JPH0158956B2 - - Google Patents
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- JPH0158956B2 JPH0158956B2 JP1050183A JP1050183A JPH0158956B2 JP H0158956 B2 JPH0158956 B2 JP H0158956B2 JP 1050183 A JP1050183 A JP 1050183A JP 1050183 A JP1050183 A JP 1050183A JP H0158956 B2 JPH0158956 B2 JP H0158956B2
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、Ｌ−トリプトフアンの製造法に関
し、更に詳しくは、トリプトフアンの生成を調整
する遺伝情報を有するプラスミドを含有し、か
つ、トリプトフアナーゼの欠失したエシエリヒア
属に属する微生物を栄養培地に培養し、Ｌ−トリ
プトフアンを製造するに際し、アントラニル酸お
よび／またはインドール並びにグリシンおよびグ
ルコースを添加することを特徴とするＬ−トリプ
トフアンの改良された製造法に関するものであ
る。 従来微生物を用いてＬ−トリプトフアン（以
下、単に「トリプトフアン」という）を製造する
に際し、栄養培地中にアントラニル酸、インドー
ルを添加し、培養する方法（例えば、特公昭35−
12384号公報）、或いは、Ｌ−セリンを含む培地に
微生物を培養する（特開昭55−162771号公報、
他）か、または、微生物菌体の存在下にインドー
ルとＬ−セリンを生化学的に反応せしめる方法
（例えば特公昭53−1836号公報、特開昭56−
137894号公報等）が知られている。 本発明者らは、先に、トリプトフアンの生成を
調整する遺伝情報を有するプラスミドを含有し、
かつ、トリプトフアナーゼの欠失したエシエリヒ
ア属に属する微生物の創製手段及びその微生物に
よるトリプトフアンの製造方法を提案した（特開
昭57−80398号公報参照）。 この提案の方法によれば、培地にアントラニル
酸を添加し、培養することにより培養物中のトリ
プトフアンの蓄積量を飛躍的に高めることに成功
しているがアントラニル酸の培地中への添加等に
よつて、インドールの濃度が高くなるとトリプト
フアン生産菌の増殖が悪くなり、さらにトリプト
フアンの生産性を高めるには、培養に長時間要す
るなど問題点があつた。インドールの蓄積は、ト
リプトフアン合成系酵素の多大さに比し、基質で
あるＬ−セリンの供給能力が弱いためである。従
つて、培地中にＬ−セリンを添加することでイン
ドールは消失しトリプトフアン生産菌の増殖並び
にトリプトフアンの生産性は増大するものと考え
られるがＬ−セリンは高価なため実用的でない。
そこで、かかる課題を解決するために培地組成に
ついて、検討したところ培地中にアントラニル酸
の添加に伴なつてグリシン及びグルコースを添加
することが、当該発酵においてアントラニル酸か
らトリプトフアンへの転換率を高め、トリプトフ
アンの生産性が増大することを見い出し、本発明
を完成した。本発明の特徴とするところは、高価
なＬ−セリンに替え、グリシンとグルコースを共
存させることによりトリプトフアンの増収が図れ
るところにある。 本発明に用いることができる微生物は、トリプ
トフアンの生成を調整する遺伝情報を有するプラ
スミドを含有することにより、トリプトフアンの
生合成系が増強され、セリン生合成系を併せも
ち、かつ、トリプトフアナーゼの欠失したもので
あれば属を問わないが、トリプトフアンの生合成
系が明確になつているエシエリヒア属に属する菌
が好適であり、さらにアントラニル酸合成酵素に
対するトリプトフアンによるフイードバツク阻害
が解除されたトリプトフアンオペロンをもつプラ
スミドを有し、かつ、トリプトフアンレプレツサ
ー及びトリプトフアナーゼが欠損した大腸菌をト
リプトフアンの生産に好適なものとして挙げるこ
とができ、より具体的のものとしては、本発明者
らが先に提案したエシエリヒアコリーW3110
trpAE1 trpR tnaA（pSC101−trp・I15）の菌
で、1980年10月28日付でアメリカンタイプカルチ
ヤーコレクシヨンに寄託され、ATCC31743の受
託番号が付されたものを挙げることができる。 本発明の方法は、上述の微生物を用いてトリプ
トフアンを製造するには、当該微生物を栄養培地
中に培養するそれ自体公知の培地組成による公知
の方法を実施するに際し、該培地にアントラニル
酸または／およびインドールを添加し、インドー
ルの添加量又はインドールの生成量を考慮し、グ
リシン及びグルコースを適当量添加培養すること
によつて実施することができる。 かかる培養は、培地に培養当初からアントラニ
ル酸または／およびインドール並びにグリシン及
びグルコースを添加したものについて行うことも
できるが、これらを添加しない栄養培地、例えば
通常の微生物の培養に用いられる炭素源、窒素源
あるいは無機塩、ビタミン等菌の生育に必要な栄
養源を含む培地で培養し、菌体の増殖を待つて、
アントラニル酸または／およびインドール並びに
グリシン及びグルコースを添加する方法によつて
も行うことができる。この方法による場合は、培
養液中に初発の炭素源として用いたグルコース、
澱粉等から生成したグルコース含量が少いとき
は、グリシンの添加に併せて、グルコースの添加
は必須のものとなる。 また、増殖菌体を集菌した後、新たにアントラ
ニル酸または／およびインドール並びにグリシン
及びグルコースを添加調整した培地でさらに培養
を続ける方法を採ることもできる。この場合は、
アントラニル酸もしくはインドールまたはグリシ
ンもしくはグルコースの添加量比は使用する微生
物の特性に基づいて最適量が変化するため臨界的
ではないが、通常アントラニル酸またはインドー
ルに対して、約等モル〜10倍モルのグリシン、約
等モル〜40倍モルのグルコースを添加して培養を
行うことが好ましい。 また、培養時間は、上記の培養方法に準じて、
異なるが、培養初期にアントラニル酸等を添加し
て培養を行う場合は、約24時間〜約120時間で菌
体の増殖後インドール等を添加して培養を行う場
合は、添加後約２時間〜24時間培養を行うのがよ
い。また、培養は振盪または通気撹拌などの好気
条件下に行うおがよく、培養温度は通常20゜〜40゜
にて行うのがよい。PHは６〜９が望ましい。 かくして、培養液中に蓄積されるトリプトフア
ンを単離精製するには、既知の方法、たとえば活
性炭やイオン交換樹脂への吸着、溶出によつて容
易に行うことが出来る。 以下に本発明の方法を実施例をもつて詳細に説
明する。 実施例 １ Eacherichia coli W3110 trpAE1 trpR
tnaA（pSC101−trp・I15）をテトラサイクリン
を10ｇ／で含むＬ−ブロス（100ml容フラスコ
に20ml）に接種し37℃で14時間培養した。この培
養液１mlをテトラサイクリンを10mg／で含むＬ
−ブロス（500ml容フラスコに100ml）に接種し37
℃で６時間培養した。かくして得られた種培養液
全量を１の培地Ｋを含むジヤーフアーメンター
（丸菱理科装置研究所、MD−250型、２容量）
に植菌し、37℃で18時間培養した。培養中の培地
のPHは14％アンモニア水により７に調節し撹拌は
500rpm、通気は1v.v.m.で行なつた。培養後に菌
体を遠心分離し、0.9％食塩水で２回洗浄するこ
とにより、30ｇの湿潤菌体を得た。得られた湿潤
菌体0.6ｇを500ml容フラスコ内で20mlの培地KW
に懸濁した。基質として加えたインドール、Ｌ−
セリン、グリシン、グルコースの濃度はそれぞれ
0.5ｇ／、１ｇ／、２ｇ／、30ｇ／であ
る。33℃で４時間撹拌後に生成したＬ−トリプト
フアンを薄層クロマトグラフイーで定量した結果
を表１に示す。 【表】 モル変換率
b) ○印は培地KWに添加したことを示す
なお、前記のＬ−ブロス、培地Ｋ、培地KWは
次のような組成からなる培地である。 【表】 実施例 ２ 実施例１で得られた湿潤菌体0.6ｇを500ml容フ
ラスコ内で20mlの培地KWに懸濁した。基質とし
て加えたアントラニル酸、Ｌ−セリン、グリシ
ン、グルコースの濃度はそれぞれ１ｇ、１ｇ、２
ｇ、30ｇ／である。33℃で４時間撹拌後に生成
したＬ−トリプトフアンを薄層クロマトグラフイ
ーで定量した結果を表２に示す。 【表】 実施例 ３ Ｅ・coli W3110 trpAE1 trpR tnaA
（pSC101−trp・I15）を実施例１と同様にＬ−ブ
ロスで前培養した。得られた種培養液２mlを培地
KF（500ml容フラスコに20ml）に植菌し33℃で72
時間培養した。KF培地にはグリシまたはＬ−セ
リンを添加したものと、対照として両者をともに
加えないものを用いた。また、培養20時間目にグ
リシンまたはＬ−セリンを２ｇ／で添加する試
験も行なつた。72時間後に生成されたＬ−トリプ
トフアン、並びにインドールを薄層クロマトグラ
フイーで定量した結果を表３に示す。 【表】 【表】 なお、前記の培地KFは次のような組成からな
る培地である。 培地KF：KH2PO4 ２ｇ （NH4）2SO4 10ｇ MgSO4・7H2O １ｇ FeSO4・7H2O 10mg MnCl2・4H2O 10mg カザミノ酸 ８ｇ 酵母エキス １ｇ アントラニル酸 ４ｇ グルコース 20ｇ CaCO3（別殺菌） 30ｇ テトラサイクリン 10mg／PH7.0
し、更に詳しくは、トリプトフアンの生成を調整
する遺伝情報を有するプラスミドを含有し、か
つ、トリプトフアナーゼの欠失したエシエリヒア
属に属する微生物を栄養培地に培養し、Ｌ−トリ
プトフアンを製造するに際し、アントラニル酸お
よび／またはインドール並びにグリシンおよびグ
ルコースを添加することを特徴とするＬ−トリプ
トフアンの改良された製造法に関するものであ
る。 従来微生物を用いてＬ−トリプトフアン（以
下、単に「トリプトフアン」という）を製造する
に際し、栄養培地中にアントラニル酸、インドー
ルを添加し、培養する方法（例えば、特公昭35−
12384号公報）、或いは、Ｌ−セリンを含む培地に
微生物を培養する（特開昭55−162771号公報、
他）か、または、微生物菌体の存在下にインドー
ルとＬ−セリンを生化学的に反応せしめる方法
（例えば特公昭53−1836号公報、特開昭56−
137894号公報等）が知られている。 本発明者らは、先に、トリプトフアンの生成を
調整する遺伝情報を有するプラスミドを含有し、
かつ、トリプトフアナーゼの欠失したエシエリヒ
ア属に属する微生物の創製手段及びその微生物に
よるトリプトフアンの製造方法を提案した（特開
昭57−80398号公報参照）。 この提案の方法によれば、培地にアントラニル
酸を添加し、培養することにより培養物中のトリ
プトフアンの蓄積量を飛躍的に高めることに成功
しているがアントラニル酸の培地中への添加等に
よつて、インドールの濃度が高くなるとトリプト
フアン生産菌の増殖が悪くなり、さらにトリプト
フアンの生産性を高めるには、培養に長時間要す
るなど問題点があつた。インドールの蓄積は、ト
リプトフアン合成系酵素の多大さに比し、基質で
あるＬ−セリンの供給能力が弱いためである。従
つて、培地中にＬ−セリンを添加することでイン
ドールは消失しトリプトフアン生産菌の増殖並び
にトリプトフアンの生産性は増大するものと考え
られるがＬ−セリンは高価なため実用的でない。
そこで、かかる課題を解決するために培地組成に
ついて、検討したところ培地中にアントラニル酸
の添加に伴なつてグリシン及びグルコースを添加
することが、当該発酵においてアントラニル酸か
らトリプトフアンへの転換率を高め、トリプトフ
アンの生産性が増大することを見い出し、本発明
を完成した。本発明の特徴とするところは、高価
なＬ−セリンに替え、グリシンとグルコースを共
存させることによりトリプトフアンの増収が図れ
るところにある。 本発明に用いることができる微生物は、トリプ
トフアンの生成を調整する遺伝情報を有するプラ
スミドを含有することにより、トリプトフアンの
生合成系が増強され、セリン生合成系を併せも
ち、かつ、トリプトフアナーゼの欠失したもので
あれば属を問わないが、トリプトフアンの生合成
系が明確になつているエシエリヒア属に属する菌
が好適であり、さらにアントラニル酸合成酵素に
対するトリプトフアンによるフイードバツク阻害
が解除されたトリプトフアンオペロンをもつプラ
スミドを有し、かつ、トリプトフアンレプレツサ
ー及びトリプトフアナーゼが欠損した大腸菌をト
リプトフアンの生産に好適なものとして挙げるこ
とができ、より具体的のものとしては、本発明者
らが先に提案したエシエリヒアコリーW3110
trpAE1 trpR tnaA（pSC101−trp・I15）の菌
で、1980年10月28日付でアメリカンタイプカルチ
ヤーコレクシヨンに寄託され、ATCC31743の受
託番号が付されたものを挙げることができる。 本発明の方法は、上述の微生物を用いてトリプ
トフアンを製造するには、当該微生物を栄養培地
中に培養するそれ自体公知の培地組成による公知
の方法を実施するに際し、該培地にアントラニル
酸または／およびインドールを添加し、インドー
ルの添加量又はインドールの生成量を考慮し、グ
リシン及びグルコースを適当量添加培養すること
によつて実施することができる。 かかる培養は、培地に培養当初からアントラニ
ル酸または／およびインドール並びにグリシン及
びグルコースを添加したものについて行うことも
できるが、これらを添加しない栄養培地、例えば
通常の微生物の培養に用いられる炭素源、窒素源
あるいは無機塩、ビタミン等菌の生育に必要な栄
養源を含む培地で培養し、菌体の増殖を待つて、
アントラニル酸または／およびインドール並びに
グリシン及びグルコースを添加する方法によつて
も行うことができる。この方法による場合は、培
養液中に初発の炭素源として用いたグルコース、
澱粉等から生成したグルコース含量が少いとき
は、グリシンの添加に併せて、グルコースの添加
は必須のものとなる。 また、増殖菌体を集菌した後、新たにアントラ
ニル酸または／およびインドール並びにグリシン
及びグルコースを添加調整した培地でさらに培養
を続ける方法を採ることもできる。この場合は、
アントラニル酸もしくはインドールまたはグリシ
ンもしくはグルコースの添加量比は使用する微生
物の特性に基づいて最適量が変化するため臨界的
ではないが、通常アントラニル酸またはインドー
ルに対して、約等モル〜10倍モルのグリシン、約
等モル〜40倍モルのグルコースを添加して培養を
行うことが好ましい。 また、培養時間は、上記の培養方法に準じて、
異なるが、培養初期にアントラニル酸等を添加し
て培養を行う場合は、約24時間〜約120時間で菌
体の増殖後インドール等を添加して培養を行う場
合は、添加後約２時間〜24時間培養を行うのがよ
い。また、培養は振盪または通気撹拌などの好気
条件下に行うおがよく、培養温度は通常20゜〜40゜
にて行うのがよい。PHは６〜９が望ましい。 かくして、培養液中に蓄積されるトリプトフア
ンを単離精製するには、既知の方法、たとえば活
性炭やイオン交換樹脂への吸着、溶出によつて容
易に行うことが出来る。 以下に本発明の方法を実施例をもつて詳細に説
明する。 実施例 １ Eacherichia coli W3110 trpAE1 trpR
tnaA（pSC101−trp・I15）をテトラサイクリン
を10ｇ／で含むＬ−ブロス（100ml容フラスコ
に20ml）に接種し37℃で14時間培養した。この培
養液１mlをテトラサイクリンを10mg／で含むＬ
−ブロス（500ml容フラスコに100ml）に接種し37
℃で６時間培養した。かくして得られた種培養液
全量を１の培地Ｋを含むジヤーフアーメンター
（丸菱理科装置研究所、MD−250型、２容量）
に植菌し、37℃で18時間培養した。培養中の培地
のPHは14％アンモニア水により７に調節し撹拌は
500rpm、通気は1v.v.m.で行なつた。培養後に菌
体を遠心分離し、0.9％食塩水で２回洗浄するこ
とにより、30ｇの湿潤菌体を得た。得られた湿潤
菌体0.6ｇを500ml容フラスコ内で20mlの培地KW
に懸濁した。基質として加えたインドール、Ｌ−
セリン、グリシン、グルコースの濃度はそれぞれ
0.5ｇ／、１ｇ／、２ｇ／、30ｇ／であ
る。33℃で４時間撹拌後に生成したＬ−トリプト
フアンを薄層クロマトグラフイーで定量した結果
を表１に示す。 【表】 モル変換率
b) ○印は培地KWに添加したことを示す
なお、前記のＬ−ブロス、培地Ｋ、培地KWは
次のような組成からなる培地である。 【表】 実施例 ２ 実施例１で得られた湿潤菌体0.6ｇを500ml容フ
ラスコ内で20mlの培地KWに懸濁した。基質とし
て加えたアントラニル酸、Ｌ−セリン、グリシ
ン、グルコースの濃度はそれぞれ１ｇ、１ｇ、２
ｇ、30ｇ／である。33℃で４時間撹拌後に生成
したＬ−トリプトフアンを薄層クロマトグラフイ
ーで定量した結果を表２に示す。 【表】 実施例 ３ Ｅ・coli W3110 trpAE1 trpR tnaA
（pSC101−trp・I15）を実施例１と同様にＬ−ブ
ロスで前培養した。得られた種培養液２mlを培地
KF（500ml容フラスコに20ml）に植菌し33℃で72
時間培養した。KF培地にはグリシまたはＬ−セ
リンを添加したものと、対照として両者をともに
加えないものを用いた。また、培養20時間目にグ
リシンまたはＬ−セリンを２ｇ／で添加する試
験も行なつた。72時間後に生成されたＬ−トリプ
トフアン、並びにインドールを薄層クロマトグラ
フイーで定量した結果を表３に示す。 【表】 【表】 なお、前記の培地KFは次のような組成からな
る培地である。 培地KF：KH2PO4 ２ｇ （NH4）2SO4 10ｇ MgSO4・7H2O １ｇ FeSO4・7H2O 10mg MnCl2・4H2O 10mg カザミノ酸 ８ｇ 酵母エキス １ｇ アントラニル酸 ４ｇ グルコース 20ｇ CaCO3（別殺菌） 30ｇ テトラサイクリン 10mg／PH7.0
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ トリプトフアンの生成を調整する遺伝情報を
有するプラスミドを含有し、かつ、トリプトフア
ナーゼの欠失したエシエリヒア属に属する微生物
を栄養培地に培養し、Ｌ−トリプトフアンを製造
するに際し、アントラニル酸および／またはイン
ドール並びにグリシンおよびグルコースを添加す
ることを特徴とするＬ−トリプトフアンの製造
法。 ２ アントラニル酸および／またはインドール並
びにグリシンおよびグルコースの添加を該微生物
が増殖したのちに行うことを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の製造法。 ３ 該微生物がアントラニル酸合成酵素に対する
トリプトフアンによるフイードバツク阻害が解除
されたトリプトフアンオペロンをもつプラスミド
を含有する大腸菌である特許請求の範囲第２項記
載の製造法。 ４ 該微生物がエシエリヒアコリーW3110
（Esherichia coli）trpAE1 trpR tnaA
（pSC101−trp・I15）である特許請求の範囲第３
項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1050183A JPS59140891A (ja) | 1983-01-27 | 1983-01-27 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1050183A JPS59140891A (ja) | 1983-01-27 | 1983-01-27 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59140891A JPS59140891A (ja) | 1984-08-13 |
| JPH0158956B2 true JPH0158956B2 (ja) | 1989-12-14 |
Family
ID=11751942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1050183A Granted JPS59140891A (ja) | 1983-01-27 | 1983-01-27 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59140891A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62208284A (ja) * | 1986-03-10 | 1987-09-12 | Sanraku Inc | 新規なプラスミド |
| KR101142885B1 (ko) * | 2003-12-15 | 2012-05-10 | 씨제이제일제당 (주) | 트립토판 생합성 관련 변이유전자를 함유한 대장균 변이주및 이를 이용한 트립토판 제조방법 |
-
1983
- 1983-01-27 JP JP1050183A patent/JPS59140891A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59140891A (ja) | 1984-08-13 |
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