JPH0257917B2

JPH0257917B2 -

Info

Publication number: JPH0257917B2
Application number: JP58162960A
Authority: JP
Inventors: Minoru Yabuki; Keiji Mizushina; Shoichi Ando; Takaaki Fujii
Original assignee: Godo Shusei KK
Current assignee: Godo Shusei KK
Priority date: 1983-09-05
Filing date: 1983-09-05
Publication date: 1990-12-06
Also published as: JPS6054682A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なキトビアーゼの製造法に関す
る。本発明者らは天然の土壤より数多くの微生物を
単離し、その生産物について種々研究を行つた結
果、今回本発明者によつて分離された細菌がキチ
ン分解酵素を多量に産生することを見出し、本発
明を完成した。すなわち、本発明は新規なキトビアーゼの製造
法を提供するものである。本発明のキトビアーゼを産生する細菌は次のよ
うな菌学的性質を有する。 (1) 形態直状、球形末端を有する桿形、大きさ1.0〜
2.4μｍ、運動性あり、極単毛性で鞭毛を有す
る、グラム陰性 (2) 生育状態 0.2％コロイドキチン、0.1％ペプトン、0.1
％肉汁エキス、0.3％塩化ナトリウム及び2.0
％寒天含有（PH7.0）キチン−寒天平板培地
中、30℃で72時間インキユベーシヨンする
と、明確なコロニーを形成する。肉汁液体培地中、37℃で生育する。 7.5％塩化ナトリウム含有肉汁液体培地中
で生育しない。単一窒素源としてアンモニア、単一炭素源
としてグルコース、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ア
スパラギン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−グルタミ
ン酸、Ｌ−セリン又はＬ−アラニンを含有す
る無機培地中で生育する。トリプチケースダイズ寒天培地上で褐色の
水溶性色素を生成しない。アルギニン、アスパラギン、ロイシン及び
メチオニンを含有する混合培地中で生育す
る。 (3) 生理学的性質硝酸塩の還元：陽性Ｖ−Ｐテスト：陰性インドールの生成：陽性（0.1％トリプト
フアン含有トリプトンブロス中）硫化水素の生成：陽性（2.5％ペプトン水
中）デンプンの加水分解：陽性ウレアーゼ：陰性オキシダーゼ：陽性カタラーゼ：陽性チトクロームオキシダーゼ：陽性生育の温度範囲：13〜42℃で生育し、27〜
30℃において最もよく生育生育のPH範囲：5.5〜9.0 酸素に対する態度：通性嫌気性糖類に対する資化性、酸およびガスの生成
（資化性、酸およびガスの生成があるもの、
ないものを、それぞれ＋、−で示す）：

【表】

【表】 (4) その他の性質グルコン酸の酸化：陰性（グルコン酸オキ
シダーゼ試験）リジンの脱炭酸反応：陰性〔モラKg
（Moller）法〕塩化ナトリウムの耐性：陽性（1.0％NaCl
含有ブロスにおいて生育最大）シアン化カリウムの耐性：陽性（モラー
法）フオスフアターゼ：陽性カゼインの加水分解：陽性ゼラチン溶解性：陽性デオキシリボヌレアーゼ：陽性リボヌクレアーゼ：陽性アルギニン脱水素酵素：陽性グルタミン酸の脱炭酸反応：陰性ビブリオスタテイツク試薬、２，４−ジア
ミノ−６，７−ジイソプロプルプテリジン
（０／129）に対する反応性：陰性２，３−ブタンジオールからアセトインが
生産されるが、グルコースからは生産されな
い。ブキヤナン（Buchanan、P.）等（1974年）、
コワン（Cowan、S.T.）（1974年）、及びゲルハ
ルト（Gerhardt、P.）等（1981年）の系統的方
法により調べられた上記性状と本発明に係るキチ
ン溶解性に基づき、本細菌の種属を検索すると、
キチン分解性を有する生物としては、コワン
（1974年）のビブリオ（ベネツケア）・パラヘモリ
テイカス〔Viibrio（Beneckea）
parahemolyticus〕及びバウマン（Bauman、P.
L.）等のビブリオ（クロモバクテリウム）・アル
ギノリテイカス（V.（Chromobacterium）
alginolyticus〕が認められる〔ブキヤナン等
（1974）によれば、この２種の生物はビブリオ・
パラヘモリテイカスに分類されている〕。キチン
溶解性の細菌は既に報告があり、それらはセラテ
イア（Serratia）属〔モンリアル（Monreal、
J.）等（1969年）、レイド（Reid、J.D）等（1981
年）〕、ビブリオ属〔内田等（1979年）〕、ベネツケ
ア属〔高橋等（1982年）〕及びストレプトミセス
属〔レイノルズ（Reynolds、D.M.）（1954年）〕
であると記載されている〔ブキヤナン等（1974
年）に依ればベネツケアはビブリオ属に属すると
考えられている〕。これらを参考にすると、本細
菌はビブリオナセエ科に属するものと考えられ
る。因みに、本細菌はペプトンから硫化水素を生
成する能力があり、またビブリオスタテイツク
（Vibriostatic）試薬０／129に感作しない点でビ
ブリオ属とは全く相違する。叙上の証拠より、本細菌は菌株アエロモナス・
ヒドロフイラ・亜アネロゲネス ATCC15467
（IFO13282）に類似する。なぜなら、本細菌はＶ
−Ｐ反応、グルコン酸オキシダーゼ試験が陰性で
あり、グリセリン及びグルコースからガスを生成
しない〔ブキヤナン等（1974年）〕。然し、本細菌
が強いキチン溶解活性を有するのに対し、上記菌
株はキチン溶解性を全く示さない点で全く相違す
る。そこで本発明者は、本細菌を公知の菌株と区
別するために、アエロモナス・ヒドロフイラ・亜
アネロゲネス A52（Aeromonas hydrophila
subsp.anaerogenesA52；以下において細菌52と
略称することがある）と命名し、工業技術院微生
物工業技術研究所に受託番号微工研菌寄7206号
（FERM Ｐ−7206）として寄託した。本細菌は次の如くして分離、純化される。分離
は、0.2％コロイドキチン、0.1％ペプトン、0.1％
肉汁エキス、0.3％塩化ナトリウム及び2.0％寒天
含有キチン−寒天平板培地（PH7.0）で、試料の
懸濁液を１白金耳量画線する（画線平板法）こと
により行つた。30℃で72時間インキユベーシヨン
後、コロニーを採取し、上記と同組成の斜面キチ
ン−寒天培地に保存する。コロニーの周囲にはコ
ロイドキチンが溶解している明確な領域が形成さ
れる。分離したコロニーからの当該細菌の純化は
キチン−寒天培地及び普通ブロス−寒天培地上で
交互に６回平板培養することにより行う。最後に
47個の分離物のうち、キチン−寒天培地上で生育
が早く、大きく明確なコロニーを形成するものを
細菌A52として選択した。斯くして得られた細菌は、1.0％肉汁エキス、
1.0％ペプトン、0.5％塩化ナトリウム、2.0％寒天
含有普通ブロス−傾斜培地（1N−NaOHでPH7.0
に調整）中、28℃で３日間培養した後室温で存在
し、１箇月ごとに新しい培地に植え継ぎ保存す
る。本発明のキトビアーゼは、上記細菌を栄養源培
地に接種し培養せしめることにより製造される。
培養に用いられる培地としては、酵素誘導基質で
あるキチンと当該菌が利用する栄養源を含むもの
であれば何れでもよいが、例えば1.0％エビ殻キ
チン、0.2％ブドウ糖、0.5％ペプトン、1.0％酵母
エキス、0.7ｇ／リン酸二水素カリウム、0.3％
塩化ナトリウムを含有（1N−NaOHでPH7.0に調
整）するものが挙げられる。培養法としては、振盪培養が好適である。培養
に適当な温度は25〜30℃であるが多くの場合28℃
付近で培養する。２〜３日間培養後、培養液は次
の操作に付される。キトビアーゼの単離は、後記実施例に示す如
く、キトビアーゼの理化学的性状を考慮して種々
の方法を適当に組合せることによつて行う。すなわち、キトビアーゼは通常、培養液中に
存在するので、遠心分離又は過等の手段によつ
て培養物から細菌を分離した後、培養液に硫酸
アンモニウムを添加して塩析を行う。次いで塩析
により析出したタンパクの沈澱を0.1Mトリス−
塩酸緩衝液（PH7.0）に溶かし、これを遠心分離
してその上澄液を粗酵素液とする。粗酵素液はキ
トビアーゼ及びキチナーゼを含有する。粗酵素液からキトビアーゼの単離は、キトビア
ーゼ及びキチナーゼのコロイドキチンへの吸着性
の相違を利用して行う。すなわち、粗酵素液及び
コロイドキチンをトリス−塩酸緩衝液と混ぜ、キ
チナーゼをコロイドキチンに吸着させた後遠心分
離し上清を得、これをキトビアーゼ画分とする。
なお、キチナーゼは遠心分離により得られた沈澱
から得られる。キトビアーゼ画分から、キトビアーゼの分離精
製は、CM−セルロースクロマトグラフイー及び
DEAE−セフアデツクスＡ−50によるカラムクロ
マトグラフイーを利用して行なわれる。以上の如くして得られたキトビアーゼは次のよ
うな理化学的性質を有する。作用：キチナーゼと共に作用してキチンを分
解する。至適PH：PH7.0 Km^*：ｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル
グルコサミニド0.17ｍＭ PH安定性：37℃で30分処理した場合、PH6.0
〜PH9.0において90％以上の残存活性を示す。至適温度：PH7.0において、ｐ−ニトロフエ
ニル−Ｎ−アセチルグルコサミニドを基質とし
た場合50℃付近にある。温度安定性：ｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセ
チルグルコサミニド基質で、PH7.0において、
０〜40℃、30分処理して80％以上の残存活性を
示す。等電点^**：PH6.8付近分子量^***：115000 ＊〔Km値の測定〕 5.0ｍＭｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセチル
グルコサミニド0.2ml、50mMトリス−マレイン
酸緩衝液（PH7.0）0.7ml、及び酵素液0.1mlからな
る反応液を37℃で10分間インキユベートする。次
いで、この反応液に0.25M炭酸ナトリウム溶液
2.0mlを加え反応を停止し、同時にｐ−ニトロフ
エノールの発色を起こさせた。生成したＮ−アセ
チルグルコサミンはｐ−ニトロフエノールと等モ
ルであるから、405nｍの吸光度を測り、ｐ−ニ
トロフエノールの検量線からその量を求めた。キ
トビアーゼ活性は、ｐ−ニトロフエニル−Ｎ−ア
セチルコサミニドから１分間に1μmolのＮ−アセ
チルグルコサミンを生成する酵素量を１単位とし
た。結果はラインウイーバー−バーク
（Lineweaver−Burk）プロツトからKm値を求
めた。なお、酵素液は精製キトビアーゼ標品を用
い、１反応液中の酵素量は0.054Uで行つた。＊＊〔等電点電気泳動〕ポリアクリルアミドゲルデイスク等電点電気泳
動はデイビス、ビー．ジエー．Ann.N.Y.Acad.
Sci.、121、404（1964）に基き、7.5％ゲル、トリ
ス−グリシン緩衝液（PH8.4）中で行つた。チユ
ーブ一本あたり２〜４ｍＡの電流を流し、５℃で
泳動した。＊＊＊〔分子量〕 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る。斯くして得られる本発明のキトビアーゼは細胞
壁溶解酵素としてプロトプラストの形成等に利用
できるものである。次に実施例及び参考例を挙げて説明する。参考例１ (1) エビ殻キチンの調製冷凍エビ殻を解凍し、10分間ワーリングブレ
ンダー処理を行ない、水道水で３回以上水洗す
る。得られたエビ殻フレークを、1N水酸化ナ
トリウムに１晩浸漬して除タンパクを行ない、
水道水で３回以上水洗する。次いで得られた除
タンパクエビ殻フレークを1N塩酸に１晩浸漬
してカルシウム分を除く。以上の操作により得
られた精製エビ殻フレークを水道水で水洗後、
1N水酸化ナトリウムでPH7.0に調整後、10分間
ワーリングブレンダー処理し、乾物量を２％に
調整して、オートクレーブで120℃にて20分間
滅菌する。 (2) コロイドキチンの調製 (1)で得たエビ殻キチンをボールミルで約24時
間粉砕しボールミルキチンとした。このボール
ミルキチンを以下の操作に付しコロイドキチン
を得た。ａ冷却した乳鉢をアセトンで湿らせ、ボール
ミルキチンと濃塩酸をよく混合する。ｂ大量の冷水中によく撹拌しながら滴下分散
させる。ｃ 18000ｇで10分間遠心分離することにより
水洗する。ｄワーリングブレンダーで10分間処理する。ｅ 18000ｇで10分間遠心分離してコロイドキ
チンを集め、更に0.025Mトリス−塩酸緩衝
液（PH7.2）で洗う。斯くして得られたコロイドキチンは、適宜緩衝
液に分散させ使用に供される。実施例１ (1) 酵素生産のための培養水道水１にペプトン15ｇ、酵母エキス５
ｇ、リン酸二水素カリウム0.68ｇを加え、1N
−水酸化ナトリウムでPH7.0に調整した前培養
培地を、綿栓試験管に５mlずつ入れ、常法に従
い滅菌する。次いでこれに保存培地から細菌
A52を一白金耳接種し、28℃で24時間振盪培養
を行なう。本培養は、水道水１に、エビ殻キ
チン10ｇ、グルコース２ｇ、ペプトン５ｇ、酵
母エキス10ｇ、リン酸二水素カリウム0.68ｇ、
塩化ナトリウム３ｇを加え、1N−水酸化ナト
リウムでPH7.0に調整した本培養培地を、500ml
容フラスコに70mlずつ分注し、常法に従い滅菌
する。次いで、これに培養終了後の前培養培地
１mlを接種し、28℃で72時間振盪培養
（240rpm）した。 (2) 粗酵素液の調製培養終了後、本培養培地から18000ｇで20分
間遠心分離することにより菌体を除いた後、細
菌による汚染を防ぐために最終濃度0.02％とな
るようにアジ化ナトリウムを加え培養液とし
た。次いで０℃冷却下、スターラーで静かに撹
拌しながら、培養液に80％飽和になるように
固形硫安を徐々に加え塩析を行つた。このと
き、培養液のPHが酸性側に傾かないように、
1N−水酸化ナトリウムでPH7.0付近に保持しな
がら行つた。塩析は０〜４℃に冷却しながら１
時間以上行つた。塩析により析出したタンパク
の沈澱は、18000ｇで20分間遠心分離して集め
た。この沈澱を培養液の10分の１容の0.1M
トリス−塩酸緩衝液（PH7.0）に溶かし、０〜
４に冷却して１時間静置後、不溶物を18000ｇ
で20分間遠心分離で除き、上清を粗酵素液と
し、−20℃で凍結保存した。 (3) キチン吸着によるキチナーゼとキトビアーゼ
の分離コロイドキチンに対する両酵素の親和力の違
いにより次の如くして分離した。粗酵素液75ml（キチナーゼ約887U）と、コ
ロイドキチン2.5ｇ（乾物重量）を含む25ｍＭ
トリス−塩酸緩衝液（PH7.2）300mlを混ぜ、
時々撹拌しながら氷冷下で１時間、キチナーゼ
をコロイドキチンに吸着させた。次いで18000
ｇで20分間遠心分離を行ない、上清をキトビア
ーゼ画分とした。 (4) キトビアーゼの精製実施例１の(3)で得られたキトビナーゼ画分を
１ｍＭ PMSFの存在下でエバポレータ濃縮
後、５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）に対
して一晩透析した標品を、50ｍＭ酢酸緩衝液
（PH5.2）で平衡化したCM−セルロースのカラ
ム（2.6×45cm）でイオン交換した。なお、溶
出は塩化ナトリウム濃度勾配０→0.3Mで、流
速は40ml／時とした。次いで、溶出液を限外
過により濃縮・脱塩した後、0.05M塩化ナトリ
ウム含有25ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）
で平衡化させたDEAE−セフアデツクスＡ−50
のカラムクロマトグラムに付し（カラムサイズ
2.6×45cm）精製キトビアーゼを得た。なお、
溶出は塩化ナトリウム濃度勾配0.05→0.2Mで、
流速は44ml／時とした。以上の各操作段階におけるトキビアーゼの精製
度及び回収率を第１表に、またDEAE−セフアデ
ツクスＡ−50によるカラムクロマトグラムを第１
図に示す。第１表より明らかな如く、上記操作に
より粗酵素液中のキトビアーゼは144培に精製さ
れた。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図はCM−セルロースのカラムによりイオ
ン交換して得られたキトビアーゼ溶出液のDEAE
−セフアデツクスＡ−50によるカラムクロマトグ
ラムを示す図面である。

Claims

【特許請求の範囲】１アエロモナス・ヒドロフイラ・亜アネロゲネ
スA25（微工研菌寄第7206号）を培地に培養し、
その培養物から下記の理化学的性質を有するキト
ビアーゼを採取することを特徴とするキトビアー
ゼの製造法。作用：キチナーゼと共に作用してキチンを分
解する。至適PH：PH7.0 Km：ｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセチルグ
ルコサミニド0.17ｍＭ PH安定性：37℃で30分処理した場合、PH6.0
〜PH9.0において90％以上の残存活性を示す。至適温度：PH7.0において、ｐ−ニトロフエ
ニル−Ｎ−アセチルグルコサミニドを基質とし
た場合50℃付近にある。温度安定性：ｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセ
チルグルコサミニド基質で、PH7.0において、
０〜40℃、30分処理で80％以上の残存活性を示
す。等電点：PH6.8付近分子量：115000