。さらにまた、本発明のカラムは分析を目的と
したＨＰＬＣ用カラ用板ラム以外取を目的とした分取用
ＨＰＬＣ用カラムとしても好適に使用でき、必要とされ
る試料を短時間のうちに純度よく分離・精製することが
可能であるのである。 また、ＨＡｐを充填した従来のカラムを使用して分取を
行なう場合、分取したサンプルの溶離液として通常燐酸
塩の液が使用される関係上、溶離後の処理として脱塩を
必要とする場合もしばしばあるが、この場合分離操作自
体は短時間であっても、後処理を含めると決して短時間
とはいえなかった。しかし本発明では充填材としてＣＯ
Ａρを使用しているので、溶離液としてこれまで不向き
と考えらていた、揮発性の炭酸塩系溶離液が使用可能で
あるので、後処理の時間を大幅に短縮できるという利点
も有している。この点は特に核酸を分離・精製する際に
威力を発揮する。 即ち、核酸類としてたとえばプラスミドＤＮ＾を分離・
精製する場合は、分離後最終的には分取液にエタノール
を加え核酸を沈殿させ回収保存される。しかしこの操作
は燐酸塩を含む液では燐酸塩も共に析出沈殿するので前
処理として燐酸塩の脱塩が必要であった。しかしながら
ここで揮発性塩を使用すれば、直接エタノール添加によ
る沈殿析出が実施可能であり、合計の処理時間が大幅に
軽減される。 ここで脱塩処理とは、透析のことを指し、溶離液に燐酸
を使用した場合、この処理には通常１５〜２４時間を必
要としていたが、本発明では炭酸塩系溶離液が使用可能
であるので、この脱塩処理時間は１時間以内と大幅に短
時間で完了することができる。この炭酸塩系溶離液の使
用はＣ０Ａｐの如く炭酸根を含有するアパタイトを使用
することで初めて達成できるものであり、従来の如きＨ
Ａｐでは達成できない。 以上種々列記した通り、ＬＣ用及びＨＰＬＣ用カラムの
充填材にｃｏａｐを使用することにより種々の効果があ
り、本発明の効果は経済的に極めて大なるものがある。
なる液体クロマトグラフィー用充填材、及びこれを充填
してなるカラムに関するものである。 〔発明の背景〕 アパタイトとは広義には、下記（１）式の一般式で表わ
される化合物をいい、この式でＭはＣａ、 Ｐｂ。 Ｂａ、 Ｓｒ、 Ｍｇ、ＮＬ Ｈａｓ Ｋ、Ｆｅ、ｌｌ
ｊ！その他の金属原子を、ｚ０４は’Ｏａ 、Ａｓ０４
、ＶＯ４、ＳＯａ 、Ｓｉｎｇ、ＣＯｓその他の酸根を
、ＹはＦ、０１（ＳＣＩ！、、Ｂｒ５Ｏ１Ｃ０３その他
の陰イオン性原子（団）を示す広範囲な化合物群の総称
である。 Ｍ”＋ｅ（ＺＯ’−ａ）＊Ｙ−ｘ ・−＝−−（１）
本発明においては、上記（１）式においてＭが実質的に
Ｃａであり、ｚ０４が実質的にＰＯ２であり、Ｙが実質
的にＯＨである化合物をヒドロキシアパタイトと呼ぶ、
そして、ここでＺＯａまたは／及びＹの一部がＣＯｓで
置換されたものを炭酸含有ヒドロキシアパタイトと呼ぶ
。 ヒドロキシアパタイト（以下ＨＡｐと略記する）は、天
然歯や天然骨と同じ化学組成を持つ無機化合物であると
ころから、生体親和性に優れていることが知られており
、この性質から、■＾ｐは蛋白質、核酸、酵素等の生体
高分子物質の分離・精製に最も適した物質であり、従っ
て、この分離・精製を目的とした液体クロマトグラフィ
ー（以下、ＬＣと略記する）用カラムの充填材として好
適に使用されている。さらに、近年高速液体クロマトグ
ラフイー（以下ＨＰＬＣと略記する）の普及により少量
の試料を短時間で処理すること（微量分析）、あるいは
大量の試料を一度に処理すること（大量分取）が可能と
なり、ＨＡｐのこの分野への応用は今後共々広がること
が予想される。従って、ＬＣ用のカラム充填材として、
更に高性能でかつ使用しやすい）ＩＡｐの開発が望まれ
ている。 〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕従来の
ＬＣ用のカラム充填材に使用される１ｌＡｐは、＾、Ｔ
ｉｘｓｌｉｕｓ＋ｅｔ、ａ１．＋により発表された、水
溶性のカルシウム塩と水溶性の燐酸塩を反応させる湿式
合成法（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、 ＋６５＋ １３２（１９５６））をもとに適宜改良
を加えた方法で製造されたものが一般的であった。これ
らの方法で得られたＨＡ９は現在のところ、ＬＣ用カラ
ム充填材としての性能がすぐれているといわれているも
のであって、次のような物性を示すのが通常である。 Ｃａ／ｌ’ｌｔ １．４〜１．５５Ｘ線回折
回折ピークが弱い。 Ｃ０ｗ含有量 ０．１重量％未満 しかしながらＨＡｐを製造する上記従来の方法は、原料
の調整、ｐＨ管理、撹拌状態、温度管理等の反応及びそ
の後の処理等に非常に煩雑な操作を必要とする。 しかも、この方法は得られたＨＡｐが品質的に再現性が
乏しく、ＨＡｐを合成することさえ非常に困難であるこ
とも事実である。更には、この方法を工業的にスケール
アップすると、小型スケールと比較してその再現性が著
しく乏しくなり、工業的実施には不向きな方法である。 その上、得られた前記物性の１ｌＡｐは、燐酸ナトリウ
ム緩衝液中で冷所保存しなければ、その物性を維持でき
ないという問題もある。 以上述べたようにＨＡｐはＬＣＣ用カラム充填材として
生体高分子の分離・精製に優れた性能を発揮するにも拘
らず、従来公知の方法では再現性よく製造することが困
難であり、この点から）ＩＡｐは高価なものとなってい
る。そのため、ＨＡｐは生体高分子の分離・精製のため
のＬＣ用カラム充填材として他の充填材と比較して使用
頻度が極度に少なく、限られた分野で使用されているの
が実情である。 〔課題を解決するための手段〕 本発明者らはこれら種々の問題を解決するために鋭意検
討を重ねた結果、ＨＡｐ中に炭酸根を含有させることで
、再現性よ＜１ＩＡｐを製造することができ、かつ、こ
の炭酸根をＣｏｗ として０．５重量％以上含有したＨ
Ａｐ （以下、炭酸根を含有したＨＡｐを炭酸含有ヒド
ロキシアパタイトと称し、ＣＯ＾ρと略記する）は、生
体高分子の分離能力がＨＡｐより更に優れていることを
見出し、本発明を完成するに至ったものである。 即ち本発明の第１は、炭酸根をＣＯ３として０．５重量
％以上含有したヒドロキシアパタイトからなることを特
徴とする液体クロマトグラフィー用充填材であり、第２
は炭酸根をＣＯｉとして０．５重量％以上含有したヒド
ロキシアパタイトを充填してなることを特徴とする液体
クロマトグラフィー用カラムの発明である。 〔発明の詳細な開示〕 以下、本発明の詳細な説明する。 尚、炭酸根をＣＯＳとし０．５重量％以上含有したＣＯ
ｉｐを、ＬＣ用のカラム充填材として使用した例は未だ
知られていない。 本発明で用いられるＣ０Ａｐの製造方法には特に制限は
なく、従来公知の方法、例えば第二燐酸カルシウムと炭
酸カルシウムをアンモニア水中で反応させる方法（特公
昭５８−３０２４４号公報の方法）や、第二燐酸カルシ
ウム２水塩と炭酸カルシウムとを水中で反応させる方法
（特開昭６０−５００９号公報の方法）、本発明者らが
先に提案した、有機溶媒を含む反応媒体中で燐酸または
／及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウムとを反応させ
る方法（特開昭５９−１０７９１２号公報）など、いず
れの方法でも得ることができる。 しかし、本発明に使用するＣ０Ａｐ中には、炭酸根がＣ
Ｏｉとして０．５重量％以上含有していなければならな
い、従うて、本発明においてはｃｏａｐは燐酸または／
及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウムとを、アンモニ
ア水、水、有ａｔ８媒の何れかの媒体中で下記する如き
モル比で反応させて得ることができる。 即ち、反応槽にアンモニア水、水、有機溶媒の何れかを
媒体として仕込み、これに燐酸または／及びそのカルシ
ウム塩出炭酸カルシウム塩を加えて、通常大気圧下にて
媒体を加熱し、蒸発した媒体は還流させる方法で反応さ
せる。尚、この際の燐酸または／及びそのカルシウム塩
と炭酸カルシウムの割合はカルシウムと燐の原子比がＣ
ａ／Ｐとして１．３０〜１．９０好ましくは１．４５〜
１．７５の範囲で、また、炭酸根と燐の割合はＣ０３／
ＰＯ４として０．０１５〜１．９０の範囲で実施される
０反応時間は、媒体がアンモニア水または水の場合は概
ね５〜８時間必要であり、媒体が有機溶媒を含有する場
合は約２時間もあれば十分である。 加熱終了後は生成したｃｏａｐが析出しスラリー状とな
っているので、これを通常公知の方法で濾別・分離し、
乾燥すれば良い。 Ｃ０Ａｐの原子比（’Ｃａ／Ｐ）は、理論的には５／３
であるのでカルシウムと燐との反応時における原子比も
５７３ζ１．６７が最適であるはずであるが、実際の反
応に際しては、原子比が上記の範囲内にあれば好適にＣ
０Ａｐを合成することができる。 上記反応の原料として使用する燐酸または／及びそのカ
ルシウム塩としては、ＨｘＰＯａ 、ＨａＰ＊Ｏｔ、Ｈ
ＰＯｓ、Ｐ、０２、Ｃａ（ＨｔＰＯ４）ｔ ＨＨｔＯ、
Ｃａ（ＰＯｓ）＊、ＣａＨＰＯｎ、ＣａＨＰＯｎ ・２
ＨｘＯ１ＣａｚＰｓＯｙ、Ｃａ２（ＰＯｎ）ｔ、Ｃａ５
Ｈｘ（ＰＯａ）ｈ・５ＨｘＯ１等が使用可能である。し
がしながら、これらの化合物は本発明において使用可能
な原料の一部であって、これらに限定する必要はない、
また、これらの化合物は特に高純度のものを使用する必
要はなく、通常市販の工業用のもので十分である。今一
つの原料である炭酸カルシウムも同様に、工業用のもの
で十分である。 カルシウム源として、上記の如き燐酸のカルシウム塩の
外にＣａＯ、Ｃａ（ＯＲ）ｚ 、ＣａＣ１，Ｃａ（ＮＯ
＋）ｘ、（ＣＨｓＣＯＯ） １Ｃａ等のカルシウムの酸
化物、水酸化物及び無機酸並びに有機酸のカルシウム塩
を使用することも可能である。 また、炭酸源として、本発明ではカルシウム原子の補給
にもなるので炭酸カルシウムを使用するがＫｔＣＯｌ
、ＫＨＣＯｓ 、ＮａｚＣＯ，、ＮａＨＣＯ，、（ＮＨ
ａ） ｚｃＯｓ、ＮＨａｌｌＣＯｓ等の炭酸塩や炭酸ガ
スを使用しても差支えない。 本発明においては、炭酸カルシウムと上記の如き燐酸ま
たは／及びそのカルシウム塩の一種類以上を適宜選択し
て、カルシウムと燐の原子比Ｃａ／Ｐが１．３０−１．
９０、好ましくは１．４５〜１．７５となるように反応
槽に投入すればよい、また、上記炭酸カルシウムの投入
量を変化させることにより、生成するＣ０１ｐ中に含有
する炭酸根の含有量を調節することが可能であり、この
方法により炭酸根をＣＯｌとして７．０重量％以下の範
囲で調節することができる。 本発明において、媒体の使用量はその種類、反応時の原
料の種類、反応時の撹拌状態などによりそれぞれ適性値
が異なるが、いずれの条件においてもスラリー濃度とし
て５〜６０重量％となる量が好ましい。 本発明において、Ｃ０Ａｐの製造の際に媒体としてアン
モニア水を使用する場合は、濃度が５〜２８重量％のも
のを使用する。また有機溶媒を媒体として使用する場合
はその有機溶媒としては、ベンゼン、トルエン、キシレ
ン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン
、各種石油ナフサや工業用ガソリン等の芳香族及び脂肪
族炭化水素類Ｈｉｓｏ−７’チルアルコール、ｎ−７ミ
ルアルコール等のアルコール類；トリエチルアミン、ト
リブチルアミン、エタノールアミン等のアミン類；エチ
ルエーテル、エチルブチルエーテルや各種セルソルブ、
カルピトール等のエーテル類；メチルエチルケトン、メ
チルイソブチルケトン等のケトン類が挙げられる。しか
しこれらは本発明においては使用可能な有機溶媒の一例
にすぎない。 かくして得られたｃｏＡｐは、液体クロマトグラフィー
用、特に高速液体クロマトグラフィー用充填として使用
した場合、生体高分子物質の分離・精製に、従来のＨＡ
ｐを使用した場合よりも更に優れた性能を示す。 本発明においては、二〇ＣＯＡ、をカラムに充填して液
体クロマトグラフィー用カラムとするが、Ｃ０Ａｐをカ
ラムに充填する方法は、従来公知の湿式充填法（スラリ
ー法）で行なう。 即ち、湿式充填法には平衡密度法、非平衡密度法、高粘
度法などがあるが、これらの中から充填材であるｃｏＡ
ｐの粒径または／及び物理的強度を考慮し、適宜好まし
い充填法を選択すればよい。 Ｃ０Ａｐをカラムに充填するには、パッカーと呼ばれる
充填容器と高圧ポンプが必要である。また、充填には溶
媒を用い、Ｃ０Ａｐはこの溶媒の１〜２０重量％のスラ
リーとして上記パッカーに流し込み、７０〜３５０ｋｇ
／ｃｊの間の一定圧力で充填するのが望ましい。 上記の溶媒としてはテトラブロモエタン、テトラクロロ
エチレン、四塩化炭素、メチル７ ル：ｌ−ル、エチル
アルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルア
ルコール、水、アセトン、ジオキサン、クロロホルム、
テトラヒドロフラン、シクロヘキサノール、エチレング
リコールなどが挙げられる。そして、これらの溶媒の一
種または二種以上を組み合わせればよい。 カラムの大きさについても、分析用の小型（内径１１程
度）から工業用の大型（内径１００ｍ１以上）まで適用
することができる。 尚、本発明ではＣ０ＡｐをＨＰＬＣ用のカラムに充填す
る場合には、充填密度を０．５８／ Ｃ−以上とすると
、分離性能が更に向上するので好ましい。 〔実施例〕 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。尚
、以下において％は重量％を表す。 製造例１ 蒸留水２ Ｉｔ、 Ｃａ（ＯＢ）ｚ粉末７４ｇ及びＣａ
ＣＯ５粉末６８ｇを、撹拌機及び還流冷却器を備えた有
効容積３Ｉｌのセパラブルフラスコに仕込み、撹拌しな
がら更に濃度４０％のＨｚＰＯｎ水溶液２００ ｄを１
５分間で添加した後、加熱して沸騰温度（約９８°Ｃ）
で５時間反応させた。 反応終了後は生成物を冷却後、加圧濾過機で濾過・水洗
し、次いで１３０℃で１６時間乾燥して白色の粉末を８
３ｇ得た。 この粉末のＸ線回折図を第１図に示す。 第１ｒＥＪより明らかなようにＸ線回折図は回折角度２
θ−３１，７，３２，２，３２，８に主ピークを有し、
ＡＳＴＭカード９−４３２に記載のＣ０Ａｐの特性回折
ピークと一敗した。また赤外吸収スペクトルを第２図に
示す、第２図より明らかなように１４５０Ｃ１１−’、
８７０Ｃ１”’付近にＣ−０の吸収ピークが観察され
た。またこのｃｏＡｐの物性分析結果を第１表に示す。 製造例２ Ｃａ（ＮＯｘ）ｚ粉末８３．６ｇを溶解した水溶液１ｊ
！に濃度２８％のアンモニヤ水を加えてｐ旧Ｏに調整し
た後、これを製造例１で使用したセパラブルフラスコに
仕込みよく撹拌した。 次いで、この水溶液に（ＮＨ４） を肝０４粉末３９．
６ｇとＮＨ４ＨＣＯ３粉末１１．９ｇを溶解させた混合
水溶液１１を５〜１０ ｄ ／ｓ ｉ ｎ、の速度で徐
々に添加した。しかる後これを撹拌しながら加熱し、沸
騰温度（約９８°Ｃ）で５時間反応させた。 反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色の粉末を３８ｇ得た。この粉末のＸ線回折図
を第３図に示す。 第３図より明らかなようにＸ線回折図の回折角度は第１
図と同じ主ピークを有し、Ｃ０Ａｐと特定される。また
赤外吸収スペクトルを第４図に示す。 第４図より明らかなように第２図と同様のＣ−Ｏの吸収
ピークが観察された。またこのＣ０Ａｐの物性分析結果
を第１表に示す。 製造例３ Ｃａ（ＨｉＰＯｇ）ｘ ・ＨｉＯ７５，６ｇ 、 Ｃａ
ＣＯ５７０，Ｏｇ 、水１００ｇ及びｎ−ヘキサン３５
０ｇを、撹拌機及び還流冷却器を備えた有効容積ＩＩｌ
のセパラブルフラスコに仕込み、撹拌しながら昇温させ
還流温度（６３℃）以下で約２時間加熱し反応させたの
ち、セパラブルフラスコ内の水分とｎ−ヘキサンを蒸発
させ、留出したｎ−へキサンと水に相当する容量のｎ−
ヘキサンを系内に加えながら加熱を行った。操作が進行
するに従ってセパラブルフラスコ内の温度が上昇し、内
温か６８℃を越えた時点で加熱を中止して、生成物を製
造例１と同様に濾過・乾燥して白色の粉末を得た。 この粉末について、製造例１と同様にＸ′線回折及び赤
外吸収スペクトルによってＣ０Ａｐであることを確認し
た。 製造例４ Ｃａ）ＩＰＯ４８１，６ｇ５ＣａＣＯｚ ４０．Ｏｇ
、水２００ｇ及び濃度２８％のアンモニア水Ｌｏｇを、
製造例３で使用したセパラブルフラスコに仕込みよ（撹
拌した。しかる後、これを撹拌しながら昇温し、８０〜
１００℃の温度で５時間反応させた。 反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色粉末状のＣ０Ａｐを１１０ｇを得た。 二〇Ｃ０Ａｐの物性分析結果を第１表に示す。 製造例５〜８ Ｃａ（ＨｚＰＯａ）ｔ−ＨｉＯ、ＣａＨＰＯ４・２Ｈ＊
０１ＣａＨＰＯａ、ＣａＣＯ５の各粉末、水及び有ＩＩ
ａ溶媒を第２表に示した条件でセパラブルフラスコに仕
込み、第２表に示した以外の条件については、実施例１
と同様な操作により白色粉末状のＣ０Ａｐを第２表に示
す量を得た。このＣ０Ａｐの物性分析結果を第１表に示
す。 製造例９ 製造例２を５０倍にスケールアップしてその再現性を確
認した。即ち、Ｃａ （ＮＯｘ） ！粉末４．１８ｋｇ
を溶解した水溶液５０ｊ！に濃度２８％のアンモニヤ水
を加えてｐＨ０に調整した後、これを撹拌機及び還流冷
却器を備えた有効容積５０２のステンレス製反応槽へ仕
込みよく撹拌した。 次いで、この水溶液に（ＮＨ４） １ｔｌＰＯ４粉末１
．９８ｋｇとＮ）１４ＨＣＯ３粉末５９５ｇを溶解させ
た混合水溶液５０１を２５０〜５００ ｄ／騙ｉｎ、の
速度で徐々に添加した。以下、製造例２と同様の操作を
行い、白色粉末状のＣ０Ａ９を第２表に示す量得た。こ
のＣ０Ａｐの物性を第１表に示す。 比較製造例１ 従来法によるＨＡｐ合成法（Ａ、ティセリウス（＾。 Ｔｉ５ｅｌｉｕｓ））らの方法Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈ
ｅ＋ｗ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 。 ６５、１３２（１９５６）） 。 有効容積３１のフラスコへ濃度０．５ｍｏｌ／ ｊ！の
ＣａＣ１，ｚ水溶液１ｆｆｉと濃度０．５ａ＋ｏｌ／
１のＮａｚＨＰＯ４水溶液１１を毎分１２０滴の割合で
同時に滴下し、撹拌棒でゆっくりと撹拌しながら反応を
行なった、滴下終了後、上澄み液をデカンテーションに
より除去し、残留した沈殿物を４回、各々２２の蒸留水
で洗浄した０次にこの沈殿物に２１の蒸留水を加え、更
に濃度４０％のＮａＯＨ水溶液を５０１加えた後１時間
沸騰した。 反応液を冷却後再びデカンテーションにより上澄液を除
き、再度２１の蒸留水で４回洗浄した。 次にｐＨ６，８で濃度０．０１ｓ＋ｏｌ／ Ｉｔの燐酸
ナトリウム緩衝液を２２加え沸騰する直前まで加熱した
。この操作を２度繰返すが、沸騰時間は各々５分と１５
分にした。次に、１１１１６．８で濃度０．０１ｍｏｌ
／ １の燐酸ナトリウム緩衝液を２２加え２度沸騰（各
１５分間）させて第１表に示す量のＩ）Ａｐ ３６．を
得た。 このようにして得られたＨＡｐはｐＨ６，８で濃度０．
００１ ｍｏｌ／ｆｆｉの燐酸ナトリウムＨｄｊ液に入
れ、冷蔵庫にて保存した。 その結果第１表に示す物性のＨＡｐを得た。またこのＨ
Ａｐの赤外吸収スペクトルを第５図に示すが、第５図か
らも明らかなように、炭酸根（Ｃ−０）の吸収スペクト
ル（１４５０ｃ＋ａ−’、８７０ ｃ＋ａ−’付近）は
見られなかった。 実施例１〜２ 内径７．６ ｎｕ＋、長さ１１００ＩＩのＨＰＬＣ用金
属カラムへ、製造例１及び２により得られたＣ０Ａｐを
定常の方法により１０ ｋｇ／ｃ＋ａ−Ｇの圧力でそれ
ぞれ充填し、充填終了後ＨＰＬＣ装置にこのカラムを装
着した。充填密度は０．５２ｇ／ｃｊであった。 また、カラムの分離能の評価を行なうためトリプトファ
ン（０，１６％）、牛血清アルブミン（４，６％）、リ
ゾチウム（２，０％）、チトクロムＣ（１，０％）を含
有する混合溶液を標準試料として用いて展開を行なった
。展開は、燐酸緩衝液１０ｎＭ（ｐＨ６，８）と３５０
ｍＭ（ｐＨ６，８）による直線濃度勾配法により行な
い、上記標準試料を１０．０μ！注入した。また、流速
は１０１１ ／ｌｌ１ｉｎになるように７．５ｋｇ／ｃ
ｄの展開圧とした。 タンパク質の検出は、２８０ｎｍの吸光度を測定した。 二〇カラムにより得られたクロマトグラムを第６図及び
第７図に示す。第６図及び第７図からも明らかなように
、主なピークが４カ所にあられれており、標準試料であ
る４次分がきれいに分離されていることがわかる。各ピ
ークは左側からトリプトファン、牛血清アルブミン、リ
ゾチウム、チトクロムＣに対応するピークであることを
ｔｉｌｌした。尚、チトクロムＣには、２種の異性体が
ありピークが２つに分離している。 実施例３〜４ 製造例２及び９で得られたＣ０Ａｐを用い、以下に示す
カラムクロマトの操作手順に従って牛血清アルブミンの
分離を行なった。即ち、Ｃ０Ａｐ各ｌｏｇを５００ ｄ
のビーカーにとり、イオン交換水（以下単に水と略記す
る）を静かに加え、ゆっくり撹拌する。１０分間静置後
デカンテーシッンする。この操作を上澄みが清澄になる
まで繰り返す。その後直径１０ｍ＋ｍのクロマトグラフ
ィー用（ＬＣ用）のガラスカラムに懸濁したＣ０Ａｐを
重層する（充填高さ１００〜１２０ｍｍ ） 、その後
ガラスカラムの洗浄を水で行ない、同時に流速の測定を
行なう（約１０ｄ／Ｉｔになるように充填する）０次に
濃度が１％になるように水に溶かした牛血清アルブミン
をｌ ｄｃＯＡｐカラムに吸着させる。この時の操作は
すべて室温で行なう。次に吸着させた生血端アルブミン
を分離するため、燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，８）
で展開を行なう、溶出液は重量分画型のフラクションコ
レクターで収集する（ｌ試験管あたり２．５ｇの溶出液
）、得られた溶出液の吸光度は紫外部 ２Ｂ０ｎｍで測
定した。これにより得られた結果を第８図及び第９図に
示す。第８図、第９図から本発明のＣ０Ａｐはすぐれた
分解能を示し、吸脱着に優れているのがわかる。 実施例５ 内径７．６ ｓ＋ｓ、長さ１００ｍｍのＨＰＬＣ用カラ
用心ラム０ｋｇ／ ｃｄ−Ｇの圧力で製造例３により得
られたＣ０Ａｐを、実施例１及び２と同様の方法で充填
し、それ以降の操作は、実施例１及び２と同様にして）
ＩＰＬｃ用カラムの操作を行なった。充填密度は０．５
２ｇ／ｃｄであった。各ピークの保持時間及び半値幅に
よりその結果を第３表に示す。第３表かられかる通り実
施例１及び２で得られたクロマトグラムと同じ結果を示
した。 実施例６ 内径７．６■、長さ１００ｍ＋ｗのＨＰＬＣ用カラ用心
ラム０ｋｇ／ ｃｆｆｌの圧力で製造例６により得られ
たＣ０Ａｐを充填し、それ以降の操作は、実施例１及び
２と同様にしてＨＰＬＣ用カラム操作を行なった。充填
密度は０．６０ｇ／ａｊであった。その結果を実施例５
と同様に第３表に示す、第３表からもわかる通り、実施
例１及び２で得られたクロマトグラムと同じ結果を示し
た。 実施例７ 実施例６で使用したカラムに対し、標準試料の分離を３
００回行なった。３００回目に得られたクロマトグラム
の結果を実施例５と同様に第３表に示す、第３表からも
わかる通り、本発明のカラムは３００回の繰返し使用に
対しても良い分離能を示し、優れた耐久性をもっている
ことがわかる。 実施例８ 内径７．６ ｍｔｍ、長さ１００ｍｍの１（ＰＬＣ用カ
シカラム５００ｋｇ／ｃｄ−Ｇの圧力で製造例７により
得られたＣＯ＾ｐを密度１．０３ｇ／ｃ＋４に充填し、
それ以降の操作は実施例１及び２と同様な操作でＨＰＬ
Ｃ用カラ用心ラムを行なった。その結果を実施例５と同
様に第３表に示す。 第３表から、高い圧力でｃｏｎｐをカラムへ充填してい
るにも拘らず、実施例５及び６で得られたクロマトグラ
ムと同じ結果を示し、耐圧性に優れていることがわかる
。 実施例９ 内径２１１．長さ２５〇−鋼の分取用カラムに、８０ｋ
ｇ／ｄ−Ｇの圧力で、製造例５に従って得たｃｏａｐを
密度０．６２１／ｃ−に充填し、操作法は実施例１及び
２と同様な方法でＨＰＬＣ用カラムの操作を行なった。 ただし標準試料は７０μｌ注入した。これにより得られ
たクロマトグラムの結果を実施例５と同様に第３表に示
す、第３表の結果から本発明のカラムによれば通常のＨ
ＰＬＣと同じ結果が得られ、分取用としても十分使用可
能であることがわかる。 実施例１０ 内径７．６ ＋＋ｎ、長さ１００ｍ翔のＨＰＬＣ用カラ
ムに、８０ｋｇ／ｃｄ−Ｇの圧力で、製造例７に従って
得たＣ０Ａｐを密度０．５８ｇ／ｃｊに充填し、それ以
降の操作は実施例１及び２と同様に行なった。ただし展
開中の流速が３ 、４ ｄ ／ｌａ ｉ ｎ、になるよ
うに圧力を５０ｋｇ／ｃｄ−Ｇに調整した。これにより
得られたクロマトグラムの結果を実施例５と同様に第３
表に示す、第３表からもわかる通り、分離を短時間で行
なわれたにも拘らず、各々の４つのピークがきれいに分
離していることがわかる。 実施例１１ 実施例５で使用したＨＰＬＣカラムを用い、核酸に対す
る分離能の評価を炭酸塩を展開液として行なった。 核酸のサンプルには米国シグマ社製の子牛胸腺デオキシ
リボ核酸（ＯＮ＾）を使用し、展開は蒸留水と炭酸水素
アンモニウム水溶液２Ｍ （ｐｌ＋７．８）による直線
濃度勾配法により行ない、上記サンプルを１０．０μ２
注入した。また、流速は１ｍ／ａｋｉｎ、になるように
７．５ｋｇ／ｃ＋ｉ−Ｇの展開圧とした。 核酸の検出は２６０ｎａ＋の吸光度を測定した。このカ
ラムにより得られたクロマトグラムを第１０図に示す、
第１Ｏ図からもわかるように主なピークが２カ所にあら
れれ、一部熱処理を行ない一本鎖となった核酸が、二本
鎖のそれときれいに分離されていることがわかる。さら
にそれぞれのピーク分取液にエタノールを加え、核酸を
糸状沈殿物として直接回収した。 実施例１２ 標準試料による分離能評価を終えた実施例６で使用した
カラムについて、実施例１１の操作を５０回行なった０
本操作終了後、再度、標準試料による分離能評価を行な
ったところ、カラムの劣化は全く見られなかった。 比較例１ 比較製造例１に従って得たＨＡｐを用い、以下、実施例
３及び４と全く同一の方法で、牛血清アルブミンの分離
を行なった。得られた結果を第１１図に示す。 実施例３及び４ではすぐれた分離能を示し、吸脱着にす
ぐれているのに対し、比較製造例１に従って得た炭酸根
を含有していないＲＡＰは、第１１図から回収量が劣る
ことがわかる。 比較列２ 比較製造例１に従って得たｎａｐを内径７．６ ｍｍ、
長さ１００１のカラムに充填し、その後の操作は実施例
４と同様な操作で標準試料の分離を行った。 尚、この時の充填密度は０．２８ｇ／ｃ＋４であった。 また流速をｌ ａｔ／ｓｉｎ、にするため、Ｉｋｇ／ｃ
ｄ−Ｇの圧力になるように調整を行なったが、ＨＰＬＣ
としては低圧になるため、操作に困難をきたした。 これにより得られたクロマトグラムを第１２図に示す、
第１２図と第６図及び第７図との比較からもわかる通り
、従来法に従って得たＨＡｐを充填したものは、全体的
にブロードなピークを示した。 比較例３ 比較製造例１に従って得たＨＡｐを、内径７．６ ＋ｕ
＋、長さ１ｏｏｎ＋ｍのカラムに充填圧力１５ｋｇ／ｄ
−Ｇで充填した。しかし内部で結晶が破壊され目づまり
が生じ、展開を行うことができなかった。 比較例４ 比較製造例１に従って得た１ＩＡｐを、内径７．６ ｍ
ｍ、長さ１００１１１１のカラムに充填して、実施例１
２と同様な操作を行なったが、五回目でカラム圧力が上
昇し展開が不可能となった。 〔発明の効果］ 以上詳細に説明したように、本発明は炭酸根をＣＯ３と
して０．５％以上含存したｃｏＡｐをＬＣ用または）Ｉ
ＰＬＣ用カラムの充填剤として使用する、また、このＣ
ＯＡρを充填してなるカラムの発明である。 従来ＬＣ用またはＨＰＬＣ用カラムは充填材が）ＩＡｐ
であるので、分離能にやや問題があると共に、耐圧・耐
久性に劣るという問題があった。また、ＨＡｐが品質的
に再現性良く製造できないという重大な問題もあった。 これに対し本発明の充填材はＣ０Ａｐであるので分離能
が優れており、また結晶の強度が大きいため耐圧・耐久
性にも優れている。従って、２００回以上の繰返し使用
が可能で、優れた耐久性を持っている３以上のことから
、本発明のＣ０ＡＰは特にＨＰＬＣ用充填材として使用
した場合、充填密度を０．５ｇ／Ｃ−以上とすることが
できるので、ＨＰＬＣ特有の展開条件下で一層向上した
分離能を示すのである。 さらに、従来のＨＰＬＣ用カラムは耐圧・耐久性に劣る
のに対し、本発明のカラムにおいてはＣ０Ａｐ結晶が破
壊されにくく、従って、容易に０．５ｇ／ｃ−以上の密
度で充填することができ、カラムの強度も大で少なくと
も１（ＰＬＣの実質的な充填圧力である１０ｋｇ）ｄを
満足し、さらに５００ｋｇ／ｃ＋ａ以上の高い圧力をか
けても充填材であるＣ０Ａｐ自体には全く支障がない。 また、本発明のＣ０Ａｐは従来のＨＡｐと異なり結晶を
配向させながらＨＰＬＣ用カラムに充填するという煩雑
な操作を必要としないので、簡単にカラム充填が行なえ
るという利点がある。さらに圧力の調整により流速制御
ができるので展開液も従来品に比べ少量で済むという利
点もある。さらにまた、本発明のカラムは分析を目的と
したＨＰＬＣ用カラ用板ラム以外取を目的とした分取用
ＨＰＬＣ用カラムとしても好適に使用でき、必要とされ
る試料を短時間のうちに純度よく分離・精製することが
可能であるのである。 また、ＨＡｐを充填した従来のカラムを使用して分取を
行なう場合、分取したサンプルの溶離液として通常燐酸
塩の液が使用される関係上、溶離後の処理として脱塩を
必要とする場合もしばしばあるが、この場合分離操作自
体は短時間であっても、後処理を含めると決して短時間
とはいえなかった。しかし本発明では充填材としてＣＯ
Ａρを使用しているので、溶離液としてこれまで不向き
と考えらていた、揮発性の炭酸塩系溶離液が使用可能で
あるので、後処理の時間を大幅に短縮できるという利点
も有している。この点は特に核酸を分離・精製する際に
威力を発揮する。 即ち、核酸類としてたとえばプラスミドＤＮ＾を分離・
精製する場合は、分離後最終的には分取液にエタノール
を加え核酸を沈殿させ回収保存される。しかしこの操作
は燐酸塩を含む液では燐酸塩も共に析出沈殿するので前
処理として燐酸塩の脱塩が必要であった。しかしながら
ここで揮発性塩を使用すれば、直接エタノール添加によ
る沈殿析出が実施可能であり、合計の処理時間が大幅に
軽減される。 ここで脱塩処理とは、透析のことを指し、溶離液に燐酸
を使用した場合、この処理には通常１５〜２４時間を必
要としていたが、本発明では炭酸塩系溶離液が使用可能
であるので、この脱塩処理時間は１時間以内と大幅に短
時間で完了することができる。この炭酸塩系溶離液の使
用はＣ０Ａｐの如く炭酸根を含有するアパタイトを使用
することで初めて達成できるものであり、従来の如きＨ
Ａｐでは達成できない。 以上種々列記した通り、ＬＣ用及びＨＰＬＣ用カラムの
充填材にｃｏａｐを使用することにより種々の効果があ
り、本発明の効果は経済的に極めて大なるものがある。
第１図及び第３図は製造例１及び製造例２で得られた本
発明のｃｏａｐのＸ線回折図であり、第２図及び第４図
は同じく製造例１及び製造例２で得られたｃｏａｐの赤
外吸収スペクトルを表す図である。 第５図は比較製造例１で得られたＨＡｐの赤外吸収スペ
クトルを表す図である。 第６図及び第７図は実施例１及び実施例２で行なったＨ
ＰＬＣ用カラムによる牛血清アルブミンを展開して得ら
れたクロマトグラムである。第８図及び第９図は実施例
３及び実施例４で行なったＬＣ用カラムによる生血清ア
ルブミンを展開して得られたクロマトグラムである。 第１Ｏ図は実施例１１で行なったＨＰＬＣ用カラムによ
る核酸を展開して得られたクロマトグラムである、第１
１図は比較例１で行なったＬＣ用ガラスカラムによる牛
血清アルブミンを展開して得られたクロマトグラムであ
る。第１２図は比較例２で行なったＨＰＬＣ用カラムに
よる生血清アルブミンを展開して得られたクロマトグラ
ムである。 特許出願人 三井東圧化学株式会社 第２図 （ｃｍ−） ｍ４図 （ｃｍ−１） 第５図 ４（９） 蕉 薫 −１（８） ■（ｃｍ力 第６図 ０ １０ ２０ （ｍｉｎ）第７
図 ０ １０ ２０ （ｍ’＋ｎ）第８図 分画番号 第９図 分画番号 第１θ図 ０ １０ ２０（ｍｉｎ）第１１
図 分画番号 第１２図 ０ １０ ２０ （ｍｉｎ）手続（甫
正書（自発） 平成１年８月４日 特許庁長官 吉 １）文 毅 殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第１１７０９６号 ２、発明の名称 液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都千代田区霞が関三丁目２番５号名称（３１
２） 三井東圧化学株式会社４、補正により増加する
請求項の数 零５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 別紙のとおり（補正の対象の欄に記載した事明細書 １、発明の名称 液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム２、特許請
求の範囲 ｌ）炭酸根をＣＯｓとして０．５重量％以上含有したヒ
ドロキシアパタイトからなることを特徴とする液体クロ
マトグラフィー用充填材。 ２）炭酸根をＣｏ３として０．５重量％以上含有したヒ
ドロキシアパタイトを充填してなることを特徴とする液
体クロマトグラフィー用カラム。 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は、炭酸根を含有したヒドロキシアパタイトから
なる液体クロマトグラフィー川充填材、及びこれを充填
してなる液体クロマトグラフィー用カラムに関するもの
である。 〔発明の前景〕 アパタイトとは広義には、下記０）式の組成式で表わさ
れる化合物をいい、この式でＭはＣａ、 Ｐｂ。 Ｂａ５Ｓｒ、 Ｍｇ％Ｎｉ、Ｈａ％に％Ｆｅ％Ａｔその
他の金属原子を、ｚ０４はＰＧ、 、Ａｓ１ａ、ＶＯ４
％ ＳＯａ 、 ５ｉＯａ、ＣＯ，その他の酸根を、Ｙ
はＦ、ＯＨ，ＣＦ４、Ｂ「、０、ＣＯ３その他の陰イオ
ン性原子（団）を示す広範囲な化合物群の総称である。 ？Ｉ”ｘ、Ｍ”−（ｚＯ’−ａ）ｉＹ−＊ −−−−−
（１）（ｎ＋■−１Ｏ１ｎ・０及び−〇の場合も含む）
本発明においては、上記（１）式においてＭが実質的（
すなわち、不純物レベルの他の原子、原子団が入っても
よい）にＣａであり、ＺＯ，が実質的にＰＯ。 であり、Ｙが実質的に０１１である化合物をヒドロキシ
アパタイトと呼ぶ、そして、ここでｚ０４または／及び
Ｙの一部がＣＯ３で置換されたものを炭酸含有ヒドロキ
シアパタイトと呼ぶ。 ヒドロキシアパタイト（以下■＾ｐと略記する）は、天
然歯や天然骨と同じ化学組成を持つ無機化合物であると
ころから、生体物質との親和性に優れているという特性
を有し、蛋白質、核酸、酵素等の生体高分子物質の分離
・精製を目的とした液体クロマトグラフィー（以下、Ｌ
Ｃと略記する）用カラムの充填材として好適に使用され
ている。 さらに、近年高速液体クロマトグラフィー（以下１１Ｐ
Ｌｃと略記する）の普及により少量の試料を短時間で処
理すること（＠量分析）、あるいは−度に大量の試料を
しかも短時間に処理すること（大量分取）が可能となり
、ＩＩＡｐのこの分野への応用は今後益々広がることが
予想される。従って、ＩＩＰＬＣを含むＬＣ用のカラム
充填材として、さらに高性能でかつ使用しやすい１ｌＡ
ｐの開発が望まれている。 〔従来の技術及び発明が解決しようとするｆｆ！題〕従
来のＬＣ用のカラム充填材に使用される１１＾ｐは、＾
、Ｔｉ５ｅ１１ｕｓ＋ｅｔ、ａ１．＋により発表された
、水溶性のカルシウム塩と水溶性の燐酸塩を反応させる
湿式合成法（＾ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、＋６５．１３２（１９５６））をもとに適宜改良を
加えた方法で製造されたものが一般的であつた。これら
の方法で得られた１１Ａ、は従来、ＬＣ用カラム充填材
としての性能がすぐれているといわれているものであっ
て、次のような物性を示すのが通常である。 Ｃａ／Ｐ比 １．４〜１．５５ Ｘｌｉ１回折 回折ピークが弱い。 ＣＯ３含有ｆｉｔｏ、１ｆｆｉｆｆｉ％未満しかしなが
ら１ｌＡｐを製造する上記従来の方法は、原料の調整、
ｐＨ管理、撹拌核層、温度管理等の反応右よびその後の
処理等に非常に煩雑な操作を必要とする。 しかも、この方法では、品質的に再現性良く、＋１＾ｐ
を製造することは大変困難である。更には、この方法を
工業的にスケールアップすると、小型スケールと比較し
てその再現性が著しく乏しくなり、工業的実施には不向
きな方法である。その上、得られた前記物性のＩＩＡｐ
は、燐酸ナトリウム緩衝液中で冷所保存しなければ、そ
の物性を維持できないという問題もある。 以上述べたようにＬＣｍカラム充填材として生体高分子
の分離・精製に優れた性能を発揮する１ｌＡｐを、従来
公知の方法で再現性よ＜！１１造することが困難であり
、この点からＩＩＡｐは高価なものとなっている。その
ため、１ｚ静は生体高分子の分離・精製のためのＬＣｍ
カラム充填材として他の充填材と比較して使用頻度が極
度に少なく、限られた分野で使用されているのが実情で
ある。 また、従来使用されているＨＡｐは、耐圧性及び耐久性
において必ずしも十分でな（、特にＩＩＰＬＣでの長期
にわたる繰り返し使用が制限されていた。 本発明は、上述の従来技術における問題を解決するため
になされたものである。 本発明の目的は、品質的に安定した製造が可能であり、
製造コストの低減化が可能なＩ＋静を提供することにあ
る。 本発明の他の目的は、ＩＩＰＬｃを含めたＬＣ用のカラ
ム充填材として、特に生体物質の分離能が向上した１１
＾ｐを提供することにある。 本発明の他の目的は、耐圧および耐久性に優れたＩＩＡ
Ｉ）からなるＩＩＰＬｃを含めたＬＣ用のカラム充填材
を提供することにある。 本発明の他の目的は、耐久性および生体物質の分離能に
優れたＩＩＰＬＣを含むＬＣ用に好適なカラムを提供す
ることにある。 （課題を解決するための手段） 本発明者らはこれら種々の問題を解決するために鋭意検
討を重ねた結果、訝＾ｐ中に炭酸根を含有させることで
、再現性よ＜ＩＩ静を製造することができ、かつ、この
炭ｒａｍをｃｏ、として０．５重量％以上含有したＩＩ
Ａｐ（以下、炭酸根を含有した１１＾ｐを炭酸含有ヒド
ロキシアパタイトと称し、Ｃ０Ａｐと略記する）は、生
体高分子の分離能力がＩＩＡｐより更に優れているため
、上記の目的がすべて達成されることを見出し、本発明
を完成するに至ったものである。 すなわち本発明の第１は、炭酸根をＣＯ３として０．５
重量％以上含有したヒドロキシアパタイトからなること
を特徴とする液体クロマトグラフィー用充填材であり、
第２は炭酸根をＣＯ３として０．５重量％以上含有した
ヒドロキシアパタイトを充填してなることを特徴とする
液体クロマトグラフィｍｍカラムの発明である。 〔発明の詳細な開示〕 以下、本発明の詳細な説明する。 本発明のＬＣｍカラムの充填材は、炭酸根をＣＯＳとし
て０．５重量％以上含有したＣ０Ａｐからなる。この充
填材をカラムに充填することにより、本発明のＬＣｍカ
ラムを得ることができる。 なお、本発明の充填材およびカラムの用途としテノ”Ｌ
Ｃ’は’ＩＩＰＬｃ’を含む。 従来のＩＩＡｐからなる充填材を用いたＬＣｍカラムは
先に述べたように、分離能にやや問題があると共に、耐
圧、耐久性に劣るという問題があった。 また、１１＾ｐが品質的に再現性良く製造できないとい
う重大な問題もあった。さらに、従来のＩＩＡｐは耐圧
性および耐久性に劣るので、ＩＩＰＬｃでの繰り返し使
用での良好な耐久性が得られなかった。 これに対し本発明のＣＯＡρからなる充填材は、品質的
に再現性良く製造可能であり、しかも生体物質の分離能
が高い。 さらに、Ｃ０Ａｐ結晶の物理的強度が高いので、本発明
の充填材は、耐圧性および耐久性に優れる。 その結果、本発明の充填材をカラムに充填する際の充填
圧として、少なくとも５００ｋｇ／ｃｊまでの高圧が採
用できる。 さらに、本発明の充填材を充填したカラムは、■円、Ｃ
における繰り返し使用の耐久性に優れる。 また、従来のＩＩＡ、は平板状の結晶形状をしているた
め、結晶を配向させながらＩＩＰＬｃｍカラムに充填す
るという煩雑な操作を必要としたが、本発明で用いるＣ
ｏ静の場合は、そのような配慮は特に必要がないので簡
単にカラム充填が行なえるという利点がある。さらに圧
力の調整により流速制御ができるので展開液も従来品に
比べ少量で済むという利点もある。さらにまた、本発明
のカラムは分析を目的としたＩＩＩ’ＬＣ用カラム以外
に、分取を目的とした分取用Ｉｌｌ”ＬＣ用カラムとし
ても好適に使用でき、必要とされる試料を短時間のうち
に純度よく分離・精製することが可能であるのである。 また、１１＾ｐを充填した従来のカラムを使用して分取
を行う場合、分取したサンプルの溶離液として通常燐酸
塩の水溶液が使用される関係上、溶離後の処理として脱
塩を必要とする場合もしばしばあるが、この場合分！Ｉ
湿作自体は短時間であっても、後処理を含めると決して
短時間とはいえなかった。しかし、本発明のＣ０Ａｐか
らなる充填材に対しては、ｔ８ｊｕｌ液としてこれまで
アパタイトクロマトには不向きと考えられていた、揮発
性の炭酸塩系溶離液が使用可能である。従って、カラム
から溶出した情製フラクシッンを直接凍結、乾燥させて
目的物を高純度品として回収するか、または、加温また
は／および減圧操作により塩を短時間に揮発、除去し、
つぎの工程での艮作に用いることができるので後処理の
時間を大幅に短縮できるという利点も有している。この
点は特に核酸を分離・精製する際に威力を発揮する。 即ち、核Ｍ類としてたとえばプラスミドＤＮＡを分離・
精製する場合は、分離後最終的には分取液にエタノール
を加え核酸を沈殿させ回収保存される。しかしてこの操
作は燐酸塩を含む液では燐酸塩も共に析出沈殿するので
沈殿回収の前処理として燐酸塩の脱塩が必要であった。 しかしながらここで例えば炭酸水素アンモニウムのよう
なアルコールに対する溶解度の大きな揮発性塩を使用す
れば、直接エタノール添加による沈殿析出が実施可能で
あり、合計の処理時間が大幅に軽減される。 ここで脱塩処理とは、透析のことを指し、溶離液に燐酸
緩衝液を使用した場合、この処理には通常１５〜２４時
間を必要としていたが、本発明では炭酸塩系溶離液が使
用可能であるので、この脱塩処理時間は１時間以内と大
幅に短時間で完了することができる。この炭酸塩系溶離
液の使用はＣＯＡｐの如く炭酸根を含有するアパタイト
を使用することでより効果的となる。 上述のように、本発明の炭酸根含有アパタイトからなる
ＬＣ用充填材およびこれを充填したＬＣ用カラムの利点
として従来不可とされていた炭酸根を含む溶離液を用い
ることができる点もあげられる。 すなわち、これまでの１ＩＡｐを充填したＬＣｍカラム
に炭酸根を含む溶離液を通液するとカラムが閉塞し通液
が困難となる。これは炭Ｎｉ根がアパタイトと反応を起
こすためと考えられる。 一方、本発明の炭酸根含をアパタイトの場合はあらかじ
め炭酸根を含有しているために炭酸根を含む溶離液を通
液しても問題を生じないものと考えられる。 以上種々列記した通り、ＬＣ用およびＩＩＰＬｃｍカラ
ムの充填材にＣＯＡ、を使用することにより種々の効果
があり、本発明の効果は経済的に極めて大なるものがあ
る。 本発明のＬＣ用充填材は、炭酸根をＣＯｓとして０．５
重量％以上含有したＣ０Ａｐからなる。 本発明における炭酸根含有量とは日本化成肥料協会技術
専門委員会（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｍ１ｔＬｅｅ
ＪａｐａｎＰｈａｓｐｈａＬｅ ｌ Ｃｏｍｐｏｕ
ｎｄ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔ
ｕｒ−ｅｒ”ｓ Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）の定める燐
鉱石分析法に準じて測定した無水炭酸（Ｃｏｄ）の測定
値をＣＯ３含有量に換算したものとする。 本発明で用いられるＣ０Ａｐの製造方法には特に制限は
なく、従来公知の方法が利用できる０例えば第二燐酸カ
ルシウムと炭酸カルシウムをアンモニア水中で反応させ
る方法（特公昭５８−３０２４４号公報の方法）や、第
二燐酸カルシウム２水塩と炭酸カルシウムとを水中で反
応させる方法（特開昭６０−５００９号公報の方法）、
本発明者らが先に提案した、有機溶媒を含む反応媒体中
で燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウム
とを反応させる方法（特開昭５９−１０７９１２号公報
）など、いずれの方法でも得ることができる。 しかしながら、本発明に使用するＣＯＡ、中には、炭酸
根がＣＯｓとして０．５重量％以上の範囲で含有してい
るのが好ましい なお、アパタイトの製造技術の面からはＣＯｓ含有量と
して７．０重量％まで調節可能であるが５．０重量％を
越える場合はクロマトグラフィーの充填材としての分離
性能が低下して好ましくない、従って、本発明において
はＣＯＡｐは燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸
カルシウムとを、アンモニア水、水、有８１溶媒の何れ
かまたはそれらの混合物の反応用媒体中で下記する如き
モル比で反応させて得ることができる。 すなわち、反応槽にアンモニア水、水、有機溶媒の単独
もしくはそれらの混合物を反応用媒体として仕込み、こ
れに燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウ
ムとを加えて、通常大気圧下にて反応用媒体を加熱し、
蒸発した反応用媒体は還流させる方法で反応させる。な
お、この際の燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸
カルシウムの割合はカルシウムと燐の原子比がＣａ／Ｐ
として１．３０〜ｌ１．９０好ましくは１．４５〜１．
７５の範囲で、また、炭酸根と燐の割合はＣＯｓ／ＰＯ
ａ として０．０１５〜１．９０の範囲で実施される。 反応時間は、媒体がアンモニア水または水の場合は概ね
５〜８時間必要であり、反応用媒体が有機溶媒を含有す
る場合は約２時間もあれば十分である。 加熱終了後は生成したＣ０Ａｐが析出しスラリー状とな
っているので、これを通常公知の方法で濾別・分離し、
乾燥すれば良い。 ＣＯＡｐの原子比（Ｃａ／Ｐ）は、理論的には５／３で
あるのでカルシウムと燐との反応時における原子比も５
／３ζ１．６７が最適であるはずであるが、実際の反応
に際しては、原子比が上記の範囲内にあれば好適にＣ０
Ａｐを合成することができる。 上記反応の原料として使用する燐酸または／及びそのカ
ルシウム塩としては、ｌ１ｓＰＯｎ 、１ＩｎＰ ｔｃ
ｈ、ｕｐｏｓ、Ｐ＊Ｏｓｂ Ｃａ（ＩｌｔＰＯ４）ｔ
・１１１０ ％ Ｃａ（ＰＯｓ）＊、Ｃａ１１ＰＯｎ、
Ｃａ１ｌｌ”０４ｊ ２１１ｔＯ１ＣａｚＰｔＯｙ、Ｃ
ａ５（ＰＯａ）ｔ 、Ｃａ１１１ｇ （ＰＯ４） 、
・５１１ｇＧ、等が使用可能である。しかしながら、こ
れらの化合物は本発明において使用可能な原料の一部で
あって、これらに限定する必要はない、また、これらの
化合物は特に高純度のものを使用する必要はなく、通常
市販の工業用のもので十分である。今一つの原料である
炭酸カルシウムも同様に、工業用のもので十分である。 カルシウム源として、上記の如き燐酸のカルシウム塩の
外にＣａＯｓ Ｃａ（Ｏｌｌ）ｔ 、ＣａＣ１，Ｃａ（
ＮＯｓ）ｔｌ（ＣＩ＋ＩＣ０Ｏ） ｔｅａ等のカルシウ
ムの酸化物、水酸化物及び無機酸並びに有ａ酸のカルシ
ウム塩を使用することも可能である。 また、炭酸源として、本発明ではカルシウム原子の補給
にもなるので炭酸カルシウムを使用するがＸ＊ＣＯｓ
、Ｋ１１ＣＯ３、Ｎａ＝ＣＯｓ、Ｎａ１ｌＣＯ，、（Ｎ
ＩＩＪ ｚｃＯｓ、Ｎｌ１ｎｌｌＣＯｓ等の炭酸塩や炭
酸ガスを使用しても差支えない。 本発明においては、炭酸カルシウムと上記の如き燐酸ま
たは／及びそのカルシウム塩の一種類以上を適宜選択し
て、カルシウムと燐の原子比Ｃａ／Ｐが１．３０〜１．
９０．好ましくは１．４５〜１．７５となるように反応
槽に投入すればよい、また、上記炭酸カルシウムの投入
量を変化させることにより、生成するＣ０Ａｐ中に含有
する炭酸根の含有量を！ｇＩｗｉすることが可能であり
、この方法により炭酸根をＣＯｓとして７．０重量％以
下の範囲で調節することができる。 本発明において、反応用媒体の使用量はその種類、反応
時の原料の種類、反応時の撹拌状態などによりそれぞれ
適性値が異なるが、いずれの条件においてもスラリー濃
度として５〜６０重量％程度となる量が好ましい。 本発明において、ＣＯ静の製造の際に反応用媒体として
アンモニア水を使用する場合は、濃度が５〜２８重盟％
のアンモニア水溶液を用いて、反応媒体のｐｌ＋を７〜
１１の範囲で適宜調節して反応を行なう。 また反応用媒体として使用できる有機溶媒としては、例
えばベンゼン、トルエン、キシレン、ペンタン、ヘキサ
ン、ヘプタン、オクタン、デカン、各種石油ナフサや工
業用ガソリン等の芳香族及び脂肪族炭化水素類ＨＩｇｏ
−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール等のアルコ
ール類；トリエチルアミン、トリブチルアミン、エタノ
ールアミン等のアミン頬；エチルエーテル、エチルブチ
ルエーテルや各種セルソルブ、カルピトール等のエーテ
ル類；メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等
のケトン類が挙げられる。しかしこれらは本発明におい
ては使用可能な有機溶媒の一例にすぎない。 かくして得られたＣＯＡｐは、液体クロマトグラフィー
用、特に高速液体クロマトグラフィー用充填として使用
した場合、生体高分子物質の分離・精製に、従来の１Ｉ
Ａｐを使用した場合よりも更に優れた性能を示す。 本発明において用いられるＣＯＡｐの粒径については０
．５〜５０ｐ−の範囲のものを用いることが好ましい、
さらに好ましくは、２〜Ｌ５ｔｔ■のものが選択される
。 本発明においては、このＣＯ静をカラムに充填して液体
クロマトグラフィー用カラムとするが、Ｃ０Ａｐをカラ
ムに充填する方法としては、従来公知の湿式充填法（ス
ラリー法）等を使用できる。 すなわち、湿式充填法には平衡密度法、非平衡密度法、
高粘度法などがあるが、これらの中から充填材であるＣ
ＯＡｐの粒径または／及び物理的強度を考慮し、適宜好
ましい充填法を選択すればよい。 ＣＯＡ、をＩＩＰＬｃｍカラムに充填するには、パッカ
ーと呼ばれる充填容器と高圧ポンプが必要である。 また、充填には充填用溶媒を用い、Ｃ０Ａｐはこの溶媒
の１〜２０重量％のスラリーとして上記パッカーに流し
込み、７０〜３５０ｋｇ／ｃｊの間の一定圧力で充填す
るのが望ましい。 上記の充填用溶媒としてはテトラブロモエタン、テトラ
クロロエチレン、四塩化炭素、メチルアルコール、エチ
ルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピル
アルコール、水、アセトン、ジオキサン、クロロホルム
、テトラヒドロフラン、シクロヘキサノール、エチレン
グリコールなどが挙げられる。そして、これらの溶媒の
一種または二種以上を組み合わせればよい。 本発明の充填材を充填するカラムの材質、形状、大きさ
はその用途に応じて選択することができる。 すなわち、カラムの大きさについては、内径ｌ■−程度
の小型分析用から内径１０Ｇ−１以上の分取用のサイズ
のカラムに適用することができる。 例えば、ｌＩＩ’Ｌｃ用カラムの用台ラム内径３−有効
長さ３０ｍ５＋程度の分析用カラム、内径７．６ｍ■有
効長さ１０Ｇ＋ｓ−程度の分析およびミクロ分取用カラ
ム、内径５０〇−有効長さ５００■−の大型分取用カラ
ムなどが例としてあげられる。 本発明の充填材はこれらの分析用小型カラムから分取用
大型カラムまでその分離特性のカラムのスケールに対す
る依存性が極めて少ない。 また、カラムの材質については通常液体クロマトグラフ
ィー用カラムに使われる材質、例えば、ステンレススチ
ール、ガラス、樹脂などの一般的な材質が使用てきる。 なお、本発明の充填材をｎｐｔｃ用のカラムに充填する
場合には、充填密度を０．５ｇ／ ｃ−以上とすると、
分離性能が更に向上するので好ましい、また、あまり充
填密度を上げるとカラムの通液抵抗が大きくなり好まし
くないので充填密度の上限は１．１ｇ／ ｃｄ程度であ
る。 （実施例〕 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。尚
、以下において％は重量％を表す。 製造例１ 蒸留水２ Ｎ、 Ｃａ（Ｏｆｆ）＊粉末７４Ｉ！及びＣ
ａＣＯ５粉末６８ｇを、撹拌機及び還流冷却器を備えた
有効容積３ｊ！のセパラブルフラスコに仕込み、撹拌し
ながら更に濃度４０％の１１３ＰＯ４水溶液２００ ａ
ｔを１５分間で添加した後、加熱して沸騰温度（約９８
℃）で５時間反応させた。 反応終了後は生成物を冷却後、加圧濾過機で濾過・水洗
し、次いで１３０℃で１６時間乾燥して白色の粉末を８
３ｇ得た。 この粉末のＸ線回折図を第１図に示す。 第１図より明らかなようにＸ線回折図は回折角度２０−
３１．７．３２．２．３２．８ニ主ヒークを有し、Ａ３
７Ｍカード９−４３２に記載のＣ０Ａｐの特性回折ピー
クと一致した。また赤外吸収スペクトルを第２図に示す
、第２図より明らかなように１４５０ｃｍ−’、８７０
ｅｌｌ −’付近にＣ−０の吸収ピークが観察された。 ＣａＯ含有量はＩ！ＤＴ＾キレート滴“定法により、
Ｐ２Ｏ，含有量は比色定量法により測定した。また二〇
Ｃ０Ａｐの物性分析結果を第１表に示す。 製造例２ Ｃａ （ＮＯｓ） ｚ粉末８３．６ｇを溶解した水溶液
Ｉｎに濃度２８％のアンモニヤ水を加えてｐＨＩＯに調
整した後、これを製造例１で使用したセパラブルフラス
コに仕込みよく撹拌した。 次いで、この水溶液に（Ｎｉ１４） ＊ＩＩＰＯｍ粉末
３９．６ｇとＮｌＩ４１１ＣＯｓ粉末１１．９ｇを溶解
させた混合水溶液１２を５〜１０ ｙｄ ／ ｍ ｉ
ｎの速度で徐々に添加した。しかる後これを撹拌しなが
ら加熱し、沸騰温度（約９８℃）で５時間反応させた。 反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色の粉末を３８ｇ得た。この粉末のＸ＆’ｉ回
折図を第３図に示す。 第３図より明らかなようにＸ線回折図の回折角度は第１
図と同じ主ピークを有し１．Ｃ１１ｌｐと特定される。 また赤外吸収スペクトルを第４図に示す。 第４図より明らかなように第２図と同様のＣ−０の吸収
ピークが観察された。またこのＣａ静の物性分析結果を
第１表に示す。 製造例３ Ｃａ（Ｉｌｘｌ”０４）ｔ ・１ｌｔｏ ７５．６ｇ
５ＣａＣＯ３７０，Ｏｇ 、水１００ｇ及びｎ−ヘキサ
ン３５０ｇを、撹拌機及び還流冷却器を備えた有効容ａ
ｌｌ！のセパラブルフラスコに仕込み、撹拌しながら昇
温させ還流温度（６３℃）以下で約２時間加熱し反応さ
せたのち、セパラブルフラスコ内の水分と１−ヘキサン
を蒸発させ、留出したｎ−ヘキサンと水に相当する容量
のｎ−ヘキサンを系内に加えながら加熱を行った。操作
が進行するに従ってセパラブルフラスコ内の温度が上昇
し、内温か６８℃を越えた時点で加熱を中止して、生成
物を製造例１と同様に濾過・乾燥して白色の粉末を得た
。 この粉末について、製造例１と同様にＸ線回折及び赤外
吸収スペクトルによってＣａ静であることを確認した。 製造例４ Ｃａ１ｌＰＯ４＋１．６ｇ５ＣａＣＯｚ ４０．０ｇ
、水２００ｇ及び濃度２８％のアンモニア水１０ｇを、
製造例３で使用したセパラブルフラスコに仕込みよ（撹
拌した。しかる後、これを撹拌しながら昇温し、８０〜
１００″Ｃの温度で５時間反応させた。 反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色粉末状のＣａ静を１１２ｇを得た。 このＣ０Ａｐの物性分析結果を第１表に示す。 製造例５〜８ Ｃａ（Ｉｌｘｌ’０ｎ）ｚ ・１Ｉｔｏ 、Ｃａ１ｌＰ
Ｏ４＋ ２１１ｔＯ１ＣａｌｌＰＯ４、ＣａＣＯ３の各
粉末、水及び有ａ溶媒を第２表に示した条件でセパラブ
ルフラスコに仕込み、第２表に示した以外の条件につい
ては、実施例１と同様な操作により白色粉末状のＣ０Ａ
ｐを第１表に示す鼠を得た。このＣ０Ａｐの物性分析結
果を第１表に示す。 製造例９ 製造例２を５０倍にスケールアップしてその再現性を＆
１認した。即ち、Ｃａ （ＮＯｓ） を粉末４．１８ｆ
ｔｇを溶解した水溶液５０２に濃度２８％のアンモニヤ
水を加えてｐＨｉｏに調整した後、これを撹拌機及び還
流冷却器を備えた有効容積５０ｆｆｉのステンレス製反
応槽へ仕込みよく撹拌した。 次いで、この水溶液に（ＮＩＩ４） ｄｉｒ’ｏｎ粉末
１．９８ｋｇとＮ１１ｉｌｌＣＯｓ粉末５９５ｇを溶解
させた混合水溶液５０ｆｆｉを２５０〜５００ ｍ／■
ｉｎの速度で徐々に添加した。以下、製造例２と同様の
操作を行い、白色粉末状のＣＯ＾ｐを第１表に示す債得
た。このｃｏｉｐの物性を第１表に示す。 比較製造例１ 従来法による方法（Ａ、ティセリウス（Ａ、Ｔｉ５ｅ、
１ｊｕｓ） ）らの方法Ａｒｃｈ、 ［ｌｉｏｃｈｅｍ
、 ｌ１ｉｏｐｈｙｓ、 、 ６５＋ １３２（１９
５６）に従ってＩＩＡｐを以下のようにして合成した。 有効容４６３Ｎのフラスコへ濃度０．５＊ｏｌ／ｊ！の
ＣａＣ１，を水溶液夏ｌと濃度０．５ｍｏｌ／ｊ！のＮ
ａｚｌｌｌ’０４水溶液１２を毎分１２０滴の割合で同
時に滴下し、撹拌棒でゆっ（りと撹拌しながら反応を行
なった。 滴下終了後、上澄み液をデカンテーションにより除去し
、残留した沈殿物を４回、各々２ｊ！の蒸留水で洗浄し
た０次にこの沈殿物に２２の蒸留水を加え、更に濃度４
０％のＮａ０ＩＩ水溶液を５０ｍ１加えた後１時間沸騰
した。 反応液を冷却後再びデカンテーションにより上澄液を除
き、再度２１の蒸留水で４回洗浄した。 次にｐＨ６，８で濃度０．０１ｍｏｌ／ ｌの燐酸ナト
リウム緩衝液を２１加え沸騰する直前まで加熱した。こ
の操作を２度繰返すが、沸騰時間は各々５分と１５分に
した０次に、ｐＨ６，８で濃度０．０１ｍｏｌ／ １．
の燐酸ナトリウム緩衝液を２２加え２度清謄（各１５分
間）させて第１表に示す量のＩＩＡρ３Ｇｇを得た。 このようにして得られた１１＾ｐはｐＨ６，８で濃度０
．００１ ｍｏｌ／ｊ！の燐酸ナトリウムｒＡｉｌｊ液
に入れ、冷蔵庫にて保存した。 その結果第１表に示す物性の１１＾ｐを得た。またこの
ＩＩＡρの赤外吸収スペクトルを第５図に示すが、第５
図からも明らかなように、炭酸根（Ｃ−０）の吸収スペ
クトル（１４５０ｃ＋＊−’、８７０ ｃｔａ−’付近
）は見られなかった。 実施例１〜２ 内径７．６ ＋ｕ＋、長さ１００− のＩｌｒ’ｌ、
Ｃ用金屈カラムへ、製造例１及び２により得られたＣ０
Ａｐを通常の方法により１０ ｋｇ／ｄ−Ｇの圧力でそ
れぞれ充填し、２種のカラムを作成した。充填終了後各
カラムをＩＩＰＬＣ装置に装着した０両カラムとも充填
密度は０．５２ｇ／ｃｄであった。 各カラムの分離能の評価を行なうためトリプトファン（
０，１６％）、牛血清アルブミン（４，６％）、リゾチ
ウム（２，０％）、及びチトクロムＣ（１，０％）を含
有する混合溶液を標準試料として用いて展開を行なった
。展開は、燐酸緩衝液１０ｍＭ （ｐＨ６，８）と３５
０ ａ＋Ｍ（ｐＨ６，８）による直線濃度勾配法により
行ない、上記標準試料を１０．０μｌ注入した。また、
流速はＩｍ ｌ ／ｗｉｎになるように７．５ｋｇ／ｃ
＋Ｊの展開圧とした。 タンパク質の検出は、２８０ｎ腸の吸光度を測定した。 製造例１で得たＣＯＡρを有するカラムで得られたクロ
マトグラムを第６図に、製造例２で得たＣＯ静を有する
カラムで得られたクロマトグラムを第７図に示す、第６
図及び第７図からも明らかなように、主なピークが４カ
所にあられれており、標準試料である４成分がきれいに
分離されていることがわかった。各ピークは左側からト
リプトファン、牛血清アルブミン、リゾチウム、チトク
ロムＣに対応するピークであることを確認した。尚、チ
トクロムＣには、２種の異性体がありピークが２つに分
離している。 実施例３〜４ 製造例２及び９で得られたＣＯ静を用い、以下に示すカ
ラムクロマトの操作手順に従うて牛血清アルブミンの精
製を行なった。即ち、ＣＯ＾ｐ各１０ｇを５００７のビ
ーカーにとり、イオン交換水（以下単に水と略記する）
を静かに加え、ゆっくり撹拌した。 １０分間静置後デ
カンテーションした。この艮作を上澄みが清澄になるま
で繰り返した。その後、直径１０ｍ■のクロマトグラフ
ィー川（ＬＣ用）のガラスカラムに懸濁したＣＯ静を重
層した（充填高さ１００〜１２１）＋■）、その後ＣＯ
静が充填されたガラスカラムの洗浄を水で行ない、同時
に流速の測定を行なった（約１０ｄ／ｈになるように充
填する）０次に１％牛血清アルブミン水溶液ＩＪｄをカ
ラムに通し、カラム内のＣ０Ａｐに牛血清アルブミンを
吸着させた。この時の操作はすべて室温で行なった０次
に吸着させた牛血清アルブミンをカラムから溶出するた
め、燐酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋６．８）で展開を行
なった。？８出液は重量分Ｗ型のフラクシッンコレクタ
ーで収集した（ｌ試験管あたり２．５ｇの溶出液）、得
られた溶出液の吸光度は紫外部２Ｂ０ｎｍで測定した。 ！５造例２で得られたＣＯＡ、を有するカラムでの結果
を第８図に、製造例９で得られたＣＯ静を有するカラム
での結果を第９図に示す、第８図、第９図から本発明の
ｃｏＡｐは比較製造例のアパタイトを用いた場合の第１
１図に比べてシャープなりロマトパターンが得られてお
り優れた分解能を示し、吸脱着に優れているのがわかる
。 実施例５ 内径７．６ｍｓ、長さ１０ｈｍのＩＩＰＬｃ用カラムに
、１０ｋｇ／ ｄ−Ｇの圧力で製造例３により得られた
Ｃ０Ａｐを、実施例１及び２と同様の方法で充填し、そ
れ以降の操作は、実施例１及び２と同様にしてＩＩＰＬ
ｃ川カラム用操作を行なった。充填密度は０．５２ｇ／
ｃｊであった。各ピークの保持時間及び半値幅によりそ
の結果を第３表に示す、第３表かられかる通り実施例１
及び２で得られたクロマトグラムと同じ結果を示した。 実施例６ 内径７．６ ａｓ、長さ１００− のＩＩＰＬＣ川カ
ラム用、８０ｋｇ／ ｃｄ−Ｇの圧力で製造例６により
得られたＣ０Ａｐを充填し、それ以降の操作は、実施例
Ｉ及び２と同様にしてＩＩＰＬｃ用カラム操作を行なっ
た。充Ｉａｖｉ度は０．６０ｇ／ｄであった。その結果
を実施例５と同様に第３表に示す、第３表からもわかる
通り、実施例１及び２で得られたクロマトグラムと同じ
結果を示した。 実施例７ 実施＠６で使用したカラムに対し、標準試料の分離を３
００回行なった。３００回目に得られたクロマトグラム
の結果を実施例５と同様に第３表に示す、第３表からも
わかる通り、本発明のカラムは３００回の繰返し使用に
対しても良い分離能を示し、優れた耐久性をもっている
ことがわかる。 実゛施例８ 内径７．６ ｍｍ、長さ１００ｍ−のＩＩＰＬＣ用カラ
ムシカラム０ｋｇ／ｄ−Ｇの圧力で製造例７により得ら
れたＣＯＡ。 を密度１．０３ｇ／ｃ−に充填し、それ以降の操作は実
施例！及び２と同様な操作でＩＩＰＬＣ用カラムシカラ
ム行なった。その結果を実施例５と同様に第３表に示す
。 第３表から、高い圧力でｃｏＡｐをカラムへ充填してい
るにも拘らず、実施例５及び６で得られたクロマトグラ
ムと同じ結果を示し、耐圧性にぼれていることがわかる
。 実施例９ 内径２１ｍ５＋、長さ２５０１曽の分取用カラムに、８
０ｋｇ／ｃｄ−Ｇの圧力で、製造例５に従って得たｃｏ
Ａｐを密度０．６２ｇ／ｃｊに充填し、操作法は実施例
１及び２と同様な方法でＩＩＰＬｃ用カラムの操作を行
なった。ただし標準試料は７０μｌ注入した。これによ
り得られたクロマトグラムの結果を実施例５と同様に第
３表に示す、第３表の結果から本発明のカラムによれば
通常のＩＩＩ’ＬＣと同じ結果が得られ、分取用として
も十分使用可能であることがわかる。 実施例１０ 内径７．６ ｖｇｍ、長さ１００ｍｍのＩＩＰＬｃ用カ
ラムに、８０ｋｇ ／ｃｄ−Ｇの圧力で、製造例７に従
って得たＣＯＡ、を密度０．５８ｇ／ｃｊに充填し、そ
れ以降の操作は実施例１及び２と同様に行なった。ただ
し展開中の流速が３．４ ｄ／ｓｉｎになるように圧力
を５０ｋｇ／ｃｊ−Ｈに調整した。これにより得られた
クロマトグラムの結果を実施例５と同様に第３表に示す
、第３表からもわかる通り、分離を短詩ｒ１１で行なわ
れたにも拘らず、各々の４つのピークがきれいに分離し
ていることがわかる。 実施例１１ 実施例５で使用したｌｌｒ’Ｌｃカラムを用い、核酸に
対する分離能の評価を炭酸塩を展開液として行なった。 核酸のサンプルには米国シグマ社製の子牛胸腺デオキシ
リボ核酸（ＤＮ＾）を使用し、展開は蒸留水と炭酸水素
アンモニウム水溶液２Ｍ （ａｌ１７．８）による直線
濃度勾配法により行ない、上記サンプルを１０、Ｏ＃
ｌカラムに注入した。また、流速はｌａｆ／鰺ｉｎにな
るように７．５ｋｇ／ｃｄ−Ｇの展開圧とした。 核酸の検出は２６０ｎ−の吸光度を測定した。このカラ
ムにより得られたクロマトグラムを第１０図に示す、第
１０図からもわかるように主なピークが２カ所にあられ
れ、一部熱処理を行ない一本鎖となった核酸が、二本鎖
のそれときれいに分離されていることがわかる。さらに
それぞれのピーク分取液にエタノールを加え、核酸を糸
状沈殿物として直接回収した。 実施例１２ 標準試料による分離能評価を終えた実施例６で使用した
カラムについて、実施例１１の操作を５０回行なった０
本操作終了後、再度、標準試料による分離能評価を行な
ったところ、カラムの劣化は全（見られなかった。 比較例１ 比較製造例！に従って得た旧ρを用い、以下、実施例３
及び４と全く同一の方法で、牛血清アルブミンの分離を
行なった。得られた結果を第１１図に示す。 実施例３及び４″２９はすぐれた分離能を示し、吸脱着
にすぐれているのに対し、比較製造例１に従って得た炭
酸根を含有していないＩＩＡρは、第１１図から回収量
が劣ることがわかる。 比較列２ 比較製造例１に従って得た１１静を内径７．６１１１ｍ
、長さ１００１−のカラムに充填し、その後の操作は実
施例４と同様な操作で標準試料の分に１を行った。 尚、この時の充填密度は０．２８ｇノｃＩＩであった。 また流速を１Ｍ１／−蓋ｎにするため、１ｋｇ／ｄ−Ｇ
の圧力になるように調整を行なったが、ＩＩＰＬＣとし
ては低圧になるため、操作に困難をきたした。 これにより得られたクロマトグラムを第１２図に示す、
第１２図と第６図及び第７図との比較からもわかる通り
、従来法に従って得た１■静を充填したものは、全体的
にブロードなピークを示した。 比較例３ 比較製造例１に従って得たＩＩＡｐを、内径７．６ ｍ
ｓ＋、長さ１００■鵬のカラムに充填圧力１５ｋｇ／ｃ
ｊ−Ｇで充填した。しかし内部で結晶が破壊され目づま
りが生じ、展開を行うことができなかった。 比較例４ 比較製造例１に従って得た１■静を、内径７．６ ｍｍ
、長さ１００＋＊■のカラムに充填して、実施例１２と
同様な操作を行なったが、二回目でカラム圧力が上昇し
展開が不可能となった。 〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明は炭酸根をＣＯｌと
して０．５重量％以上含有したＣＯＡ、をＬＣ用または
Ｉｌｌ”ＬＣ用カラムの充填剤として使用する、また、
このＣ０Ａｐを充填してなるカラムの発明である。 従来ＬＣ用またはＩｌｌ”ＬＣ用カラムは充填材が１１
＾ｐであるので、分離能にやや問題があると共に、耐圧
・耐久性に劣るという問題があった。また、１１静が品
質的に再現性良く製造できないという重大な問題もあっ
た。 これに対し本発明の充填材はＣＯ＾ρであるので分＋１
！Ｉｆｔｍが偏れており、また結晶の強度が大きいため
耐圧・耐久性にも優れている。従って、２００回以上の
繰返し使用が可能で、優れた耐久性を持っている０以上
のことから、本発明のＣＯＡｐは特にＩＩｒ’ＬＣ用充
填材として使用した場合、充填密度を０．５ε／ｄ以上
とすることができるので、ＩＩＩ’ＬＣ特有の展開条件
下で一層向上した分離能を示すのである。 さらに、従来のｌＩｒ’Ｌｃ用カラムは耐圧・耐久性に
劣るのに対し、本発明のカラムにおいてはＣ０Ａｐ結晶
が破壊されにくく、従って、容易に０．５５／ｃｄ以上
の密度で充填することができ、カラムの強度も大で少な
くともＩＩＰＬＣの実質的な充填圧力である１０ｋｇ／
ｃシを満足し、さらに５００ｋｇ／ｃｄ以上の高い圧力
をかけても充填材であるＣＯ静静体体は全く支障がない
。 また、本発明のＣＯ静は従来のＩＩＡＩ）と異なり結晶
を配向させながらＩＩＰＬＣｍカラムに充填するという
煩雑な操作を必要としないので、節単にカラム充填が行
なえるという利点がある。さらに圧力の調整により流速
制御ができるので展開液も従来品に比べ少量で済むとい
う利点もある。さらにまた、本発明のカラムは分析を目
的としたＩＩＰＬｃ用カラム以外に、分取を目的とした
分取用＋１ＰＬｃ用カラムとしても好適に使用でき、必
要とされる試料を短時間のうちに純度よく分離・精製す
ることが可能であるのである。 また、１■静を充填した従来のカラムを使用して分取を
行なう場合、分取したサンプルの溶離液として通常燐酸
塩の液が使用される関係上、溶離後の処理として脱塩を
必要とする場合もしばしばあるが、この場合分離操作自
体は短時間であっても、後処理を含めると決して短時間
とはいえなかった。しかし本発明では充填材としてＣＯ
Ａｐを使用しているので、溶離液としてこれまで不向き
と考えらていた、揮発性の炭酸塩系溶離液が使用可能で
あるので、後処理の時間を大幅に短縮できるという利点
も有している。この点は特に核酸を分離・精製する際に
威力を発揮する。 即ち、核酸類としてたとえばプラスミドＤＮＡを分離・
精製する場合は、分離後最終的には分取液にエタノール
を加え核酸を沈殿させ回収保存される。しかしこの操作
は燐酸塩を含む液では燐酸塩も共に析出沈殿するので前
処理として燐酸塩の脱塩が必要であった。しかしながら
ここで揮発性塩を使用すれば、直接エタノール添加によ
る沈殿析出が実施可能であり、合計の処理時間が大幅に
軽減される。 ここで脱塩処理とは、透析のことを指し、溶離液に燐酸
を使用した場合、この処理には通常１５〜２４時間を必
要としていたが、本発明では炭酸塩系溶離液が使用可能
であるので、この脱塩処理時間は１時間以内と大幅に短
時間で完了することができる。この炭酸塩系溶離液の使
用はＣ０Ａｐの如く炭酸根を含有するアパタイトを使用
することで初めて達成できるものであり、従来の如き１
１＾ｐでは達成できない。 以上種々列記した通り、ＬＣ用及びＩＩＩ’ＬＣｍカラ
ムの充填材にＣＯ＾ｐを使用することにより種りの効果
があり、その産業上の利用可能性はきわめて大なるもの
であるといわざるを得ない。
発明のｃｏａｐのＸ線回折図であり、第２図及び第４図
は同じく製造例１及び製造例２で得られたｃｏａｐの赤
外吸収スペクトルを表す図である。 第５図は比較製造例１で得られたＨＡｐの赤外吸収スペ
クトルを表す図である。 第６図及び第７図は実施例１及び実施例２で行なったＨ
ＰＬＣ用カラムによる牛血清アルブミンを展開して得ら
れたクロマトグラムである。第８図及び第９図は実施例
３及び実施例４で行なったＬＣ用カラムによる生血清ア
ルブミンを展開して得られたクロマトグラムである。 第１Ｏ図は実施例１１で行なったＨＰＬＣ用カラムによ
る核酸を展開して得られたクロマトグラムである、第１
１図は比較例１で行なったＬＣ用ガラスカラムによる牛
血清アルブミンを展開して得られたクロマトグラムであ
る。第１２図は比較例２で行なったＨＰＬＣ用カラムに
よる生血清アルブミンを展開して得られたクロマトグラ
ムである。 特許出願人 三井東圧化学株式会社 第２図 （ｃｍ−） ｍ４図 （ｃｍ−１） 第５図 ４（９） 蕉 薫 −１（８） ■（ｃｍ力 第６図 ０ １０ ２０ （ｍｉｎ）第７
図 ０ １０ ２０ （ｍ’＋ｎ）第８図 分画番号 第９図 分画番号 第１θ図 ０ １０ ２０（ｍｉｎ）第１１
図 分画番号 第１２図 ０ １０ ２０ （ｍｉｎ）手続（甫
正書（自発） 平成１年８月４日 特許庁長官 吉 １）文 毅 殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第１１７０９６号 ２、発明の名称 液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 住所 東京都千代田区霞が関三丁目２番５号名称（３１
２） 三井東圧化学株式会社４、補正により増加する
請求項の数 零５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 別紙のとおり（補正の対象の欄に記載した事明細書 １、発明の名称 液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム２、特許請
求の範囲 ｌ）炭酸根をＣＯｓとして０．５重量％以上含有したヒ
ドロキシアパタイトからなることを特徴とする液体クロ
マトグラフィー用充填材。 ２）炭酸根をＣｏ３として０．５重量％以上含有したヒ
ドロキシアパタイトを充填してなることを特徴とする液
体クロマトグラフィー用カラム。 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は、炭酸根を含有したヒドロキシアパタイトから
なる液体クロマトグラフィー川充填材、及びこれを充填
してなる液体クロマトグラフィー用カラムに関するもの
である。 〔発明の前景〕 アパタイトとは広義には、下記０）式の組成式で表わさ
れる化合物をいい、この式でＭはＣａ、 Ｐｂ。 Ｂａ５Ｓｒ、 Ｍｇ％Ｎｉ、Ｈａ％に％Ｆｅ％Ａｔその
他の金属原子を、ｚ０４はＰＧ、 、Ａｓ１ａ、ＶＯ４
％ ＳＯａ 、 ５ｉＯａ、ＣＯ，その他の酸根を、Ｙ
はＦ、ＯＨ，ＣＦ４、Ｂ「、０、ＣＯ３その他の陰イオ
ン性原子（団）を示す広範囲な化合物群の総称である。 ？Ｉ”ｘ、Ｍ”−（ｚＯ’−ａ）ｉＹ−＊ −−−−−
（１）（ｎ＋■−１Ｏ１ｎ・０及び−〇の場合も含む）
本発明においては、上記（１）式においてＭが実質的（
すなわち、不純物レベルの他の原子、原子団が入っても
よい）にＣａであり、ＺＯ，が実質的にＰＯ。 であり、Ｙが実質的に０１１である化合物をヒドロキシ
アパタイトと呼ぶ、そして、ここでｚ０４または／及び
Ｙの一部がＣＯ３で置換されたものを炭酸含有ヒドロキ
シアパタイトと呼ぶ。 ヒドロキシアパタイト（以下■＾ｐと略記する）は、天
然歯や天然骨と同じ化学組成を持つ無機化合物であると
ころから、生体物質との親和性に優れているという特性
を有し、蛋白質、核酸、酵素等の生体高分子物質の分離
・精製を目的とした液体クロマトグラフィー（以下、Ｌ
Ｃと略記する）用カラムの充填材として好適に使用され
ている。 さらに、近年高速液体クロマトグラフィー（以下１１Ｐ
Ｌｃと略記する）の普及により少量の試料を短時間で処
理すること（＠量分析）、あるいは−度に大量の試料を
しかも短時間に処理すること（大量分取）が可能となり
、ＩＩＡｐのこの分野への応用は今後益々広がることが
予想される。従って、ＩＩＰＬＣを含むＬＣ用のカラム
充填材として、さらに高性能でかつ使用しやすい１ｌＡ
ｐの開発が望まれている。 〔従来の技術及び発明が解決しようとするｆｆ！題〕従
来のＬＣ用のカラム充填材に使用される１１＾ｐは、＾
、Ｔｉ５ｅ１１ｕｓ＋ｅｔ、ａ１．＋により発表された
、水溶性のカルシウム塩と水溶性の燐酸塩を反応させる
湿式合成法（＾ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、＋６５．１３２（１９５６））をもとに適宜改良を
加えた方法で製造されたものが一般的であつた。これら
の方法で得られた１１Ａ、は従来、ＬＣ用カラム充填材
としての性能がすぐれているといわれているものであっ
て、次のような物性を示すのが通常である。 Ｃａ／Ｐ比 １．４〜１．５５ Ｘｌｉ１回折 回折ピークが弱い。 ＣＯ３含有ｆｉｔｏ、１ｆｆｉｆｆｉ％未満しかしなが
ら１ｌＡｐを製造する上記従来の方法は、原料の調整、
ｐＨ管理、撹拌核層、温度管理等の反応右よびその後の
処理等に非常に煩雑な操作を必要とする。 しかも、この方法では、品質的に再現性良く、＋１＾ｐ
を製造することは大変困難である。更には、この方法を
工業的にスケールアップすると、小型スケールと比較し
てその再現性が著しく乏しくなり、工業的実施には不向
きな方法である。その上、得られた前記物性のＩＩＡｐ
は、燐酸ナトリウム緩衝液中で冷所保存しなければ、そ
の物性を維持できないという問題もある。 以上述べたようにＬＣｍカラム充填材として生体高分子
の分離・精製に優れた性能を発揮する１ｌＡｐを、従来
公知の方法で再現性よ＜！１１造することが困難であり
、この点からＩＩＡｐは高価なものとなっている。その
ため、１ｚ静は生体高分子の分離・精製のためのＬＣｍ
カラム充填材として他の充填材と比較して使用頻度が極
度に少なく、限られた分野で使用されているのが実情で
ある。 また、従来使用されているＨＡｐは、耐圧性及び耐久性
において必ずしも十分でな（、特にＩＩＰＬＣでの長期
にわたる繰り返し使用が制限されていた。 本発明は、上述の従来技術における問題を解決するため
になされたものである。 本発明の目的は、品質的に安定した製造が可能であり、
製造コストの低減化が可能なＩ＋静を提供することにあ
る。 本発明の他の目的は、ＩＩＰＬｃを含めたＬＣ用のカラ
ム充填材として、特に生体物質の分離能が向上した１１
＾ｐを提供することにある。 本発明の他の目的は、耐圧および耐久性に優れたＩＩＡ
Ｉ）からなるＩＩＰＬｃを含めたＬＣ用のカラム充填材
を提供することにある。 本発明の他の目的は、耐久性および生体物質の分離能に
優れたＩＩＰＬＣを含むＬＣ用に好適なカラムを提供す
ることにある。 （課題を解決するための手段） 本発明者らはこれら種々の問題を解決するために鋭意検
討を重ねた結果、訝＾ｐ中に炭酸根を含有させることで
、再現性よ＜ＩＩ静を製造することができ、かつ、この
炭ｒａｍをｃｏ、として０．５重量％以上含有したＩＩ
Ａｐ（以下、炭酸根を含有した１１＾ｐを炭酸含有ヒド
ロキシアパタイトと称し、Ｃ０Ａｐと略記する）は、生
体高分子の分離能力がＩＩＡｐより更に優れているため
、上記の目的がすべて達成されることを見出し、本発明
を完成するに至ったものである。 すなわち本発明の第１は、炭酸根をＣＯ３として０．５
重量％以上含有したヒドロキシアパタイトからなること
を特徴とする液体クロマトグラフィー用充填材であり、
第２は炭酸根をＣＯ３として０．５重量％以上含有した
ヒドロキシアパタイトを充填してなることを特徴とする
液体クロマトグラフィｍｍカラムの発明である。 〔発明の詳細な開示〕 以下、本発明の詳細な説明する。 本発明のＬＣｍカラムの充填材は、炭酸根をＣＯＳとし
て０．５重量％以上含有したＣ０Ａｐからなる。この充
填材をカラムに充填することにより、本発明のＬＣｍカ
ラムを得ることができる。 なお、本発明の充填材およびカラムの用途としテノ”Ｌ
Ｃ’は’ＩＩＰＬｃ’を含む。 従来のＩＩＡｐからなる充填材を用いたＬＣｍカラムは
先に述べたように、分離能にやや問題があると共に、耐
圧、耐久性に劣るという問題があった。 また、１１＾ｐが品質的に再現性良く製造できないとい
う重大な問題もあった。さらに、従来のＩＩＡｐは耐圧
性および耐久性に劣るので、ＩＩＰＬｃでの繰り返し使
用での良好な耐久性が得られなかった。 これに対し本発明のＣＯＡρからなる充填材は、品質的
に再現性良く製造可能であり、しかも生体物質の分離能
が高い。 さらに、Ｃ０Ａｐ結晶の物理的強度が高いので、本発明
の充填材は、耐圧性および耐久性に優れる。 その結果、本発明の充填材をカラムに充填する際の充填
圧として、少なくとも５００ｋｇ／ｃｊまでの高圧が採
用できる。 さらに、本発明の充填材を充填したカラムは、■円、Ｃ
における繰り返し使用の耐久性に優れる。 また、従来のＩＩＡ、は平板状の結晶形状をしているた
め、結晶を配向させながらＩＩＰＬｃｍカラムに充填す
るという煩雑な操作を必要としたが、本発明で用いるＣ
ｏ静の場合は、そのような配慮は特に必要がないので簡
単にカラム充填が行なえるという利点がある。さらに圧
力の調整により流速制御ができるので展開液も従来品に
比べ少量で済むという利点もある。さらにまた、本発明
のカラムは分析を目的としたＩＩＩ’ＬＣ用カラム以外
に、分取を目的とした分取用Ｉｌｌ”ＬＣ用カラムとし
ても好適に使用でき、必要とされる試料を短時間のうち
に純度よく分離・精製することが可能であるのである。 また、１１＾ｐを充填した従来のカラムを使用して分取
を行う場合、分取したサンプルの溶離液として通常燐酸
塩の水溶液が使用される関係上、溶離後の処理として脱
塩を必要とする場合もしばしばあるが、この場合分！Ｉ
湿作自体は短時間であっても、後処理を含めると決して
短時間とはいえなかった。しかし、本発明のＣ０Ａｐか
らなる充填材に対しては、ｔ８ｊｕｌ液としてこれまで
アパタイトクロマトには不向きと考えられていた、揮発
性の炭酸塩系溶離液が使用可能である。従って、カラム
から溶出した情製フラクシッンを直接凍結、乾燥させて
目的物を高純度品として回収するか、または、加温また
は／および減圧操作により塩を短時間に揮発、除去し、
つぎの工程での艮作に用いることができるので後処理の
時間を大幅に短縮できるという利点も有している。この
点は特に核酸を分離・精製する際に威力を発揮する。 即ち、核Ｍ類としてたとえばプラスミドＤＮＡを分離・
精製する場合は、分離後最終的には分取液にエタノール
を加え核酸を沈殿させ回収保存される。しかしてこの操
作は燐酸塩を含む液では燐酸塩も共に析出沈殿するので
沈殿回収の前処理として燐酸塩の脱塩が必要であった。 しかしながらここで例えば炭酸水素アンモニウムのよう
なアルコールに対する溶解度の大きな揮発性塩を使用す
れば、直接エタノール添加による沈殿析出が実施可能で
あり、合計の処理時間が大幅に軽減される。 ここで脱塩処理とは、透析のことを指し、溶離液に燐酸
緩衝液を使用した場合、この処理には通常１５〜２４時
間を必要としていたが、本発明では炭酸塩系溶離液が使
用可能であるので、この脱塩処理時間は１時間以内と大
幅に短時間で完了することができる。この炭酸塩系溶離
液の使用はＣＯＡｐの如く炭酸根を含有するアパタイト
を使用することでより効果的となる。 上述のように、本発明の炭酸根含有アパタイトからなる
ＬＣ用充填材およびこれを充填したＬＣ用カラムの利点
として従来不可とされていた炭酸根を含む溶離液を用い
ることができる点もあげられる。 すなわち、これまでの１ＩＡｐを充填したＬＣｍカラム
に炭酸根を含む溶離液を通液するとカラムが閉塞し通液
が困難となる。これは炭Ｎｉ根がアパタイトと反応を起
こすためと考えられる。 一方、本発明の炭酸根含をアパタイトの場合はあらかじ
め炭酸根を含有しているために炭酸根を含む溶離液を通
液しても問題を生じないものと考えられる。 以上種々列記した通り、ＬＣ用およびＩＩＰＬｃｍカラ
ムの充填材にＣＯＡ、を使用することにより種々の効果
があり、本発明の効果は経済的に極めて大なるものがあ
る。 本発明のＬＣ用充填材は、炭酸根をＣＯｓとして０．５
重量％以上含有したＣ０Ａｐからなる。 本発明における炭酸根含有量とは日本化成肥料協会技術
専門委員会（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｃｏｍ１ｔＬｅｅ
ＪａｐａｎＰｈａｓｐｈａＬｅ ｌ Ｃｏｍｐｏｕ
ｎｄ Ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔ
ｕｒ−ｅｒ”ｓ Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）の定める燐
鉱石分析法に準じて測定した無水炭酸（Ｃｏｄ）の測定
値をＣＯ３含有量に換算したものとする。 本発明で用いられるＣ０Ａｐの製造方法には特に制限は
なく、従来公知の方法が利用できる０例えば第二燐酸カ
ルシウムと炭酸カルシウムをアンモニア水中で反応させ
る方法（特公昭５８−３０２４４号公報の方法）や、第
二燐酸カルシウム２水塩と炭酸カルシウムとを水中で反
応させる方法（特開昭６０−５００９号公報の方法）、
本発明者らが先に提案した、有機溶媒を含む反応媒体中
で燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウム
とを反応させる方法（特開昭５９−１０７９１２号公報
）など、いずれの方法でも得ることができる。 しかしながら、本発明に使用するＣＯＡ、中には、炭酸
根がＣＯｓとして０．５重量％以上の範囲で含有してい
るのが好ましい なお、アパタイトの製造技術の面からはＣＯｓ含有量と
して７．０重量％まで調節可能であるが５．０重量％を
越える場合はクロマトグラフィーの充填材としての分離
性能が低下して好ましくない、従って、本発明において
はＣＯＡｐは燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸
カルシウムとを、アンモニア水、水、有８１溶媒の何れ
かまたはそれらの混合物の反応用媒体中で下記する如き
モル比で反応させて得ることができる。 すなわち、反応槽にアンモニア水、水、有機溶媒の単独
もしくはそれらの混合物を反応用媒体として仕込み、こ
れに燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸カルシウ
ムとを加えて、通常大気圧下にて反応用媒体を加熱し、
蒸発した反応用媒体は還流させる方法で反応させる。な
お、この際の燐酸または／及びそのカルシウム塩と炭酸
カルシウムの割合はカルシウムと燐の原子比がＣａ／Ｐ
として１．３０〜ｌ１．９０好ましくは１．４５〜１．
７５の範囲で、また、炭酸根と燐の割合はＣＯｓ／ＰＯ
ａ として０．０１５〜１．９０の範囲で実施される。 反応時間は、媒体がアンモニア水または水の場合は概ね
５〜８時間必要であり、反応用媒体が有機溶媒を含有す
る場合は約２時間もあれば十分である。 加熱終了後は生成したＣ０Ａｐが析出しスラリー状とな
っているので、これを通常公知の方法で濾別・分離し、
乾燥すれば良い。 ＣＯＡｐの原子比（Ｃａ／Ｐ）は、理論的には５／３で
あるのでカルシウムと燐との反応時における原子比も５
／３ζ１．６７が最適であるはずであるが、実際の反応
に際しては、原子比が上記の範囲内にあれば好適にＣ０
Ａｐを合成することができる。 上記反応の原料として使用する燐酸または／及びそのカ
ルシウム塩としては、ｌ１ｓＰＯｎ 、１ＩｎＰ ｔｃ
ｈ、ｕｐｏｓ、Ｐ＊Ｏｓｂ Ｃａ（ＩｌｔＰＯ４）ｔ
・１１１０ ％ Ｃａ（ＰＯｓ）＊、Ｃａ１１ＰＯｎ、
Ｃａ１ｌｌ”０４ｊ ２１１ｔＯ１ＣａｚＰｔＯｙ、Ｃ
ａ５（ＰＯａ）ｔ 、Ｃａ１１１ｇ （ＰＯ４） 、
・５１１ｇＧ、等が使用可能である。しかしながら、こ
れらの化合物は本発明において使用可能な原料の一部で
あって、これらに限定する必要はない、また、これらの
化合物は特に高純度のものを使用する必要はなく、通常
市販の工業用のもので十分である。今一つの原料である
炭酸カルシウムも同様に、工業用のもので十分である。 カルシウム源として、上記の如き燐酸のカルシウム塩の
外にＣａＯｓ Ｃａ（Ｏｌｌ）ｔ 、ＣａＣ１，Ｃａ（
ＮＯｓ）ｔｌ（ＣＩ＋ＩＣ０Ｏ） ｔｅａ等のカルシウ
ムの酸化物、水酸化物及び無機酸並びに有ａ酸のカルシ
ウム塩を使用することも可能である。 また、炭酸源として、本発明ではカルシウム原子の補給
にもなるので炭酸カルシウムを使用するがＸ＊ＣＯｓ
、Ｋ１１ＣＯ３、Ｎａ＝ＣＯｓ、Ｎａ１ｌＣＯ，、（Ｎ
ＩＩＪ ｚｃＯｓ、Ｎｌ１ｎｌｌＣＯｓ等の炭酸塩や炭
酸ガスを使用しても差支えない。 本発明においては、炭酸カルシウムと上記の如き燐酸ま
たは／及びそのカルシウム塩の一種類以上を適宜選択し
て、カルシウムと燐の原子比Ｃａ／Ｐが１．３０〜１．
９０．好ましくは１．４５〜１．７５となるように反応
槽に投入すればよい、また、上記炭酸カルシウムの投入
量を変化させることにより、生成するＣ０Ａｐ中に含有
する炭酸根の含有量を！ｇＩｗｉすることが可能であり
、この方法により炭酸根をＣＯｓとして７．０重量％以
下の範囲で調節することができる。 本発明において、反応用媒体の使用量はその種類、反応
時の原料の種類、反応時の撹拌状態などによりそれぞれ
適性値が異なるが、いずれの条件においてもスラリー濃
度として５〜６０重量％程度となる量が好ましい。 本発明において、ＣＯ静の製造の際に反応用媒体として
アンモニア水を使用する場合は、濃度が５〜２８重盟％
のアンモニア水溶液を用いて、反応媒体のｐｌ＋を７〜
１１の範囲で適宜調節して反応を行なう。 また反応用媒体として使用できる有機溶媒としては、例
えばベンゼン、トルエン、キシレン、ペンタン、ヘキサ
ン、ヘプタン、オクタン、デカン、各種石油ナフサや工
業用ガソリン等の芳香族及び脂肪族炭化水素類ＨＩｇｏ
−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール等のアルコ
ール類；トリエチルアミン、トリブチルアミン、エタノ
ールアミン等のアミン頬；エチルエーテル、エチルブチ
ルエーテルや各種セルソルブ、カルピトール等のエーテ
ル類；メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等
のケトン類が挙げられる。しかしこれらは本発明におい
ては使用可能な有機溶媒の一例にすぎない。 かくして得られたＣＯＡｐは、液体クロマトグラフィー
用、特に高速液体クロマトグラフィー用充填として使用
した場合、生体高分子物質の分離・精製に、従来の１Ｉ
Ａｐを使用した場合よりも更に優れた性能を示す。 本発明において用いられるＣＯＡｐの粒径については０
．５〜５０ｐ−の範囲のものを用いることが好ましい、
さらに好ましくは、２〜Ｌ５ｔｔ■のものが選択される
。 本発明においては、このＣＯ静をカラムに充填して液体
クロマトグラフィー用カラムとするが、Ｃ０Ａｐをカラ
ムに充填する方法としては、従来公知の湿式充填法（ス
ラリー法）等を使用できる。 すなわち、湿式充填法には平衡密度法、非平衡密度法、
高粘度法などがあるが、これらの中から充填材であるＣ
ＯＡｐの粒径または／及び物理的強度を考慮し、適宜好
ましい充填法を選択すればよい。 ＣＯＡ、をＩＩＰＬｃｍカラムに充填するには、パッカ
ーと呼ばれる充填容器と高圧ポンプが必要である。 また、充填には充填用溶媒を用い、Ｃ０Ａｐはこの溶媒
の１〜２０重量％のスラリーとして上記パッカーに流し
込み、７０〜３５０ｋｇ／ｃｊの間の一定圧力で充填す
るのが望ましい。 上記の充填用溶媒としてはテトラブロモエタン、テトラ
クロロエチレン、四塩化炭素、メチルアルコール、エチ
ルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピル
アルコール、水、アセトン、ジオキサン、クロロホルム
、テトラヒドロフラン、シクロヘキサノール、エチレン
グリコールなどが挙げられる。そして、これらの溶媒の
一種または二種以上を組み合わせればよい。 本発明の充填材を充填するカラムの材質、形状、大きさ
はその用途に応じて選択することができる。 すなわち、カラムの大きさについては、内径ｌ■−程度
の小型分析用から内径１０Ｇ−１以上の分取用のサイズ
のカラムに適用することができる。 例えば、ｌＩＩ’Ｌｃ用カラムの用台ラム内径３−有効
長さ３０ｍ５＋程度の分析用カラム、内径７．６ｍ■有
効長さ１０Ｇ＋ｓ−程度の分析およびミクロ分取用カラ
ム、内径５０〇−有効長さ５００■−の大型分取用カラ
ムなどが例としてあげられる。 本発明の充填材はこれらの分析用小型カラムから分取用
大型カラムまでその分離特性のカラムのスケールに対す
る依存性が極めて少ない。 また、カラムの材質については通常液体クロマトグラフ
ィー用カラムに使われる材質、例えば、ステンレススチ
ール、ガラス、樹脂などの一般的な材質が使用てきる。 なお、本発明の充填材をｎｐｔｃ用のカラムに充填する
場合には、充填密度を０．５ｇ／ ｃ−以上とすると、
分離性能が更に向上するので好ましい、また、あまり充
填密度を上げるとカラムの通液抵抗が大きくなり好まし
くないので充填密度の上限は１．１ｇ／ ｃｄ程度であ
る。 （実施例〕 以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。尚
、以下において％は重量％を表す。 製造例１ 蒸留水２ Ｎ、 Ｃａ（Ｏｆｆ）＊粉末７４Ｉ！及びＣ
ａＣＯ５粉末６８ｇを、撹拌機及び還流冷却器を備えた
有効容積３ｊ！のセパラブルフラスコに仕込み、撹拌し
ながら更に濃度４０％の１１３ＰＯ４水溶液２００ ａ
ｔを１５分間で添加した後、加熱して沸騰温度（約９８
℃）で５時間反応させた。 反応終了後は生成物を冷却後、加圧濾過機で濾過・水洗
し、次いで１３０℃で１６時間乾燥して白色の粉末を８
３ｇ得た。 この粉末のＸ線回折図を第１図に示す。 第１図より明らかなようにＸ線回折図は回折角度２０−
３１．７．３２．２．３２．８ニ主ヒークを有し、Ａ３
７Ｍカード９−４３２に記載のＣ０Ａｐの特性回折ピー
クと一致した。また赤外吸収スペクトルを第２図に示す
、第２図より明らかなように１４５０ｃｍ−’、８７０
ｅｌｌ −’付近にＣ−０の吸収ピークが観察された。 ＣａＯ含有量はＩ！ＤＴ＾キレート滴“定法により、
Ｐ２Ｏ，含有量は比色定量法により測定した。また二〇
Ｃ０Ａｐの物性分析結果を第１表に示す。 製造例２ Ｃａ （ＮＯｓ） ｚ粉末８３．６ｇを溶解した水溶液
Ｉｎに濃度２８％のアンモニヤ水を加えてｐＨＩＯに調
整した後、これを製造例１で使用したセパラブルフラス
コに仕込みよく撹拌した。 次いで、この水溶液に（Ｎｉ１４） ＊ＩＩＰＯｍ粉末
３９．６ｇとＮｌＩ４１１ＣＯｓ粉末１１．９ｇを溶解
させた混合水溶液１２を５〜１０ ｙｄ ／ ｍ ｉ
ｎの速度で徐々に添加した。しかる後これを撹拌しなが
ら加熱し、沸騰温度（約９８℃）で５時間反応させた。 反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色の粉末を３８ｇ得た。この粉末のＸ＆’ｉ回
折図を第３図に示す。 第３図より明らかなようにＸ線回折図の回折角度は第１
図と同じ主ピークを有し１．Ｃ１１ｌｐと特定される。 また赤外吸収スペクトルを第４図に示す。 第４図より明らかなように第２図と同様のＣ−０の吸収
ピークが観察された。またこのＣａ静の物性分析結果を
第１表に示す。 製造例３ Ｃａ（Ｉｌｘｌ”０４）ｔ ・１ｌｔｏ ７５．６ｇ
５ＣａＣＯ３７０，Ｏｇ 、水１００ｇ及びｎ−ヘキサ
ン３５０ｇを、撹拌機及び還流冷却器を備えた有効容ａ
ｌｌ！のセパラブルフラスコに仕込み、撹拌しながら昇
温させ還流温度（６３℃）以下で約２時間加熱し反応さ
せたのち、セパラブルフラスコ内の水分と１−ヘキサン
を蒸発させ、留出したｎ−ヘキサンと水に相当する容量
のｎ−ヘキサンを系内に加えながら加熱を行った。操作
が進行するに従ってセパラブルフラスコ内の温度が上昇
し、内温か６８℃を越えた時点で加熱を中止して、生成
物を製造例１と同様に濾過・乾燥して白色の粉末を得た
。 この粉末について、製造例１と同様にＸ線回折及び赤外
吸収スペクトルによってＣａ静であることを確認した。 製造例４ Ｃａ１ｌＰＯ４＋１．６ｇ５ＣａＣＯｚ ４０．０ｇ
、水２００ｇ及び濃度２８％のアンモニア水１０ｇを、
製造例３で使用したセパラブルフラスコに仕込みよ（撹
拌した。しかる後、これを撹拌しながら昇温し、８０〜
１００″Ｃの温度で５時間反応させた。 反応終了後は製造例１と同様にして、生成物を濾過・乾
燥して白色粉末状のＣａ静を１１２ｇを得た。 このＣ０Ａｐの物性分析結果を第１表に示す。 製造例５〜８ Ｃａ（Ｉｌｘｌ’０ｎ）ｚ ・１Ｉｔｏ 、Ｃａ１ｌＰ
Ｏ４＋ ２１１ｔＯ１ＣａｌｌＰＯ４、ＣａＣＯ３の各
粉末、水及び有ａ溶媒を第２表に示した条件でセパラブ
ルフラスコに仕込み、第２表に示した以外の条件につい
ては、実施例１と同様な操作により白色粉末状のＣ０Ａ
ｐを第１表に示す鼠を得た。このＣ０Ａｐの物性分析結
果を第１表に示す。 製造例９ 製造例２を５０倍にスケールアップしてその再現性を＆
１認した。即ち、Ｃａ （ＮＯｓ） を粉末４．１８ｆ
ｔｇを溶解した水溶液５０２に濃度２８％のアンモニヤ
水を加えてｐＨｉｏに調整した後、これを撹拌機及び還
流冷却器を備えた有効容積５０ｆｆｉのステンレス製反
応槽へ仕込みよく撹拌した。 次いで、この水溶液に（ＮＩＩ４） ｄｉｒ’ｏｎ粉末
１．９８ｋｇとＮ１１ｉｌｌＣＯｓ粉末５９５ｇを溶解
させた混合水溶液５０ｆｆｉを２５０〜５００ ｍ／■
ｉｎの速度で徐々に添加した。以下、製造例２と同様の
操作を行い、白色粉末状のＣＯ＾ｐを第１表に示す債得
た。このｃｏｉｐの物性を第１表に示す。 比較製造例１ 従来法による方法（Ａ、ティセリウス（Ａ、Ｔｉ５ｅ、
１ｊｕｓ） ）らの方法Ａｒｃｈ、 ［ｌｉｏｃｈｅｍ
、 ｌ１ｉｏｐｈｙｓ、 、 ６５＋ １３２（１９
５６）に従ってＩＩＡｐを以下のようにして合成した。 有効容４６３Ｎのフラスコへ濃度０．５＊ｏｌ／ｊ！の
ＣａＣ１，を水溶液夏ｌと濃度０．５ｍｏｌ／ｊ！のＮ
ａｚｌｌｌ’０４水溶液１２を毎分１２０滴の割合で同
時に滴下し、撹拌棒でゆっ（りと撹拌しながら反応を行
なった。 滴下終了後、上澄み液をデカンテーションにより除去し
、残留した沈殿物を４回、各々２ｊ！の蒸留水で洗浄し
た０次にこの沈殿物に２２の蒸留水を加え、更に濃度４
０％のＮａ０ＩＩ水溶液を５０ｍ１加えた後１時間沸騰
した。 反応液を冷却後再びデカンテーションにより上澄液を除
き、再度２１の蒸留水で４回洗浄した。 次にｐＨ６，８で濃度０．０１ｍｏｌ／ ｌの燐酸ナト
リウム緩衝液を２１加え沸騰する直前まで加熱した。こ
の操作を２度繰返すが、沸騰時間は各々５分と１５分に
した０次に、ｐＨ６，８で濃度０．０１ｍｏｌ／ １．
の燐酸ナトリウム緩衝液を２２加え２度清謄（各１５分
間）させて第１表に示す量のＩＩＡρ３Ｇｇを得た。 このようにして得られた１１＾ｐはｐＨ６，８で濃度０
．００１ ｍｏｌ／ｊ！の燐酸ナトリウムｒＡｉｌｊ液
に入れ、冷蔵庫にて保存した。 その結果第１表に示す物性の１１＾ｐを得た。またこの
ＩＩＡρの赤外吸収スペクトルを第５図に示すが、第５
図からも明らかなように、炭酸根（Ｃ−０）の吸収スペ
クトル（１４５０ｃ＋＊−’、８７０ ｃｔａ−’付近
）は見られなかった。 実施例１〜２ 内径７．６ ＋ｕ＋、長さ１００− のＩｌｒ’ｌ、
Ｃ用金屈カラムへ、製造例１及び２により得られたＣ０
Ａｐを通常の方法により１０ ｋｇ／ｄ−Ｇの圧力でそ
れぞれ充填し、２種のカラムを作成した。充填終了後各
カラムをＩＩＰＬＣ装置に装着した０両カラムとも充填
密度は０．５２ｇ／ｃｄであった。 各カラムの分離能の評価を行なうためトリプトファン（
０，１６％）、牛血清アルブミン（４，６％）、リゾチ
ウム（２，０％）、及びチトクロムＣ（１，０％）を含
有する混合溶液を標準試料として用いて展開を行なった
。展開は、燐酸緩衝液１０ｍＭ （ｐＨ６，８）と３５
０ ａ＋Ｍ（ｐＨ６，８）による直線濃度勾配法により
行ない、上記標準試料を１０．０μｌ注入した。また、
流速はＩｍ ｌ ／ｗｉｎになるように７．５ｋｇ／ｃ
＋Ｊの展開圧とした。 タンパク質の検出は、２８０ｎ腸の吸光度を測定した。 製造例１で得たＣＯＡρを有するカラムで得られたクロ
マトグラムを第６図に、製造例２で得たＣＯ静を有する
カラムで得られたクロマトグラムを第７図に示す、第６
図及び第７図からも明らかなように、主なピークが４カ
所にあられれており、標準試料である４成分がきれいに
分離されていることがわかった。各ピークは左側からト
リプトファン、牛血清アルブミン、リゾチウム、チトク
ロムＣに対応するピークであることを確認した。尚、チ
トクロムＣには、２種の異性体がありピークが２つに分
離している。 実施例３〜４ 製造例２及び９で得られたＣＯ静を用い、以下に示すカ
ラムクロマトの操作手順に従うて牛血清アルブミンの精
製を行なった。即ち、ＣＯ＾ｐ各１０ｇを５００７のビ
ーカーにとり、イオン交換水（以下単に水と略記する）
を静かに加え、ゆっくり撹拌した。 １０分間静置後デ
カンテーションした。この艮作を上澄みが清澄になるま
で繰り返した。その後、直径１０ｍ■のクロマトグラフ
ィー川（ＬＣ用）のガラスカラムに懸濁したＣＯ静を重
層した（充填高さ１００〜１２１）＋■）、その後ＣＯ
静が充填されたガラスカラムの洗浄を水で行ない、同時
に流速の測定を行なった（約１０ｄ／ｈになるように充
填する）０次に１％牛血清アルブミン水溶液ＩＪｄをカ
ラムに通し、カラム内のＣ０Ａｐに牛血清アルブミンを
吸着させた。この時の操作はすべて室温で行なった０次
に吸着させた牛血清アルブミンをカラムから溶出するた
め、燐酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ＋６．８）で展開を行
なった。？８出液は重量分Ｗ型のフラクシッンコレクタ
ーで収集した（ｌ試験管あたり２．５ｇの溶出液）、得
られた溶出液の吸光度は紫外部２Ｂ０ｎｍで測定した。 ！５造例２で得られたＣＯＡ、を有するカラムでの結果
を第８図に、製造例９で得られたＣＯ静を有するカラム
での結果を第９図に示す、第８図、第９図から本発明の
ｃｏＡｐは比較製造例のアパタイトを用いた場合の第１
１図に比べてシャープなりロマトパターンが得られてお
り優れた分解能を示し、吸脱着に優れているのがわかる
。 実施例５ 内径７．６ｍｓ、長さ１０ｈｍのＩＩＰＬｃ用カラムに
、１０ｋｇ／ ｄ−Ｇの圧力で製造例３により得られた
Ｃ０Ａｐを、実施例１及び２と同様の方法で充填し、そ
れ以降の操作は、実施例１及び２と同様にしてＩＩＰＬ
ｃ川カラム用操作を行なった。充填密度は０．５２ｇ／
ｃｊであった。各ピークの保持時間及び半値幅によりそ
の結果を第３表に示す、第３表かられかる通り実施例１
及び２で得られたクロマトグラムと同じ結果を示した。 実施例６ 内径７．６ ａｓ、長さ１００− のＩＩＰＬＣ川カ
ラム用、８０ｋｇ／ ｃｄ−Ｇの圧力で製造例６により
得られたＣ０Ａｐを充填し、それ以降の操作は、実施例
Ｉ及び２と同様にしてＩＩＰＬｃ用カラム操作を行なっ
た。充Ｉａｖｉ度は０．６０ｇ／ｄであった。その結果
を実施例５と同様に第３表に示す、第３表からもわかる
通り、実施例１及び２で得られたクロマトグラムと同じ
結果を示した。 実施例７ 実施＠６で使用したカラムに対し、標準試料の分離を３
００回行なった。３００回目に得られたクロマトグラム
の結果を実施例５と同様に第３表に示す、第３表からも
わかる通り、本発明のカラムは３００回の繰返し使用に
対しても良い分離能を示し、優れた耐久性をもっている
ことがわかる。 実゛施例８ 内径７．６ ｍｍ、長さ１００ｍ−のＩＩＰＬＣ用カラ
ムシカラム０ｋｇ／ｄ−Ｇの圧力で製造例７により得ら
れたＣＯＡ。 を密度１．０３ｇ／ｃ−に充填し、それ以降の操作は実
施例！及び２と同様な操作でＩＩＰＬＣ用カラムシカラ
ム行なった。その結果を実施例５と同様に第３表に示す
。 第３表から、高い圧力でｃｏＡｐをカラムへ充填してい
るにも拘らず、実施例５及び６で得られたクロマトグラ
ムと同じ結果を示し、耐圧性にぼれていることがわかる
。 実施例９ 内径２１ｍ５＋、長さ２５０１曽の分取用カラムに、８
０ｋｇ／ｃｄ−Ｇの圧力で、製造例５に従って得たｃｏ
Ａｐを密度０．６２ｇ／ｃｊに充填し、操作法は実施例
１及び２と同様な方法でＩＩＰＬｃ用カラムの操作を行
なった。ただし標準試料は７０μｌ注入した。これによ
り得られたクロマトグラムの結果を実施例５と同様に第
３表に示す、第３表の結果から本発明のカラムによれば
通常のＩＩＩ’ＬＣと同じ結果が得られ、分取用として
も十分使用可能であることがわかる。 実施例１０ 内径７．６ ｖｇｍ、長さ１００ｍｍのＩＩＰＬｃ用カ
ラムに、８０ｋｇ ／ｃｄ−Ｇの圧力で、製造例７に従
って得たＣＯＡ、を密度０．５８ｇ／ｃｊに充填し、そ
れ以降の操作は実施例１及び２と同様に行なった。ただ
し展開中の流速が３．４ ｄ／ｓｉｎになるように圧力
を５０ｋｇ／ｃｊ−Ｈに調整した。これにより得られた
クロマトグラムの結果を実施例５と同様に第３表に示す
、第３表からもわかる通り、分離を短詩ｒ１１で行なわ
れたにも拘らず、各々の４つのピークがきれいに分離し
ていることがわかる。 実施例１１ 実施例５で使用したｌｌｒ’Ｌｃカラムを用い、核酸に
対する分離能の評価を炭酸塩を展開液として行なった。 核酸のサンプルには米国シグマ社製の子牛胸腺デオキシ
リボ核酸（ＤＮ＾）を使用し、展開は蒸留水と炭酸水素
アンモニウム水溶液２Ｍ （ａｌ１７．８）による直線
濃度勾配法により行ない、上記サンプルを１０、Ｏ＃
ｌカラムに注入した。また、流速はｌａｆ／鰺ｉｎにな
るように７．５ｋｇ／ｃｄ−Ｇの展開圧とした。 核酸の検出は２６０ｎ−の吸光度を測定した。このカラ
ムにより得られたクロマトグラムを第１０図に示す、第
１０図からもわかるように主なピークが２カ所にあられ
れ、一部熱処理を行ない一本鎖となった核酸が、二本鎖
のそれときれいに分離されていることがわかる。さらに
それぞれのピーク分取液にエタノールを加え、核酸を糸
状沈殿物として直接回収した。 実施例１２ 標準試料による分離能評価を終えた実施例６で使用した
カラムについて、実施例１１の操作を５０回行なった０
本操作終了後、再度、標準試料による分離能評価を行な
ったところ、カラムの劣化は全（見られなかった。 比較例１ 比較製造例！に従って得た旧ρを用い、以下、実施例３
及び４と全く同一の方法で、牛血清アルブミンの分離を
行なった。得られた結果を第１１図に示す。 実施例３及び４″２９はすぐれた分離能を示し、吸脱着
にすぐれているのに対し、比較製造例１に従って得た炭
酸根を含有していないＩＩＡρは、第１１図から回収量
が劣ることがわかる。 比較列２ 比較製造例１に従って得た１１静を内径７．６１１１ｍ
、長さ１００１−のカラムに充填し、その後の操作は実
施例４と同様な操作で標準試料の分に１を行った。 尚、この時の充填密度は０．２８ｇノｃＩＩであった。 また流速を１Ｍ１／−蓋ｎにするため、１ｋｇ／ｄ−Ｇ
の圧力になるように調整を行なったが、ＩＩＰＬＣとし
ては低圧になるため、操作に困難をきたした。 これにより得られたクロマトグラムを第１２図に示す、
第１２図と第６図及び第７図との比較からもわかる通り
、従来法に従って得た１■静を充填したものは、全体的
にブロードなピークを示した。 比較例３ 比較製造例１に従って得たＩＩＡｐを、内径７．６ ｍ
ｓ＋、長さ１００■鵬のカラムに充填圧力１５ｋｇ／ｃ
ｊ−Ｇで充填した。しかし内部で結晶が破壊され目づま
りが生じ、展開を行うことができなかった。 比較例４ 比較製造例１に従って得た１■静を、内径７．６ ｍｍ
、長さ１００＋＊■のカラムに充填して、実施例１２と
同様な操作を行なったが、二回目でカラム圧力が上昇し
展開が不可能となった。 〔発明の効果〕 以上詳細に説明したように、本発明は炭酸根をＣＯｌと
して０．５重量％以上含有したＣＯＡ、をＬＣ用または
Ｉｌｌ”ＬＣ用カラムの充填剤として使用する、また、
このＣ０Ａｐを充填してなるカラムの発明である。 従来ＬＣ用またはＩｌｌ”ＬＣ用カラムは充填材が１１
＾ｐであるので、分離能にやや問題があると共に、耐圧
・耐久性に劣るという問題があった。また、１１静が品
質的に再現性良く製造できないという重大な問題もあっ
た。 これに対し本発明の充填材はＣＯ＾ρであるので分＋１
！Ｉｆｔｍが偏れており、また結晶の強度が大きいため
耐圧・耐久性にも優れている。従って、２００回以上の
繰返し使用が可能で、優れた耐久性を持っている０以上
のことから、本発明のＣＯＡｐは特にＩＩｒ’ＬＣ用充
填材として使用した場合、充填密度を０．５ε／ｄ以上
とすることができるので、ＩＩＩ’ＬＣ特有の展開条件
下で一層向上した分離能を示すのである。 さらに、従来のｌＩｒ’Ｌｃ用カラムは耐圧・耐久性に
劣るのに対し、本発明のカラムにおいてはＣ０Ａｐ結晶
が破壊されにくく、従って、容易に０．５５／ｃｄ以上
の密度で充填することができ、カラムの強度も大で少な
くともＩＩＰＬＣの実質的な充填圧力である１０ｋｇ／
ｃシを満足し、さらに５００ｋｇ／ｃｄ以上の高い圧力
をかけても充填材であるＣＯ静静体体は全く支障がない
。 また、本発明のＣＯ静は従来のＩＩＡＩ）と異なり結晶
を配向させながらＩＩＰＬＣｍカラムに充填するという
煩雑な操作を必要としないので、節単にカラム充填が行
なえるという利点がある。さらに圧力の調整により流速
制御ができるので展開液も従来品に比べ少量で済むとい
う利点もある。さらにまた、本発明のカラムは分析を目
的としたＩＩＰＬｃ用カラム以外に、分取を目的とした
分取用＋１ＰＬｃ用カラムとしても好適に使用でき、必
要とされる試料を短時間のうちに純度よく分離・精製す
ることが可能であるのである。 また、１■静を充填した従来のカラムを使用して分取を
行なう場合、分取したサンプルの溶離液として通常燐酸
塩の液が使用される関係上、溶離後の処理として脱塩を
必要とする場合もしばしばあるが、この場合分離操作自
体は短時間であっても、後処理を含めると決して短時間
とはいえなかった。しかし本発明では充填材としてＣＯ
Ａｐを使用しているので、溶離液としてこれまで不向き
と考えらていた、揮発性の炭酸塩系溶離液が使用可能で
あるので、後処理の時間を大幅に短縮できるという利点
も有している。この点は特に核酸を分離・精製する際に
威力を発揮する。 即ち、核酸類としてたとえばプラスミドＤＮＡを分離・
精製する場合は、分離後最終的には分取液にエタノール
を加え核酸を沈殿させ回収保存される。しかしこの操作
は燐酸塩を含む液では燐酸塩も共に析出沈殿するので前
処理として燐酸塩の脱塩が必要であった。しかしながら
ここで揮発性塩を使用すれば、直接エタノール添加によ
る沈殿析出が実施可能であり、合計の処理時間が大幅に
軽減される。 ここで脱塩処理とは、透析のことを指し、溶離液に燐酸
を使用した場合、この処理には通常１５〜２４時間を必
要としていたが、本発明では炭酸塩系溶離液が使用可能
であるので、この脱塩処理時間は１時間以内と大幅に短
時間で完了することができる。この炭酸塩系溶離液の使
用はＣ０Ａｐの如く炭酸根を含有するアパタイトを使用
することで初めて達成できるものであり、従来の如き１
１＾ｐでは達成できない。 以上種々列記した通り、ＬＣ用及びＩＩＩ’ＬＣｍカラ
ムの充填材にＣＯ＾ｐを使用することにより種りの効果
があり、その産業上の利用可能性はきわめて大なるもの
であるといわざるを得ない。
第１図及び第３図はそれぞれ製造例１及び製造例２で得
られた本発明のＣＯ＾ｐのＸ線回折図である。 第２図及び第４図はそれぞれ製造例１及び製造例２で得
られたＣＯ静の赤外吸収スペクトルを表す図である。第
５図は比較製造例１で得られたＩＩＡｐの赤外吸収スペ
クトルを表す図である。 第６図及び第７図はそれぞれ実施例１及び実施例２で行
なったｌｌｒ’Ｌｃ用カラムによる牛血清アルブミンを
展開して得られたクロマトグラムである。 第８図及び第９図はそれぞれ実施例３及び実施例４で行
なったＬＣ用カラムによる牛血清アルブミンを展開して
得られたクロマトグラムである。 ｉ１０図は実施例１１で行なったＩＩＰＬＣ用カラム用
法ラム酸を展開して得られたクロマトグラムである。 第１１図は比較例１で行なったＬＣ用ガラスカラムによ
る牛血清アルブミンを展開して得られたクロマトグラム
である。第１２図は比較例２で行なったＩＩＰＬＣｍカ
ラムによる牛血清アルブミンを展開して得られたクロマ
トグラムである。 特許出願人 三井東圧化学株式会社
られた本発明のＣＯ＾ｐのＸ線回折図である。 第２図及び第４図はそれぞれ製造例１及び製造例２で得
られたＣＯ静の赤外吸収スペクトルを表す図である。第
５図は比較製造例１で得られたＩＩＡｐの赤外吸収スペ
クトルを表す図である。 第６図及び第７図はそれぞれ実施例１及び実施例２で行
なったｌｌｒ’Ｌｃ用カラムによる牛血清アルブミンを
展開して得られたクロマトグラムである。 第８図及び第９図はそれぞれ実施例３及び実施例４で行
なったＬＣ用カラムによる牛血清アルブミンを展開して
得られたクロマトグラムである。 ｉ１０図は実施例１１で行なったＩＩＰＬＣ用カラム用
法ラム酸を展開して得られたクロマトグラムである。 第１１図は比較例１で行なったＬＣ用ガラスカラムによ
る牛血清アルブミンを展開して得られたクロマトグラム
である。第１２図は比較例２で行なったＩＩＰＬＣｍカ
ラムによる牛血清アルブミンを展開して得られたクロマ
トグラムである。 特許出願人 三井東圧化学株式会社
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）炭酸根をＣＯ＿３として０．５重量％以上含有した
ヒドロキシアパタイトからなることを特徴とする液体ク
ロマトグラフィー用充填材。 ２）炭酸根をＣＯ＿３として０．５重量％以上含有した
ヒドロキシアパタイトを充填してなることを特徴とする
液体クロマトグラフィー用カラム。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63117096A JPH0743358B2 (ja) | 1988-05-16 | 1988-05-16 | 液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム |
| EP89304946A EP0342932A1 (en) | 1988-05-16 | 1989-05-16 | Solid support and column for liquid chromatography |
| KR1019890006667A KR910003119B1 (ko) | 1988-05-16 | 1989-05-16 | 액체 크로마토 그래피용 충전재 및 컬럼 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63117096A JPH0743358B2 (ja) | 1988-05-16 | 1988-05-16 | 液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01287462A true JPH01287462A (ja) | 1989-11-20 |
| JPH0743358B2 JPH0743358B2 (ja) | 1995-05-15 |
Family
ID=14703300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63117096A Expired - Lifetime JPH0743358B2 (ja) | 1988-05-16 | 1988-05-16 | 液体クロマトグラフィー用充填材及びカラム |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0342932A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0743358B2 (ja) |
| KR (1) | KR910003119B1 (ja) |
Families Citing this family (4)
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| JPH08193997A (ja) * | 1995-01-18 | 1996-07-30 | Mitsubishi Materials Corp | 活性型ＴＧＦ−β１の吸着剤、活性型ＴＧＦ−β１の検査法及び癌の検査法 |
| JPH08198610A (ja) * | 1995-01-18 | 1996-08-06 | Mitsubishi Materials Corp | Ｏｈ基炭酸水酸アパタイトを用いたカラム剤 |
| US5691453A (en) * | 1995-06-07 | 1997-11-25 | Biopure Corporation | Separation of polymerized hemoglobin from unpolymerized hemoglobin on hydroxyapatite using HPLC |
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| JPS6413453A (en) * | 1987-07-08 | 1989-01-18 | Asahi Optical Co Ltd | Packing agent for liquid chromatography |
| JPH01162148A (ja) * | 1987-12-18 | 1989-06-26 | Asahi Optical Co Ltd | 液体クロマトグラフィー用充填剤およびその製法 |
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| JP5318002B2 (ja) * | 2010-02-19 | 2013-10-16 | ユニ・チャーム株式会社 | マスク |
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1988
- 1988-05-16 JP JP63117096A patent/JPH0743358B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-16 KR KR1019890006667A patent/KR910003119B1/ko not_active Expired
- 1989-05-16 EP EP89304946A patent/EP0342932A1/en not_active Withdrawn
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60143762A (ja) * | 1983-10-03 | 1985-07-30 | Mitsui Toatsu Chem Inc | クロマトグラフイ−用ヒドロキシアパタイト |
| JPS6413453A (en) * | 1987-07-08 | 1989-01-18 | Asahi Optical Co Ltd | Packing agent for liquid chromatography |
| JPH01162148A (ja) * | 1987-12-18 | 1989-06-26 | Asahi Optical Co Ltd | 液体クロマトグラフィー用充填剤およびその製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR900017632A (ko) | 1990-12-19 |
| JPH0743358B2 (ja) | 1995-05-15 |
| KR910003119B1 (ko) | 1991-05-20 |
| EP0342932A1 (en) | 1989-11-23 |
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