JPH0147996B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なキチナーゼ及びその製造法に関
する。 本発明者らは天然の士壌より数多くの微生物を
単離し、その生産物について種々研究を行つた結
果、今回本発明者によつて分離された細菌がキチ
ン分解酵素を多量に産生することを見出し、本発
明を完成した。 すなわち、本発明は新規なキチナーゼ及びその
製造法を提供するものである。 本発明のキチナーゼを産生する細菌は次のよう
な菌学的性質を有する。 (1) 形態 直状、球形末端を有する桿形、大きさ1.0〜
2.4μm、運動性あり、極単毛性で鞭毛を有する、
グラム陰性 (2) 生育状態 0.2％コロイドキチン、0.1％ペプトン、0.1％
肉汁エキス、0.3％塩化ナトリウム及び2.0％寒
天含有（PH7.0）キチン―寒天平板培地中、30
℃で72時間インキユベーシヨンすると、明確な
コロニーを形成する。 肉汁液体培地中、37℃で生育する。 7.5％塩化ナトリウム含有肉汁液体培地中で
生育しない。 単一窒素源としてアンモニアを、単一炭素源
としてグルコース、Ｌ―アルギニン、Ｌ―アス
パラギン、Ｌ―ヒスチジン、Ｌ―グルタミン
酸、Ｌ―セリン又はＬ―アラニンを含有する無
機培地中で生育する。 トリプチケースダイズ寒天培地上で褐色の水
溶性色素を生成しない。 アルギニン、アスパラギン、ロイシン及びメ
チオニンを含有する混合培地中で生育する。 (3) 理化学的性質 硝酸塩の還元：陽性 Ｖ―Ｐテスト：陰性 インドールの生成：陽性（0.1％トリプトフ
アン含有トリプトンプロス中） 硫化水素の生成：陽性（2.5％ペプトン水中） デンプンの加水分解：陽性 ウレアーゼ：陰性 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 チトクローム オキシダーゼ：陽性 生育の温度範囲：13〜42℃で生育し、27〜30
℃において最もよく生育 生育のPH範囲：5.5〜9.0 酸素に対する態度：通性嫌気性 糖類に対する資化性、酸およびガスの生成
（資化性、酸およびガスの生成があるもの、な
いものを、それぞれ＋、−で示す）：

【表】 (4) その他の性質 グルコン酸の酸化：陰性（グルコン酸オキシ
ダーゼ試験 リジンの脱炭酸反応：陰性〔モラー（Moll
―er）法〕 塩化ナトリウムの耐性：陽性（1.0％Nacl含
有プロスにおいて生育最大） シアン化カリウムの耐性：陽性（モラー法） フオスフアターゼ：陽性 カゼインの加水分解：陽性 ゼラチン溶解性：陽性 デオキシリボヌクレアーゼ：陽性 リボヌクレアーゼ：陽性 アルギニン脱水素酵素：陽性 グルタミン酸の脱炭酸反応：陰性 ビブリオスタテイツク試薬、２，４―ジアミ
ノ―６，７―ジイソプロピル プテリジン
（０／129）に対する反応性：陰性 ２，３―ブタンジオールからアセトインが生
産されるが、グルコースから生産されない。 ブキヤナン（Buchanan，P.）等（1974年）、
コワン（Cowan，S.T.）（1974年）、及びゲルハ
ルト（Gerhardt，P.）等（1981年）の系統的方
法により調べられた上記性状と本発明に係るキチ
ン溶解性に基づき、本細菌の種属を検索すると、
キチン分解性を有する生物としては、コワン
（1974年）のビブリオ（ベネツケア）・パラモリテ
イカス〔Vibrio（Beneckea）Parahemolyti―
cus〕及びバウマン（Bauman，P.L.）等のビブ
リオ（クロモバクテリウム）・アルギノリテイカ
ス〔V.（Chromobacterium）alg―inolyticus〕が
認められる〔ブキヤナン等（1974）によれば、こ
の２種の生物はビブリオ・パラヘモリテイカスに
分類されている〕。キチン溶解性の細菌は既に報
告があり、それらはセラテイア（Serratia）属
〔モンリアル（Monreal，J.）等（1969年）、レイ
ド（Reid，J.D）等（1981年）〕、ビブリオ属〔内
田等（1979年）〕、ベネツケア属〔高橋等（1982
年）〕及びストレプトミセス属〔レイノルズ
（Reynolds，D.M.）（1954年）〕であると記載さ
れている〔ブキヤナン等（1974年）に依ればベネ
ツケアはビブリオ属に属すると考えられている〕。
これらを参考にすると、本細菌はビブリオナセエ
科に属するものと考えられる。因みに、本細菌は
ペプトンから硫化水素を生成する能力があり、ま
たビブリオスタテイツク（Vibriostatic）試薬
０／129に感作しない点でビブリオ属とは全く相
違する。 叙上の証拠より、本細菌は菌株アエロモナス・
ヒドロフイラ・亜アネロゲネスATCC15467（IFO
13282）に類似する。なぜなら、本細菌はＶ―Ｐ
反応、グルコン酸オキシダーゼ試験が陰性であ
り、グリセリン及びグルコースからガスを生成し
ない〔プキヤナン等（1974年）〕。然し、本細菌が
強いキチン溶解活性を有するのに対し、上記菌株
はキチン溶解性を全く示さない点で全く相違す
る。そこで本発明者は、本細菌を公知の菌株と区
別するために、アエロモナス・ヒドロフイラ・亜
アネロゲネス A52（Aeromonas hyd―rophila
subsp.anaerogenes A52；以下において細菌52と
略称することがある）と命名し、工業技術院微生
物工業技術研究所に受託番号微工研菌寄第7206号
（FERM Ｐ―7206）として寄託した。 本細菌は次の如くして分離、純化される。分離
は、0.2％コロイドキチン、0.1％ペプトン、0.1％
肉汁エキス、0.3％塩化ナトリウム及び2.0％寒天
含有キチン―寒天平板培地（PH7.0）上で、試料
の懸濁液を１白金耳量画線する（画線平板法）こ
とにより行つた。30℃で72時間インキユベーシヨ
ン後、コロニーを採取し、上記と同組成の斜面キ
チン―寒天培地に保存する。コロニーの周囲には
コロイドキチンが溶解している明確な領域が形成
される。分離したコロニーからの当該細菌の純化
はキチン―寒天培地及び普通プロス―寒天培地上
で交互に６回平板培養することにより行う。最後
に47個の分離物のうち、キチン―寒天培地上で生
育が早く、大きく明確なコロニーを形成するもの
を細菌A52として選択した。 斯くして得られた細菌は、1.0％肉汁エキス、
1.0％ペプトン、0.5％塩化ナトリウム、2.0％寒天
含有普通プロス―傾斜培地（1NNaOHでPH＝7.0
に調整）中、28℃で３日間培養した後室温で保存
し、１箇月ごとに新しい培地に植え継ぎ保存す
る。 本発明のキチナーゼは、上記細菌を栄養源培地
に接種し培養せしめることにより製造される。培
養に用いられる培地としては、酵素誘導基質であ
るキチンと当該菌が利用する栄養源を含むもので
あれば何れでもよいが、例えば1.0％エビ殻キチ
ン、0.2％ブドウ糖、0.5％ペプトン、1.0％酵母エ
キス、0.7ｇ／リン酸二水素カリウム、0.3％塩
化ナトリウムを含有（1N―NaOHでPH＝7.0に調
整）するものが挙げられる。 培養法としては、振盪培養が好適である。培養
に適当な温度は25〜30℃であるが多くの場合28℃
付近で培養する。２〜３日間培養後、培養液は次
の操作に付される。 キチナーゼの単離は、後記実施例に示す如く、
キチナーゼの理化学的性状を考慮して種々の方法
を適当に組合せることによつて行う。 すなわち、キチナーゼは通常、培養液中に存
在するので、遠心分離又は過等の手段によつて
培養物から細菌を分離した後、培養液に硫酸ア
ンモニウムを添加して塩析を行う。次いで塩析に
より析出したタンパクの沈澱を0.1Mトリス―塩
酸緩衝液（PH7.0）に溶かし、これを遠心分離し
てその上澄液を粗酵素液とする。粗酵素液はキチ
ナーゼ及びキトビアーゼを含有する。 粗酵素液からキチナーゼの単離は、キチナーゼ
及びキトビアーゼのコロイドキチンへの吸着性の
相違を利用して行う。すなわち、粗酵素液及びコ
ロイドキチンをトリス―塩酸緩衝液と混ぜ、キチ
ナーゼをコロイドキチンに吸着させた後遠心分離
し沈澱を得る。この沈澱を後記実施例に示す如
く、フエニルメチルスルホニルフルオリド
（PMSF）含有トリス―塩酸緩衝液により処理し
てコロイドキチンを溶解し、キチナーゼ画分を得
る。 キチナーゼ画分から、キチナーゼの分離精製
は、Bio―Gel Ｐ―200によるゲル過及び
DEAE―セフアデツクス Ａ―50によるカラムク
ロマトグラフイーにより行う。 以上の如くして得られたキチナーゼは次のよう
な理化学的性質を有する。 作用：キチンに作用して、これを分解する。 至適PH：PH7.0 Km^*：コロイドキチン量にして1.35μg／ml。 PH安定性：37℃で30分処理した場合、PH5.2
〜PH8.2において80％以上の残存活性を示す。 至適温度：PH7.0において、コロイドキチン
を基質とした場合45℃付近にある。 温度安定性：コロイドキチン基質でPH7.0に
おいて、０〜50℃、30分処理で95％以上の残存
活性を示す。 等電点^**：PH7.4付近 分子量^***：153.000 ＊ 〔Km値の測定〕 1.3％コロイドキチンを含む50mM酢酸緩衝液
（PH5.2）0.4ml、50mM酢酸緩衝液（PH5.2）1.6ml、
及び酵素液2.0mlからなる反応液を37℃で45分間
インキユベートし、このときの濁度の減少から活
性を測定した。濁度の減少は610nmの吸光度の減
少から求め、１分間に１％の濁度を減少させる酵
素量を１単位とした。結果はラインウイーバーバ
ーク（Lineweaver―Burk）プロツトによりKm
値を求めた。Km値はコロイドキチンの乾物重量
で示した。なお、酵素液は精製キチナーゼ標品を
用い、１反応液中の酵素量は0.075Uで行つた。 ＊＊ 〔等電点電気泳動〕 ポリアクリルアミドゲルデイスク等電点電気泳
動はデイビス、ビー、ジエー．Ann.N.Y.Acad.
Sci…121，404（1964）に基き、7.5％ゲル、トリ
ス―グリシン緩衝液（PH8.4）中で行つた。チユ
ーブ一本あたり２〜4mAの電流を流し、５℃で
泳動した。 ＊＊＊ 〔分子量〕 SDS―ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る。 斯くして得られる本発明のキチナーゼは細胞壁
溶解酵素としてプロトプラストの形成等に利用で
きるものである。 次に実施例を挙げて説明する。 参考例 １ (1) エビ殻キチンの調製 冷凍エビ殻を解凍し、10分間ワーリングブレン
ダー処理を行ない、水道水で３回以上水洗する。
得られたエビ殻フレークを、1N水酸化ナトリウ
ムに１晩浸漬して除タンパクを行ない、水道水で
３回以上水洗する。次いで得られた除タンパクエ
ビ殻フレークを1N塩酸に１晩浸漬してカルシウ
ム分を除く。以上の操作により得られた精製エビ
殻フレークを水道水で水洗後、1N水酸化ナトリ
ウムでPH7.0に調整後、10分間ワーリングブレン
ダー処理し、乾物量を２％に調整して、オートク
レープで120℃にて20分間滅菌する。 (2) コロイドキチンの調製 (1)で得たエビ殻キチンをボールミルで約24時間
粉砕しボールミルキチンとした。このボールミル
キチンを以下の操作に付しコロイドキチンを得
た。 ａ 冷却した乳鉢をアセトンで湿らせ、ボールミ
ルキチンと濃塩酸をよく混合する。 ｂ 大量の冷水中によく撹拌しながら滴下分散さ
せる。 ｃ 18000ｇで10分間遠心分離することにより水
洗する。 ｄ ワーリングブレンダーで10分間処理する。 ｅ 18000ｇで10分間遠心分離してコロイドキチ
ンを集め、更に0.025M トリス―塩酸塩緩衝
液（PH7.2）で洗う。 斯くして得られたコロイドキチンは、適宜緩衝
液に分散させ使用に供される。 実施例 １ (1) 酵素生産のための培養 水道水１にペプトン５ｇ、酵母エキス５ｇ、
リン酸二水素カリウム0.68ｇを加え、1N―水酸
化ナトリウムでPH7.0に調整した前培養培地を、
綿栓試験管に５mlずつ入れ、常法に従い滅菌す
る。次いでこれに保存培地から細菌A52を一白金
耳接種し、28℃で24時間振盪培養を行なう。本培
養は、水道水１に、エビ殻キチン10ｇ、グルコ
ース２ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス10ｇ、リン
酸二水素カリウム0.68ｇ、塩化ナトリウム３ｇを
加え、1N―水酸化ナトリウムでPH7.0に調整した
本培養培地を、500ml容フラスコに70mlずつ分注
し、常法に従い滅菌する。次いでこれに培養終了
後の前培養培地１mlを接種し、28℃で72時間振盪
培養（240rpm）した。 (2) 粗酵素液の調整 培養終了後、本培養培地から18000ｇで20分間
遠心分離することにより菌体を除いた後、細菌に
よる汚染を防ぐために最終濃度0.02％となるよう
にアジ化ナトリウムを加え培養液とした。次い
で０℃冷却下、スターラーで静かに撹拌しなが
ら、培養液に80％飽和になるように固形硫安を
除々に加え塩析を行つた。このとき、培養液の
PHが酸性側に傾かないように、1N―水酸化ナト
リウムでPH7.0付近に保持しながら行つた。塩析
は０〜４℃に冷却しながら１時間以上行つた。塩
析により析出したタンパクの沈澱は、18000ｇで
20分間遠心分離して集めた。 この沈澱を培養液の10分の１容の0.1Mトリ
ス―塩酸緩衝液（PH7.0）に溶かし、０〜４℃に
冷却して１時間静置後、不溶物を18000ｇで20分
間遠心分離で除き、上清を粗酵素液とし、−20℃
で凍結保存した。 (3) キチン吸着によるキチナーゼとキトビアーゼ
の分離 コロイドキチンに対する両酵素の親和力の違い
により次の如くして分離した。 粗酵素液75ml（キチナーゼ約887U）と、コロ
イドキチン2.5ｇ（乾物重量）を含む25mMトリ
ス―塩酸緩衝液（PH7.2）300mlを混ぜ、時々撹拌
しながら氷冷下で１時間、キチナーゼをコロイド
キチンに吸着させた。次いで18000ｇで20分間遠
心分離を行ない沈澱を採取した。この沈澱に
0.5M塩化ナトリウムを含む25mMトリス―塩酸
緩衝液（PH7.2）400mlを加え、氷冷下でよく分散
させ、１時間かけて十分洗浄し、18000ｇで20分
間遠心分離してキチナーゼ以外の不純タンパクを
除いた。得られた沈澱に1mM PMSFを含む
25mMトリス―塩酸緩衝液（PH7.2）300mlを加え
よく分散させ、32℃で12時間インキユベートした
ところ、コロイドキチンがほぼ完全に溶解してキ
チナーゼが遊離した。ここで再び18000ｇで20分
間遠心分離して不消化物を除き上清をキチナーゼ
画分とした。 (4) キチナーゼの精製 実施例１の(3)で得られたキチナーゼ画分をエバ
ポレーター濃縮後、25mMトリス―塩酸緩衝液
（PH7.2）で平衡化したBio―Gel Ｐ―200のカラム
（2.6×100cm）でゲル過を行つた。流速は28
ml／時とした。次いでゲル過で得たキチナーゼ
画分を、透析チユーブ中でシヨ糖により濃縮を行
つた後、25mMトリス―塩酸緩衝液（PH7.2）で
平衡化したDEAE―セフアデツクスＡ―50のカラ
ムクロマトグラフに付し（カラムサイズ：2.6×
45cm）精製キチナーゼを得た。なお、溶出は塩化
ナトリウム濃度勾配０→0.3Mで、流速は42ml／
時とした。 以上の各操作段階におけるキチナーゼの精製度
及び回収率を第１表に、またDEAE―セフアデツ
クスＡ―50によるカラムクロマトグラムを第１図
に示す。第１表より明らかな如く、上記操作によ
り粗酵素液中のキチナーゼは171倍に精製された。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図はBio―Gel Ｐ―200のカラムによりゲ
ル過して得られたキチナーゼ画分のDEAE―セ
フアデツクスＡ―50によるカラムクロマトグラム
を示す図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するキチナーゼ。 作用：キチンに作用して、これを分解する。 至適PH：PH7.0 Km：コロイドキチン量にして1.35μg／ml。 PH安定性：37℃で30分処理した場合、PH5.2
   〜8.2において80％以上の残存活性を示す。 至適温度：PH7.0において、コロイドキチン
   を基質とした場合45℃付近にある。 温度安定性：コロイドキチン基質でPH7.0に
   おいて、０〜50℃、30分処理で95％以上の残存
   活性を示す。 等電点：PH7.4付近 分子量：153000 ２ アエロモナス属に属するキチナーゼ生産菌を
   培地に培養し、その培養物から下記の理化学的性
   質、 作用：キチンに作用して、これを分解する。 至適PH：PH7.0 Km：コロイドキチン量にして1.35μg／ml。 PH安定性：37℃で30分処理した場合、PH5.2
   〜8.2において80％以上の残存活性を示す。 至適温度：PH7.0において、コロイドキチン
   を基質とした場合45℃付近にある。 温度安定性：コロイドキチン基質でPH7.0に
   おいて、０〜50℃、30分処理で95％以上の残存
   活性を示す。 等電点：PH7.4付近 分子量：153000 を有するキチナーゼを採取することを特徴とする
   キチナーゼの製造法。 ３ キチナーゼ生産菌がアエロモナス・ヒドロフ
   イラ・亜アネロゲネスA52（微工研菌寄第7206号）
   である特許請求の範囲第２項記載のキチナーゼの
   製造法。