JPH03400B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、インシユリン分泌増強活性因子の構
成成分である新規な蛋白性要素物質に係るもので
ある。更に詳しくは、ボルデテラ属に属する微生
物の菌体及び倍養上清中にインシユリン分泌を促
進し且つ、血糖値を正常に維持調整する薬理効果
を有する成分、すなわちボルデテラ属産生インシ
ユリン分泌増強活性物質（以下、Ｎ−IAPと略称
す。）の副作用を軽減した新規な蛋白性要素物質
に係るものである。 糖尿病薬であるＮ−IAPは、その特徴的なイン
シユリン分泌の促進及び血糖値を正常に維持調整
する薬理作用と併せて、高分子蛋白質であるが故
に、Ｎ−IAPを投与した時に発現する抗体産生に
より、Ｎ−IAPを再び投与すると、アナフイラキ
シを誘発するという問題点を有している。すなわ
ち、糖尿病の治療及び予防に有効であるインシユ
リン分泌増強活性以外の副作用の除去、特にアナ
フラキシが抑制されたより安全な医薬品の提供が
望まれている。 本発明者等は鋭意研究の結果、Ｎ−IAPを、高
濃度の尿素水溶液を用いて解離をおこなうことに
より新規な蛋白性要素物質を単離・同定すること
に成功した。この単離・同定された新規な蛋白性
要素物質はそれぞれ単独では、インシユリン分泌
増強作用は不活性であるが、この蛋白性要素物質
をそれぞれ別途に投与すると、驚くべきことに
IAPを投与したときと同等のインシユリン分泌促
進作用及び血糖値を正常に維持調整する作用を有
し、更に、Ｎ−IAPの投与したときに発現する抗
体産生により、Ｎ−IAPを再投与するとアナフイ
ラキシを誘発する欠点が著しく軽減することが判
明した。すなわち、単独では、糖尿病の治療及び
予防に有効であるインシユリン分泌増強作用は不
活性であるが、それぞれを別途に投与することに
よりインシユリン分泌増強活性を有し、しかも副
作用を大幅に減弱した新規な蛋白性要素物質の分
離・同定を達成したものである。 以下本発明の構成について説明する。 インシユリン分泌増強活性物質 本発明に於ける出発物質であるインシユリン分
泌増強活性物質（以下、“Ｎ−IAP”と略称する）
は、病原性菌として公知のボルデテラ属に属する
微生物（百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症
菌）、特に好ましくは百日核相菌（Bordetella
pertussis phase ）を固形培地や液体培地に
て培養し、その菌体しくは培地から採取、精製し
て得られる蛋白性物質である。 菌体ならびに培養物からＮ−IAPの有利な採取
および精製は、溶解度法、クロマトグラフイー
法、分子篩法、電気泳動法および生物学的方法の
一つ又は、これ等の方法の組合せなど、当該分野
で汎用の多くの分別精製方法により達成され得、
従つて本発明は特定の採取精製法に何等限定され
るものではない。 Ｎ−IAPの極めて有利な採取精製方法の１例と
して、カラムクロマトグラフイー的手段を提示し
得る。この場合、微生物の培養上清液は、ハイド
ロキシアパタイト（生化学工業(株)製）、カルボキ
シメチルセフアロースCL−6B（フアルマシア・
フアイン・ケミカルズ社製）の充填材より成るカ
ラムを通し次いで、セフアクリルＳ−200（フアル
マシン・フアインケミカルズ社製）を用いるゲル
ろ過法により精製されるＮ−IAPはこれらのカラ
ムに極めて選択的に吸着され、次いで0.5M
NaCl含有の0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）等の適切
に選定された溶出液に溶離されて精製物を与え
る。この精製物に透析操作を適宜施こすことによ
り、不要な塩類が除去されて高活性のＮ−IAPが
得られる。又、Ｎ−IAPは菌体内にも存在するの
で、所望の場合には、例えば菌体浮遊液にNaCl
を添加して菌体内Ｎ−IAPを溶液中に浸出せしめ
る手段などを採用してもよい。 Ｎ−IAPを産生するボルデテラ属の微生物は、
前記の通り百日核菌、パラ百日核菌及び気管支敗
血症菌として周知であるが、他方、これらの病源
菌を、培地組成の変更、紫外線、Ｘ線等の各種放
射線照射又は変異誘起剤の適用等の慣用の各種手
段で変異せしめて得られる変異株も又、Ｎ−IAP
産生菌として有用である。 培養方法としては、液体振盪培養方法が活性及
び収率の点で好ましいが、他の方法によることも
妨げない。 なお、ボルデテラ属に属する別生物の菌学的性
質、培養条件等はBergy′s Manual of
Deteminative Bacteriology第８版1974年
Baltimore：The Williams ＆ Willkns CO.，
J.Exp・Med.129；523〜550（1969）、細菌学実習
提要：第３版第６頁以下、昭和47年（丸善(株)発
行）、等に記載されている。 次に、Ｎ−IAPの各種物性に付き詳述する。存
在状態及び溶解特性： 脱塩後、凍結乾燥して得られる粉末は、非潮解
性白色または淡褐色粉末であり、約３〜５mg／ml
までは室温で水に溶解、6NHCl中では不溶性白
沈を生じ、ピリジン、ドデシル硫酸ナトリウム、
メルカプトエタノール、システイン溶液に溶解す
る。冷時（４℃）、精製活性物質の溶液に硫安、
ドライアイス・アセトンあるいはエタノール、ト
リクロル酢酸、塩化亜鉛溶液及びその他の数種の
金属イオンを含む溶液等の添加により、各々白
濁、沈澱を生ずる。水とクロロホルムあるいはｎ
−ブタノール混合液では不溶性となり両液の界面
に集まる。 Ｎ−IAPの水溶液を80℃以上に加温すると白濁
する。0.5MNaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
に対し本Ｎ−IAPを溶解し、次いで蒸留水を外液
として透析すると、一時白濁するが透析の続行に
より完全に再溶液し、白濁は消失する。また、高
濃度溶液では0.01M酢酸緩衝液（PH4.5）に対し、
撤底的に透析すると淡褐色に着色して溶解するこ
ともある。 分子量： 10〜30％の密度匂配のアクリルアミドゲル37：
１の架橋比で、濃縮ゲルのPHが6.8、泳動ゲルの
PHが8.8、泳動電圧：90Vで16時間泳動する平板
法SDS−ポリアクリルアミド−デイスク電気泳動
法（ラムリー法）で処理した後、20％TCAで１
時間処理し、次いでクマージーブルーで染色す
る。尚蛋白質のSDS化を１％SDSで100℃５分間
処理する。SDS−ゲル電気泳動法によるＮ−IAP
の分子量は105700±5000である。 組成： Lowry法による蛋白質98重量％以上ある。尚、
各成分の測定方法は下記各文献に依つた。 蛋白質 Lowry，O.H.，N.J.Rosebrough，A.L.Farr，
and R.J.Randall. J.Biol.Chem.193：265 1951蛋白質成分のアミ
ノ酸組成及び組成比（μM／100μM；6NHClで
110℃、24時間加水分解、日立−835高速アミノ酸
分析器にて分析）： アスパラギン酸（Asp）7.5〜7.9、スレオニン
（Thr）6.8〜7.8、セリン（Ser）5.9〜7.6、グルタ
ミン酸（Glu）8.8〜9.4、プロリン（Pro）5.5〜
6.4、グリシン（Gly）8.7〜9.6、アラニン（Ala）
9.1〜10.8、シスチン／２（Cys／２）1.0〜2.0、バ
リン（Val）6.6〜7.6、メチオニン（Met）2.5〜
3.3、イソロイシン（Ile）3.6〜4.1、ロイシン
（Leu）7.5〜8.7、チロシン（Tyr）5.1〜6.6、フ
エニルアラニン（Phe）3.7〜4.5、リジン（Lys）
3.1〜4.4、ヒスチジン（His）0.9〜1.4、アルギニ
ン（Arg）6.1〜6.6であつた。等電点PH（ポリア
クリルアミドゲル等電点電気泳動法により泳動
し、種々の標準蛋白との泳動パターンと比較測
定）：9.3±0.2 デイスク電気泳動パターン： アクリルアミドゲル（ポリアクリルアミド濃度
7.5％、1NKOH−泳酢酸緩衝液（PH4.3））、試料
30μｇ、通電4mA、２時間／ゲル１本、アミドブ
ラツク10Bによる染色、７％酢酸溶液による脱色
の条件下でのデイスク電気泳動において、距離
（スペーサ・ゲル先端を基準として）2.3±0.2cm
の位置に極めて先鋭な単一のバンドを与える。 生物学的性質： 哺乳動物に対しインシユリン分泌増強作用及び
耐糖能良化作用を有し、これらの作用は１回の投
与で数週間乃至数ケ月にわたつて持続する。急性
毒性（LD₅₀）はddy系マウス（静注）で約
200μg／Kg体重である。 要素物質 １ 前記Ｎ−IAPは、5M尿素の蛋白変性剤の共
存下、カラムクロマトグラフ法等により分別さ
れて２種の要素物質に分離されることが確認さ
れた。 要素物質の有利な単離精製法の１例として、
5M尿素存在下に於けるイオン交換法を提示し
得る。 即わち、Ｎ−IAPを３〜5M、好しくは４〜
5M尿素存在下PH5.4−6.8好しくはPH5.8−6.5の
リン酸緩衝液で12時間−96時間、好しくは24時
間−48時間インキユベイトし、前記リン酸緩衝
液によつて平衡化したCM−セフアロース カ
ラム クロマトグラフにて分離・精製を行な
う。その結果、Ｎ−IAPは分子量の異なる二種
の要素物質（以下、分子量の大きい順に蛋白性
要素物質CP−Ａ及びPs−１とそれぞれ命名す
る）に分離され、これらの要素物質は同一カラ
ムによる再ゲルろ過により、デイスク電気泳動
的に単一な物質として得られる。 このようにして得られた要素物質Ps−１は
単独では、インシユリン分泌増強活性を示さな
い。またPs−１は酸性蛋白質であることが確
認された。 ２ 要素物質Ps−１は単独では殆んど目的とす
るインシユリン分泌増強活性を示さない。すな
わちインシユリン分泌増強不活性であるが、要
素物質Ps−１をもう一つの要素物質CP−Ａと
in vitroで混合するとＮ−IAPを再構成し、更
にPs−１とCP−Ａとを別々に投与、例えばCP
−Ａを3μｇ／rat当り右股関節よりIVで投与
し、８時間経過後Ps−１を左股関節静脈より
投与すると、Ｎ−IAPと同等のインシユリン分
泌増強活性が発現し、しかも前記Ｎ−IAPを投
与したときに発現する抗体産生が著しく減少
し、Ｎ−IAPを再投与すると誘発されるアナフ
イラキシの発生が著しく低減されることが判明
した。 ３ 要素物質の物性： Ps−１ 分子量：SDS−ゲル電気泳動法 28000±1200 等電点：PH5.8 アミノ酸分析 ASp.9.3±1.0，Thr.7.4±0.8，Ser.10.6±1.0，
Glu.10.6±1.0，Pro.4.4±0.5，Gly.11.2±1.0，
Ala.10.6±1.0，Cys／２ 1.3±0.3，Val.6.7±
0.7，Met.1.6±0.3，Ile.3.2±0.4，Leu.5.5±0.6，
Tyr.4.6±0.5，Phe.3.5±0.4，Lys.2.2±0.3，
His.1.7±0.3，Arg.5.9±0.6 組成： Lowry法による蛋白質98重量％以上 CP−Ａ 分子量：SDS−ゲル電気泳動法 75000±5000 塩基性蛋白質 アミノ酸分析： Asp.6.4±0.7，Thr.7.3±0.8，Ser.8.2±0.9，
Glu.9.3±1.0，Pro.6.3±0.7，Gly.11.±1.0，
Ala.9.0±0.9，Cys／２ 1.2±0.3，Val.6.2±0.6，
Met.2.7±0.4，Ile.3.4±0.4，Leu.8.4±0.9，
Tyr.5.6±0.6，Phe.3.6±0.5，Lys.4.7±0.5，
His.1.1±0.3，Arg.4.9±0.5 組成： Lowry法による蛋白質98重量％以上 実施例 Ｎ−IAPの製造及び精製 １ 百日咳相菌前野株IID513 （Bordetella pertussis phase Ｉ，Maeno
StrainIID 513）の凍結乾燥保存菌株（北里大薬
学部微生物学教室捉供）をBordet−Gengou平板
培地で37℃、２日間培養後、下記第１表に組成を
示すイオン交換樹脂加Cohen−Wheelerの変法培
地（CW培地）200mlを分注した500mlの振盪コル
ベンに１白金耳接種し、37℃、20〜22時間振盪培
養した。この培養液の菌量を、分光光度計（波長
650nm）で測定し、加えた時の菌量が最終濃度約
0.1×10⁹個／mlとなるように、イオン交換樹脂加
CW培地１を分注した２の振盪コルベンに加
え、37℃、48時間振盪培養（振盪回数97回／分）
を行つた。 尚、上記菌株の菌学的性質は、先にあげた百日
咳Ｉ相菌に関する文献の記載と一致した。 第 １ 表 Cohen−Wheelerの変法培地組成 カザミノ酸 1.0ｇ 酵母エキス １ｇ リン酸二水素カリウム 0.5ｇ 可溶性濃粉 ２ｇ 0.5％硫酸銅液 １ml １％塩化カルシウム液 １ml ４％塩化マグネシウム液 １ml ポリペプトン ５ｇ １％シスチン液 2.5ml 0.5％硫酸鉄液 １ml 塩化ナトリウム 2.5ｇ （蒸留水を加えた総量1000mlとし、20％NaOH
水溶液でPH7.2に調整後、陰イオン交換樹脂（ダ
イヤイオンSA−20AP；三菱化成(株)製）３ｇを加
え、121℃で15分間、高圧蒸気滅菌して使用に供
した。） 得られた48時間振盪培養液を、56℃で30分間加
温した後、４℃で遠心分離（15000rpm）して培
養上清液と菌体とに分離した。得られた培養清液
をＮ−IAPの精製単離のための出発材料とした。 10の培養上清液を1N塩酸でPH6.0に調整後、
第１精製工程としてハイドロキシアパタイトカラ
ム（2.5×４cm）に流速200ml／時間で流した。 大部分の蛋白質は吸着されずそのままカラムを
通過し、目的とするインシユリン分泌増強活性
（後記活性測定法参照）も殆んど検知されなかつ
た。尚、蛋白質濃度の測定は後記第２表註記の
Lowryの方法による。 その後、吸着された物質についてはまず0.01M
リン酸緩衝液（PH6.0）でカラムを洗い、次いで
リン酸緩衝液のモル濃度を0.1にPHを7.0に夫々上
げて吸着された蛋白質を順次溶出する。しかし目
的のＮ−IAPはまだこの条件では溶出されず；更
に同じ条件のリン酸緩衝液に0.5MのNaClを含む
同組成のリン酸緩衝液で溶出した。この条件で溶
出された蛋白質に一致して目的Ｎ−IAPを効率よ
く回収することができた。 得られた粗Ｎ−IAPを濃縮し、ついで透過分子
量限界8000の透析膜（Thomas社製Cat.No.3787−
F25）に入れた後蒸留水に対して２回（計12時
間）0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）に対して２回
（計12時間）夫々透析した。更に精製を進める為
に、上記透析後のＮ−IAPを含む溶液を0.01Mリ
ン酸緩衝液（PH6.0）で平衡化されたカルボキシ
メチルセフアロースCL−6Bカラム（1.5×10cm）
に通した。このカラムに吸着されない物質には全
く活性は存在しなかつたが、次いでリン酸緩衝液
のモル濃度を0.1にPHを7.0に上げ、更に食塩0.5M
を加えた溶出液で溶出してＮ−IAPを得た。 この部分は、デイスク電気泳動法的には未だわ
ずかな不純物を含むため、このＮ−IAPを含む溶
液を濃縮し、セフアクリルＳ−200によりゲルろ
過法をおこなう。 以上の精製工程によつて精製されたＮ−IAPの
活性の回収率、精製度等は第２表に示す通りであ
る。

【表】 上記最終工程で得られた物質の純度をポリアク
リルアミドゲル（ポリアクリルミド濃度7.5％，
1N KOH−氷酢酸緩衝液（PH4.3））デイスク電
気泳動法によつて検定した。 実験方法は、J.V.Maizel，Jrの方法
（Biochem，Biophys.Res.Comm.1963，13483）
によつた。 尚、ゲル１本当りの試料は30Kg（蛋白質とし
て）、通電は4mAで２時間、染色はアミド・ブラ
ツク10B、脱色は７％酢酸溶液による。 −２ 百日咳Ｉ相菌東浜株IID 510 （Bordetella Pertussis phaseI，Tohama
Strain IID 510）の凍結乾燥保存菌株（北里大学
薬学部微生物学教室提供）を用いて、実施例Ｉ−
１と同様の方法にてＮ−IAPを生成した。 本生成物のデイスク電気泳動（PH4.3ゲル使用）
で単一なバンドを与え、等電点PHは9.3±0.2を示
した。またその組成は、蛋白質約98重量％以上で
あり、かつアミノ酸組成および組成比は、第４表
に示す通りであつた。

【表】

【表】 実施例 要素物質の製造及び精製 精製したインシユリン分泌増強活性物質（Ｎ−
IAP）10mgを5M尿素含有の0.05Mリン酸緩衝液
（PH6.4）で24時間透析した後、同じ緩衝液で平衡
化したCM−セフアロースCL−6Bカラム
（16φ200mm）に装填し、流速：２ml／時及び３
ｇ／フラクシヨンの条件にて0.1Mリン酸、0.5M
塩化ナトリウム及び5M尿素を含む水溶液を用い
食塩密度勾配にて溶出する。この結果を第１図に
示した。インシユリン分泌増強物質はこの操作に
より２種の分子量の異なる要素物質（前記の通り
分子量の大きい順にCP−Ａ及びPs−１と命名）
に分離された。 これ等の構成成分を更に精製度を高めるため
に、まず、Ps−１分画を、集めて濃縮後、セフ
アクリルｓ−200カラム（16φ×1100mm）を用い
て、ゲルろ過をおこなつた。この結果、純粋Ps
−１を1.2mg得た。要素物質Ps−１とCP−Ａの蛋
白質成分のアミノ酸組成及び組成比率（μM／
100μM）は下記の通りである。 Ps−１ Asp.9.3，Thr.7.4，Ser.10.6，Glu.10.6，
Pro.4.4，Gly.11.2，Ala.10.6，Cys.／２ 1.3，
Val.6.7，Met.1.6，1le.3.2，Leu.5.5，Tyr.4.6，
Phe.3.5，Lys.2.2，His.1.7，Arg.5.9 CP−Ａ Asp.6.4，Thr.7.3，Ser.8.2，Glu.9.3，Pro.6.3，
Gly.11.1，Ala.9.0，Cys.／２ 1.2，Val.6.2，
Met.2.7，Ile.3.4，Leu.8.4，Tyr.5.6，Phe.3.6，
Lys.4.7，His.1.1，Arg.4.9 −３ 上記各例で単離精製された要素物質 Ps−１及びCP−Ａは、第２図に示す通り、デ
イスク電気泳動的に単一物質であることが確認さ
れた。 又、インシユリン分泌増強活性因子と要素物質
Ps−１及びCP−ＡとをSDS・デイスク電気泳動
法により比較検討した結果を、第３図に示す。 尚、要素物質Ps−１及びCP−Ａの物性は、前
記“要素物質の物性”の項に詳記した通りであ
る。又、各電気泳動の実験条件は実施例に準ず
る。 実施例 薬理効果 −１ インシユリン分泌増強活性測定法 各活性物質の当該活性は種々のインシユリン分
泌刺激物質に対する動物の反応性で測定出来る
が、通常はグルースを刺激物質として用いる。 Γ 検定用使用動物 ウイスター系雄性ラツト（体重130〜140ｇ） Γ 試験方法 各力価の活性物質を生理食塩液に溶解し、その
0.2mlをエーテル麻酔下で股静脈内に注入し、３
日後にインシユリン分泌増強活性を測定する。な
お実験開始前18〜20時間絶食させる。測定方法
は、ラツト尾静脈より0.1mlの血液を採取後、直
ちに30％グルコース溶液を体重100ｇ当り１ml腹
腔内に投与し、正確に15分後、0.1mlの血液を再
び採取する。インシユリン分泌増強活性は、グル
コース投与前、後の血糖値および血中インシユリ
ン値の差より求める。血糖値はグルコースオキシ
ダーゼ法、インシユリンは二抗体法にて測定す
る。血糖値及びインシユリンの測定方法は夫々下
記文献及びキツトによる。 血糖値：グルコースオキシダーゼ法 Bergmeyer，Ｈ，−U.，and Berner，E.in
“Methods of enzymatic analysis” Bergmeyer，Ｈ，−U.，eds，New York
Academic press P.123（1963） グルコスタツト インシユリン；二抗体法 Morgan，C.R.，and Razarow，A.Diabetes
12115（1963） インシユリンリアキツト−ダイナボツト社製 まず以下の式に従つて活性物質投与群及び対照
群ラツトの△Ｉ／△Ｇ値を求める。 △Ｉ／△Ｇ（μU／mg） ＝グルコース投与後の血中インシユリン値（μU／m
l）−グルコース投与前の／ グ
ルコース投与後の血糖値（mg／ml）−グルコース※ ※血中インシユリン値（μU／ml）／投与前の血糖値
（mg／ml） 尚、血糖値を活性の計算に用いるのは分泌され
るインシユリン量が血糖値によつて大きく影響さ
れるためである。 次に活性物質の力価は、 単位（unit）＝（本物質投与群ラツトの平均△Ｉ／△
Ｇ−対照群の平均△Ｉ／△Ｇ／対照群の平均△Ｉ／△Ｇ
）×100 で求める。 各物質の比活性は力価単位を、重量で除したも
のとする。 −３ インシユリン分泌増強活性 本発明者が単離、精製したインシユリン分泌増
強活性物質は哺乳動物のインシユリン分泌を促進
し、且つ血糖値を正常値に維持調製する作用を示
し、さらに抗体産生を増強し、細胞性免疫を高め
る作用をも示す。本活性因子は極めて微量でこれ
等の作用を示す事から各種糖尿病の治療および予
防薬として、或いは免疫機能の異常による疾患
（例えば、悪性腫瘍、再生不良性貧血、リユウマ
チ関節炎等）に対する医薬として有用である。 本発明者は、この様な有効な活性を示すＮ−
IAPを、その要素物質に分離すると、薬理作用が
不活性となるが、これ等の要素物質をそれぞれ別
途に投与することによつて、その薬理活性を示す
新規な単一物質を得ることに成功した。要素物質
Ps−１及びCP−Ａのインシユリン分泌増強活性
を第６表に示す。 −４ 副作用および毒性 本発明者が単離、精製したインシユリン分泌増
強活性物質は、きわめて微量で、インシユリン分
泌増強活性を示し、各種糖尿病の治療および予防
薬として極めて有用と考えられる。しかしこのイ
ンシユリン分泌増強活性物質には、本来の活性と
は別に、白血球数を増加させる作用、ヒスタミン
に対する感受性を増加させる作用等のいわゆる副
作用を示し、さらに強い抗体産生の発現、すなわ
ち抗原性を示す事が判明した。特に抗原性は、二
回目以後の投与時にアナフイラキーシヨツク等の
重篤な結果をもたらしかねない。インシユリン分
泌増強活性物質は極めて微量で、本来の効果を示
すことから、この副作用が発現する可能性は少な
いものと考えられるが、より安全で有効な医薬品
と言う意味からは、本来の効果を低下させない
で、副作用を除去する事が望ましい事は言うまで
もない。 本発明はインシユリン分泌増強活性物質を要素
物質に分離し、これ等要素物質をそれぞれ別途に
投与することによつて、インシユリン分泌増強活
性はインシユリン分泌増強物質と同程度の活性を
有し、更に抗原性が1/30以下に減弱し、急性毒性
値（LD₅₀値）も減少することが確認された。要
素物質Ps−１及びCP−Ａの抗原性を第６表に示
す。 Γ 抗原性の測定法 ハートレイ系雄性モルモツト（体重 250ｇ）−
群６匹に、試料を連日３回投与し、投与後22日目
に、同じ試料１mgを静脈内に注射し、その後のア
ナフイラキシ−シヨツクによる死亡数を観察し
た。

【表】 要素物質Ps−１及びCP−Ａの静注LD₅₀値を第７
表に示す。

【表】 要素物質Ps−１はもう一つの要素物質CP−Ａ
と組合わせて主に糖尿病治療薬として有用と考え
られる。現在糖尿病に対する薬物療法は、インシ
ユリン注射あるいは血糖降下薬の経口投与のみで
いずれも対症療法にすぎず、殆んど不治の病と言
つてさしつかえない。しかもインシユリン注射の
ために毎日通院しなければならない繁雑さがあ
り、血糖降下薬の投与では血糖値の常位低下の発
現が常に危険視されている。要素物質Ps−１の
特徴は、もう一つの要素物質CP−Ａと組合せる
と、インシユリン分泌活性を有するのみならず血
糖値をいろいろな条件で高めた時（高血糖状態、
特に摂食時に類するグルコース負荷時）にのみ血
中インシユリンを増加させて血糖値をすみやかに
正常に戻す作用を発現する。要素物質Ps−１を
もう一つの要素物質CP−Ａと別々に投与する利
点としては、１回投与で数週間から数ケ月にわた
つて活性が持続することがあり、更に特に、特願
昭52−10397号及び特願昭52−49641号に開示され
ているインシユリン分泌増強活性物質の、抗体産
生の発現により連続投与することができなかつた
次点を解決し、連続投与可能ならしめたことであ
る。更に、要素物質Ps−１はもう一つの要素物
質CP−Ａと組合せることによつて糖尿病、糖尿
病の合併症及び糖尿病が起因となる様々な成人病
の治療薬としてばかりでなく、前糖尿病状態への
適用や、現在全く治療法がなく悲慘な状態にある
若年型糖尿病の予防及び治療薬ならびに診断薬と
して有用である。 以上、詳述の通り、本発明要素物質Ps−１は
もう一つの要素物質CP−Ａと組合せることによ
つて、糖尿病の治療および予防薬、免疫調節剤と
して極めて有用であり、人体に対する有効量は、
活性物質の比活性に応じて固形物として、インシ
ユリン分泌増強活性用途においては約数
10Units／Kg（体重）〜数万Units／Kg（重量）
の範囲であり、免疫増強活性用途については約数
10Units／Kg（体重）〜数万Units／Kg（体重）
の範囲である。 患者に対する投与方法は、各活性用途とも静脈
内投与が最も有効であり、その他腹腔内、筋肉内
および皮下投与、あるいは消化管内への直接投
与、経口投与、直腸内投与および舌下、皮内、鼻
粘膜、動脈、リンパ乃至気管投与も有効である。 投与形態としては、各活性用途とも注射液、坐
剤、腸溶・胃溶剤、舌下錠および吸入剤等を例示
し得る。注射液の最も単純な組成を例示すれば、
インシユリン分泌増強活性10000Units，NaCl9mg
および滅菌蒸溜水で１mlとしたものをあげ得る。 又、薬剤に調合する際に、活性を劣化せしめる
ことのない任意の他成分を混合し得ることも当業
者にとり自明であろう。

【図面の簡単な説明】

第１乃至第３図は、本発明実験説明図であり、
第１図は、CM−セフアロースCL−6Bカラムク
ロマトグラフイーである。第２図は、Disc−電
気泳動図である。第３図は要素物質のSDS−
Disc電気泳動図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ SDS−ゲル電気泳動法による分子量が28000
   ±1200；Lowry法による蛋白質98重量％以上で
   あり、且つ蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比
   （μM／100μM）は、 Asp.9.3±1.0，Thr.7.4±0.8，Ser.10.6±1.0，
   Glu.10.6±1.0，Pro.4.4±0.5，Gly.11.2±1.0，
   Ala.10.6±1.0，Cys／２ 1.3±0.3，Va1.6.7±
   0.7，Met.1.6±0.3，Ile.3.2±0.4，Leu.5.5±0.6，
   Tyr.4.6±0.5，Phe.3.5±0.4，Lys.2.2±0.3，
   His.1.7±0.3及びArg.5.9±0.6であり； 且つ等電点PH5.8でありCP−Ａとの組合せによ
   りインシユリン分泌増強活性の発現に係わること
   を特徴とする蛋白性要素物質Ps−１。 ２ ボルデテラ属に属する微生物を精製して得ら
   れたインシユリン分泌増強活性物質を3M〜5M尿
   素含有リン酸緩衝液（PH5.4−6.8）で12−96時間
   インキユベイトし、次いで、リン酸緩衝液（PH
   5.4−6.8）によつて平衡化したCM−セフアロー
   スCL−6Bカラムにて分離・精製をおこなうこと
   を特徴とする蛋白性要素物質Ps−１の製造方法。