JPS63254990A - 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は発酵法によるＬ−スレオニンの製造法に関する
ものである。

〈従来の技術〉 プロビデンシア属に属する微生物を用いる発酵法による
Ｌ−スレオニンの製造法としては、メチオニン代謝拮抗
物質に耐性を有し、かつ、Ｌ−スレオニン生産性を有す
る微生物を用いる方法（特開昭６１−２１６６９８号公
報）や、生育のためにＬ−ロイシンを必要とし、かつＬ
−ｉレオニン生産能を有する微生物を用いる方法（特開
昭６１−２６０８９１号公報）が知られている。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかし、これらの方法によるＬ−スレオニンの生成蓄積
濃度、または、糖などの原料からのし一スレ・オニン生
成収率は十分に満足できるものではなかっな。

く問題点を解決するための手段および作用〉本発明者ら
は、さらに生産性の高いし−スレオニンの製造方法につ
いて鋭意研究した結果、プロビデンシア属に属しＬ〜ス
レオニン生産能を有する微生物に、ピルビン酸デヒドロ
ゲナーゼ阻害剤に対する耐性を付与することにより、し
−スレオニン生産性が向上することを見出し本発明に到
達した。

すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属し、ピルビ
ン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対する耐性を有し、かつ
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物を培養して、培養
液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培養液よ
りＬ−スレオニンを採取することを特徴とする発酵法に
よるＬ−スレオニンの製造法である。

ここで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤とは、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼによるピルビン酸からアセチル
ＣｏＡを生成する反応を阻害し、その結果微生物の生育
を抑制する物質のことである。

ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤としては、例えばフ
ルオロピルビン酸、ブロモピルビン酸、グリオキシル酸
、チアミンアナローグなどが挙げられ、好ましくはチア
ミンアナローグが用いられる。好ましく使用できるチア
ミンアナローグとしてはたとえばオキシチアミン、デア
ミノチアミン、チアミンチアゾール、とリチアミンなど
が挙げられ、このうちオキシチアミンが特に好ましく用
いられる。

本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属しく
バージ−のマニュアル・オブ・システマティク・バクテ
リオロジー第−巻（１９８４）、第４９５〜４９６頁に
従う）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対して耐
性を有する微生物である。

かかる性質を有していれば、池の栄養要求性、他の薬剤
抵抗性を持つものでも本発明の範囲に含まれる。特に、
上記ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤耐性に加え１、
Ｌ−イソロイシンまたは、Ｌ−ロイシンに対する栄養要
求性ないしｌ　ｅ　ａｋｙ型要求性、α−アミノ−β−
ヒドロキシ吉草酸なとスレオニン代謝拮抗物質に対する
耐性およびエチオニンなどメチオニン代謝拮抗物質に対
する耐性は、Ｌ−スレオニン生成能に有効に作用するの
で、これらのいくつかの特性ないしはすべての特性をあ
わせ持つ微生物がより好ましく用いられる。

本発明で用いられる変異株の代表的なものとしては、例
えば、プロビデンシア・レトゲリＯＴＲ２８−７０（Ｆ
ＥＲＭ　　Ｐ−９１９３）が挙げられる。

この変異株は、プロビデンシア・レトゲリＴＰ６−２８
　（α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−エチ
オニン耐性、チアイソロイシン耐性、し−イソロイシン
要求性、Ｌ−ロイシン要求性）を親株として、通常の変
異処理方法によって得られたもので、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼ阻害剤のうち、チアミンアナローグから選ば
れたオキシチアミンに耐性を有する変異株である。

変異株の誘導は、通常の変異処理法によって行うことが
できる。

すなわち、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に耐性を
有する変異株を得るには親株を紫外線照射するか、ある
いは、変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ｍ：トロ
ーＮ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸な
ど）で処理した後、親株が十分生育できないような濃度
のピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を含む固体培地で
親株より有意に生育可能な菌株を取得すればよい。

本発明におけるピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤耐性
株とは、その親株より強い耐性を有する菌株のことであ
り、好ましくは、親株の２４時間後の相対生育度が４０
％以下になるような濃度のピルビン酸デヒドロゲナーゼ
阻害剤を含む培地で培養した場合の相対生育度か５０％
以上を示すようなものをいう。

例えば、オキシチアミン耐性株の場合は、オキシチアミ
ン１０ｍＭとなるように添加した培地で培養した時の２
４時間後の相対生育度が、無添加の場合の５０％以上の
ものをオキシチアミン百（性株という。

ここで、相対生育度は培養液の６６０　ｎｍにおける吸
光度を測定し、各菌株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻
害剤を添加していない培養液の吸光度を１００％として
表わした場合の相対吸光度で示す。

本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその曲の有機
微量成分を含有する通常の培地である。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、でん粉お
よびセルロースの加水分解物、糖蜜などの糖類、フマー
ル酸、クエン酸、コハク酸などのごとき有ｎ酸、グリセ
ロールのごときアルコール頚などを２〜１５％、窒素源
として、酢酸アンモニウムのごとき有機アンモニウム塩
、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウムのごときｇ（３アンモニウム
塩、アンモニアガス、アニモニア水、尿素などを０．５
〜４．０％、有機微量栄養素としては、Ｌ−インロイシ
ン、Ｌ−ロイシンなどの被要求物質が０．００１〜０．
４％、または必要に応じてコーンステイープリカー、ペ
プトン、酵母エキスなど０〜４％をそれぞれ適当量含有
する培地が好適に用いられる。これらの他に、リン酸カ
リウム、硫酸マグネシウム、硫酸第１鉄７水相物、硫酸
マンガン４−６水和物などが微量成分として少量添加さ
れる。

培養は、好気的条件で行なう。培養の間、培地のｐＨは
５から９に、温度は２４〜３７°Ｃに調節し、４８〜１
２０時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得
られる。

培！ｅ液よりＬ−スレオニンを採取するには、通常の方
法を用いることができる。例えば、菌体を除去した培養
　液をｐＨ２に塩酸で調製したのち、強酸性カチオンイ
オン交換樹脂に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶
出し、脱アンモニア後、濃縮する。これにアルコールを
添加し、冷却保存下で生成した結晶を集め、Ｌ−スレオ
ニンを得ることができる。

〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例Ｉ Ａ、（オキシチアミン耐性株の分離） プロビデンシア・レトゲリＴＰ６−２８（α−アミノ−
β−ｂドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−エチオニン耐性、チア
イソロイシン耐性、Ｌ−インロイシン要求性ないしはＬ
ｅａｋｙ型要求性、Ｌ−ロイシン要求性）の菌体に常法
によりＮ−メチル−Ｎ−一二トローＮ−二トロングアニ
ジン処理（３００μｇ　／　ｍｌ、３０°Ｃで２０分）
したのち、この細胞をオキシチアミン−ＨＣ１３０ｍＭ
、Ｌ−ロイシン５０　ｒｕｔ　／　ｆｌ添加した寒天培
地（コハク酸ナトリウム０．８％、硫安０．１％、リン
酸第１カリウム０．３％、リン酸第２カリウム０．７％
、硫酸マグネシウム７水和物０．０１％を含む完全合成
培地）に塗布した６次に３０℃にて、５〜７日培養し、
生じた大きなコロニーを釣菌分離して、オキシチアミン
耐性株グロビデンシア・レトゲリ０ＴＲ２８−７０を取
得した。

Ｂ、（オキシチアミン耐性株の耐性度）下記第１表に示
す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３０℃で６時間振
どう培養し、生育した菌体を集菌し生理食塩水でよく洗
浄した。この菌体懸濁液を、オキシチアミン０．１．５
．１０ｍＭの濃度でそれぞれ含む最少培地（培地組成：
コハク酸ナトリウム０．８％、硫安０．１％、リン酸第
１カリウム０゜３％、リン酸第２カリウム０．７％、硫
酸マグネシウム７水和物０．０１％、Ｌ−インロイシン
０．００５％、Ｌ−ｏイレン０．００５％）５ｍｌに植
菌して、３０’Ｃにて１４時間培養し、各菌株の生育度
を調べた。その結果は、第１表に示すとおりである。た
だし、オキシチアミンは、市販のもの（シグマ社製）を
用いた。

本発明方法で使用するオキシチアミン耐性株プロビデン
シア・レトゲリ０ＴＲ２８−７０では、親株のプロビデ
ンシア・レトゲリＴＰ６−２８と比較して、オキシチア
ミンによって生育が阻害されず、オキシチアミンに対す
る耐性を獲得していることが明らかである。

実線例２ （し−スレオニン生産菌の培養およびＬ−スレオニンの
生産） 第２表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３０″
Ｃ１１６時間振とうして前培養したのち、１１５’Ｃ１
１０分間オートクレーブで滅菌した下記組成の発酵培地
４０の１を含むＩＬ容三角フラスコに接種し、３０°Ｃ
１１５０ｒｐＩ、振幅３■の条件下で７４時間培養した
。

発　酵　　用　　培　　地 グルコース（別滅菌）　　　　　８　％（ＮＨ＜　）２
３０４　　　　　　　３　　％Ｋｌ（□ＰＯ２０，１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０４％ Ｆｅ　　　　　　　　　　　　　　２ｐｌｕｌ１Ｍ　ｎ
　　　　　　　　　　　　　　２　　ｐｌ）Ｉ’し一イ
ソロイシン　　　０．００５　％Ｌ−ロイシン　　　　
　　０．０６　％ＣａＣ０，（別滅菌）　　　　　４　
％ｐＨ７（に０１１で中和） 培養終了後、培養液から菌体、炭酸カルシウムを除去し
、その　液中のＬ−スレオニンを自動アミノ酸分析計（
日本電子ＪＬＣ，２００Ａ）で定量したところ、第２表
に示す結果を得た。

スレオニン生成敗率は、消費グルコースに対する生成ス
レオニン重量収率で表わした。

本発明例のグロビデンシア・レトゲリ０ＴＲ２８−７０
は、親株のグロビデンシア・レトゲリＴＰ６−２８と比
較して、蓄積量、生成収率とも、閉著に高いＬ−スレオ
ニンを生産した。

実施例３ 第３表に示す各菌株を、液体ブイヨン培地で３０℃、１
６時間、振どう培養し、これを実施例２の発酵用培地の
うち、（ＮＨ４）２　ＳＯ４を０．５％、グルコースを
４．０％とした以外は同様の培地８００ｍ１を分注した
ガラス製小型ジャーファーメンタ−へ、接種サイズ１０
％となるように接種した。３０°Ｃ１８００ｒｐｎ、通
気量Ｉ　ＶＶＩＩにて、通気撹拌培養を開始した。ＰＨ
調節および窒素源の供給は、２５％アンモニア水で行な
い、ｐＨは、６．５〜８．０に維持した。グルコース、
ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，０１Ｌ−ロイシンお
よびＬ−インロイシンをｌ！ｙｒ続的に添加しながら、
６４時間培養したところ第３表に示すような結果を得た
。

プロビデンシア・レトゲリ０ＴＲ２８−７０の培養液よ
り菌体を除き、そのＰ液５００ｍ１を強力チオン交換樹
脂ダイヤイオン５Ｋ−ＩＢ（Ｈ型）のカラムを通した。

カラムを水洗後、２Ｎアンモニア水でカラムの吸着成分
を溶出し、脱色後減圧濃縮した。

これにエタノールを加え、冷却し、生成した結晶を集め
て乾燥した結果、純度９６％以上のＬ−スレオニン３２
．４ｇを得た。

〈発明の効果〉 本発明法により、高い収率および高い蓄積濃度でＬ−ス
レオニン生成が可能となり、より安価なＬ−スレオニン
の生産が可能となる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロビデンシア（Ｐｒｉｖｉｄｅｎｃｉａ）属に
   属し、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤に対する耐性
   を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微生物を培
   養して、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、
   前記培養液よりＬ−スレオニンを採取することを特徴と
   する発酵法によるＬ−スレオニンの製造法。
2. （２）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤が、チアミン
   アナローグである特許請求の範囲第１項記載の発酵法に
   よるＬ−スレオニンの製造法。
3. （３）チアミンアナローグがオキシチアミンである特許
   請求の範囲第２項記載の発酵法によるＬ−スレオニンの
   製造法。