JPH0138472B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はストレプトミセス属に属して抗生物質
イスタマイシン（Istamycin）Ａおよびイスタマ
イシンＢの如きイスタマイシン類生産菌として有
用である新種の放線菌微生物に関する。 本発明者らは、神奈川県三浦半島沿岸の海底土
より昭和53年８月に分離した放線菌でSS−939号
株の番号が付された菌株を培養して、イスタマイ
シンＡまたはイスタマイシンＢ、またはこれらの
混合物を蓄積せしめ、その培養液からイスタマイ
シンＡまたはイスタマイシンＢを採取できること
を発見した。イスタマイシンＡとイスタマイシン
Ｂは、諸種の細菌に広く且つ強い抗菌作用を示
し、毒性の低いアミノ配糖体抗生物質であること
から、化学療法剤として細菌感染症の治療に用い
られる抗生物質である。そして、本発明者は、上
記の放射菌SS−939号株をストレプトミセス・テ
ンジマリエンシスSS−939株と命名し、その菌学
的性質を調べて新規な微生物であることを確認し
た。 本発明の要旨とするところは、気菌糸の色調が
白色で次第に青緑色を帯びた灰色を増し、気菌糸
に螺旋糸を示さず、また胞子表面が平滑であり、
メラニン様色素生産性すなわちクロモゲン性があ
り、炭素源としてグルコースとイノシトールを同
化するがアラビノース、Ｄ−キシロース、シユク
ロース、ラムノース、ラフイノース、Ｄ−マンニ
ツトを同化せず、イスタマイシン類の生産性を有
する、実質的に純粋に分離されたストレプトミセ
ス・テンジマリエンシスにある。 本発明のストレプトミセス・テンジマリエンシ
スにより生産されるイスタマイシンＡは塩基性物
質であり、その炭酸塩として単離されたイスタマ
イシンＡは白色粉末で、明確な融点を示さない
が、102〜108℃で分解し、比旋光度は〔α〕²⁵ _D＝
＋155゜（c0.4、水）を示し、元素分析値は
C₁₇H₃₅N₅O₅・１／2H₂CO₃の分子式の理論値
（C49.99％、H8.63％、N16.65％、O24.73％）に
合致し、さらにこの分子式は高分解能マススペク
トルによつて証明された（実測値：ｍ／
e389.2588、C₁₇H₃₅N₅O₅の理論値：389.2635）。水
溶液中で測定した紫外部吸収曲線は末端吸収を示
すのみである。重水中で測定した ¹H−核磁気共
鳴スペクトル（TMS外部標準、pD5.4）で、
δ3.20（ｓ、Ｎ−CH₃）、3.57（ｓ、Ｎ−CH₃）、3.89
（ｓ、Ｏ−CH₃）、4.50（ｓ、CH₂）および5.80（d.J
＝3.5Hz、CH）に特徴的なシグナルを示した。イ
スタマイシンＡは水およびメタノールに溶ける
が、エタノール及びその他の一般の有機溶媒に難
溶あるいは不溶である。ニンヒドリン反応および
ライドン−スミス反応に陽性である。セルロース
（アビセル）の薄層クロマトグラフイー（展開
系：ブタノール・ピリジン・酢酸・水、６：４：
２：４容）で、イスタマイシンＡはRf0.22に単一
スポツトを示し、後述のイスタマイシンＢの
Rf0.25と明らかに区別される。蟻酸・酢酸・水
（25：75：900容）を用いた高圧濾紙電気泳動
（３、300V、15分）で、アラニンの移動度を1.0
としたとき、イスタマイシンＡおよびイスタマイ
シンＢの移動度は共に2.15を示して区別されな
い。 また、本発明のストレプトミセス・テンジマリ
エンシスにより生産されるイスタマイシンＢはそ
の性状がイスタマイシンＡときわめて類似してい
る。イスタマイシンＢも塩基性物質であり、その
炭酸塩は白色粉末で、明確な融点を示さないが、
112〜124℃で分解し、比旋光度は〔α〕²⁵ _D＝＋
165゜（c0.4、水）を示し、元素分析値は
C₁₇H₃₅N₅O₅・１／2H₂CO₃の分子式の理論値
（C49.99％、H8.63％、N16.65％、O24.73％）に
合致し、さらにこの分子式は高分解能マススペク
トルによつて証明された（実測値：ｍ／
e389.2625、C₁₇H₃₅N₅O₅の理論値：389.2635）。水
溶液中で測定した紫外部吸収曲線は末端吸収を示
すのみである。重水中で測定した ¹H−核磁気共
鳴スペクトル（TMS外部標準、pD5.4）で、
δ3.26（ｓ、Ｎ−CH₃）、3.59（ｓ、Ｎ−CH₃）、3.95
（ｓ、Ｏ−CH₃）、4.57（ｓ、CH₂）および5.96（ｄ、
Ｊ＝3.5Hz、CH）に特徴的なシグナルを示した。
イスタマイシンＢは水およびメタノールに溶ける
が、エタノール及びその他の一般の有機溶媒に難
溶あるいは不溶である。ニンヒドリン反応および
ライドン−スミス反応に陽性である。前述の如
く、イスタマイシンＡとはセルロースの薄層クロ
マトグラフイーで区別される。 イスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢは次
の構造式を有するものである。 イスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢの栄
養寒天平板上における諸種の試験菌に対する最低
発育阻止濃度は第１表に示すとおりで、ともにグ
ラム陽・陰性菌の発育を強く阻止する。

【表】

【表】 イスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢの急
性毒性は、100mg／Kgの量をマウス静脈内投与し
た場合に、いずれも７日間以上生存し、何らの副
作用を認めなかつた。 以上の諸性状から、イスタマイシンＡおよびイ
スタマイシンＢは、ホーテイマイシンＡ（R.
Okachiら、「ジヤーナル・オブ・アンチビオチク
ス」30巻、541頁、1977年）およびスポラリシン
Ａ（T.Deushiら、「ジヤーナル・オブ・アンチビ
オチクス」32巻、173頁、1979年）と類似である
が、Ｃ−メチル基を有せず、Ｎ−メチル基を２個
有する点で、これらの抗生物質とは明らかに区別
される。但し、イスタマイシンＡは特開昭54−
141701号公報（昭和54年11月５日公開）に示され
た化合物KA−7038Iと同一物質であると認めら
れる。 本発明によるストレプトミセス・テンジマリエ
ンシスSS−939号株は三浦半島沿岸の海底土をカ
ナマイシン10mcg／ml含有のMY培地（マルトー
ス１％、イーストエキス0.4％、寒天1.5％、PH
7.2）で27℃、３日間培養して生育した放線菌集
落を釣菌し、さらに炭水化物同化性試験培地（プ
リドハム・ゴツトリーブ培地）にグルコース、キ
シロース、アラビノース、ラムノース、ラフイノ
ース、イノシトール夫々を各々１％含有させて、
イノシトールを含有する培地でイノシトールを同
化して生育する放線菌をスクリーニングして分離
されたものである。 本発明によるストレプトミセス・テンジマリエ
ンシスSS−939号株の菌学的性状は次に示す通り
である。 (a) 形 態 寒天培地上に良く生育したSS−939号株は単純
分枝し、良く伸長した基中菌糸から、直状または
少しく湾曲した気中菌糸を伸長し、成熟すると先
端に10〜50の長円筒状（巾１ミクロンで長さ４〜
５ミクロン）の胞子の連鎖を形成する。気菌糸に
は、螺旋糸や車軸分枝は示さない。電子顕微鏡下
で胞子表面は平滑で、刺状または毛状構造は見ら
れない。鞭毛や胞子のうもなく、典型的なストレ
プトミセスである。 (b) 各種培地上の特徴 シユークロース・硝酸塩寒天培地（27℃培
養）：弱い無色の発育上に白色の気菌糸を生じ、
次第に青緑色を帯びた灰色（17sec Aqua
Blue、カラー・ハーモニー・マニユアルによ
る、以下同じ）を増す。培地に顕著な拡散性色
素を生産することはない。 グリセリン・アスパラギン寒天培地（27℃培
養）：と殆んど同じであるが、気菌糸を着生
しにくい。 スターチ寒天培地（27℃培養）：と殆んど
同じであるが、気菌糸を着生し、菌発育の周辺
のスターチは透明となる。 チロシン寒天培地（37℃培養）：、の所
見に殆んど同じであり、メラニン様色素を生産
する。 栄養寒天培地（27℃培養）：無色の発育上に
白色の気菌糸を着生し、培地は茶褐色を帯び
る。 イースト・麦芽寒天培地（27℃培養）：無色
の発育上に白色の気菌糸を着生し、次第に青緑
色を帯びた灰色（19 dc Aqua Green）を示
す。培地は茶褐色を呈する。 オートミール寒天培地（27℃培養）：無色の
発育上に白色ないし青灰色（17 ec Aqua
Blue）を帯びた気菌糸を着生する。 (c) 生理的性質 20〜41℃で生育可能である。 スターチ寒天培地上でスターチを加水分解す
る。 脱脂牛乳の凝固、ペプトン化は殆んど見られ
ない。 メラニン様色素をチロシン寒天培地上および
ペプトン・イースト・鉄寒天培地上に生成す
る。 (d) 炭素源の同化性（プリドハム・ゴツトリーブ
寒天培地上） グルコースとイノシトールのみを同化し、アラ
ビノース、Ｄ−キシロース、シユクロース、ラム
ノース、ラフイノース、Ｄ−マンニットは同化し
ない。Ｄ−フラクトースの同化は疑わしい。 以上の性状は、本菌株が典型的なストレプトミ
セスに属することを示し、気菌糸が螺旋糸を形成
せず、メラニン様色素生産性（クロモゲニツク
性）を有する。気菌糸の色調、クロモゲン性から
類似菌種を検索すると、ストレプトミセス・ビリ
ドクロモゲネス（Streptomyces
viridochromogenes）があげられるが、SS−939
号株は螺旋糸をつくらず、キシロース、アラビノ
ース、ラムノース、フラクトース、ラフイース、
マンニツトを利用しないことでも明らかに区別さ
れ、胞子の表面が平滑であるが刺状でないことで
決定的に異なる。クロモゲン性がなく、気菌糸の
色調のやゝ似たストレプトミセス・ビリデフアシ
エンス（Streptomyces viridifaciens）とは、本
菌株SS−939号株の気菌糸が螺旋状にならないこ
と、および炭素源としてフラクトース、シユクロ
ースを同化しないことで区別される。その他、
SS−939号株の特徴的な炭素源同化性を示すスト
レプトミセス属の菌種はない。従つてSS−939号
株を含む菌種は新種であり、ストレプトミセス・
テンジマリエンシス（Streptomyces
tenjimariensis）と命名した。 このストレプトミセス・テンジマリエンシス
SS−939号は昭和54年４月21日工業技術院微生物
工業技術研究所に保管委託申請し、微工研菌寄第
4932号である。 なお、前記の特開昭54−141701号公報に記載さ
れるストレプトミセスsp.No.KC−7038株（微工研
菌寄第4386号）は、イスタマイシンＡと同一物質
と認められる化合物KA−7038I物質を生産する
ので、本発明によるストレプトミセス・テンジマ
リエンシスSS−939株と上記KC−7038株との比
較を次の第２表に要約して示す。

【表】 上記の両菌株は、共にストレプトミセス属に属
するが、形態的に気菌糸の色調、螺旋糸の有無、
胞子表面の性状において明らかに異つており、ま
た生理的性状も、メラニン様色素の産生、資化性
炭素源の内容において明らかに相異なる菌種であ
る。なお、KC−7038株はイスタマイシンＢを生
産しない点でも異なる。 本発明の新規微生物をイスタマイシンＡ、イス
タマイシンＢ生産に利用する場合には、通常の微
生物が利用しうる栄養源含有培地に接種して、好
気的に発育させることによつて、イスタマイシン
Ａまたは（および）イスタマイシンＢを含む培養
液を得る。栄養源としては放線菌の栄養源として
用いられる公知のものが使用できる。例えば市販
されている大豆粉、落花生粉、棉実粉、乾燥酵
母、ペプトン、肉エキス、カゼイン、コーン・ス
チーブ・リカー、硝酸ソーダ、硫酸アンモニウム
などの窒素源、および市販されているグルコー
ス、澱粉、グリセリン、マルトース、デキストリ
ン、蔗糖、乳糖などの炭水化物、あるいは大豆
油、脂肪などの炭素源と、必要に応じて食塩、炭
酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガ
ン、燐酸塩などの無機塩類および各種のアミノ酸
などを使用できる。これらのものは、本発明の菌
が利用し、イスタマイシンＡまたはイスタマイシ
ンＢの生産に役立つものであれば良く、公知の放
線菌の培養材料はすべて使用できる。その大量生
産には液体通気撹拌培養が好ましく、培養温度は
本発明の菌が発育し、イスタマイシンＡまたはイ
スタマイシンＢを生産する範囲で適用しうるが、
殊に好ましいのは25〜30℃である。培養は普通イ
スタマイシンＡまたは（および）イスタマイシン
Ｂが充分蓄積するまで継続される。通常２〜７日
間の培養が行なわれる。 イスタマイシンＡまたは（および）イスタマイ
シンＢの定量は、試験菌としてバシルス・サブチ
リスPCI 219株を使用して、抗生物質の定量に用
いられる通常の円筒平板法によつて行ない、精製
イスタマイシンＡを1000mcg（単位）／mgとして
標準物質とした。なお、精製イスタマイシンＢは
3170mcg（単位）／mgの力価を示した。 イスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢおよ
びそれらの塩は水によく溶け、本発明の菌の培養
液では主として液体部分に存在する。液体中のイ
スタマイシンＡおよびイスタマイシンＢは実質的
にブタノール、酢酸ブチル、クロロホルムなどの
有機溶媒に抽出されないので、これらの溶媒によ
る処理は夾雑物の除去のために必要ならば利用で
きる。培養液あるいは水溶液中のイスタマイシン
Ａまたは（および）イスタマイシンＢは種々の吸
着剤を用いて採取することができる。吸着剤とし
て活性炭を使用した場合、吸着した抗生物質は弱
酸性水および弱酸性のメタノール水、プロパノー
ル水、アセトン水などで溶出される。 また、イスタマイシンＡまたは（および）イス
タマイシンＢはその塩基性の性状にもとづいて、
収率よく陽イオン交換樹脂に吸着溶出される。こ
の方法は大量の培養液より採取するのに最も適し
た方法である。陽イオン交換体としてはカルボン
酸を活性基とするアンバーライトIRC−50、CG
−50（ローム・アンド・ハース社製）、レワチツト
CNP（バイエル社製、CM−セフアデツクス（フ
アルマシア社製）などのＨ型、Na型、NH₄型な
どおよびそれらの混合型が用いられ、吸着した抗
生物質は酸性水、稀アンモニア水および無機塩の
水溶液などによつて収率よく溶出され、通常0.2
−1N塩酸および0.2N−1Nアンモニア水が使用さ
れる。イスタマイシンＡまたはおよびイスタマイ
シンＢは実質的に陰イオン交換樹脂に吸着しない
ので、その酸性溶液の中和や、酸性の夾雑物を除
去するのに好ましい材料である。 イスタマイシンＡおよびイスタマイシンＢは、
前述の如くブタノール・ピリジン・酢酸、水
（６：４：２：４容）を展開系とするセルロース
（アビセル）の薄膜クロマトグラフイーで、分離
される（イスタマイシンＡ：Rf0.22；イスタマイ
シンＢ：Rf0.25）性状にもとずいて、セルロース
のカラムクロマトグラフイーによつて、薄膜クロ
マトグラフイーと同一または類似の溶媒系で展開
することにより、有効に分離精製することができ
る。 以下に、本発明の微生物を利用したイスタマイ
シンＡまたは（および）イスタマイシンＢの製造
法の実施例を示す。 実施例 １ 寒天斜面培地に培養したストレプトミセス・テ
ンジマリエンシスSS−939号株（微工研菌寄第
4932号）を、澱粉1.0％、グルコース0.2％、大豆
粉1.0％、食塩0.3％、リン酸二カリウム0.1％、硫
酸マグネシウム（7H₂O）0.1％を含む液体培地
（500ml三角フラスコ中110ml）に接種し、27℃で
48時間回転振盪培養して種培養を得た。この種培
養220mlを、澱粉2.0％、グルコース0.2％、大豆
粉2.0％、食塩0.3％、リン酸二カリウム0.1％、硫
酸マグネシウム（7H₂O）0.1％の液体培地（15
）を含む30容のジヤーフアーメンターに接種
し、27℃で72時間通気撹拌培養（毎分15通気、
毎分300回転）した。 この培養液（ジヤーフアーメンター、６基分）
を集め、塩酸でPH2.0に調整して濾過し、90の
濾液（2.5mcg／ml）を得た。この濾液をアンバ
ーライトIRC−50（NH₄型）12を充填した塔に
通過吸着せしめ、水洗（24）後、1Nアンモニ
ア水で溶出した。活性溶離液（３）を集めて減
圧濃縮乾燥し、粗粉末3.51ｇ（61mcg／mg）を得
た。 この粗粉末を100mlの水にとかし、ダウエツク
ス１−X4（OH型）300mlをつめた塔（内径40mm）
にかけ、続いて水で展開し、はじめの流出液200
mlを捨て、次の880mlを集め、これを、続いてア
ンバーライトCG−50（NH₄型）150mlをつめた塔
（内径25mm）にかけて吸着せしめ、水洗（300ml）
後、0.2Nアンモニア水900ml、次いで0.4Nアンモ
ニア水900mlで溶出し、18mlずつ分画した。分画
66〜80を合して減圧濃縮乾固してイスタマイシン
ＡおよびＢを含有する210mgの白色粉末（力価
460mcg／mg）を得た。（なお、分画28〜65にはイ
スタマイシンＡまたはイスタマイシンＢ以外の数
種の抗生物質が溶離された。） 実施例 ２ 実施例１に述べたと同様の方法で得られた培養
濾液（ジヤーフアーメンター、10基分、150）
をアンバーライトIRC−50（NH₄）20を充填し
た塔に通過吸着せしめ、水洗（40）後、1Nア
ンモニア水で溶出、活性溶離液を減圧濃縮乾燥し
て、粗粉末4.1ｇ（力価240mcg／mg）を得た。 この粗粉末を20mlの水にとかし、ダウエツクス
１−X4（OH型）200mlをつめた塔（内径30mm）に
かけ、続いて水で展開し、はじめの流出液270ml
を捨て、次の270mlを集め、続いてこれをアンバ
ーライトCG−50（NH₄型）150mlをつめた塔（内
径25mm）にかけて吸着せしめ、水洗（150ml）後、
0.2Nアンモニア水900ml、次いで0.4Nアンモニア
水900mlで溶出し、18mlずつ分画した。分画55〜
90を合して減圧濃縮乾固してイスタマイシンＡお
よびイスタマイシンＢを含有する980mgの白色粉
末（力価940mcg／mg）を得た。 実施例 ３ 実施例２で得られたイスタマイシンＡおよびイ
スタマイシンＢを含有する白色粉末（力価
940mcg／mg）980mgを、ブタノール・ピリジン・
酢酸・水（６：４：２：２容）の混液15mlにとか
し、セルロース粉末（アビセル）60ｇを充填した
塔（内径25mm）にかけ、はじめに、ブタノール・
ピリジン・酢酸・水（６：４：２：２容）の混液
1200ml、次いで６：４：２：２容の混液600mlで
展開し、10mlずつ分画した。分画45〜74にイスタ
マイシンＢが分画114〜154に、イスタマイシンＡ
が分画75〜113に、両者が混合して溶出された。 分画45〜74を合して減圧濃縮乾固し、５mlの水
にとかして、アンバーライトCG−50（NH₄型）
25mlの塔に通過吸着せしめ、水洗（25ml）後、
0.4Nアンモニア水で溶離し、活性溶離液（40ml）
を減圧濃縮乾固して、イスタマイシンＢの精製粉
末15.3mg（力価3170mcg／mg）を得た。 同様に、分画114〜154を合して減圧濃縮乾固
し、５mlの水にとかして、アンバーライトCG−
50（NH₄型）25mlの塔に通過吸着せしめ、水洗
（25ml）後、0.4Nアンモニア水で溶離し、活性溶
離液（45ml）を減圧濃縮乾固してイスタマイシン
Ａの精製粉末50mg（力価1000mcg／mg）を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 気菌糸の色調が白色で次第に青緑色を帯びた
   灰色を増し、気菌糸に螺旋糸を示さず、また胞子
   表面が平滑であり、メラニン様色素生産性すなわ
   ちクロモゲン性があり、炭素源としてグルコース
   とイノシトールを同化するがアラビノース、Ｄ−
   キシロース、シユクロース、ラムノース、ラフイ
   ノース、Ｄ−マンニツトを同化せず、イスタマイ
   シン類の生産性を有する、実質的に純粋に分離さ
   れたストレプトミセス・テンジマリエンシス。