JPH02218698A - 蛋白質性要素物質及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インシュリン分泌増強活性因子の構成成分で
ある新規な蛋白性要素物質に係るものである。更に詳し
くは、ボルデテラ属に属する微生物の国体及び培養上清
中にインシュリン分泌を促進し且つ、血糖値を正常に相
持調整する藁即効宋を有する成分、すなわらボルデテラ
属産生インシュリン分泌増強活性物質（以ド、Ｎ−ＩＡ
Ｐと略称す。〉のｆ＋ｉ’１作用を軽減しＩｃｆｒ規な
蛋白性要素物質に係るものである。

糖尿病薬であるＮ−Ｉ　Ａ　Ｐは、その特徴的なインシ
ュリン分泌の促進及び血糖値を正常に維持調整する薬理
作用と併往て、高分子蛋白質であるが故に、Ｎ−ＩＡＰ
を投与した時に発現する抗体産生により、Ｎ−ＩＡＰを
再び投与すると、アナフィラキシを誘発するという問題
点を有している。

すなわち、糖尿病の治療及び予防に有効であるインシュ
リン分泌増強活性以外の副作用の除去、特にアナフィラ
キシが抑制されたより安全な医薬品の提供が望まれてい
る。

本発明者等は鋭意研究の結果、Ｎ−ＩＡＰを、高濃度の
尿素水溶液を用いて解離をおこなうことにより新規な蛋
白性要素物質を１１１１・同定することに成功した。こ
の単離・同定された新規な蛋白性要素物質はそれぞれ単
独では、インシュリン分泌増強作用は不活性であるが、
この蛋白性要素物質をそれぞれ別途に投与すると、驚く
べきことにＩＡＰを投与したときと同等のインシュリン
分泌促進作用及び血糖値を正常に維持調整する作用を有
し、更に、Ｎ−ＩＡＰの投与したときに発現する抗体産
生ににす、Ｎ−ＩＡＰを再投与するとアナフィラキシを
誘発する欠点が１しく軽減することが判明した。すなわ
ち、単独では、糖尿病の治療及び予防に有効であるイン
シュリン分泌増強作用は不粘性であるが、それぞれを別
途に投与することによりインシュリン分泌増強活ゼ１を
有し、しかも０１作用を大幅に減弱した新規な蛋白性要
素物質の分離・同定を達成したものである。

以下本発明の構成について説明する。

インシュリン 本発明に於ける出発物質であるインシュリン分泌増強活
性物質（以■、”Ｎ−ＩＡＰ”と略称する）は、病源竹
菌として公知のボルデテラ属に属する微生物（百日咳菌
、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌）、特に好ましくは百
日咳■相開（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｒ
ｓ　ｐｈａｓｅ　Ｉ　）を固形培地や液体培地にて培養
し、その菌体もしくは培地から採取、精製して得られる
蛋白性物質である。

菌体ならびに培養物からのＮ−ＩＡＰの有利な採取およ
び精製は、溶解度法、クロマトグラフィー法、分子篩法
、電気泳動法および生物学的方法の一つ又は、これ等の
方法の組合せなど、当該分野で汎用の多くの分別精製方
法により達成され得、従って本発明は特定の採取精製法
に何等限定されるものではない。

Ｎ−ＩＡＰの極めて有利な採取精製方法の１例として、
カラムクロマトグラフィー的手段を提示し得る。この場
合、微生物の培養上清液は、ハイドロキシアパタイト（
生化学工業■製）、カルボキシメチルセファロース０Ｌ
−６Ｂ　（ファルマシア・ファイン・クミカルズ礼製）
の充填材より成るカラムを通し次いで、セファクリル３
．−２００（゛ノアルマシア・ファインケミカルズ礼製
）を用いるゲルろ過払により精製されるＮ−１ΔＰはこ
れらのカラムに極めて選択的に吸着され、次いＦ　０．
５Ｍ　　ＮａＣｊ！含有の０．１ＭリンＭ緩衝液（ｐＨ
７、ｏＢｇの適切に選定された溶出液に溶離されて精製
物を与える。この精製物に透析操作を適宜施こずことに
より、不要な塩類が除去されて５活性のＮ−１ΔＰｔｆ
ｉ得られる。又、Ｎ−１ΔＰは菌体内にも存在するので
、所望の場合には、例えば菌体浮遊液にＮａＣ１を添加
して菌体内Ｎ−ｒ△１〕を溶液中に浸出せしめる手段な
どを採用してもよい。

Ｎ−１ΔＰを産生ずるボルアア”う属の微生物は、前記
の通り百日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症菌どし
て周知であるが、他方、これらの病源菌を、培地組成の
変更、紫外線、Ｘ線等の各種放射線照射又は変異誘起剤
の適用等の慣用の各種手段で変異せしめて得られる変異
株ら又、Ｎ−ＩＡＰ産生菌として有用である。

培養方法としては、液体振盪培養方法が活性及び収率の
点で好ましいが、他の方法によることも妨げない。

なお、ボルデテラ属に属する微生物の菌学的性質、培養
条件等はＢｅｒｇｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｒＤｅｔｃ
ｖｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｉｘｙ第８版
１９７４年Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　：　Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｌｋｎｓ　ＣＯ，。

、１−　Ｅｘｐ　−Ｈｅｄ、　１２９：　５２３〜５５
０（１９６９）　、細菌学実習提要：第３版第６頁以下
、昭和４７年（丸首■発行）、等に記載されている。

次に、Ｎ−１ＡＰの各種物性に付き詳述する。

存在状態及び溶解特性： 脱塩後、凍結乾燥して得られる粉末は、非潮解性白色ま
たは淡褐色粉末であり、約３〜５　＃ｌ！Ｆ　／　ａｔ
まぐは穿温で水に溶解、６ＮＨＣＪ！中では不溶性自沈
を生じ、ピリジン、ドデシル硫酸ナトリウム、メルノＪ
ブトエタノール、シスアイン溶液に溶解する。冷時（４
℃）、精製活性物質の溶液に硫安、ドライアイス・アセ
トンあるいはエタノール、トリクロル酢酸、塩化亜鉛溶
液及びその他の数種の金属イオンを含む溶液等の添加に
より、各々白濁、沈澱を生ずる。水とり［１０ホルムあ
るいはｎ−ブタノール混合液ぐは不溶性となり両液の界
面に集まる。

Ｎ−１ΔＰの水溶液を８０℃以にに加温すると白濁１Ｊ
る。０．５ＭＮａｅｊ！含有０．１Ｍリン酸Ｖｉ　’ａ
ｊ液（ｐｌ−１７，０）に対し木Ｎ−ＩＡＰを溶解し、
次いで蒸留水を外液として透析すると、−時白濁するが
透析の続行により完全に再溶液し、白濁は消失する。

また、高濃度溶液゛Ｃは０．０１Ｍ酢酸緩衝液（１）Ｈ
４，５）に対し、徹底的に透析すると淡褐色に着色して
溶解することもある。

分子量： １０・〜３０％の密度匂配のアクリルアミドゲル３７：
１の架橋比で、濃縮ゲルのｐ　ｔ−１が６，８、泳Ｓｈ
ゲルのｐＨが８．８、泳！１１電ＩＥＥ：９０Ｖテ１６
時間泳動ザる甲板法５ＤＳ−ポリアクリルアミドーアイ
スク電気泳動法（ラムクー法）で処理した後、　２０％
ＴＣＡでＩＭｌ？ｉＪ処理し、次いでクマージープルー
ご染色する。尚蛋白質のＳＤＳ化を１％ＳＯ８で１００
℃５分間処理する。５ＯＳ−ゲル電気泳動法によるＮ−
、ＩＡＩ）の分子ｆｆｉ　Ｇ；１１０５７００＋　５（
１００ｒ　７５５　ル。

組　　成　： Ｌｏｗｒｙ法による蛋白質９８重量％以上ある。尚、各
成分の測定方法は下記各文献に依った。

１−追−１ ＬＯＷｒＶ、Ｏ，１１，、Ｎ、Ｊ、ＲＯ３ＯｂｒＯｕ（
Ｊｈ、Ａ、Ｌ、Ｆａｒｒ　ａｎｄ　Ｒ１゜Ｒａｎｄａ　
ｉ　ｌ　。

Ｊ、Ｂ１０１．Ｃｈｅｌｌ、　１９３：　２６５１９５
１蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（μＭ　／　１
００μＭ：６ＮＨ（Ｊで１１０℃、２４時間加水分解、
日立−８３５高速アミノ酸分析器にて分析）： アスパラギン酸（Δ５Ｄ）７．５〜７．９、スレオニン
（Ｔ　ｈ　ｒ　）６．８−７．８　、　ＩｚリジンＳｅ
ｒ）５．９〜７．６、グルタミン酸（ＧＩＬＪ）８．８
・−９，４、プロリン（Ｐ　ｒ　Ｏ）５．５〜６．４　
、グリシン（Ｇｌｙ）８．７〜９．６．７ラニン（△ｌ
　ａ　）９．１−１０．８、シスチン／２　（Ｃｙｓ／
２）１．０〜２．ｏ　、バリン（Ｖａｔ１６６〜７６、
メチＡ″ニン（Ｍ　ｅ　ｔ　１２．５−３．３、イソロ
イシン（Ｉ　ｌ　ｅ　）３．Ｇ　〜４．１　、ｃ＋イシ
ン（ｔ−ｅ　ＬＪ　）７．５−８．７　、チロシン（Ｔ
　ｙ　ｒ　）５．１〜６．６、フｘニルアラ＝　ン（Ｐ
　ｈ　ｅ　）３．７〜４．５　、リジン（Ｌ　Ｖ　Ｓ　
）３．１〜４．４　、ｔニスプシン（Ｈｉ　ｓ　）０．
９〜１．４、アルギニン（△ｒＱ）６．１〜６．６であ
った。

等電点ｐｌ−１（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳
動法により泳動し、種々の標準蛋白との泳動パターンと
比較測定）　：　　９．３±０．２ディスク電気泳動パ
ターン： アクリルアミドゲル（ポリアクリルアミドｍ度７．５％
、ＩＮＫＯＨ−氷醋酸緩衝液（ｐＨ４，３）　）、試料
３０埒、通電４ｍＡ、２時間／ゲル１本、アミドブラッ
ク１０Ｂによる染色、７％酢酸溶液による脱色の条件下
でのディスク電気泳動において、距ｌｉｌ！（スベーナ
・ゲル先端を基準として）２．３±０、．２ｃｍの位置
にルめで先１２な単一のバンドを与える。

生物学的性質： 咄乳動物に対しインシュリン分泌増強作用及び耐糖能良
化作用を有し、これらの作用は１回の投与で数週間乃至
数ケ月にわって持続する。急’ｆｉ毒性（ＬＤ５Ｑ）は
ｄｄｙ系マウス（静注）で約２００Ｍ／に９体重である
。

ｌ−」Ｌ−ＪＬ−旦 １、前記Ｎ　−Ｉ　Ａ　Ｐは、５Ｍ尿素の蛋白変性剤の
共存下、カラムクロマドグラフ法等により分別されて２
種の１５素物質に分離されることが確認された。

要素物質の右利な１１１！精製法の１例として、５Ｍ尿
素存在下に於けるイオン交換法を程、示し得る。

即わち、Ｎ−１ΔＰを３〜５Ｍ、好しくは４〜５Ｍ尿素
存在下ｐ）（５，４−６，８好しくはｐＨ５，８６，５
のリン酸Ｉ！笥液で１２時間−９６時間、好しくは２４
時門−４８時聞インキュベイトし、前記リン酸ｍｍ液に
よって平衡化したＣ　Ｍ−ｔファロースカラム　り１］
７１−グラフにて分離・精製を行なう。

その結果、Ｎ−ＴＡＰは分子量の異なる二秒の要素物質
（以下、分子Ｓの大きい順に蛋白性要素物質ＣＰ−Ａ及
びＰＳ−１とそれぞれ命名する）に分離され、これらの
要素物質は同一カラムによる＋ＩＴグルろ過により、ア
イスフ電気泳動的に単一な物質として得られる。

このようにして得られた要素物質Ｐｓ−１は単独では、
インシュリン分泌増強活性を示さない。

またｌ）　Ｓ　−１は酸性蛋白質（゛あることが確認さ
れた。

２、要素物質Ｐｓ−１は単独では殆んど目的とり”るイ
ンシュリン分泌増強活性を示さない、すなわちインタ」
リン分泌増強不活性であるが、要素物質１’）　Ｓ　−
ｉをもう一つの１！素物質ＣＰ−八とｎ　ＶｌｔｒＯで
北合するとＮ−Ｉ　Ａ　Ｐを再構成し、更にＩ）　Ｓ　
−１とＣＰ−Ａとを別々に投与、例えばＣＰ−△を３　
ｎ　／　ｒａｔ当り布設ｌｌ１ＩＩｌよりＩＶで投与し
、８時間経過後ＰＳ−１を左股関節静脈より投与すると
、Ｎ−ＩＡＰと同等のインシュリン分泌増強活性が発現
し、しかも前記Ｎ−１ＡＩ）を投与したときに発現する
抗体産生が著しく減少し、Ｎ−ＩＡＰを再投５ケると誘
発されるアナフィラキシの発生が著しく低減されること
が判明した。

３、要素物質の物性： 頭」じニュ 分子ｆｆｉ：５ＤＳ−ゲル１哲気詠動法２８０００±１
２００ 等電点：　　ｐＨ５，ａ アミノ酸分析 △ｓｐ、　　９．３±１．０　、Ｔｈｒ、　　７．４±
０．８　、　Ｓｅｐ、　ＴＯ，６±１．０゜Ｇ　Ｉ　Ｌ
Ｊ、　１０．６：）１．０　、　Ｐｒ０．　４．４（０
，！ｉ　、　Ｇ　Ｉ　ｙ、　１１．２：！：１．０　。

△ｌ　ａ、　１０．６±１．０　、　Ｃｙｓ／２１．３
±０．３　、　Ｖａ　１．６．７±Ｏ１γ。

Ｍｅｔ、　　１．６ｔ０．３　、　　Ｉ　ｌ　ｅ、　　
３．２−！：０．４　、　Ｌｅｕ、　　５．５±０，６
ｉ’ｙｒ、４．６±０．５．Ｐｈｅ、３．５±０．４　
、ｌｙｓ、２．２±０．３゜１−１ｉｓ、　　１７±０
，３．Δｒ（Ｊ、　　５．９±０．６組成： ｔｏｗｒｙ法による蛋白質９８千吊％以上ニーＸ−り二
Ａ 分子量：　５ＯＳ−ゲル電気泳動法 ７５０００±５０００ 塩基性蛋白質 アミノ酸分析： △ｓ　ｐ、　　　６．４　二１０．７　　、　　Ｔｈｒ
、　　　７．３±０．８　　、　３ｅｒ、　　　８．２
　±０．９　。

Ｇｌｕ、　９．３±１．０　、　Ｐｒｏ、　６．３±０
．７　、　Ｇ　Ｉ　Ｖ、　１１．１±１．０゜ΔＩａ、
９．０±０．９　、　Ｃｙｓ／２１．２±０．３　、　
Ｖａ　＋、　６．２±０５６゜Ｍｅｔ、２．７±０．４
．　Ｉｌｅ、　３．４±０．４．　ｌｅｕ、　８．４±
０．９゜７ｙｒ、　５．６±０．６　、　ｐｈｅ、　３
．６±０．５　、１−ｙｓ、４．７±０，５゜ト（ｉｓ
、　　　１．１±０．３　　、　　Ａｒｏ、　　　４．
９±０．５組成： ｔｏｗｒｙ法による蛋白質９８重１１％以上笈１拠」 Ｎ−ＩＡＰのｌｉｔ造及び精製 １、　百日咳Ｉ相開前野株ｌＩＤ５１３（Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｐｈａｓｅ　■、Ｈａ
ｅｎｏ　５ｔｒａｉｎ１１Ｄ５１３）の凍結乾燥保存菌
株（北里大学桑学ＮＳ　微生物学教室提供）をＢｏｒｄ
ｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ　ｌ根培地で３７℃、２日間培養後
、下記第１表に組成を示すイオン交換樹脂加Ｃｏｈｅｎ
−Ｗｈｅｅｌｅｒの変法培地（ＣＷ培地’）　　２００
ｒｒｔｌを分注した５００ｍ１！　（１）　ｍ　ｔＭ　
コルベンに１白金且接種し、３７℃、２０−２２時間振
盪培養した。この培養液の菌那を、分光光度計（波長６
！１０ｎｌｌｌ）Ｃ’測測定、加えた時の菌徂が最終哨
度約０、　ＩＸ　１０９個／＃１１２となるように、イ
オン交換樹脂加ＣＷ培地１Ｒを分注した２１の振盪コル
ベンに加え、３７℃、４８時間ｉ虐培養（振鏝回数９７
回／分）を行った。

尚、上記菌株の菌学的性質は、先にあげた百［」咳Ｉ相
開に関する文献の記載と一致した。

ｌ−」−一五 カザミノ酸 酵母エキス リン酸二水素カリウム 可溶性製粉 ０．５％硫酸銅液 １％塩化カルシウム液 ４％塩化マグネシウム液 ポリペプトン １％シスヂン液 ０．５％硫酸鉄液 塩化ナトリウム （蒸留水を加えた総量１０００１ｄとし、１．０９ １ｇ ０１５ｇ １ｇ １　　戒 ａｅ 　　ｄ １ｇ ２．５− １ａｉ！ ２．５ｇ ２０％Ｎ　ａ　Ｏ＋−１ 水溶液でｐｌ４７．２に調整後、 （ダイヤイオン５Ａ−２０ＡＰ りを加え、１２１℃で１５分間、 陰イオン交換樹脂 二二菱化成■製）３ ＾圧蒸気滅菌して使 用に供した。） １ｑられた４８時間撮揺培養液を、５６℃で３０分間；
Ｊ１１温した摂、４℃で遠心分離（１５，ＯＯＯｒｐｍ
）シて培養上清液と菌体とに分離した。得られた培養清
液をＮ−Ｉ　Ａ　Ｉ）の精製単離のための出発材料とし
た。。

１０ｆｉの培養上清液を１Ｎ塩酸でｐＨ６，０に調整後
、第１粘装丁程としてハイドに１ヤシアバタイ１−カラ
ム（２，５Ｘ　４　ｃｍ　＞に流速２００ｄ／＋１１５
闇で流した。

大部分の蛋白質は成性されずそのままカラムを通過し、
ｌ］的とりるインシュリン分泌増強活ヤＦ（後記活性測
定法参照）も殆ｌυど検知されなかった。尚、蛋白質濃
度の測定は侵記第２表註記の１０Ｗｒｙの方法による。

その後、吸着された物質についてはまず０．ＯＩＭリン
Ｆｉ！２緩衝液（ｐＨ６，０）でカラムを洗い、次いで
リン酸緩衝液のモルｆ１度を０．１にｐｌ−１を７．０
に人々上げて成性された蛋白質を順次溶出づる。しかし
目的の１１−ＩＡＰはまだこの条件では溶出されず：更
に同じ条件のリン酸緩衝液に０．５ＭのＮａ（Ｊを含む
同組成のリン酸緩衝液で溶出した。この条件で溶出され
た蛋白質に一致して目的Ｎ−ＩＡＰを効率よく回収する
ことができた。

得られた粗Ｎ・−ＩＡＰを濃縮し、ついで透過分子間限
界ａ、　ｏｏｏの透析膜（ｒｈｏｍａｓ社製Ｃａｔ、Ｎ
ａ　３７８７−Ｆ２５＞に入れた後蒸留水に対して２回
（計１２時間）　０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐｔ−＋６
．０）に対して２回（ｉｍｌ−１２時間）夫々透析した
。更に精製を進める為に、上記透析後のＩ’ｍ−ＩＡＩ
）を含む溶液を０．ＯＩＭリンＩ！ｌ！２１１笥液（１
）ｌ−１６，０）で平衡化されたカルポキシメチールセ
フ７０−スＣＬ　、−６Ｂカラム（１，５Ｘ　１０ｃｍ
　）に通した。このカラムに吸着されない物質には全く
活性は存在しなかったが、次いでリン酸緩衝液のモル濃
度を０，１にＩ）Ｈを７，０に上げ、更にｆｉ塩０．５
Ｍを加えた溶出液で溶出してＮ−ＩＡＰを４Ｑた。

この部分は、ディスク電気泳動法的には未だわずかな不
純物を含むため、このＮ−ＩＡＰを含む溶液を濃縮し、
セファクリルＳ　−２００によりゲルろ過払をおこなう
。

以上の精製工程によって精製されたＮ−ＩＡＰの活性の
回収率、精製度等は第２表に示す通りである。

第２表 （注）蛋白質！！度はＬｏｗｒｙの方法（Ｌｏｒｒｙ、
　０．　ｌｔ、　、　ＮＪ、　　Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇ
ｈ、Ａ。Ｌ、Ｆａｒｒ、ａｎｄ　　Ｒ，Ｊ、Ｒａｎｄａ
ｌｔ（１９５１）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｉ＋、１９３２
６５）に従って測定し、対照に牛血清フルＩミンを用い
た。

上記最終工程で得られた物質の純度をポリアクリルアミ
ドゲル（ポリアクリルアミドｍ度　７．５％。

１ＮにＯｌ−氷酢酸緩衝液（ｐｉ−１４，３）　）ディ
スク電気泳朔払によって検定した。

実験方法は、Ｊ、Ｖ、ＨａｉＺｅｌ、Ｊｒの方法（Ｂｉ
ｏｃｈｃ＋ｎＢｉｏｐｈｙｓ、Ｒｃｓ、Ｃｏｍｍ、　１
９６３．１３４８３＞によった。

尚、ゲル１本当りの試料は３０／１１　（蛋白質として
）、通電は４ｍＡで２時間、染色はアミド・ブラック１
０Ｂ１脱色は７％酢酸溶液による。

−２，百日咳Ｉ相開束浜株１１０５１０（Ｂｏｒｄｅｔ
ｅｌｌａ　　Ｐｃｒｔｕｓｓｉｓ　　ｐｈａｓｅｌ、　
　丁ｏｈａｍａ　　５ｔｒａｉｎ１１０５１０）の凍結
乾燥保存菌株（北１人学薬学部微生物学教室提供）を用
いて、実施例１−１と同様の方法にてＮ−ＩＡＰを生成
した。

本生成物のディスク電気泳動（＋））−１４，３ゲル使
用）で単一なバンドを与え、苦゛電点ｐＨは９３±０．
２を示した。またその組成は、蛋白質的９８重ｊ％以上
であり、かつアミノ酸組成および組成比は、第４表に示
ず通りであった。

東−三り一五 アミノ酸組成ｆ８Ｎ−塩酸１１０℃１６時闇加水分解）
μＭ／１００μＭ 実施例「　要素物質の製造及び精製 精製したインシュリン分泌増強活性物質（Ｎ−ＩＡＰ）
１０りを５Ｍ尿素含有の０．０５ＭリンＭ緩衝液（ｐｌ
−１６，４）で２４時間透析した後、同じ＊ｉ液で平衡
化したＣＭ−セファ［１−スＣＬ−６Ｂカラム（１６φ
２００ａｅ＋）に装填し、流速：２ｄ／時及び３ｇ／フ
ラクシフンの条件にて０，１Ｍリン酸、０．５Ｍ塩化ナ
トリークム及び５Ｍ尿素を含む水溶液を用い食塩密度勾
配にて溶出する。この結果を第１図に示した。インシュ
リン分泌増強物質はこの操作により２種の分子前１の異
なる要素物質（＠記の通り分子ｍの大きい順にＣＰ−Ａ
及びＰ　ｓ−１と命名）に分離された。

これ等の構成成分を更に精製度を高めるために、まず、
Ｐ　ｓ　−１分画を、集めて濃縮後、セファクリルＳ−
２００カラム（１６φＸ１１００ｍ＋）を用いて、ゲル
ろ過をおこなった。この結果、純粋なｐｓ−１を１．２
〜得た。要素物質ｐｓ−１とＣＰ−Ａの缶内質成分のア
ミノ酸組成及び組成比率（μＭ　／１１００Ｌｔ　）は
１・記の通りである。

Ａｓ　ｐ、　９．３　、　Ｔｈ　ｒ、　？、４　、　Ｓ
ｅ　ｒ、１０．６゜ＧＲｕ、　１０．６．　Ｐｒｏ、　
４．４　、　Ｇｆｔ　ｙ、　１１．２゜ＡＪ！ａ、　１
０．６．　Ｃｙｓ、　／２　１．３　、　Ｖａ１６．７
　。

Ｍａｔ、１．６．１１ｅ、３．２　、Ｌｃｕ、５．５　
。

Ｔｙｒ、４．６　、Ｐｈｅ、３．５　、Ｌ　ｙｓ、’２
．２　。

ト１　　　ｉ　　　ｓ、　　　１．７　　　、　　　Ａ
ｒｇ　　、　　５．９ＣＰ−八 Ａｓｐ、６．４　、Ｔｈｒ、７．３　、Ｓｅｒ、８．２
　。

Ｇｆｔ　ｕ、　９．３　、　Ｐｒｏ、　６．３　、　Ｇ
ｌ　ｙ、　１１．１゜Ａｊ！ａ、　９．０　、　Ｃｙｓ
、　／２　１．２．　Ｖａｊ！、　６．２　。

Ｍｅｔ、２．７　、　　Ｉ　ｌｉｅ、　３．４　、　Ｌ
ｅｕ、　８．４　。

Ｔｙｒ、５．６　、Ｐｈｅ、３．６　、Ｌｙｓ、４．７
　。

Ｈｉ　　　！３．　　１．１　　　、　　　Ａｒｑ　　
、　　４．９−３．上記各例でｔｉｔ　＊＋精製された
要素物質Ｐｓ−１及びＣＰ−へは、第２図に示す通り、
ディスク電気泳動的に単一物質であることが確認された
。

又、インシュリン分泌堆強活性囚子と要素物質Ｐ　ｓ−
１及びＣＰ−Ａとを５ＤＳ−：Ｆイスク電気泳動法によ
り比較機関した結果を、第３図に示す。

尚、要素物質Ｐ　ｓ−１及びＣＰ−への物性１よ、前記
゛″Ｔ１５索物質の物性゛′の項に詳記した通りである
。又、各電気泳動の実験条件は実施例工に型する。

支ＬＬＩＩ　　薬理効果 −１，インシュリン分泌増強活性測定法名粘性物質の当
該活性は種々のインシュリン分泌刺激物質に対する動物
の反応性で測定出来るが、通常はグル」−スを刺激物質
として用いる。

０検定用使用動物 ウィスター系雄性ラット（体重１３０〜１４０ｇ）Ｏ試
験方法 各力価の活性物質を生理食塩液に溶解し、その０．２ｄ
をエーテル麻酔ドで股静脈内に注入し、３日侵にインシ
ュリン分泌増強活性を測定する。なお実験開始前１８〜
２０時間絶食させる。測定方法は、ラット尾静脈より０
．１−の血液を採取後、直ちに３０％グルコース溶液を
体１１００１Ｊ当りｌａｉ！腹腔内に投与し、正確に１
５分後、０．１７１１！！の血液を再び採取する。イン
シュリン分泌増強活性は、グルコース投与前、後の血糖
値および血中インシュリン値の差より求める。血糖値は
グル」−スオキシダーゼ法、インシュリンは二抗体法に
て測定する。血糖値及びインシュリンの測定方法は夫々
下記文献及びキットによる。

血糖値ニゲルコースオキシダーゼ法 ８ｅｒｇｍｃｙｅｒ、ＩＩ、−Ｉｌ、、ａｎｄ　　Ｂｃ
ｒｒ＋ａｒ、Ｉ：、　　ｉｎ“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｒ　
ｃｎｚｙａ＋ａｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　”Ｂｅｒｇ
ｍｅｙｅｒ、Ｈ，−Ｕ、、　　ｅｄｓ、　　Ｈｅｍ　Ｙ
ｏｒｋ　　Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ　　Ｐ、１２３
　　（１９６３）グルコスタット インシュリン：二抗体法 Ｍｏｒｇａｎ、　Ｃ，ｌｔ、、　ａｎｄ　Ｉｌａｚａｒ
ｏｗ、＾、ＤｉａｂＱｔｃＳ　　１２インシ」リンリア
キット−ダイナポット社製まず以下の式に従っ又活性物
質投与群及び対照群ラットのΔＩ／ΔＣ値を求める。

Δ■／ΔＧ（μＩＪ／Ｒ９＞ グルコース投与後の血［１］インシユリンＷ１（μＵ／
瀬）グルコース投与前の血中インシュリン値（μＵ／ｄ
）グルコース投与前の血糖値（Ｒ９／　ｎｌ！　）尚、
血糖値を活性の計算に用いるのは分泌さ゛れるインシュ
リンｍが血糖値によって大きく影響されるためである。

次に活性物質の力価は、 で求める。

各物質の比活性は力価単位を、重量で除したものとする
。

−３，インシュリン分泌増強活性 本発明者が単離、精製したインシュリン分泌増強活性物
質は哺乳動物のインシュリン分泌を促進し、且つ血糖値
を正常値に維持調整する作用を示し、さらに抗体産生を
増強し、ＩＩ胞付性免疫高める作用をも示す。本活性因
子は也めて微量でこれ等の作用を承り事から各種糖尿病
の治療おにび予防薬として、或いは免疫機能の異常によ
る疾患（例えば、悪性腫瘍、再生不良性貧血、リュウ７
チ関節炎等）に対する医薬として有用である。

本発明者は、この様な有効な活性を示すＮＩＡＰを、ぞ
の要糸物質に分離すると、薬理作用が不ｈ！ｉ性となる
が、これ等の要素物質をそれぞれ別途に投与することに
よって、その薬理活性を承り新規な単一物質を得ること
に成功した。要素物質ＰＳ−１及びＣＰ−Ａのインシュ
リン分泌増強活性を第６表に示す。

−４，副作用および重性 本発明者が単離、精製したインシュリン分泌１１つ強活
性ｖＩＪ質は、きわめて微量で、インシュリン分泌増強
粘性を示し、各種糖尿病の治療および予防薬として極め
て有用と考えられる。しかしこのインシュリン分泌増強
活性物質には、本来の活性とは別に、白血球数を増加さ
せる作用、ヒスタミンに対する感受性を増加させる作用
等のいわゆる副作用を示し、さらに強い抗体産生の発現
、すなわち抗原性を示す事が判明した。特に抗原性は、
二回目以炭の投与時にアナフィラキシ−ショック笠の重
篤な結果をもたらしかねない。インシュリン分泌増強活
性物質は極めて徴用で、本来の効果を示すことから、こ
の副作用が発現する可能性は少ないものと考えられるが
、より安全で有効な医薬品と言う意味からは、本来の効
果を低下させないで、副作用を除去する事が望ましい事
は言うまでもない。

本発明者はインシュリン分泌増強活性物質を要素物質に
分離し、これ等要素物質をそれぞれ別途に投与すること
によって、インシュリン分泌増強活性はインシュリン分
泌増強物質と同程度の活性を有し、更に抗原性が１７３
０以下に減弱し、急性毒性値（１−Ｄ５（１値）も減少
することが確認された。

要素物質Ｐ　ｓ−１及びＣＰ−Ａの抗原性を第６表に示
す。

Ｏ抗原性の測定法 ハートレイ系に！！性モルモット（体重２５０ｇ　）　
−８Ｔ６匹に、試料を連日３回投与し、投与後２２日目
釘、同じ試料１１Ｉｐｇを静脈内に注射し、その後のア
ナフィラギシーショックによる死亡数を観察した。

第　　　６　　　表 （注） Ｎ−ＩＡＰ：インシュリン分泌増強活性物質［ＡＰ　　
　：インシュリン分泌増強活性ＡＳＡ　　　：抗原性 要素物質Ｐｓ〜１及びＣＰ−への静注ＬＤ５ｏ値を第７
表に示す。

要素物質ＰＳ−１はもう一つの要素物質ｃ　ｐ　−Ａと
組合わせて主に糖尿病治療薬として有用と考えられる。

現在糖尿病に対する薬物療法は、インシュリン注射ある
いは血糖降下薬の経口投与のみでいずれも対症療法にす
ぎず、殆んど不治の病と苦ってさしつかえない。しかも
インシュリン注射のために旬日通院しなければならない
繁雑さがあり、血糖降下薬の投ちでは血糖値の異常低下
の発現が常に危険視されている。要素物質ｐ　ｓ　−ｉ
の特徴は、もう一つの要素物質ＣＰ−Ａと組合けると、
インシ」リン分泌活性を有づるのみならず白糖値をいろ
いろな条件で高めＩ、：時（高血糖状態、特に摂食時に
類りるグル」−ス負傭時）にのみ血中インシュリンを増
加さけて血糖値をすみやかに正常に戻す作用を発現する
。要素物質ｐｓ−１をもう一つの要素物質ＣＰ−Δと別
々に投与する和自としては、１回投与で数週間から数ケ
月にわたって活性が持続することがあり、更に特に、特
願昭５２−１０３９γ号及び特願昭５２−４９６４１号
に開示されているインシュリン分泌増強活性物質の、抗
体産生の発現により連続投与することができなかった欠
点を解決し、連続投与可能ならしめたことである。

更に、要素物質ＰＳ−１はもう−っの要素物質ＣＰ−Ａ
と組合せることによって糖尿病、糖尿病の合併症及び糖
尿病が起因となる様々な成人病の治療部としてばかりで
なく、前糖尿病状態への適用や、現在全く治療法がなく
悲惨な状態にある若年型糖尿病の予防及び治療部ならび
に診断薬として有用である。

以上、詳述の通り、本発明要素物質Ｐｓ−１はもう一つ
のｇ５素物質ＣＰ−Ａと組合せることによって、糖尿病
の治療および予防薬、免疫調節剤として穫めて有用であ
り、人体に対する有効用は、活性物質の比活性に応じて
固形物として、インシュリン分泌増強活性用途において
は約数１ｏ　ＩＪｎｉｔＳ／Ｋｇ＜体重）〜数万Ｕｎｉ
ｔｓ／Ｋｇ（重量）の範囲であり、免疫増強活性用途に
ついては約数１０　Ｕｎｉｔｓ／に９＜体ｆＪｉ）〜数
カｔｌｎｉｔｓ／？（９（体ｆｆ１）（７）ｆｌｆｌｒ
ある。

患者に対する投与方法は、各活性用途とも静脈内投与が
最も有効であり、その地腹腔内、筋肉内および皮下投与
、あるいは消化管内への直接投与、経口投与、直腸内投
与および舌下、皮肉、鼻粘膜、動脈、リンパ乃至気管投
与も有効である。

投与形態としては、各活性用途とも注射液、坐剤、腸溶
・胃溶剤、舌下錠および吸入剤・等を例示し得る。注射
液の最も単純な組成を例示すれば、インク１リン分泌増
強話性１０，０００　Ｕｎｉｔｓ、　Ｎ　ａＣｊ！９■
および滅菌蒸溜水で１１ｒｉとしたものをあげ得る。

又、薬剤に調合り−る際に、活性を劣化せしめることの
ない任意の他成分を混合し得ることも当栗者にとり自明
であろう。

【図面の簡単な説明】

第１乃至第３図は、本発明実験説明図であり、第１図は
、ＣＭ−セファ０−スＣＬ　−６Ｂカラムクロマトグラ
フィーである。 第２図は、Ｄｉｓｃ−電気泳動図である。 第３図は要素物質の５Ｏ８−Ｄｉｓｃ″心気泳動図であ
る。 ＣＭ−セファロース　ＣＬ−６８カラム７０マ）−７゛
ラフイーフラクション魯号 第２図 Ｄｉｓｃ−電気デ永初図 Ｐ−Ａ Ｐｓ　−／ −ＩＡＰ Ｐ−Ａ Ｐｓ−／

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ＳＤＳ−ゲル電気泳動法による分子量が２８００
   ０±１２００；Ｌｏｗｒｙ法による蛋白質９８重量％以
   上であり、且つ蛋白質成分のアミノ酸組成及び組成比（
   μＭ／１００μＭ）は、 Ａｓｐ、９．３±１．０、Ｔｈｒ、７．４±０．８、Ｓ
   ｅｒ、１０．６±１．０、Ｇｌｕ、１０．６±１．０、
   Ｐｒｏ、４．４±０．５、Ｇｌｙ、１１．２±１．０、
   Ａｌａ、１０．６±１．０、Ｃｙｓ／２１．３±０．３
   、Ｖａｌ、６．７±０．７、Ｍｅｔ、１．６±０．３、
   Ｉｌｅ、３．２±０．４、Ｌｅｕ、５．５±０．６、Ｔ
   ｙｒ、４．６±０．５、Ｐｈｅ、３．５±０．４、Ｌｙ
   ｓ、２．２±０．３、Ｈｉｓ、１．７±０．３及びＡｒ
   ｇ、５．９±０．６であり；且つ、等電点ｐＨ５．８で
   ありＣＰ−Ａとの組合せによりインシュリン分泌増強活
   性の発現に係わることを特徴とする蛋白性要素物質Ｐｓ
   −１。 のボルデテラ属に属する微生物を精製して得られたイン
   シュリン分泌増強活性物質を３Ｍ〜５Ｍ尿素含有リン酸
   緩衝液（ｐＨ５．４−６．８）で１２−９６時間インキ
   ユベイトし、次いで、リン酸緩衝液（ｐＨ５．４−６．
   ８）によって平衡化したＣＭ−セフアロースＣＬ−６Ｂ
   カラムにて分離・精製をおこなうことを特徴とする蛋白
   性要素物質Ｐｓ−１の製造方法。