JPH0195778A - 耐熱性プロテアーゼ及びその製法 - Google Patents
耐熱性プロテアーゼ及びその製法Info
- Publication number
- JPH0195778A JPH0195778A JP62253749A JP25374987A JPH0195778A JP H0195778 A JPH0195778 A JP H0195778A JP 62253749 A JP62253749 A JP 62253749A JP 25374987 A JP25374987 A JP 25374987A JP H0195778 A JPH0195778 A JP H0195778A
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- Japan
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- protease
- minutes
- heat
- activity
- bacillus stearothermophilus
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
・ − ６ 一
「産業上の利用分野］
本発明は、耐熱性プロテアーゼ及びその製法に関する。
さらに詳しくは、中等度好熱菌バチルス・ステアロサー
モフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈＮｕｓ ）の培養液から抽出して得られる耐熱性
の高くかつ比活性の高い、耐熱性プロテアーゼ（以下、
プロテアーゼＴ ＯＳ ０１１−１と記す）及びその製
法に関する。
モフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈＮｕｓ ）の培養液から抽出して得られる耐熱性
の高くかつ比活性の高い、耐熱性プロテアーゼ（以下、
プロテアーゼＴ ＯＳ ０１１−１と記す）及びその製
法に関する。
［従来の技術］
従来、耐熱性プロテアーゼとしては、中等度好熱菌バチ
ルス・サーモプロテオリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の生産す
るサーモライシンが一般的でまた工業的にも広く利用さ
れている。このサーモライシンは熱に対してのみならず
、有機溶媒、尿素などにも非常に安定である。そのため
研究用試薬としてのみでなく、各種食品加工用、洗剤添
加用など広い分野にわたってかつ力価を減することなく
長時間の使用に耐える。
ルス・サーモプロテオリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）の生産す
るサーモライシンが一般的でまた工業的にも広く利用さ
れている。このサーモライシンは熱に対してのみならず
、有機溶媒、尿素などにも非常に安定である。そのため
研究用試薬としてのみでなく、各種食品加工用、洗剤添
加用など広い分野にわたってかつ力価を減することなく
長時間の使用に耐える。
［発明か解決しようとする問題点］
このようにサーモライシンは耐熱性を有するすぐれた蛋
白質分解酵素であるが、この酵素よりさらに耐熱性が高
く、かつ比活性の高い酵素が存在すれば、使用範囲はさ
らに広がりまた少量の使用でより高い酵素反応を示す。
白質分解酵素であるが、この酵素よりさらに耐熱性が高
く、かつ比活性の高い酵素が存在すれば、使用範囲はさ
らに広がりまた少量の使用でより高い酵素反応を示す。
本発明の目的はこのような酵素を提供することにある。
［問題点を解決するための手段及び作用］木発明者らは
以上のような点に着目し、サーモライシンより耐熱性が
高くかつ比活性の高いプロテアーゼについて検討した結
果、サーモライシン類似の構造を有し、さらに耐熱性か
高くかつ比活性の上昇したプロテアーゼを見出し、本発
明に至った。
以上のような点に着目し、サーモライシンより耐熱性が
高くかつ比活性の高いプロテアーゼについて検討した結
果、サーモライシン類似の構造を有し、さらに耐熱性か
高くかつ比活性の上昇したプロテアーゼを見出し、本発
明に至った。
本発明は、このようなプロテアーゼ及びその好適な製造
方法に関するものである。
方法に関するものである。
すなわち本発明は、下記の特徴を有するプロテアーゼで
ある。
ある。
分 子 量： ３４４００ （ゲルろ適法、 ５ＤＳ
−ＰＡＧＥ）３４１７６ （アミノ酸組成） ｐＨ安定性＝３７°Ｃ２３０分の処理後ｐＨ［ｉ〜９の
範囲で９０％以上の活性を有し安定で ある。
−ＰＡＧＥ）３４１７６ （アミノ酸組成） ｐＨ安定性＝３７°Ｃ２３０分の処理後ｐＨ［ｉ〜９の
範囲で９０％以上の活性を有し安定で ある。
至適ｐ Ｈ： ６．５〜６．５ （Ｈ’Ｃ，２ｍ１ｃ
ａ２＋存在下） 至適温度＝７５〜８０℃（２ｍ１ｃａ２＋存在下でカゼ
インを基質とし、２０分間反応した とき） 温度安定性＝８０℃、３０分間の熱処理後の残存活性；
１００％ ９０℃、３０分間の熱処理後の残存活 性：約４５％ （１０ＩｎＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、 ２ｍＭＣａＣｌ２
． ｐＨ７，０中） 含有金属：タンパク１分子当たり亜鉛１原子阻 害 剤
：エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ） 、
１．１０−０−フェナントロリン、ホスホラミドン 紫外線吸収スペクトル： ２８０ｎｍ付近基質特異性：
酸化インスリンβ鎖の分解において次の部分を分解する
。
ａ２＋存在下） 至適温度＝７５〜８０℃（２ｍ１ｃａ２＋存在下でカゼ
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１００％ ９０℃、３０分間の熱処理後の残存活 性：約４５％ （１０ＩｎＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、 ２ｍＭＣａＣｌ２
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↑ Ｓ Ｏ３Ｈ
−Ｌｅｕ−Ｖａ１−Ｇｌｕ−Ａ１ａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇ１ｙ↑
↑ ↑ ↑−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ↑ ↑ ↑ ↑ア
ミノ酸配列： １１ｅＴｈｒＧＩｙＴｈｒＳｅｒＴｈｒＶａｌＧ１ｙＶ
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本発明はプロテアーゼＴＯＳＯＨ−１の好適な製造方法
に関するものであり、バチルス・ステアロサーモフィル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）に属し、プ
ロテアーゼＴＯＳＯＨ−１を生産する細菌を培養し、培
養液からプロテアーゼＴＯＳＯ■−１を採取することを
特徴とするプロテアーゼＴＯＳＯＨ−１の製法に関する
。
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ＧＧＡＡＡＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＣＴＴＴまた
本発明はプロテアーゼＴＯＳＯＨ−１の好適な製造方法
に関するものであり、バチルス・ステアロサーモフィル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）に属し、プ
ロテアーゼＴＯＳＯＨ−１を生産する細菌を培養し、培
養液からプロテアーゼＴＯＳＯ■−１を採取することを
特徴とするプロテアーゼＴＯＳＯＨ−１の製法に関する
。
本発明で使用されるプロテアーゼＴＯＳＯＨ−１生産微
生物は、プロテアーゼＴＯＳＯＩＩ−１を生産すること
ができるバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）に属する全ての菌株であり、突然変異株、および変種
をも包含する。中でもとくに好ましい菌株は、本発明者
らが土壌の中から分離したプロテアーゼＴＯＳＯＨ−１
の生産性が著しく高い菌株バチルス・ステアロサーモフ
ィルスＭＫ−２３２ （Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ−２３２） （微工
研菌寄第９６４５号）である。
生物は、プロテアーゼＴＯＳＯＩＩ−１を生産すること
ができるバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）に属する全ての菌株であり、突然変異株、および変種
をも包含する。中でもとくに好ましい菌株は、本発明者
らが土壌の中から分離したプロテアーゼＴＯＳＯＨ−１
の生産性が著しく高い菌株バチルス・ステアロサーモフ
ィルスＭＫ−２３２ （Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＭＫ−２３２） （微工
研菌寄第９６４５号）である。
以下に本菌株の菌学的性質を示す。
形態
細胞の形 桿菌
細胞の大きさ １．ＯＸ １．２μ×３．０〜５．
０μ多形性 なし 運動性 あり 胞子 形成する 胞子の形 円形 胞子の大きさ ０．６〜１．０μ×１．２μ抗酸性
なし ダラム染色 十 成育状態 ■肉汁寒天平板培養 成育の良否 良好 コロニーの形 円形 コロニーの表面形状 平滑、重輪 コロニーの隆起状態 偏平 コロニーの周縁 金縁 コロニーの内容 均一 コロニーの色調 クリーム色 コロニーの透明度 不透明 ■肉汁寒天斜面培養 成育の良否 良好 −１５＝ コロニーの形 糸状 コロニーの表面形状 平滑 コロニーの透明度 不透明 コロニーの色調 クリーム色 ■肉汁液体培養 表面の成育 なし 濁度 やや濁る 沈澱 粘調 ■肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチン液化 あり、５０℃、５日■リドマスミ
ルク 液化凝固せず 生理的性質 硝酸塩の還元 陰性 脱窒反応 陰性 ＭＲテスト 陽性 ＵＰテスト 陰性 インドールの生成 陰性 硫化水素の生成 陽性 デンプンの加水分解 陽性 クエン酸の利用 陰性 色素の生成 なし ウレアーゼ 陰性 オキシダーゼ 陰性 カタラーゼ 陽性 成育の範囲 至適ｐＨ７，０付近、５０℃付近
が最適 酸素に対する態度 陰性 糖類から酸及びガスの生成の有無 アラビノース、キシロース、マンノース、フラクトース
、ガラクトースから酸を生成するがガスは生成しない。
０μ多形性 なし 運動性 あり 胞子 形成する 胞子の形 円形 胞子の大きさ ０．６〜１．０μ×１．２μ抗酸性
なし ダラム染色 十 成育状態 ■肉汁寒天平板培養 成育の良否 良好 コロニーの形 円形 コロニーの表面形状 平滑、重輪 コロニーの隆起状態 偏平 コロニーの周縁 金縁 コロニーの内容 均一 コロニーの色調 クリーム色 コロニーの透明度 不透明 ■肉汁寒天斜面培養 成育の良否 良好 −１５＝ コロニーの形 糸状 コロニーの表面形状 平滑 コロニーの透明度 不透明 コロニーの色調 クリーム色 ■肉汁液体培養 表面の成育 なし 濁度 やや濁る 沈澱 粘調 ■肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチン液化 あり、５０℃、５日■リドマスミ
ルク 液化凝固せず 生理的性質 硝酸塩の還元 陰性 脱窒反応 陰性 ＭＲテスト 陽性 ＵＰテスト 陰性 インドールの生成 陰性 硫化水素の生成 陽性 デンプンの加水分解 陽性 クエン酸の利用 陰性 色素の生成 なし ウレアーゼ 陰性 オキシダーゼ 陰性 カタラーゼ 陽性 成育の範囲 至適ｐＨ７，０付近、５０℃付近
が最適 酸素に対する態度 陰性 糖類から酸及びガスの生成の有無 アラビノース、キシロース、マンノース、フラクトース
、ガラクトースから酸を生成するがガスは生成しない。
麦芽糖、ショ糖、トレハロース、ソルビット、マンニッ
ト、イノジット、グリセリン、デンプンから酸もガスも
生成しない ７％塩化ナトリウム添加培地での成育 成育しない フェニルアラニンデアミナーゼチロシンの分解陰性 カゼインの分解 陽性 ０．０２％アジ化ナトリウム添加培地での成育成育しな
い 従って本菌株は、バーシーズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ） ８版によるバチルス・ステ
アロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）に属する菌
株と同定され、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
） ＭＫ−２３２と命名した。
ト、イノジット、グリセリン、デンプンから酸もガスも
生成しない ７％塩化ナトリウム添加培地での成育 成育しない フェニルアラニンデアミナーゼチロシンの分解陰性 カゼインの分解 陽性 ０．０２％アジ化ナトリウム添加培地での成育成育しな
い 従って本菌株は、バーシーズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ） ８版によるバチルス・ステ
アロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ）に属する菌
株と同定され、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
） ＭＫ−２３２と命名した。
本発明のプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１を製造するには、
上記のバチルス中ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌｕｓ ）
に属する菌株を培養し、該培養液よりプロテアーゼＴＯ
３ＯＨ−１を採取すればよい。例えば、バチルス・ステ
アロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ） ＭＫ−２
３２を炭素源、窒素源、塩類、その他の物質を含有する
培地に接種し、適当な温度、例えば約５０〜６０℃で酵
素力価が最高に達するまでの適当な時間、振とうまたは
通気攪拌培養して生産する方法がある。
上記のバチルス中ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌｕｓ ）
に属する菌株を培養し、該培養液よりプロテアーゼＴＯ
３ＯＨ−１を採取すればよい。例えば、バチルス・ステ
アロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ） ＭＫ−２
３２を炭素源、窒素源、塩類、その他の物質を含有する
培地に接種し、適当な温度、例えば約５０〜６０℃で酵
素力価が最高に達するまでの適当な時間、振とうまたは
通気攪拌培養して生産する方法がある。
」二記のようにして培養された培養液は、遠心分離、濾
過などの方法で清澄にした後、この清澄液に例えば硫酸
アンモニウムを加えて目的の酵素を沈澱させ、採取する
ことができる。またさらに、イオン交換樹脂、ゲル濾過
法を利用して、上記沈澱物を精製して極めて活性が高い
プロテアーゼＴＯ３ＯＨ−１を得ることができる。
過などの方法で清澄にした後、この清澄液に例えば硫酸
アンモニウムを加えて目的の酵素を沈澱させ、採取する
ことができる。またさらに、イオン交換樹脂、ゲル濾過
法を利用して、上記沈澱物を精製して極めて活性が高い
プロテアーゼＴＯ３ＯＨ−１を得ることができる。
このようにして得られた新規のプロテアーゼＴＯ８Ｏｉ
（−１の理化学的性質を以下に示す。
（−１の理化学的性質を以下に示す。
（１）作用
カゼインを基質として使用した蛋白質分解作用の好適ｐ
Ｈは図１に示すごとく６〜８であり、至適１）Ｈ８，５
〜７．０の中性プロテアーゼである。またプロテアーゼ
ＴＯ８ＯＨ−１とサーモライシンをＴＳＫｇｅｌＧ−２
０００ＳＷカラム（商品名、東ソー■製）を用いゲル濾
過により５ＤＳ−ＰＡＧＥ、 ＨＰＬＣ分析により完全
にシングルバンドになるまで精製を行い、両者のカゼイ
ンを基質とした場合の比活性を表１に示す。
Ｈは図１に示すごとく６〜８であり、至適１）Ｈ８，５
〜７．０の中性プロテアーゼである。またプロテアーゼ
ＴＯ８ＯＨ−１とサーモライシンをＴＳＫｇｅｌＧ−２
０００ＳＷカラム（商品名、東ソー■製）を用いゲル濾
過により５ＤＳ−ＰＡＧＥ、 ＨＰＬＣ分析により完全
にシングルバンドになるまで精製を行い、両者のカゼイ
ンを基質とした場合の比活性を表１に示す。
サーモライシンに比ベプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１は比
活性は約４０％高いことがわかる。
活性は約４０％高いことがわかる。
表１ 各酵素の比活性
（２）基質特異性
プロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１の特徴「基質特異性」の欄
に示したように、酸化インスリンβ鎖を基質として分解
を行わせたところ、Ｈｉｓ−Ｌｅｕ 、 Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ 。
に示したように、酸化インスリンβ鎖を基質として分解
を行わせたところ、Ｈｉｓ−Ｌｅｕ 、 Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ 。
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ 、 Ｌｅｕ−Ｖａｌ 、 Ｇｌｙ−Ｐ
ｈｅ 、 Ｐｈｅ−Ｐｈｅ 、 Ｐｈｅ−Ｔｙｒ 、
Ｌｙｓ−Ａｌａといった疎水性アミノ酸が存在する部分
を分解する。
ｈｅ 、 Ｐｈｅ−Ｐｈｅ 、 Ｐｈｅ−Ｔｙｒ 、
Ｌｙｓ−Ａｌａといった疎水性アミノ酸が存在する部分
を分解する。
（３）至適１）Ｈ
カゼインを基質として使用した蛋白質分解作用における
Ｉ）Ｈの影響を図１に示す。至適ｐＨは６．５〜６．５
である。
Ｉ）Ｈの影響を図１に示す。至適ｐＨは６．５〜６．５
である。
（４） ｐｌ＋安定性
各種ｐＨ（ｐＨ５〜８ニリン酸緩衝液、ｐＨ６〜１１ニ
ゲリシン−ＮａＯＨ緩衝液）で３７℃、６０分間処理後
の残存活性を測定した結果を図４に示す。ｐＨ６〜９の
範囲でほぼ１００％の残存活性を示した。
ゲリシン−ＮａＯＨ緩衝液）で３７℃、６０分間処理後
の残存活性を測定した結果を図４に示す。ｐＨ６〜９の
範囲でほぼ１００％の残存活性を示した。
（５）力価の測定法
１ ｍｌの２％カゼイン溶液（５０１１１Ｍ トリス−
塩酸。
塩酸。
５ ｍＭｃａｃ１２． ｐＨ７，５）に１ ｍｌの各試
料を加え、−定時間後に反応停止液（０，３３Ｍ酢酸、
０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ ）リクロロ酢酸
）を２ ｍｌ加え、室温で３０分間放置した。これをワ
ットマンＮＯ，ｌ濾紙で濾過した。これとは別にカゼイ
ン溶液に反応停止液を入れ、試料を加え、濾過したもの
を基準としてＡ ｎｍを測定し、チロシン溶液を基
準としたＡ の検量線を作成してプロテアーゼ活性を
測定した。１単位は３７℃で１分間に１μｇのチロシン
相当物質をトリクロロ酢酸可溶性区分に遊離させる酵素
量とした。
料を加え、−定時間後に反応停止液（０，３３Ｍ酢酸、
０．２２Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍ ）リクロロ酢酸
）を２ ｍｌ加え、室温で３０分間放置した。これをワ
ットマンＮＯ，ｌ濾紙で濾過した。これとは別にカゼイ
ン溶液に反応停止液を入れ、試料を加え、濾過したもの
を基準としてＡ ｎｍを測定し、チロシン溶液を基
準としたＡ の検量線を作成してプロテアーゼ活性を
測定した。１単位は３７℃で１分間に１μｇのチロシン
相当物質をトリクロロ酢酸可溶性区分に遊離させる酵素
量とした。
（６）至適温度
カゼインを基質として使用した蛋白質分解作用の温度依
存性を図２に示す。本酵素の作用最適温度は約７５℃に
ある。
存性を図２に示す。本酵素の作用最適温度は約７５℃に
ある。
（７）温度安定性
−２１＝
温度安定性を図３に示す。プロテアーゼＴ ＯＳ ＯＨ
−１は８０℃、３０分熱処理後の残存活性は１００％と
非常に安定で、９０℃、３０分熱処理後の残存活性にお
いてもサーモライシンが約３５％であるのに対し、プロ
テアーゼＴＯ８ＯＨ−１は約４５％と約１０％熱安定性
が上昇し、非常に熱安定性の高い酵素である。
−１は８０℃、３０分熱処理後の残存活性は１００％と
非常に安定で、９０℃、３０分熱処理後の残存活性にお
いてもサーモライシンが約３５％であるのに対し、プロ
テアーゼＴＯ８ＯＨ−１は約４５％と約１０％熱安定性
が上昇し、非常に熱安定性の高い酵素である。
（８） ｐＨによる失活の条件
図４に示すごと＜、ｐＨ５付近で失活が始まり、ｐＨ５
，０、３７℃、６０分間で約３０％が失活した。一方ア
ルカリ側では、ｐＨ１０付近で失活が始まり、ｐＨ１１
，３７°０１６０分間で約４０％が失活した。（ｐＨ５
〜８ニリン酸緩衝液、ｐｕｇ〜１１ニゲリシン−Ｎ ａ
ＯＨ緩衝液）（９）阻害剤の影響 阻害剤の影響を表２に示す。さらに金属塩による影響を
表３に示す。
，０、３７℃、６０分間で約３０％が失活した。一方ア
ルカリ側では、ｐＨ１０付近で失活が始まり、ｐＨ１１
，３７°０１６０分間で約４０％が失活した。（ｐＨ５
〜８ニリン酸緩衝液、ｐｕｇ〜１１ニゲリシン−Ｎ ａ
ＯＨ緩衝液）（９）阻害剤の影響 阻害剤の影響を表２に示す。さらに金属塩による影響を
表３に示す。
表２
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミンテトラアセテイツクアシ
ッド ＤＦＰ ニジイソプロピルフルオロホスフェートＰＭＳ
Ｐ ：フェニルメチルスルホニルフルオライド 表３ （ｌＯ）分子量 ゲル濾過法、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により測定した分子量は約３４４００．アミノ酸配列
からの分子量は３４１７６である。
ッド ＤＦＰ ニジイソプロピルフルオロホスフェートＰＭＳ
Ｐ ：フェニルメチルスルホニルフルオライド 表３ （ｌＯ）分子量 ゲル濾過法、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により測定した分子量は約３４４００．アミノ酸配列
からの分子量は３４１７６である。
（１１）紫外線吸収スペクトル
図５に示すごとく、水溶液の吸収極大は約２８０ｎｍ付
近にあり、吸収極小は約２４５〜２５５ｎｍにある。
近にあり、吸収極小は約２４５〜２５５ｎｍにある。
（１２）アミノ酸組成
プロテアーゼＴＯ９ＯＨ−１の特徴「アミノ酸配列」の
欄に示すごとく、Ｎ末端アミノ酸からｌ１ｅ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−−−・のアミノ酸配
列をとり、３７番目： Ａｓｎ 、 １１９番目：
Ｇｉｎのアミノ酸がサーモライシンのアミノ酸配列（３
７番目： Ａｓｐ 、 １１９番目：Ｇｌｕ ）と異
なる。アミノ酸組成は次のようであり、全部で３１６個
のアミノ酸から成る。
欄に示すごとく、Ｎ末端アミノ酸からｌ１ｅ−Ｔｈｒ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−−−・のアミノ酸配
列をとり、３７番目： Ａｓｎ 、 １１９番目：
Ｇｉｎのアミノ酸がサーモライシンのアミノ酸配列（３
７番目： Ａｓｐ 、 １１９番目：Ｇｌｕ ）と異
なる。アミノ酸組成は次のようであり、全部で３１６個
のアミノ酸から成る。
Ａｈａ ２ｇ、 Ａｒｇ １０． Ａｓｎ ２０． Ａ
ｓｐ ２４． Ｃｙｓ Ｏ。
ｓｐ ２４． Ｃｙｓ Ｏ。
Ｇｉｎ １４． Ｇｌｕ ７ 、 Ｇｌｙ ３Ｂ、 Ｈ
ｉｓ ８ 、 ｌｌｅ １８゜Ｌｅｕ ｌ［ｉ、 Ｌｙ
ｓ １１． Ｍｅｔ ２ 、 Ｐｈｅ １０． Ｐｒｏ
８ 。
ｉｓ ８ 、 ｌｌｅ １８゜Ｌｅｕ ｌ［ｉ、 Ｌｙ
ｓ １１． Ｍｅｔ ２ 、 Ｐｈｅ １０． Ｐｒｏ
８ 。
Ｓｅｒ ２Ｂ、 Ｔｈｒ ２５． Ｔｒｐ ３ 、 Ｔ
ｙｒ、２６． Ｖａｌ ２２（１３）塩基配列 プロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１の特徴「塩基配列」の欄に
示すごとく、プロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１構造遺伝子は
９４８塩基対からなる。
ｙｒ、２６． Ｖａｌ ２２（１３）塩基配列 プロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１の特徴「塩基配列」の欄に
示すごとく、プロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１構造遺伝子は
９４８塩基対からなる。
（１４）比活性
カゼインを基質とした場合の比活性を表１に示す。本発
明の酵素は市販されているサーモライシンよりも約４０
％も比活性の高い酵素である。
明の酵素は市販されているサーモライシンよりも約４０
％も比活性の高い酵素である。
（１５）耐熱性
９０℃、３０分までの耐熱性試験の結果を図３に示す。
本発明の酵素は市販されているサーモライシンよりも約
１０％も耐熱性の上昇した酵素である。
１０％も耐熱性の上昇した酵素である。
［発明の効果コ
プロテアーゼＴｏＳＯＨ−１は耐熱性が高く、かつ比活
性が高いため、使用範囲の広いプロテアーゼである。ま
たプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１は本発明方法によって製
造することができる。
性が高いため、使用範囲の広いプロテアーゼである。ま
たプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１は本発明方法によって製
造することができる。
［実施例コ
次に実施例を示すが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。
されるものではない。
実施例１
表４
表４に示す組成の培地５００ ｍｌを２１容の坂ロフラ
スコに入れ１２０℃、１５分滅菌する。同組成の培地で
培養したバチルス壷ステアロサーモフィルスＭＫ−２３
２の前培養液５０ｍ１を加え、３７℃、１５０ｒｐｍ、
２４時間振とう培養した。培養液中のプロテアーゼは
約５０００単位／ ｍｌであった。培養後、硫酸アンモ
ニウムを７０％飽和になるように加え、酵素活性画分を
析出させたのち、遠心分離（１００００ｒｐＩＩｌ、
１０分）して集めた。集めた酵素をできるだけ少量の１
０ｍＭトリス−塩酸、５ｍＭのＣａＣｌ２ （ｐｏｙ
、ｏ ）に懸濁し、透析用セロハンチューブにつめ、両
端をむすんたのち２４時間、１５℃以下、同緩衝液中で
透析した。
スコに入れ１２０℃、１５分滅菌する。同組成の培地で
培養したバチルス壷ステアロサーモフィルスＭＫ−２３
２の前培養液５０ｍ１を加え、３７℃、１５０ｒｐｍ、
２４時間振とう培養した。培養液中のプロテアーゼは
約５０００単位／ ｍｌであった。培養後、硫酸アンモ
ニウムを７０％飽和になるように加え、酵素活性画分を
析出させたのち、遠心分離（１００００ｒｐＩＩｌ、
１０分）して集めた。集めた酵素をできるだけ少量の１
０ｍＭトリス−塩酸、５ｍＭのＣａＣｌ２ （ｐｏｙ
、ｏ ）に懸濁し、透析用セロハンチューブにつめ、両
端をむすんたのち２４時間、１５℃以下、同緩衝液中で
透析した。
透析後、不溶物を遠心分離して除き、凍結乾燥し、得ら
れた粉末を粗酵素サンプルとした。粗酵素サンプルは次
の方法で分離精製した。すなわち粗酵素サンプル１ｇを
１０ｍ１の１０１１１Ｍトリス−塩酸、５ＩＩＩＭＣａ
Ｃ１□ （ｐＨ７，０）に溶解し、同緩衝液で平衡化し
たＴｏｙｏｐｅａｒｌ−ｌ（Ｗ２Ｏ（商品名、東ソー■
製）を充填したカラム（１，５Ｘ８０ｃｍ）上部に静か
に流しこみ、同緩衝液で溶出する。ここで得た活性画分
をさらにＴＳＫｇｅｌ−Ｇ２０００ＳＷ （商品名、東
ソー■製）にかけ、ピークフラクションを分取する。活
性画分は硫酸アンモニウム塩析（７０％飽和）で集め、
透析したのち、凍結乾燥する。以上の方法に従って精製
し、１１の培養液から０．１ｇのプロテアーゼＴＯ８Ｏ
Ｈ−１を得た。
れた粉末を粗酵素サンプルとした。粗酵素サンプルは次
の方法で分離精製した。すなわち粗酵素サンプル１ｇを
１０ｍ１の１０１１１Ｍトリス−塩酸、５ＩＩＩＭＣａ
Ｃ１□ （ｐＨ７，０）に溶解し、同緩衝液で平衡化し
たＴｏｙｏｐｅａｒｌ−ｌ（Ｗ２Ｏ（商品名、東ソー■
製）を充填したカラム（１，５Ｘ８０ｃｍ）上部に静か
に流しこみ、同緩衝液で溶出する。ここで得た活性画分
をさらにＴＳＫｇｅｌ−Ｇ２０００ＳＷ （商品名、東
ソー■製）にかけ、ピークフラクションを分取する。活
性画分は硫酸アンモニウム塩析（７０％飽和）で集め、
透析したのち、凍結乾燥する。以上の方法に従って精製
し、１１の培養液から０．１ｇのプロテアーゼＴＯ８Ｏ
Ｈ−１を得た。
実施例２
実施例１に従い精製したプロテアーゼＴＯ８ＯＩ！−１
を用い、高濃度のＮａＣ１中でのプロテアーゼ活性をみ
た。１０１１１Ｍトリス−塩酸、５ｍＭのＣａＣ１２（
ｐＨ７，０）中でＮａＣ１濃度を０．５Ｍ 、 ＬＭ、
２Ｍ、 ３Ｍ、 ５Ｍ、と上昇させ、残存活性を測定
した。結果を図６に示す。
を用い、高濃度のＮａＣ１中でのプロテアーゼ活性をみ
た。１０１１１Ｍトリス−塩酸、５ｍＭのＣａＣ１２（
ｐＨ７，０）中でＮａＣ１濃度を０．５Ｍ 、 ＬＭ、
２Ｍ、 ３Ｍ、 ５Ｍ、と上昇させ、残存活性を測定
した。結果を図６に示す。
図からも明らかなように、０．５Ｍでは無添加に比べ活
性が上昇し、また３Ｍ付近でも残存活性５０％と、プロ
テアーゼＴＯ８ＯＨ−１は他のプロテアーゼと比べ非常
に耐塩性のプロテアーゼである。
性が上昇し、また３Ｍ付近でも残存活性５０％と、プロ
テアーゼＴＯ８ＯＨ−１は他のプロテアーゼと比べ非常
に耐塩性のプロテアーゼである。
実施例３
実施例１に従い、精製したプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１
を用い各種微生物を用い、本酵素の溶菌活性を測定した
。各培養菌体をアセトンを用いて乾燥させ、粉末とした
ものを基質とし、本酵素、リゾチーム、アクロモペプチ
ダーゼを酵素として用い、１分間に０．００１濁度の減
少を１単位と定義し、各微生物に対する各酵素の溶菌活
性を比較した。
を用い各種微生物を用い、本酵素の溶菌活性を測定した
。各培養菌体をアセトンを用いて乾燥させ、粉末とした
ものを基質とし、本酵素、リゾチーム、アクロモペプチ
ダーゼを酵素として用い、１分間に０．００１濁度の減
少を１単位と定義し、各微生物に対する各酵素の溶菌活
性を比較した。
表５
基質 スタフィロコッカス・アウレウスＩＰ０３７６１
基質 サツカロマイセス・セレビシェＨＵＴ ７１１９
このように既存の溶菌酵素、リゾチーム、アクロモペプ
チダーゼと比較しても同等もしくはそれ以上の溶菌活性
を示した。
基質 サツカロマイセス・セレビシェＨＵＴ ７１１９
このように既存の溶菌酵素、リゾチーム、アクロモペプ
チダーゼと比較しても同等もしくはそれ以上の溶菌活性
を示した。
図１はプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１の至適ｐＨを示す図
である。 図２はプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１の至適温度を示す図
である。 図３はプロテアーゼＴＯ３ＯＨ−１と市販酵素サーモラ
イシンとの温度安定性、耐熱性を比較したものを示す図
である。 図４はプロテアーゼＴＯ３ＯＨ−１のＩ）Ｈ安定性を示
す図である。 図５はプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１の水溶液の紫外線吸
収スペクトルを示す図である。 図６はプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１の塩に対する耐性度
を示す図である。
である。 図２はプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１の至適温度を示す図
である。 図３はプロテアーゼＴＯ３ＯＨ−１と市販酵素サーモラ
イシンとの温度安定性、耐熱性を比較したものを示す図
である。 図４はプロテアーゼＴＯ３ＯＨ−１のＩ）Ｈ安定性を示
す図である。 図５はプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１の水溶液の紫外線吸
収スペクトルを示す図である。 図６はプロテアーゼＴＯ８ＯＨ−１の塩に対する耐性度
を示す図である。
Claims (3)
- （１）次の酵素化学的性質を有する耐熱性プロテアーゼ
。 分子量：３４４００（ゲルろ過法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
３４１７６（アミノ酸組成） ｐＨ安定性：３７℃、３０分の処理後ｐＨ６〜９の範囲
で９０％以上の活性を有し安定である。 至適ｐＨ：６．５〜８．５（６０℃、２ｍＭＣａ＾２＾
＋存在下） 至適温度：７５〜８０℃（２ｍＭＣａ＾２＾＋存在下で
カゼインを基質とし、２０分間反応したとき） 温度安定性：８０℃、３０分間の熱処理後の残存活性：
１００％ ９０℃、３０分間の熱処理後の残存活性：約４５％ （１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ＿２、ｐ
Ｈ７．０中） 含有金属：タンパク１分子当たり亜鉛１原子阻害剤：エ
チレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、１，１
０−Ｏ−フェナントロリン、ホスホラミドン紫外線吸収
スペクトル：２８０ｎｍ付近基質特異性：酸化インスリ
ンβ鎖の分解において次の部分を分解する。▲数式、化
学式、表等があります▼ アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 塩基配列： 【遺伝子配列があります】 - （２）バチルス・ステアロサーモフィルス（￥Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ￥ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ￥）
に属する菌株を培養して、該培養液より特許請求の範囲
第１項記載の耐熱性プロテアーゼを採取することを特徴
とする耐熱性プロテアーゼの製法。 - （３）菌株がバチルス・ステアロサーモフィルスＭＫ−
２３２（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥￥ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ￥ＭＫ−２３２）である特許請求の範
囲第２項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62253749A JPH0195778A (ja) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | 耐熱性プロテアーゼ及びその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62253749A JPH0195778A (ja) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | 耐熱性プロテアーゼ及びその製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0195778A true JPH0195778A (ja) | 1989-04-13 |
Family
ID=17255606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62253749A Pending JPH0195778A (ja) | 1987-10-09 | 1987-10-09 | 耐熱性プロテアーゼ及びその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0195778A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111568855A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-08-25 | 山东大学 | 一种可注射水凝胶的制备方法及其在术后肿瘤治疗中的应用 |
-
1987
- 1987-10-09 JP JP62253749A patent/JPH0195778A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111568855A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-08-25 | 山东大学 | 一种可注射水凝胶的制备方法及其在术后肿瘤治疗中的应用 |
| CN111568855B (zh) * | 2020-06-08 | 2022-02-08 | 山东大学 | 一种可注射水凝胶的制备方法及其在术后肿瘤治疗中的应用 |
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