JPS6374487A - 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は発酵法によるＬ−スレオニンの製造法に関する
ものである。

［従来の技術］ プロビデンシア属に属する微生物を用いる発酵法による
Ｌ−スレオニンの製造法としては、メチオニン代謝拮抗
物質に耐性を有し、かつスレオニン生産性を有する微生
物を用いる方法（特開昭６０−１８０５９７号公報）が
知られている。

［発明が解決しようとする問題点］ しかし、この方法によるＬ−スレオニンの生成蓄積濃度
、または、糖などの原料からの１−スレオニン生成収率
は十分に満足できるものではなかった。

［問題点を解決するための手段および作用］本発明者ら
は、ざらに生産性の高いＬ−スレオニンの製造方法につ
いて鋭意研究した結果、プロビデンシア属に属しＬ−ス
レオニン生産能を有する微生物にイソロイシン代謝拮抗
物質に対する耐性およびアスパラギン酸代謝拮抗物質に
対する耐性を付与することにより、Ｌ−スレオニン生産
性が向上すること、または、副生アミノ酸が減少するこ
とを見出し本発明に到達した。

すなわち、本発明は、プロビデンシア属に属しイソロイ
シン代謝拮抗物質に対する耐性およびアスパラギン酸代
謝拮抗物質に対する耐性を有し、かつＬ−スレオニン生
産能を有する微生物を培養して培養液中に１−スレオニ
ンを蓄積せしめ、該培養液よりＬ−スレオニンを採取す
ることを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造
法である。

ここで、イソロイシン代謝拮抗物質とは、プロビデンシ
ア属に属する微生物の１）生育を阻害し、その生育阻害
が１−イソロイシンの添加により回復する物質、または
、２）Ｌ−イソロイシン生合成系に関与する酵素の抑制
作用および、阻害作用を示す物質のことである。イソロ
イシン代謝拮抗物質としては、例えばチアイソロイシン
、０−メチルスレオニン、イソロイシンヒドロキサメー
ト等が挙げられる。

また、アスパラギン酸代謝゛拮抗物質とは、プロビデン
シア属に属する微生物の１）生育を阻害し、その生育阻
害がＬ−アスパラギン酸の添加により回復する物質また
は２＞１−アスパラギン酸生合成系に関与する酵素の抑
制作用および阻害作用を示し、その抑制あるいは阻害が
Ｌ−アスパラギン酸の添加により回復する物質のことで
ある。

アスパラギン酸代謝拮抗物質としては、例えばアスパラ
ギン酸ヒドロキサメート、α−メチルアスパラギン酸、
β−メチルアスパラギン酸、システィンスルフィン酸、
ジフルオロコハク酸、ハダシジン等が挙げられる。

本発明で用いられる微生物はプロビデンシア属に属しく
バージ−のマニュアル◆オブ・システマティク・バクテ
リオロジー第一！（１９８４）、第４９５〜４９６真に
従う）、インロイシン代謝拮抗物質ならびにアスパラギ
ン酸代謝拮抗物質に耐性を有する微生物である。かかる
性質を有していれば、伯の栄養要求性、他の薬剤抵抗性
を持つもので本発明の範囲に含まれる。

また、Ｌ−イソロイシン要求性、Ｌ−ロイシン要求性、
α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等スレオニン代謝拮
抗物質に対する耐性およびエチオニン等メチオニン代謝
拮抗物質に対する耐性は、し−スレオニン生成能に有効
に作用するので、これらのいくつかの特性ないしはすべ
ての特性をあわせ持つ微生物が親株としてより好ましく
用いられる。また、これらの特性は通常の変異誘導操作
により付与することが可能である。ここでいう栄養要求
性とは広義の意味であり、不完全欠失型（いわゆるＩ　
ｅａｋｙ型）も含むものである。さらに、その要求物質
の生合成前駆物質で要求性が満足される場合も含′むも
のである。

本発明で用いられる変異株の代表なものとしては例えば
以下のものがある。プロビデンシア・レトゲリ　ＡＸＲ
２Ｇ−１０（ＦＥＲＭＢＰ−１’１３８）、プロビデン
シア・レトゲリＴＰ７−５５（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１１
３７）。

これらの変異株は、それぞれ、プロビデンシア・レトゲ
リ　ＴＰ３−１０５　（α−アミノ−β−ヒドロキシ古
草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性、し−エチオニン耐
性、Ｌ−ロイシン要求性）を親株として、通常の変異処
理方法によって得られたもので、チアイソロイシンおよ
びアスパラギン酸ヒドロキサメートに耐性を有する変異
株である。

変異株の誘導は、親株を紫外線照射するか、あるいは、
変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−
ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸等）で処
理した後、親株が生育できないような濃度のイソロイシ
ン代謝拮抗物質を含む固体培地で生育可能な菌株を取得
すればよい。さらに、得られた変異株を変異処理し、親
株が生育できないような濃度のアスパラギン酸代謝拮抗
物質を含む固体培地で生育可能な菌株を取得すればよい
。　また、先に、アスパラギン酸代謝拮抗物質に対する
耐性株を分離したのちに、イソロイシン代謝拮抗物質に
対する耐性株を分離することもでき、この変異株も本発
明において、用いることができる。

本発明におけるイソロイシン代謝拮抗物質耐性株とは、
その親株より強い耐性を有する菌株のことであり、好ま
しくは、親株の２４時間後の相対生育度が４０％以下に
なるような濃度のイソロイシン代謝拮抗物質を含む培地
で培養した場合の相対生育度が５０％以上を示すような
ものを言う。

例えば、チアイソロイシン耐性株の場合は、チアイソロ
イシン５ｍＭとなるように添加した培地で培養した時の
２４時間後の生育度が、無添加の場合の５０％以上のも
のをチアイソロイシン耐性株という。

また、アスパラギン酸代謝拮抗物質耐性変異株とは親株
よりアスパラギン酸代謝拮抗物質に強い耐性を有する株
のことであり、好ましくは親株の相対生育度が３０％以
下を示すアスパラギン酸代謝拮抗物質の濃度範囲におい
て６０％以上の相対生育度を示す変異株のことでおる。

ここで、相対生育度は培養液の６６０ｎｍにおける吸光
度を測定し、各菌株のイソロイシン代謝拮抗物質、また
、アスパラギン酸代謝拮抗物質を添加していない培養液
の吸光度を１００％として表わした場合の相対吸光度で
示す。本発明において用いる菌株とその親株のデアイソ
ロイシンおよびＤＬ−アスパラギン酸ヒドロキサメート
に対する耐性を検定した結果を実施例２に示す。

本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地は、炭素源
、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機
微量成分を含有する通常の培地である。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、でん粉お
よびセルロースの加水分解物、糖蜜等の糖類、フマール
酸、クエン酸、コハク酸等の如き有機酸、グリセロール
の如きアルコール類等を２〜１５％、窒素源として、酢
酸アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸
アンモニウムの如き無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニウム、尿素等を０゜５〜４．０％、有機微
量栄養素としては、Ｌ−イソロイシン等の被要求物質が
０．００１〜０゜４％、または必要に応じてコーンステ
イープリカー、ペプトン、酵母エキス等Ｏ〜４％をそれ
ぞれ適当量含有する培地が好適に用いられる。

これらの仙リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、５Ｍ酸
第１鉄７水和物、硫酸マンガン４−６水和物等が微量成
分として少量添加される。

培養は、好気的条件で行なう。培養の間、培地のｐＩ（
は５から９に、温度は２４〜３７℃に調節し、４８〜１
２０時間振とうまたは通気培養すれば好ましい結果が得
られる。

培養液よりＬ−スレオニンを採取するには、通常の方法
を用いることができる。例えば、菌体を除去した培養ン
戸液を１１２に塩酸で調製したのち、強酸性カチオンイ
オン交換樹脂に通液後、希アンモニア水で吸着成分を溶
出し、脱アンモニア後、濃縮する。これにアルコールを
添加し、冷却保存下で生成した結晶を集め、Ｌ−スレオ
ニンを得ることができる。

〈実施例〉 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１ Ａ、（チアイソロイシン耐性株の分離）プロビデンシア
・レトゲリＴＰ３−１０５（α−アミノ−β−ハイドロ
キシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性ないしは　Ｌ
ｅａｋｙ型要求性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−ａイシン
要求性）あるいは、プロどデンシア・レトゲリ　ＡＨＸ
Ｒ７６６５（α−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性
、Ｌ−イソロイシン要求性ないしは、Ｌｅａｋｙ型要求
性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ−ロイシン要求性、ＤＬ−
アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性）の菌体に、常法
によりＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニ
ジン処理（３００ｔｌｙ／ｄ、３０℃で２０分）したの
ち、この細胞を、Ｄ。

Ｌ−チアイソロイシン１．５’Ｊ／１、Ｌ−ロイシン２
　ｇ／ｊ２、Ｌ−バリン２ｇ／（添加した寒天培地（グ
ルコース０．５％、硫安０．１％、リン酸第１カリウム
０．３％、リン酸第２カリウム０．７％、硫酸マグネシ
ウム７水和物０．０１％を含む完全合成培地）に塗布し
た。次に３０’Ｃにて、５〜７日培養し、生じた大きな
コロニーを釣菌分離して、チアイソロイシン耐性株（親
株をプロビデンシア・レトゲリ　ＴＰ３−１０５とした
ものからはプロビデンシア・レトゲリ　ＴＰ６−２８、
親株をプロビデンシア・レトゲリ　ＡＩ−ＩＸＲ７６６
５としたものからはプロビデンシア・レトゲリＴＰ７−
５５＞を取得した。

Ｂ、（ＤＬ−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性株の
分離） プロビデンシア・レトゲリ　ＴＰ６−２８（α−アミノ
−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、１−イソロイシン要求性
ないしはＬｅａｋｙ型要求性、Ｌ−エチオニン耐性、Ｌ
−ロイシン要求性、チアイソロイシン耐性）あるいはプ
ロビデンシア・レトゲリ　ＴＰ３−１０５（α−アミノ
−β−ヒドロキシ吉草酸耐性、Ｌ−イソロイシン要求性
ないしはＬｅａｋｙ型要求性、Ｌ−エチオニン耐性、し
−ロイシン要求性）の菌体に常法によりＮ−メチル−Ｎ
−一二トローＮ−二トロソグアニジン処理（３００μｇ
／ｄ、３０℃で１０分）した後、この細胞をＤＬ−アス
パラギン酸ヒドロキサメート２　ｇ／Ｊ添加した寒天培
地（グリコース０．５％、硫安０．１％、リン酸第１カ
リウム０．３％、リン酸第２カリウム０．７％、硫酸マ
グネシウム７水和物０．０１％、Ｌ−イソロイシン０．
００５％、Ｌ−ロイシン０゜００５％を含む最少培地）
に塗布した。次に３０℃にて６〜８日培養し、生じた大
きなコロニーを釣菌分離して、Ｄし一アスパラギン酸ヒ
ドロキサメート耐性株（親株をプロビデンシア・レトゲ
リ　ＴＰ６−２８としたものからはプロビデンシア・レ
トゲリ　ＡＸＲ２Ｇ−１０，親株をプロビデンシア・レ
トゲリ　ＴＰ３−１０５としたものからはＡＨＸＲ７６
６５）を取得した。

最終的に、チアイソロイシン耐性およびＤＬ−アスパラ
ギン酸ヒドロキサメート耐性をもつ、プロビデンシア・
レトゲリ　ＡＸＲ２Ｇ−１０およびプロビデンシア・−
レトゲリ　ＴＰ７−５５を取得した。

実施例２ Ａ、（チアイソロイシン耐性株の耐性度）下記第１表に
示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３０℃で１６時
間振どう培養し、生育した菌体を集菌し生理食塩水でよ
く洗浄した。この菌体懸濁液を、デアイソロイシン０，
２．５．５．０．１０７Ｆｌ１１．Ｍの濃度で含む最少
培地（培地組成ニゲルコース０．５％、硫安０．１％、
リン酸第１カリウム０．３％、リン酸第２カリウム０゜
７％、硫酸マグネシウム７水和物０．０１％、Ｌ−イソ
ロイシン０．００１％、Ｌ−ロイシン０．０５％、Ｌ−
バリン０．０５％）５ｄに植菌して、３０°Ｃにて２４
時間培養し、各菌株の生育度を調べた。その結果は、第
１表に示すとおりである。ただし、チアイソロイシンは
、市販のもの（シグマ社製）を用いた。

本発明方法で使用するチアイソロイシン耐性株（ＡＸＲ
２Ｇ−１０ｅよ（Ｆ　　ＴＰ７−５５＞では、親株のプ
ロビデンシア・レトゲリ　ＴＰ３−１０５と比較して、
チアイソロイシンによって生育が阻害されず、チアイソ
ロイシンに対する耐性を獲得していることが明らかであ
る。

第　　１　　表 （注）培養液の６６０％ｍにおける吸光度を測定し、各
菌株のチアイソロイシンを添加していない培養液の吸光
度を１００％として表わした。

Ｂ、（ＤＬ−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性変異
株の耐性度〉 下記第２表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を用いて３
０℃で１６時間振とう培養し、生育した菌体を集菌し生
理食塩水で洗浄した。この菌体懸濁液をＤＬ−アスパラ
ギン酸ヒドロキサメート０，０．２５．０゜５．１．０
，２．０ｇ／ｌの濃度で含む最少培地（グルコース０．
５％、硫安０．１％、リン酸第１カリウム０．３％、リ
ン酸第２カリウム０．７％、硫酸マグネシウム７水和物
０．０１％、Ｌ−イソロイシン０゜００５％、Ｌ−ロイ
シン０．００５％）５ｄに植菌して、３０℃にて培養し
各菌株の２４時間後の生育度を調べた。その結果は第２
表に示すとおりである。本発明方法で使用するＤＬ−ア
スパラギン酸ヒドロキサメートに耐性な変異株（プロビ
デンシア・レトゲリＡＸＲ２Ｇ−１０およびＴＰ７−５
５では、親株のプロビデンシア・レトゲリ　ＴＰ３−１
０５と比較して、高濃度のＤし一アスパラギン酸ヒドロ
キサメートによって生育が阻害されず、強いＤＬ−アス
パラギン酸ヒドロキサメート耐性を獲得していることを
示している。

第　　２　　表 □□了］■ （注）培養液の６６０％ｍにおける吸光度を測定し、各
菌株のＤＬ−アスパラギン酸ヒドロキサメートを添加し
ていない培養液の吸光度を１００％として表わした。

寅施例３ （Ｌ−レスニオン生産菌の培養およびＬ−スレオニンの
生産） 第３表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培地で３０
℃、１６時間振とうして前培養したのち、１１５℃、１
０分間オートクレーブで滅菌した下記組成の発酵培地４
０ｄを含む１１容三角フラスコに接種し、３０℃、１５
０　ｒ　ｐｍ、振幅３ｃｍの条件下で７４時間培養した
。

発酵用培地 グルコース（別滅菌）　　　　　８　％（ＮＨ４）　２
８０４　　　　　　３　　％Ｋ１−１２ＰＯ４０，１％ ＭｇＳＯ４・７１−１２０　　０．０４　　％Ｆｅ”　
　　　　　　　　　　　　２１）ｌ）ｍＭｎ＋＋２９Ｄ
ｍ Ｌ−イソロイシン　　　０．００５　　％Ｌ−ロイシン
　　　　　　０．０６　　％ＣａＣ０３（別滅菌）　　
　　　４　％ｐ）−１７（にＯＨで中和） 培養終了後、培養液から菌体、炭酸カルシウムを除去し
、その炉液中のＬ−スレオニンを自動アミノ酸分析計（
日本電子ＪＬＣ，２０ＯＡ＞で定量したところ、第３表
に示す結果を得た。

第　　３　　表 スレオニン生成収率は、消費グルコースに対する生成ス
レオニン重量収率で表わした。

本発明例のプロビデンシア・レトゲリ　ＡＸＲ２Ｇ−１
０，ＴＰ７−５５は、それぞれその親株のプロビデンシ
ア・レトゲリＴＰ３−１０５と比較して、蓄積量、生成
数率とも、顕著に高いＬ−スレオニンを生産した。

実施例４ 第４表に示す各菌株を、液体ブイヨン培地で３０℃、１
６時間、振どう培養し、これを実施例３の発酵用培地の
うち、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５％、グルコースを４
．０％とした以外は同様の培地８００ｍを分注したガラ
ス製小型ジャーファーメンタ−へ、接種サイズ１０％と
なるように接種した。３０℃、ａｏｏｒｐｍ。

通気量１ｖｖｍにて、通気攪拌培養を開始した。

１）Ｈ調節および窒素源の供給は、２５％アンモニア水
で行ない、ｐＨは、６．５〜８．０に維持した。グルコ
ース、ＫＨ２ＰＯ４、ｖｃｈｓｏ−４・７Ｈ２０、Ｌ−
ロイシンおよびＬ−イソロイシンを断続的に添加しなが
ら、６４時間培養したところ第４表に示すような結果を
得た。

プロビデンシア・レトゲリＴＰ７−５５の培養液より菌
体を除き、そのン戸液５００ｄを強力チオン交換樹脂ダ
イヤイオン５Ｋ−ＩＢ　（Ｈ型）のカラムを通した。カ
ラムを水洗後、２Ｎアンモニア水でカラムの吸着成分を
溶出し、脱色後減圧濃縮した。

これにエタノールを加え、冷却し、生成した結晶を集め
て乾燥した結果、純度９６％以上のＬ−スレオニン３１
．９９が得られ、安価なＬ−スレオニンの生産が可能と
なる。

また、本発明法により、バリンの副生を抑制し、高純度
のＬ−スレオニン生産が可能となり、精製工程を簡略化
でき、工業的実用化が有利となる。

特許出願大東し株式会社

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロビデンシア属に属し、イソロイシン代謝拮抗
   物質に対する耐性およびアスパラギン酸代謝拮抗物質に
   対する耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する
   微生物を培養して培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積
   せしめ、前記培養液よりＬ−スレオニンを採取すること
   を特徴とする発酵法によるＬ−スレオニンの製造法。
2. （２）イソロイシン代謝拮抗物質がチアイソロイシンで
   ある特許請求の範囲第１項記載の発酵法によるＬ−スレ
   オニンの製造法。
3. （３）アスパラギン酸代謝拮抗物質がアスパラギン酸ヒ
   ドロキサメートである特許請求の範囲第１項記載の発酵
   法によるＬ−スレオニンの製造法。
4. （４）微生物がプロビデンシア属レトゲリ種に属するも
   のである特許請求の範囲第１項記載の発酵法によるＬ−
   スレオニンの製造法。