JPS59140891A - L−トリプトフアンの製造法 - Google Patents

L−トリプトフアンの製造法

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JPS59140891A
JPS59140891A JP1050183A JP1050183A JPS59140891A JP S59140891 A JPS59140891 A JP S59140891A JP 1050183 A JP1050183 A JP 1050183A JP 1050183 A JP1050183 A JP 1050183A JP S59140891 A JPS59140891 A JP S59140891A
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glucose
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Shuichi Aiba
合葉 修一
Hiroshi Tsunekawa
博 恒川
Shoji Azuma
東 正二
Takeshi Kuwajima
桑島 威
Rokuro Okamoto
岡本 六郎
Tomoyuki Ishikura
石倉 知之
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Sanraku Inc
Sanraku Ocean Co Ltd
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Sanraku Inc
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、L−)’)ブトファンの製造法に関し、更に
詳しくは、トリプトファンの生成を調整する遺伝情報を
有するプラスミドを含有し7、かつ、トリプト、ファナ
ーゼの欠失したエシェリヒア属に属する微生物を栄養培
地に培養し、’L−)’Jブト7アンを製造するに際し
、アントラニル酸および/またはインドール並びにグリ
シンおよびグリコースを添加することを特徴とするL−
)リグトファンの改良された製造法に関するものである
従来微生物を用いてL −) +Jブトファン(以下、
単に「トリットファン」という)を製造するに際し、栄
養培地中にアントラニル−酸、インドールを添加し、培
養する方法(例えば、特公昭35−12384号公報)
、或いは、L−セリンを含む培地に微生物を培養する(
特開昭55−162771号公報、他)か、または、微
生物菌体の存在下にインドールとL−セリンを生化学的
に反応せしめる方法(例えば特公昭53−1836号公
報、特開昭56−137894号公報等)が知られてい
る・ 本発明者らは、先に、トリプトファンの生成を調整する
遺伝情報を有するプラスミドを含有し、かつ、トリプト
ファナーゼの欠失したエシェリヒア属に属する微生物の
創製手段及びその微生物によるトリットファンの製造方
法を提案した(%開昭57−80398号公報参照)。
この提案の方法によれば、培地にアントラニル酸を添加
し、培養することによシ培養物中のトリシトファンの蓄
積量を飛躍的に高めることに成功しているがアントラニ
ル酸の培地中への添加等によって、インドールの濃度が
高くなるとトリプトファン生産菌の増殖が悪くなシ、さ
らにトリシトファンの生産性を高めるには、培養に長時
間型するなど問題点があった。インドールの蓄積は、ト
リプトファン合成系酵素の多大さに比し、基質であるし
一セリンの供給能力が弱いためである。従って、培地中
にL−セリンを添加することでインドールは消失しトリ
シトファン生産菌の増殖並びにトリプトファンの生産性
は増大するものと考えられるがL−セリンは高価なため
実用的でない。
そこで、かかる課題を解決するために培地組成について
、検討したところ培地中にアントラニル酸の添加に伴な
ってグリシン及びグルコースを添加することが、当該発
酵においてアントラニル酸かう)!77’)ファンへの
転換率を高め、トリシトファンの生産性が増大すること
を見い出し、本発明を完成した。本発明の特徴とすると
ころは、高価なL−セリンに替え、グリシンとグルコー
スを共存させることによシトリシトファンの増収が図れ
るところにある。
本発明に用いることができる微生物は、トリシトファン
の生成を調整する遺伝情報を有するプラスミドを含有す
ることによシ、トリプトファンの生合成系が増強され、
セリン生合成系を併せもち、かつ、トリプトファナーゼ
の欠失したものであれば属を問わないが、トリシトファ
ンの生合成系・が明確になっているエシェリヒア属に属
する菌が好適であシ、さらにアントラニル酸合成酵素に
対するトリプトファンによるフィートノ々ツク阻害が解
除されたトリットファンオペロンをもつプラスミドを有
し、かつ、トリプトファンレプレッサー及びトリプトフ
ァナーゼが欠損した大腸菌をトリシトファンの生産に好
適なものとして挙げることができ、より具体的のものと
しては、本発明者らが先に提案したエシェリヒアコリー
W3110 trpAEltrpRtnaA (psc
 101− trp415)の菌で、1980年10月
28日付でアメリカンタイプカルチャーコレクションに
寄託され、ATCC31743の受託番号が付されたも
のを挙げることができる。
本発明の方法は、上述の微生物を用いてトリプトファン
を製造するには、当該微生物を栄養培地中に培養するそ
れ目体公知の培地組成による公知の方法を実施するに際
し、該培地にアントラニル酸または/およびインドール
を6≦加し、インドールの市加量又はインドールの生成
量を考慮し、グリシン及びグルコースを適当量添加培養
することによって実施することができる。
かかる培養は、培地に培養当初からアントラニル酸また
は/およびインドール並びにグリシン及びグルコースを
添加したものについて行うこともできる□が、これらを
添加しない栄養培地、例えば通常の微生物の培養に用い
られる炭素源、窒素源あ□るいは無機塩、ビタミン等閑
の生育に必要な栄養源を含む培地で培養し、菌体の増殖
を待って、アントラニル酸または/およびインドール並
びにグリシン及びグルコースを添加する方法によっても
行うことができる。この方法による場合は、培養液中に
初発の炭素源として用いたグルコース、澱粉等から生成
したグルコース含量が少いときは、グリシンの添加に併
せて、グルコースの添加は必須のものとなる。
また、増殖菌体を集菌した後、新たにアントラニル酸ま
たは/およびインドール並びにグリシン及びグルコース
な添加調整した培地でさらに培養を続ける方法を採るこ
ともできる。この場合は、アントラ二見酸もしくはイン
ドールまたはグリシンもしくはグルコースの添加量比は
使用する微生物の特性に基づいて最適量が変化するため
臨界的ではないが、通常アントラニル酸またはインドー
ルに対して、約等モル〜10倍モルのグリシン、約等モ
ル〜40倍モルのグルコースを添加して培養を行うこと
が好ましい。
また、培養時間は、上記の培養方法に準じて、異なるが
、培養初期にアントラニル酸等を添加して培養を行う場
合は、約24時間〜約120時間で菌体の増殖後インド
ール等を添加して培養を行う場合は、添加後約2時間〜
24時間培養を行うのがよい。また、培養は振盪または
通気攪拌などの好気条件下に行うのがよく、培養温度は
通常20°〜40°にて行うのがよい。PHは6〜9が
望ましい。
かくして、培養液中に蓄積されるトリプトファンを単離
精製するには、既知の方法、たとえば活性炭やイオン交
換樹脂への吸着、溶出によって容易に行うことが出来る
以下に本発明の方法を実施例をもって詳細に説明する。
−trp−I 15)をテトラサイクリンを101!で
含むL−プox(10011容フラスコに29m1)に
接種し37℃で14時間培養した。この培養液1 ml
をテトラサイクリンをIOrng/Aで含むL−ブロス
(5001J容フラスコに100M)に接種し37℃で
6時間培養した。かくして得られた種培養液全量を1!
の培地Kを含むジャーファーメンタ−(丸菱理科装置研
究所、 MD−250型、27容#)に植菌し、37℃
で18時間培養した。培養中の培地の声は14%アンモ
ニア水によシフに調節し攪拌は500 rpm 、通気
は1v、v、m、で行なりた。培養後に菌体を遠心分離
し、0.9%食塩水で2回洗浄することにより、30g
の湿潤菌体を得た。得られた湿潤菌体0.69を500
mJ容フラスコ内で201117!の培地調に懸濁した
。基質として加えたインドール、L−セリン、グリシン
、グルコースの濃度はそれぞれ0.5 j;l/Z 、
 1 j//A 、 29μ、30Iμである。33℃
で4時間攪拌後に生成したL−トリプトファンを薄層ク
ロマトグラフィーで定量した結果を表1に示す。
表1 洗浄菌体によるインドールからのL−)リプトフ
ァン生産1 0b)  0        0.87 
1002 0       0        0.3
1   363 0       0  0  0.8
8  1004 0            0  0
.29   33a)インドールからのL−)!jグト
ファンへのモル変換率b)○印は培地KWに添加したこ
とを示すなお、前記のL−ブロス、培地K、培地鼎は次
のような組成からなる培地である。
L−ブロス;バクトドリプトン  10.9酵母エキス
      5g NaCl2 Vir 7.0 培地K  : KH2PO42,9 (NH4)2So410.9 Mg504・7H201,9 F4!So4・7H2010呼 MnCt2’4H201011Q 酵母エキス    Ig グルコース     50.9 テトラサイクリン  10m9/I!、  pH7,0
培地KW : KH2PO421I (NH4)2So4   10.9 MgSO4・7H201,9 酵母エキス     19μ pi−17,0実施例2 実施例1で得られた湿潤菌体0,6gを500d容フラ
スコ内で2011117の培地調に懸濁した。基質とし
て加えたアントラニル酸、L−セリン、グリシン、グル
コースの濃度はそれぞれ1.9.1# 。
2.9 、301/Zである。33℃で4時間攪拌後に
生成したL−)リゾトファンを薄層クロマトグラフィー
で定量した結果を表2に示す。
10b)      0 0.36 0.20  37
2 0  0     0 0.48  0.72  
10030     0 0 0.45  0.67 
 1004 0  0       0.02  ND
c)Oa)消費されたアントラニル酸に対するL4リグ
トファンのモル変換率 b)○印は培地KWに添加したことを示すC)検出され
ず を実施例1と同様にL−ブロスで前培養した。付られた
種培養液2 mlを培地KF(500ml容フラスコに
20 ml)に植菌し′33℃で72時間培養した。
KF培地にをまグリシンまたはし一セリンを添加したも
のと、対照として両者をともに加えないものを用いた。
また、培養20時間目にグリシン咬たはL−セリンを2
 g、/Aで添加する試験も行なった。
72時間後に生成されたL −) IJブト7アン、並
びにインドールを薄層クロマトグラフィーで定量した結
果を表3に示す。
表3  フラスコ培養におけるグリシン添加効果熱  
             0.10     5.2
a) グリシン    1  初 発     ND    
  7.2グリシン    2  初発     ND
     7.5グリシン    3  初 発   
  ND      6.3グリシン    2 20
時間目   ND      7.OL−セリン  1
 初発   0.05    5.6L−セリン  2
 初発   0.15    5.5L−セリン  3
 初発   0.20    5.4L−セリン   
2 20時間目  0.20    5.4a)検出さ
れず なお、前記の培地KFは次のような組成からなる培地で
ある。
培地KF :KH2PO4,2,9 (NH)So      10.P  2 4 Mg504・7H201,9 FeS0  ・7HO1omp     2 MnCz2’4H20−101nq カザミノ酸     8I 酵母エキス     1g アントラニル酸    4g グルコース      50.!i+ Ca COs (別殺菌)  30I

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 トリットファンの生成を調整する遺伝情報を有する
    シラスミドを含有し、かつ、トリプトファナーゼの欠失
    したエシェリヒア属に属する微生物を栄養培地に培養し
    、L −) IJグトファンを製造するに際し、アント
    ラニル酸および/またはインドール兼ひにグリシンおよ
    びグルコースを添加することを特徴とするL−)リプト
    ファンの製造法0 2、 アントラニル酸および/またはインドールE11
    2びにグリシンおよびグルコースの添加を該微生物が増
    殖したのちに行うことを特徴とする特許請求の範囲第1
    項記載の製造法。 3、該微生物がアントラニル酸合成酵素に対するトリプ
    トファンによるフィードバック阻害が解除されたトリプ
    トファンオイロンをも(つシラスミドを含有する大腸菌
    である特許請求の範囲WJ2項記載の製造法。 4、該微生物がエシェリヒアコリーW31Δ0(Esh
    erichia、 col−i) trpAEl tr
    pRtnaA (psc 101− trp・115)
    である特許請求の範囲第3項記載の製造法。
JP1050183A 1983-01-27 1983-01-27 L−トリプトフアンの製造法 Granted JPS59140891A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62208284A (ja) * 1986-03-10 1987-09-12 Sanraku Inc 新規なプラスミド
JP2007515168A (ja) * 2003-12-15 2007-06-14 シージェイ コープ. トリプトファン生合成に関連する変異遺伝子を含有する大腸菌変異体および同変異体を使用するトリプトファンの製造方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPS62208284A (ja) * 1986-03-10 1987-09-12 Sanraku Inc 新規なプラスミド
JP2007515168A (ja) * 2003-12-15 2007-06-14 シージェイ コープ. トリプトファン生合成に関連する変異遺伝子を含有する大腸菌変異体および同変異体を使用するトリプトファンの製造方法

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