JPH0199646A - 生化学物質の分離剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はパイロジエン、核酸、及び核酸関連物質から選
ばれる生化学物質を高い効率で分離するように改善した
・ンイロジエン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる
生化学物質の分離剤に関するものである。

〔従来の技術〕

ノソイロノエン、核酸、核酸関連物質等の生化学物質は
原料中から有用物として分離する必要がある場合や、医
薬品などから不純物として除去する必要がある場合があ
り、これらの生化学物質を分離する技術は関連する分野
において重要な技術とされている。

これらの生化学物質を分離する従来の方法としては、例
えば特開昭５７−１７１４０３で開示されているように
、分離膜を用いて戸別する方法、特開昭５４−６７０２
４で開示されているようにヒアルロン酸塩を添加し、ア
ニオン樹脂により処理する方法、特開昭４７−２０３５
２で開示されているように不純物として存在する生化学
物質を酵素的に減成させる方法、特開昭４６−５２９で
開示されているように分離する生化学物質と生化学的に
反応する化合物との反応によって得られる誘導体との重
合によって造られたグルを用いてグル濾過する方法、特
開昭５９−３９２９７に開示されているように塩基性水
溶性高分子と反応させて沈殿させる方法、特開昭５２−
９９２９１で開示されているようにイオン交換樹脂を用
いる方法、又は酸やアルカリを加えて不純物として存在
する生化学物質を分解する方法などがある。しかし、こ
れまでの方法では・ぐイロノエン、核酸、及び核酸関連
物質から選ばれる生化学物質を有効に除去することは困
難であった。

これらの方法では一操作だけで、十分に不純物の生化学
物質を除去することが困難である場合や、有用な薬剤と
の分離が不十分である場合などがある。

また不純物として存在する生化学物質を、酵素的に、又
は化学的に分解する方法によるときは、他の薬剤自身も
分解を受けるなどの欠点がある。

これらの方法の欠点を改善するために、例えば、細胞抽
出液中から有用タンパク質やアミノ酸などを抽出する場
合には、共存する核酸を除去する分離剤として鮭から得
られるプロタミン硫酸や、蟹から得られるキトサンを利
用することが知られている（生化学実験講座５．Ｐ２Ｏ
１，日本生化学金網、東京化学同人）。この場合の核酸
除去の機構は、核酸を含む水溶液に核酸除去剤であるプ
ロタミン硫酸や、キトサンを溶解した水溶液を混合する
と、核酸のリン酸基の負イオンと核酸除去剤の持つ正イ
オンとが結合し、高分子凝集体を生ずることによる。こ
の凝集体を取り除くことで核酸を除去した水溶液を得る
ことができる。

しかし、プロタミン硫酸や、キトサンのような水溶性高
分子は、水溶性であるため、溶液中に含まれている核酸
などの、除去しなければならない生化学物質に比べ、水
溶性の分離剤を過剰量、使用した場合、一部の分離剤が
凝集体を取り除いた後の溶液中に残存する。

これらの水溶性の生化学物質の分離剤が残存しても問題
のないような用途には、これらの生化学物質の分離剤が
使用される場合があったが、生化学物質の分離剤の残存
が許容されない用途も多いため、対象となる生化学物質
を、−操作だけで、十分な効率で分離することができ、
しかも分離後の溶液中に生化学物質の分離剤が残存しな
いような生化学物質の分離剤゛の出現が望まれている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、パイ
ロツエン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる生化学
物質を、−操作だけで、十分な効率で分離することがで
き、しかも共存する他の薬剤が分解などを受けることも
なく、しかも分離後の溶液中に生化学物質の分離剤が残
存しないような、改善されたパイロジエン、核酸、及び
核酸関連物質から選ばれる生化学物質の分離剤を提供す
ることを目的とする。

〔問題点を解決するだめの手段〕

即ち本発明は、（１）架橋された第４級窒素含有水溶性
高分子からなる、・ぐイロジエン、核酸、及び核酸関連
物質から選ばれる生化学物質の分離剤、（２）前記の架
橋された第４級窒素含有水溶性高分子は架橋されたカチ
オン性ヒドロキシアルキルセルロースであることを特徴
とする・ぐイロノエン、核酸、及び核酸関連物質から選
ばれる生化学物質の分離剤、（３）前記の架橋された第
４級窒素含有水溶性高分子は架橋されたカチオン性ヒド
ロキ７エチルセルロースであることを特徴とする／？イ
ロノエン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる生化学
物質の分離剤、（４）架橋された第４級窒素含有水溶性
高分子は架橋されたカチオン性キトサンであることを特
徴とするパイロジエン、核酸、及び核酸関連物質から選
ばれる生化学物質の分離剤、を提供する。

本発明において分離する対象とする生化学物質はノやイ
ロジェン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれるもので
ある。

本発明において・セイロノエンと呼ぶものは、生体に投
与すると発熱を起す物質の総称であり、発熱物質、又は
発熱因子とも呼ばれているものである。パイロツエンに
は、外因性と内因性の２種類がある。外因性パイロジエ
ンは、ジフテリア菌、黄色ブドウ球菌などの病原菌が分
泌する外毒素（エンドトキシン）と大腸菌などダラム陰
性菌の細胞壁の成分である内毒素（エンドトキシン）に
大別できる。ダラム陰性菌の内毒素を構成するものは、
多糖類と結合した脂質の複合体であるリポ多糖体（ＬＰ
Ｓ）であるとされている。内因性の・２イロジエンには
、インターロイキン１やインターフェロンなど、リンフ
才力インやマクロカインに加え、好中球、好酸球、マク
ロファーソ、肥満細胞などが分泌するケミカルメデイエ
ータやグロスタグランジンなどが存在する。本発明にお
いて分離する対象とするノ４イロノエンは上記の例に限
定されるものではない。

本発明において核酸と呼ぶものは、リン酸、ペントース
、および塩基からなるポリヌクレオチドでちる。被ント
ースとしてリボースかまたはデオキシリテースの一方だ
けを含み、前者をＩＪ　ｇ核酸（ＲＮＡ）　、後者をデ
オキシリゾ核酸（ＤＮＡ　）と呼ぶ。

核酸は構造的にも機能的にもＤＮＡとＲＮＡに２犬別さ
れる。いずれも４種の主要塩基の組成で特徴づけられ、
アデニ／、グアニンおよびシトシンはＤＮＡ　、　ＲＮ
Ａに共通な塩基成分で、他にＤＮＡはチミン、ＲＮＡは
ウラフルを含んでいる。高等細胞内でＤＮＡは細胞核の
染色体に局在し、遺伝子本体となり、ＲＮＡは細胞全体
に分布して見出され、遺伝子の形質発現であるタンパク
質の生合成の働き手となっている。

本発明において核酸関連物質と呼ぶものは、核酸の構成
成分であるヌクレオシド、ヌクレオチド。

及びその誘導体のことであり、調味料や医薬として重要
な位置を占めている。これらのものは、発酵法や合成法
で工業生産されているが、例えば、５′−イノシン酸、
５′−グアニル酸が調味料として、イノシン、　ＡＴＰ
　、　ＣＤＰ−コリン、　Ｉ’ＡＤ　、　ＮＡＤ　。

ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　　などが医薬として広く用いら
れている。核酸誘導体の中には細胞のＤＮＡ合成に影響
を与えるものがあり、特に変異誘起作用を持つものは、
安全性の点から、不純物として除去する必要のあるもの
がある。

本発明の・ぞイロジエン、核酸、及び核酸関連物質から
選ばれる生化学物質の分離剤とは、上記のパイロツエン
、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる１種以上の生化
学物質を含む混合物から、これらの生化学物質を分離す
る用途に用いられる分離剤（以下の文中では単に生化学
物質の分離剤と呼ぶこともある。）のことである。

本発明において、第４級窒素含有水溶性高分子とは、水
溶性高分子の分子中に、窒素原子に４個の炭化水素残基
と、１個の酸基とが結合した部分を持つような構造の水
溶性高分子のことであり、第４級アンモニウム塩と呼ば
れるものである。アンモニウム塩の窒素原子は、いわゆ
る５価の窒素であるが、４個の炭化水素残基とは共有結
合で結合して１価の陽イオンを形成し、これが酸基とイ
オン結合で結谷したものである。架橋された第４級窒素
含有水溶性高分子とは上記の第４級窒素含有水溶性高分
子を架橋したものである。

架橋された第４級窒素含有水溶性高分子の中で、最も好
ましいものは、架橋されたカチオン性ヒドロキシアルキ
ルセルロースである。架橋されたカチオン性ヒドロキン
アルキルセルロースを生化学物質の分離剤として用いた
場合には、他の架橋された第４級窒素含有水溶性高分子
を用いた場合よりも高い分離効果が得られる。本発明を
説明するために、架橋されたカチオン化ヒドロキシアル
キルセルロースの例を用いて詳しく説明する。

本発明に用いる架橋されたカチオン性ヒドロキシアルキ
ルセルロースの製造法については、特に限定はなく、例
えば特願昭６１−２１７６７２号に示すレタカチオン化
ヒドロキシアルキルセルロースの製造法においてカチオ
ン化剤の添加時に架橋剤を加えて反応させれば反応性・
経済性の点で有利である。

また、特開昭５６−６２８０１で開示されるように、セ
ルロースエーテルを水と可溶性有機溶媒とがらなる混合
溶媒中で、グリ・／ノルトリアルキルアンモニウムハラ
イドと反応せしめて、得られるカチオン性セルロースエ
ーテルを、架橋剤で架橋させて用いてもよい。

架橋されたカチオン性ヒドロキシアルキルセルロースの
製造に用いられるアルキレンオキシドとしてはエチレン
オキシド、プロピレンオキシド並びに各種ブテンオキシ
ドが挙げられる。

このアルキレンオキシドの添加量を変えることにより種
々の置換度を持ったヒドロキシアルキルセルロースを得
ることができる。

使用するアルキレンオキシドの種類によって、カチオン
性ヒドロキシエチルセルロース、カチオン性ヒドロキシ
プロピルセルロース、カチオン性ヒドロキンブチルセル
ロースの架橋物が得られる。

この中では架橋されたカチオン性ヒドロキシエチルセル
ロースが最も好ましく、取扱いが簡単で、最も高い分離
効果が得られる。また、架橋されたカチオン性ヒドロキ
シアルキルセルロースの製造に用いられるカチオン化剤
としては、グリシツルトリアルキルアンモニウム／・ラ
イドあるいはそのハロヒドリ／型のものが使用できる。

例えばグリシツルトリメチルアンモニウムクロリド、グ
リシノルトリエチルアンモニウムクロリド、グリシツル
トリメチルアンモニウムプロミド、３−クロロ−２−ヒ
ドロキンプロビルトリメチルアンモニウムクロリドなど
である。

ｔたカチオン化ヒドロキシアルキルセルロースの架橋剤
としてはエピクロルヒドリン、１，３−フクロルー２−
ｆロバノール、１．４−ビス−（２，３゜工？キ７プロ
ポキシ）−ブタンなどが挙げられる。

また架橋剤の使用量は一般にグルコースのモル数に対し
て１％から２０％程度のモル数が望ましい。架橋剤の使
用量が、この範囲外の場合は分離する性能が十分ではな
い。

パイロツエン、核酸、及び核酸から選ばれる生化学物質
の分離剤の利用方法を、架橋されたカチオン性ヒドロキ
シアルキルセルロースを用いた核酸の分離方法の例を用
いて説明する。

前述の製造方法などで得た架橋したカチオン性ヒドロキ
シアルキルセルロースを核酸を含む水溶液、あるいは菌
体抽出液に加えた後、スタークなどを用いてよく攪拌す
る。その後静置して、核酸を吸着している架橋したカチ
オン性ヒドロキシアルキルセルロースを沈降させ、その
上清液を得る。

あるいは濾過・遠心などにより、架橋したカチオン性ヒ
ドロキシアルキルセルロースを分離し、その上清液を得
る方法によって核酸を分離できる。

架橋したカチオン化ヒドロキシアルキルセルロースの添
加量は、除去しようとする核酸含有溶液の核酸含有量に
よって調整するが、一般に核酸のモル数に対してカチオ
ン基のモル数が等モルあるいはそれ以上の添加が望まし
い。

本発明の生化学物質の分離剤は、例えば上記の例のよう
な使用方法で使用可能であるが、もちろん上記に限定さ
れるものではない。他の使用方法の例としては、例えば
一般に行なわれているように架橋されたカチオン性ヒド
ロキシアルキルセルロースをカラムに充填して使用する
方法でもよい。

この場合、カラムに充填された架橋されたカチオン性ヒ
ドロキシアルキルセルロースの上かう核酸を含む溶液を
流すと、その流出液は核酸を含まない溶液となる。

上記のように核酸を分離する場合について特に詳しく説
明したが、これらの生化学物質の分離剤の使用方法は、
核酸関連物質や、パイロツエンを分離する場合であって
も全く同様の使用方法が適用できる。

〔発明の効果〕

本発明の生化学物質の分離剤は下記の実施例でも明らか
になるように、ノぐイロノエン、核酸、及び核酸関連物
質から選ばれる生化学物質を、−操作だけで、十分な効
率で分離することができ、しかも共存する他の薬剤が分
解などを受けることもなく、しかも、分離後の溶液中に
生化学物質の分離剤が残存することがないという優れた
性質を有するものである。

分離後の溶液中に生化学物質の分離剤が残存しないのは
、架橋された第４級窒素含有水溶性高分子が十分に架橋
されているためであり、水溶液中で膨潤することはあっ
ても、水溶液中に溶出して水溶液中に残存することはな
い。

以下に本発明を実施例を用いて説明するが、本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない。

（比較例１） キトサンを用いた市販の核酸除去剤（品番Ｃ−７゜栗田
工業）を用い、その２％溶液を調整した。

この水溶液１　ｃｃを、仔牛の胴線核酸１ｒｎ９を０，
１５Ｍ　ＮａＣ４，Ｉ　Ｑｃｃに溶解した液に加えた後
１０分間スターラで攪拌する。その後３０分間５０００
　ｒｐｍで沈殿物を遠心分離し、上清液を分取した。こ
の上清液中に含まれる核酸量を測定したところ９５％の
核酸が除去された。

しかしこの上清液中に残存している核酸除去剤の含量を
測定したところ、核酸溶液に加えた元の核酸除去剤の３
０％が上清液中に残存していた。

（比較例２） カチオン化剤としてグリシツルトリメチルアンモニウム
クロリドを用いたカチオン化ヒドロキンエチルセルロー
ス（カチオン化剤の置換！１．５）の２％水溶液を調整
した。この水溶液１　ｃｃを、仔牛の胴線核酸１　ｍ９
を０．１５　Ｍ　ＮａＣｔ、　１０ｃｃに溶解した液に
加えた後、１０分間スターラで攪拌する。

その後３０分間、５０００　ｒｐｍで沈殿物を遠心分離
し、上清液を分取した。この上清液に含まれる核酸量を
測定したところ９８％の核酸が除去された。

しかしこの上清液中に残存しているカチオン化ヒドロキ
シエチルセルロースの含量を測定したところ、核酸溶液
に加えた元の核酸除去剤の２０％が上清液中に残存して
いた。

（実施例１） カチオン化剤としてグリシツルトリメチルアンモニウム
クロリドを用いたカチオン化ヒドロキシエチルセルロー
ス（カチオン化剤の置換度１．１゜ヒドロキンエチル基
の置換度１．７）に架橋剤であル１．３−ノクロルー２
−７’口／ぞノールをグルコースのモル数に対して２％
加えて反応させ架橋した。

この架橋したカチオン化ヒドロキシエチルセルｏ−ス０
．１９−を、仔牛の胴線核酸１ｍ９を０．１５　ＭＮａ
Ｃｌ　、　ｌ　Ｑｃｃに溶解した液中に加えた後１ｏ分
間スターラで攪拌する。その後１０分間２０００　ｒｐ
ｍで架橋ケ９ルを遠心分離し、上清液を分取した。

この上清液に含まれる核酸量を測定したところ９８％の
核酸が除去された。

またこの上清液中には架橋したカチオン化ヒドロキシエ
チルセルロースは全く存在していない。

（実施例２つ カチオン化剤としてグリシゾルトリメチルアンモニウム
クロリドを用いたカチオン化ヒドロキシエチルセルロー
ス（カチオン化剤の置換度１．１゜ヒドロキシエチル基
の置換度１．７）に架橋剤であるエピクロルヒドリンを
グルコースのモル数忙対して２％加えて反応させ架橋し
た。

この架橋したカチオン化とドロキシエチルセルｌｌｌ−
ス０．１５’を、仔牛の胴線核酸１ｍ９を０．１５ＭＮ
ａＣ４＋　１０　ＣＣに溶解した液中に加えた後１０分
間スターラで攪拌する。その後１０分間２０００　ｒｐ
ｍで架橋ｒルを遠心分離し、上清液を分取した。

この上清液に含まれる核酸量を測定したところ９８％の
核酸が除去された。

またこの上清液中には架橋したカチオン化ヒドロキシエ
チルセルロースは全く存在していない。

（実施例３） カチオン化剤としてグリシジルトリメチルアンモニウム
クロリドを用いたカチオン化ヒドロキシエチルセルロー
ス（カチオン化剤の置換度１゜１゜ヒドロキシエチル基
の置換度１．７）に架橋剤であル１．３〜シクロルー２
−７’ロパノールヲクルコースのモル数に対して２％加
えて反応させ架橋した。

この架橋したカチオン化ヒドロキシエチルセルロース０
．１５４をプラスチック製のミニカラムに充填し、上部
より蒸留水を流して洗浄した後、仔牛の胴線核酸１■を
０．１５　Ｍ　ＮａＣ６，１０ｃｃに溶解した液を流し
て、その流出液を回収した。この流出液に含まれる核酸
量を測定したところ９９．５％の核酸が除去された。

またこの流出液中には架橋したカチオン化ヒドロキシエ
チルセルロースは全く存在シていない。

（実施例４） カチオン化剤として３−クロロ−２−ヒドロキ／ｆロピ
ルトリメチルアンモニウムブロミドを用いたカチオン化
ヒドロキシエチルセルロース（カチオン化剤の置換ｇｏ
、６．ヒドロキシエチル基の置換度１．７）に架橋剤で
ある１、３−ノクロルー２　′−プロノ２ノールをグル
コースのモル数に対シて２％刀口えて反応させ架橋した
。

この架橋したカチオン化ヒドロキシエチルセルロース０
．１１を、仔牛の胸腺核酸１■を０．１５ＭＮａＣ１、
１０ｃｃに溶解した液中に加えた後１０分間スターラで
攪拌する。その後１０分間２０００　ｒｐｍで架ａグル
を遠心分離し、上臂液を分取した。

この上１液に含まれる核酸量を測定したところ９６％の
核酸が除去された。

またこの上溝液中には架橋したカチオン化ヒドロキンエ
チルセルロースは全く存在していない。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）架橋された第４級窒素含有水溶性高分子からなる
   、パイロジェン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる
   生化学物質の分離剤。
2. （２）架橋された第４級窒素含有水溶性高分子は架橋さ
   れたカチオン性ヒドロキシアルキルセルロースであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のパイロジェ
   ン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる生化学物質の
   分離剤。
3. （３）架橋された第４級窒素含有水溶性高分子は架橋さ
   れたカチオン性ヒドロキシエチルセルロースであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のパイロジェン
   、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる生化学物質の分
   離剤。
4. （４）架橋された第４級窒素含有水溶性高分子は架橋さ
   れたカチオン性キトサンであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載のパイロジェン、核酸、及び核酸関
   連物質から選ばれる生化学物質の分離剤。