JPH0141317B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 人間のインシユリンと豚のインシユリンとでは
インシユリン−Ｂ鎖のB30位のカルボキシル末端
位のアミノ酸が相異している。ヒトインシユリン
ではB29位のリジル（IySyI）基のつぎにスレオ
ニンが続くが、豚インシユリンではアラニンがく
る。

ヒトインシユリンの全合成［メルクリ
（MarKIi）氏他の「Hoppe−Seyler'sZ.Physiol.
Chem.」第360巻第1699〜1632頁（1979年）］の他
に種々の半合成法により出発物質としての豚イン
シユリン中のアラニンをスレオニンと交換するこ
とができる。

しかし大量のヒトインシユリンを調整するには
全合成はあまりに費用がかかりすぎる。

ルツテンベルグ（Ruttenberg）氏の米国特許
第3903068号明細書ならびにアール・オーベルマ
イヤー（R.Obermeier）氏他の「Hoppe−
Seyler'sZ.physiol.Chem.」第357巻第759〜767頁
（1976年）記載の半合成法ではトリプシン消化に
より調製された豚のデスオクタペプチドーB23−
30−インシユリンをペプチド化学的方法によりヒ
トインシユリン配列B23−30の保護された合成オ
クタペプチドと結合させている。すべての保護基
を解裂させたのちに複雑な精製段階が続く。ヒト
インシユリンの収量は小さい。

天然の豚インシユリンは酵素的方法を用いれば
比較的高収率でヒトインシユリンに変換される。

イノウエ氏他の「J.Am.Chem.Soc.」第101巻
第751〜752頁（1979年）記載の方法では、豚のデ
スオクタペプチド−B23−30−インシユリンを合
成オクタペプチド−B23−30（ヒト）とトリプシ
ン触媒の存在下に反応させてヒトインシユリンと
なす方法が開発されている。この反応の欠点は合
成オクタペプチドを使用していることで、このも
のはルツテンベルグ氏およびオーベルマイヤー氏
らの方法に際してと同様多大の出費を伴なつて調
製されねばならない。

豚インシユリンの最後のアミノ酸−B30のみが
交換される変換が経済的である。米国特許第
3276961号明細書にはボダンスツキー
（Bodanszky）氏他により一つの方法が記載され
ており、それによれば、動物インシユリンからト
リプシンおよびカルボキシペプチダーゼＡのよう
な酵素を使用してスレオニンの存在下にヒトイン
シユリンが調製されている。しかしながらそこに
記載されている条件下ではLys−Ala（B29−30）
のみでなくまたインシユリン中の他のペプチド結
合も解裂されるのでこの方法は実施できない。

ガツトナー（H.G.Gattner）氏他の「Insulin
（D.BrandburgおよびA.Wollmer両氏編）」
（1980，Proc.2nd Intern.Insulin Symposium）
（1979年）第118〜123頁およびモリハラ氏他の
「Nature」第280巻第412〜413頁（1979年）およ
びヨーロツパ特許出願A1−0017938号明細書記載
の方法ではDes−Ala−B30インシユリン（豚）
から出発しており、そしてこれを２段階法で、ト
リプシンを用いてスレオニン−メチルエステルま
たはスレオニン−第３ブチルエステルと結合させ
て相当するヒトインシユリンエステルとしてい
る。苛性ソーダまたはトリフルオロ酢酸で処理す
ることによりエステル基を解裂させるとヒトイン
シユリンが良好な収量で取得される。

直前にあげた既知の二方法は出発物質として豚
のDes−Ala−B30−インシユリンを使用してい
る。これはカルボキシペプチダーゼＡ（以下
「CPA」と略記する）を用いて豚インシユリンか
ら取得される。CPAはペプチドおよび蛋白質か
ら段階的にカルボキシル末端位の中性および酸性
Ｌ−アミノ酸を解裂させる。アミノ酸は種々の解
裂動力学により解裂される。酵素的分解は塩基性
アミノ酸例えばインシユリン−Ｂ鎖のリジン−
B29またはアルギニン−B22で停止する。従つて
インシユリン−Ｂ鎖のB30位にあるアラニン基は
それ以上の鎖分解を伴なうことなく脱離される。

しかしながらCPA消化の欠点はインシユリン
のＡ鎖のA21位にあるＣ−末端アミノ酸アスパラ
ギンに酵素が同時に作用することにある。CPA
にとつて慣用の消化条件では種々の解裂速度に応
じて、豚インシユリンのアスパラギンの約10〜20
％および同時にアラニンの80〜90％が脱離され
る。従つてかかる消化生成物は末反応のインシユ
リンと並んでDee−Ala−B30−des−Asn−Ａ−
21−インシユリン、Des−Ala−B30−インシユ
リンおよびDes−Asn−A21−インシユリンの混
合物を含有している。

シユミツト（PH．W.Schmitt）氏他の
「HoppeSeyler's Z.Physiol.Chem.」第359巻第
799〜802頁（1978年）記載の方法ではNH₄ ⁺含有
緩衝液の使用によりDes−Ala−B30−des−Asn
−A21−インシユリンの生成を５〜10％以下に減
少させることに成功している。しかしながらカラ
ムクロマトグラフイー精製にもかかわらず、かく
して調整されたヒトインシユリンがなお明らかな
免疫学的反応を惹起することを排除できない。

今やCPA−消化を迂回してトリプシンを用い
て唯一つの段階で豚インシユリンからヒトインシ
ユリンエステルへの変換が成功する半合成法が見
出された。このエステルから常法によりヒトイン
シユリンが調製されうる。一段階反応での総収率
は50〜65％に達する。本方法の利点は、反応操作
がかなり単純化されている他に前記の不純物を何
ら含有せず、従つて免疫学的に問題がある場合に
おける使用にも適するヒトインシユリンが取得さ
れることにある。

従つて本発明の目的は豚インシユリンまたは豚
インシユリンの誘導体をそれらの等電点以下のPH
値でトリプシンまたはトリプシン類似酵素の存在
下にスレオニンエステルまたは遊離のアミノ基を
有するその誘導体の過剰と反応させることを特徴
とする、豚インシユリンまたはその誘導体からの
ヒトインシユリンまたはその誘導体の製法にあ
る。

本発明による反応の出発物質としては未変化の
豚インシユリンの他に、遊離の官能基に保護基を
結合させることによりまたは個々のアミノ酸を解
裂または交換することにより得られうるようなそ
の誘導体が適当である。豚インシユリンのかかる
誘導体が使用される場合は生成物として相当する
保護基または配列を含有するヒトインシユリンが
得られる。本発明による反応に付されうる豚イン
シユリンの好ましい誘導体はDes−Phe^B１−豚イ
ンシユリンであり、これは本発明による反応に際
して相当するDes−Phe^B１−ヒトインシユリンを
生ずる。

さらに、N〓^B1位に保護基を有する豚インシユリ
ンの誘導体が好ましい。この位置における好まし
い保護基は特に第３ブチルオキシカルボニル
（Boc）基またはジメトキシフエニルプロピルオ
キシカルボニル（Ddz）基である。さらにビユン
シユ（PH．Wu¨nsch）氏の「Methoden
derorganischen Chemie（Houben−Wey1）」第
XV／１巻（1974年）により保護基が知られてい
る。

反応は本発明によれば使用されている出発イン
シユリンまたは誘導体の等電点以下のPH値で実施
される。豚インシユリンの場合等電点はPH5.4で
ある。それゆえ出発物質として豚インシユリンを
使用する場合は5.4以下のPH値で操作するのが好
ましい。他方の低いPH値での操作にはインシユリ
ンの安定性および強酸性媒体中での酵素活性によ
つて限界がある。したがつて、反応はPH４〜６で
実施されなければならない。

有機弱酸好ましくは酢酸を用いて弱酸性PH値で
あるPH約５の調整されている水性媒体中でインシ
ユリンまたはインシユリン誘導体とスレオニンエ
ステルアセテートとの反応を行うのが有利である
ことが証明された。この特定の方法の利点はまず
第一に水性有機溶媒中における操作より高い収量
が得られることにある。もう一つの利点は有機溶
媒が節約されることおよび反応混合物の後処理が
容易になることである。その理由は有機溶媒を分
離する必要がないからである。

反応は室温で実施されうる。反応を促進するに
は若干の加温が好ましいが、しかしながら約40℃
の温度を超えてはならない。冷却下での操作は何
の利益ももたらさない。

トリプシンと並んで本発明による方法には、文
献からトリプシン類似であることが知られている
酵素、すなわち塩基性アミノ酸のカルボキシル末
端でのペプチド結合を特異的に解裂させるような
酵素も適している。使用される酵素の量はあまり
厳密なものではない。これは豚インシユリン対酵
素の重量比で１：１〜100：１でありうる。好ま
しくは重量比約10：１で操作する。

スレオニンエステルとしてはすべての既知Ｌ―
スレオニンエステルが使用されうる。例えば適当
なＬ−スレオニンエステルはＬ−スレオニン−第
３ブチルエステル、Ｌ−スレオニン−０−第３ブ
チル−第３ブチルエステルおよびＬ−スレオニン
メチルエステルである。本発明で用いられるスレ
オニンエステルの誘導体には、スレオニンのOH
官能基に保護基、特にエーテル保護基を担持して
いる誘導体が包含される。

スレオニンエステルはインシユリンに対して過
剰に用いられ、インシユリンの約10〜100倍モル
量に達するべきである。

本発明による反応でははじめにヒトインシユリ
ンのB30―エステルが生成され、これは所望の場
合はそれ自体既知の方法によりエステル基を解裂
させることにより遊離のヒトインシユリンに変換
されうる。

エステルを遊離のインシユリンに変換する前に
例えば既知のカラムクロマトグラフイー法による
必要な精製操作を行つておくのが好ましい。

得られたインシユリンは慣用の投薬形態に製剤
化されて糖尿病治療のための医薬として使用され
うる。

実施例 １ 豚のインシユリン120mgおよびThr（OBu^t）Bu^t
231mgをPH4.0の0.1モルピリジンアセテート緩衝
液２ml中に懸濁させそしてDMF3mlの添加により
溶解させる。溶液のPH値を再検査しそして場合に
より新たに酢酸またはピリジンを用いてPH4.0に
調整する。透明な溶液に30℃でTPCK−トリプシ
ン５mgを加える。４時間間隔でTPCK−トリプシ
ン５mgずつをさらに２回加える。反応媒体を35℃
でさらに16時間撹拌する。次にこの溶液を1nHCl
を用いてPH２〜３まで酸性化しそしてエタノール
（１ml）およびエーテル５mlを添加することによ
り沈殿させる。沈殿を遠心分離しそしてエーテル
ですりつぶす。粉末形態の残留物をオーベルマイ
ヤー氏他の記載と同様にして「セフアデツクス
（Sephadex ）」LH20での分配クロマトグラフ
イーにより精製する。分離されたヒトインシユリ
ンエステル含有フラクシヨンを室温で真空下に濃
縮しそしアセトン／エーテルを用いて沈殿させ
る。回収された未反応の豚インシユリンはあらた
めて半合成に用いられうる。生じた沈殿を遠心分
離しそして乾燥する。収量81mg。保護基を解裂さ
せるためにこの生成物をアニソール飽和6nHCl3
ml中で40℃に短時間加温して溶解させる。次に冷
却しそして０℃で10％苛性ソーダを用いてPH２〜
３に調整する。

アセトン30mlの添加によりヒトインシユリンが
沈殿する。この沈殿を遠心分離しそして減圧下に
乾燥する。ヒトインシユリンの収量77mg。

かくして取得されたヒトインシユリンは家兎で
の血糖降下試験において豚インシユリンに比べて
26国際単位／mgの完全な生物学的活性を示す。

アミノ酸分析はヒトインシユリンについての理
論値と一致する。

理論値 実測値 Clu ７ 7.00 Ala １ 1.04 Thr ３ 2.88 Lys １ 1.01 実施例 ２ 豚インシユリン120mgおよびスレオニンメチル
エステル133mgを実施例１におけると同様にして
反応させてヒトインシユリンメチルエステルとな
しそして精製する。かくして取得された生成物
（73mg）を0.1nNaOH 0.1mlと０℃で15分間撹拌
する。次に0.1nHCl（0.5ml）を用いて中和し、透
析しそして凍結乾燥する。生成したヒトインシユ
リン（68mg）は生物学的に完全に活性であつてか
つそのアミノ酸分析は理論値に一致する。

実施例 ３ 豚のインシユリン120mgおよびスレオニン−第
３ブチルエステル175mgを実施例１におけると同
様にして反応せしめそして精製する。ヒトインシ
ユリン−第３ブチルエステルの収量76mg。この生
成物をトリフルオロ酢酸１mlおよびアニソール
0.05ml中に溶解させそして室温で60分間撹拌す
る。かくして生成した保護されてないヒトインシ
ユリンをエーテル８mlの添加により沈殿させそし
て遠心分離する。残留物を水に溶解させ、透析し
そして凍結乾燥する。完全な生物学的活性および
正確なアミノ酸組成を有するヒトインシユリンの
収量71mg。

実施例 ４ 豚のDes−Phe^B１−インシユリン115mgを実施
例１におけると同様にしてThr（Bu^t）OBu^t231mg
と反応させそして製精する。Des−Phe^B１−ヒト
インシユリン−B30−ジ第３ブチルエステルの収
量75mg。実施例１におけると同様にして第３ブチ
ル基を解裂させそして単離すると遊離のDes−
Phe^B１−ヒトインシユリン70mgが得られる。生
物学的活性は26国際単位／mgであつた。アミノ酸
分析結果は次のとおりであつた。

理論値 実測値 Clu ７ 7.00 Ala １ 0.98 Thr ３ 2.90 Phe ２ 2.10 Lys １ 1.03 実施例 ５ 豚のインシユリン120mgを実施例１におけるよ
うにしてThr（Bu^t）OBu^t231mgと反応させる。ト
リプシンの代りにアガロースゲルに結合している
トリプシン0.50mlが使用される。トリプシンアガ
ロースを去後、この溶液を実施例１におけるよ
うにして後処理する。ヒトインシユリンの収量61
mg。

実施例 ６ 豚インシユリン5gとThr（Bu^t）OBu^t−アセテ
ート30gを水20ml中に溶解させそして酢酸を用い
てPHを5.0〜5.2に調整する。反応成分を溶解させ
るために水２ml中に溶解したトリプシン400mgを
加える。反応の経過はアセテートフイルム電気泳
動により監視される。使用されている豚インシユ
リンの最大反応（約90％）に達したときメタノー
ル200mlおよびジイソプロピルエーテル50mlを添
加することにより粗製反応生成物を沈殿させる。
遠心分離および乾燥後で粗製物質収量は5.1gであ
り、このものは高圧液相クロマトグラフイー
（HPLC）分析による調査ではヒトインシユリン
−B30−Bu^t290％を含有している。

実施例 ７ 37.5％酢酸水溶液30ml中にN〓^B1−Boc−豚イン
シユリン5gおよびThr（Bu^t）OBu^t24gを順次溶解
させそして実施例６におけるようにしてH₂O2ml
中のトリプシン400mgを加える。反応は実施例６
におけるようにして進行しそして最大反応に達し
たのちメタノール／ジイソプロピルエーテルを用
いて沈殿させることにより停止させる。単離およ
び乾燥後で粗製物質の収量は5.0gであり、これは
HPLC分析によれば87％のN〓^B1−Boc−ヒトイン
シユリン−B30−Bu^t２を含有している。

実施例 ８ 豚インシユリン10gを酢酸５mlを添加して水45
ml中に溶解させる。これにThr（Bu^t）OBu^t−ア
セテート33gを加えそしてこの透明な溶液中に水
５ml中に溶解したトリプシン0.8gを撹拌下に加え
る。室温で16時間経過後、メタノールおよびジイ
ソプロピルエーテル（容量比４：１）からなる混
合物500mlを用いて沈殿させることにより反応を
停止させそして実施例１に記載のようにして後処
理する。ヒトインシユリンエステルの収量4.0g。

実施例 ９ 豚インシユリン10gを酢酸５mlを添加してThr
（Bu^t）OBu^t−アセテート60gと共に水40ml中に溶
解させる。この反応混合物中に予め水２ml中に溶
解したトリプシン0.8gを添加する。室温で16時間
経過後実施例８に記載のようにして反応混合物を
処理しそして精製する。精製後のヒトインシユリ
ンエステルの収量4.1g。

実施例 10 豚インシユリン120mgを水0.5mlおよび酢酸酸
0.04ml中にThr（Bu^t）OBu^t−アセテート380mgと
共に溶解させる。この溶液中に10単位のリジルエ
ンドペプチダーゼ−Lys−C1（蛋白質５mg）を加
える。室温で16時間経過後実施例８に記載のよう
にして処理しそして精製する。ヒトインシユリン
エステルの収量61mg。

実施例 11 Thr（Bu^t）OBu^t1.35Kgを石油エーテル１中に
溶解しそして氷冷する。酢酸340mlをこの溶液中
にかきまぜ入れそしてこの溶液を結晶化が終了す
るまで０℃に冷却する。結晶化したThr（Bu^t）
OBu^t−アセテートを過し、０℃の石油エーテ
ルで洗いそして真空下に乾燥する。Thr（Bu^t）
OBu^t−アセテートの収量1.44Kg（融点58〜60
℃）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 豚インシユリンまたは豚インシユリンの誘導
   体をそれらの等電点以下のPH値でトリプシンまた
   はトリプシン類似酵素の存在下に過剰のスレオニ
   ンエステルまたはその誘導体と反応させそして所
   望の場合は次にエステル基を解裂させることを特
   徴とする、豚インシユリンまたはその誘導体から
   のヒトインシユリンまたはその誘導体の製法。 ２ 反応が有機溶媒の非存在下に遂行されること
   を特徴とする、前記特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ３ Des−Phe^B１−豚インシユリンからDes−
   Phe^B１−ヒトインシユリンが調製されることを
   特徴とする、前記特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ４ PH４〜６で操作が行なわれることを特徴とす
   る、前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 豚インシユリンの誘導体がN〓^B1−位に保護基
   を有する豚インシユリンであることを特徴とす
   る、前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 保護基がBOCまたはDDZであることを特徴
   とする、前記特許請求の範囲第５項記載の方法。