JPH0722701B2

JPH0722701B2 - 生化学物質の分離剤

Info

Publication number: JPH0722701B2
Application number: JP62256200A
Authority: JP
Inventors: 一義上田; 洋之中村; 和雄前田
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1987-10-13
Filing date: 1987-10-13
Publication date: 1995-03-15
Anticipated expiration: 2010-03-15
Also published as: JPH0199646A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はパイロジェン、核酸、及び核酸関連物質から選
ばれる生化学物質を高い効率で分離するように改善した
パイロジェン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる生
化学物質の分離剤に関するものである。

〔従来の技術〕

パイロジェン、核酸、核酸関連物質等の生化学物質は原
料中から有用物として分離する必要がある場合や、医薬
品などから不純物として除去する必要がある場合があ
り、これらの生化学物質を分離する技術は関連する分野
において重要な技術とされている。

これらの生化学物質を分離する従来の方法としては、例
えば特開昭57−171403で開示されているように、分離膜
を用いて別する方法、特開昭54−67024で開示されて
いるようにヒアルロン酸塩を添加し、アニオン樹脂によ
り処理する方法、特開昭47−20352で開示されているよ
うに不純物として存在する生化学物質を酵素的に減成さ
せる方法、特開昭46−529で開示されているように分離
する生化学物質と生化学的に反応する化合物との反応に
よって得られる誘導体との重合によって造られたゲルを
用いてゲル過する方法、特開昭59−39297に開示され
ているように塩基性水溶性高分子と反応させて沈殿させ
る方法、特開昭52−99291で開示されているようにイオ
ン交換樹脂を用いる方法、又は酸やアルカリを加えて不
純物として存在する生化学物質を分離する方法などがあ
る。しかし、これまでの方法ではパイロジェン、核酸、
及び核酸関連物質から選ばれる生化学物質を有効に除去
することは困難であった。

これらの方法では一操作だけで、十分に不純物の生化学
物質を除去することが困難である場合や、有用な薬剤と
の分離が不十分である場合などがある。

また不純物として存在する生化学物質を、酵素的に、又
は化学的に分解する方法によるときは、他の薬剤自身も
分解を受けるなどの欠点がある。

これらの方法の欠点を改善するために、例えば、細胞抽
出液中から有用タンパク質やアミノ酸などを抽出する場
合には、共存する核酸を除去する分離剤として鮭から得
られるプロタミン硫酸や、蟹から得られるキトサンを利
用することが知られている（生化学実験講座5,P201,日
本生化学会編、東京化学同人）。この場合の核酸除去の
機構は、核酸を含む水溶液に核酸除去剤であるプロタミ
ン硫酸や、キトサンを溶解した水溶液を混合すると、核
酸のリン酸基の負イオンと核酸除去剤の持つ正イオンと
が結合し、高分子凝集体を生ずることによる。この凝集
体を取り除くことで核酸を除去した水溶液を得ることが
できる。

しかし、プロタミン硫酸や、キトサンのような水溶性高
分子は、水溶性であるため、溶液中に含まれている核酸
などの、除去しなければならない生化学物質に比べ、水
溶性の分離剤を過剰量、使用した場合、一部の分離剤が
凝集体を取り除いた後の溶液中に残存する。

これらの水溶性の生化学物質の分離剤が残存しても問題
のないような用途には、これらの生化学物質の分離剤が
使用される場合があったが、生化学物質の分離剤の残存
が許容されない用途も多いため、対象となる生化学物質
を、一操作だけで、十分な効率で分離することができ、
しかも分離後の溶液中に生化学物質の分離剤が残存しな
いような生化学物質の分離剤の出現が望まれている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、パイ
ロジェン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる生化学
物質を、一操作だけで、十分な効率で分離することがで
き、しかも共存する他の薬剤が分解などを受けることも
なく、しかも分離後の溶液中に生化学物質の分離剤が残
存しないような、改善されたパイロジェン、核酸、及び
核酸関連物質から選ばれる生化学物質の分離剤を提供す
ることを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

即ち本発明は、（１）架橋された第４級窒素含有水溶性
高分子からなる、パイロジェン、核酸、及び核酸関連物
質から得らばれる生化学物質の分離剤、（２）前記の架
橋された第４級窒素含有水溶性高分子は架橋されたカチ
オン性ヒドロキシアルキルセルロースであることを特徴
とするパイロジェン、核酸、及び核酸関連物質から選ば
れる生化学物質の分離剤、（３）前記の架橋された第４
級窒素含有水溶性高分子は架橋されたカチオン性ヒドロ
キシエチルセルロースであることを特徴とするパイロジ
ェン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる生化学物質
の分離剤、（４）架橋された第４級窒素含有水溶性高分
子は架橋されたカチオン性キトサンであることを特徴と
するパイロジェン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれ
る生化学物質の分離剤、を提供する。

本発明において分離する対象とする生化学物質はパイロ
ジェン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれるものであ
る。

本発明においてパイロジェンと呼ぶものは、生体に投与
すると発熱を起す物質の総称であり、発熱物質、又は発
熱因子とも呼ばれているものである。パイロジェンに
は、外因性と内因性の２種類がある。外因性パイロジェ
ンは、ジフテリア菌、黄色ブドウ球菌などの病原菌が分
泌する外毒素（エキソトキシン）と大腸菌などグラム陰
性菌の細胞壁の成分である内毒素（エンドトキシン）に
大別できる。グラム陰性菌の内毒素を構成するものは、
多糖類と結合した脂質の複合体であるリポ多糖体（LP
S）であるとされている。内因性のパイロジェンには、
インターロイキン１やインターフェロンなど、リンフォ
カインやマクロカインに加え、好中球、好酸球、マクロ
ファージ、肥満細胞などが分泌するケミカルメディエー
タやプロスタグランジンなどが存在する。本発明におい
て分離する対象とするパイロジェンは上記の例に限定さ
れるものではない。

本発明において核酸と呼ぶものは、リン酸、ペントー
ス、および塩基からなるポリヌクレオチドである。ペン
トースとしてリボースかまたはデオキシリボースの一方
だけを含み、前者をリボ核酸（RNA）、後者をデオキシ
リボ核酸（DNA）と呼ぶ。核酸は構造的にも機能的にもD
NAとRNAに２大別される。いずれも４種の主要塩基の組
成で特徴づけられ、アデニン、グアニンおよびシトシン
はDNA,RNAに共通な塩基成分で、他にDNAはチミン、RNA
はウラシルを含んでいる。高等細胞内でDNAは細胞核の
染色体に局在し、遺伝子本体となり、RNAは細胞全体に
分布して見出され、遺伝子の形質発現であるタンパク質
の生合成の働き手となっている。

本発明において核酸関連物質と呼ぶものは、核酸の構成
成分であるヌクレオシド，ヌクレオチド，及びその誘導
体のことであり、調味料や医薬として重要な位置を占め
ている。これらのものは、発酵法や合成法で工業生産さ
れているが、例えば、５′−イノシン酸、５′−グアニ
ル酸が調味料として、イノシン,ATP,CDP−コリン,FAD,N
AD,coenzyme Aなどが医薬として広く用いられている。
核酸誘導体の中には細胞のDNA合成に影響を与えるもの
があり、特に変異誘起作用を持つものは、安全性の点か
ら、不純物として除去する必要のあるものがある。

本発明のパイロジェン、核酸、及び核酸関連物質から選
ばれる生化学物質の分離剤とは、上記のパイロジェン、
核酸、及び核酸関連物質から選ばれる１種以上の生化学
物質を含む混合物から、これらの生化学物質を分離する
用途に用いられる分離剤（以下の文中では単に生化学物
質の分離剤と呼ぶこともある。）のことである。

本発明において、第４級窒素含有水溶性高分子とは、水
溶性高分子の分子中に、窒素原子に４個の炭化水素残基
と、１個の酸基とが結合した部分を持つような構造の水
溶性高分子のことであり、第４級アンモニウム塩と呼ば
れるものである。アンモニウム塩の窒素原子は、いわゆ
る５価の窒素であるが、４個の炭化水素残基とは共有結
合で結合して１価の陽イオンを形成し、これが酸基とイ
オン結合で結合したものである。架橋された第４級窒素
含有水溶性高分子とは上記の第４級窒素含有水溶性高分
子を架橋したものである。

架橋された第４級窒素含有水溶性高分子の中で、最も好
ましいものは、架橋されたカチオン生ヒドロキシアルキ
ルセルロースである。架橋されたカチオン性ヒドロキシ
アルキルセルロースを生化学物質の分離剤として用いた
場合には、他の架橋された第４級窒素含有水溶性高分子
を用いた場合よりも高い分離効果が得られる。本発明を
説明するために、架橋されたカチオン化ヒドロキシアル
キルセルロースの例を用いて詳しく説明する。

本発明に用いる架橋されたカチオン性ヒドロキシアルキ
ルセルロースの製造法については、特に限定はなく、例
えば特願昭61−217672号（特開昭63−72701号）に示さ
れたカチオン化ヒドロキシアルキルセルロースの製造法
においてカチオン化剤の添加時に架橋剤を加えて反応さ
せれば反応性・経済性の点で有利である。

また、特開昭56−62801で開示されるように、セルロー
スエーテルを水と可溶性有機溶媒とからなる混合溶媒中
で、グリシジルトリアルキルアンモニウムハライドと反
応せしめて、得られるカチオン性セルロースエーテル
を、架橋剤で架橋させて用いてもよい。

架橋されたカチオン性ヒドロキシアルキルセルロースの
製造に用いられるアルキレンオキシドとしてはエチレン
オキシド、プロピレンオキシド並びに各種ブテンオキシ
ドが挙げられる。

このアルキレンオキシドの添加量を変えることにより種
々の置換度を持ったヒドロキシアルキルセルロースを得
ることができる。

使用するアルキレンオキシドの種類によって、カチオン
性ヒドロキシエチルセルロース，カチオン性ヒドロキシ
プロピルセルロース，カチオン性ヒドロキシブチルセル
ロースの架橋物が得られる。この中では架橋されたカチ
オン性ヒドロキシエチルセルロースが最も好ましく、取
扱いが簡単で、最も高い分離効果が得られる。また、架
橋されたカチオン性ヒドロキシアルキルセルロースの製
造に用いられるカチオン化剤としては、グリシジルトリ
アルキルアンモニウムハライドあるいはそのハロヒドリ
ン型のものが使用できる。例えばグリシジルトリメチル
アンモニウムクロリド，グリシジルトリエチルアンモニ
ウムクロリド，グリシジルトリメチルアンモニウムブロ
ミド,3−クロロ−２−ヒドロキシプロピルトリメチルア
ンモニウムクロリドなどである。

またカチオン化ヒドロキシアルキルセルロースの架橋剤
としてはエピクロルヒドリン,1,3−ジクロル−２−プロ
パノール,1,4−ビス−（2,3,エポキシプロポキシ）−ブ
タンなどが挙げられる。

また架橋剤の使用量は一般にグルコースのモル数に対し
て１％から20％程度のモル数が望ましい。架橋剤の使用
量が、この範囲外の場合は分離する性能が十分ではな
い。

パイロジェン、核酸、及び核酸から選ばれる生化学物質
の分離剤の利用方法を、架橋されたカチオン性ヒドロキ
シアルキルセルロースを用いた核酸の分離方法の例を用
いて説明する。

前述の製造方法などで得た架橋したカチオン性ヒドロキ
シアルキルセルロースを核酸を含む水溶液、あるいは菌
体抽出液に加えた後、スターラなどを用いてよく撹拌す
る。その後静置して、核酸を吸着している架橋したカチ
オン性ヒドロキシアルキルセルロースを沈降させ、その
上清液を得る。あるいは過・遠心などにより、架橋し
たカチオン性ヒドロキシアルキルセルロースを分離し、
その上清液を得る方法によって核酸を分離できる。架橋
したカチオン化ヒドロキシアルキルセルロースの添加量
は、除去しようとする核酸含有溶液の核酸含有量によっ
て調整するが、一般に核酸のモル数に対してカチオン基
のモル数が等モルあるいはそれ以上の添加が望ましい。

本発明の生化学物質の分離剤は、例えば上記の例のよう
な使用方法で使用可能であるが、もちろん上記に限定さ
れるものではない。他の使用方法の例としては、例えば
一般に行なわれているように架橋されたカチオン性ヒド
ロキシアルキルセルロースをカラムに充填して使用する
方法でもよい。この場合、カラムに充填された架橋され
たカチオン性ヒドロキシアルキルセルロースの上から核
酸を含む溶液を流すと、その流出液は核酸を含まない溶
液となる。

上記のように核酸を分離する場合について特に詳しく説
明したが、これらの生化学物質の分離剤の使用方法は、
核酸関連物質や、パイロジェンを分離する場合であって
も全く同様の使用方法が適用できる。

〔発明の効果〕

本発明の生化学物質の分離剤は下記の実施例でも明らか
になるように、パイロジェン、核酸、及び核酸関連物質
から選ばれる生化学物質を、一操作だけで、十分な効率
で分離することができ、しかも共存する他の薬剤が分解
などを受けることもなく、しかも、分離後の溶液中に生
化学物質の分離剤が残存することがないという優れた性
質を有するものである。

分離後の溶液中に生化学物質の分離剤が残存しないの
は、架橋された第４級窒素含有水溶性高分子が十分に架
橋されているためであり、水溶液中で膨潤することはあ
っても、水溶液中に溶出して水溶液中に残存することは
ない。

以下に本発明を実施例を用いて説明するが、本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない。

（比較例１）キトサンを用いた市販の核酸除去剤（品番Ｃ−7,栗田工
業）を用い、その２％溶液を調整した。

この水溶液1ccを、仔牛の胸線核酸1mgを0.15M NaCl,10c
cに溶解した液に加えた後10分間スターラで撹拌する。
その後30分間5000rpmで沈殿物を遠心分離し、上清液を
分取した。この上清液中に含まれる核酸量を測定したと
ころ95％の核酸が除去された。

しかしこの上清液中に残存している核酸除去剤の含量を
測定したところ、核酸溶液に加えた元の核酸除去剤の30
％が上清液中に残存していた。

（比較例２）カチオン化剤としてグリシジルトリメチルアンモニウム
クロリドを用いたカチオン化ヒドロキシエチルセルロー
ス（カチオン化剤の置換度1.5）の２％水溶液を調整し
た。この水溶液1ccを、仔牛の胸線核酸1mgを0.15M NaC
l,10ccに溶解した液に加えた後、10分間スターラで撹拌
する。その後30分間、5000rpmで沈殿物を遠心分離し、
上清液を分取した。この上清液に含まれる核酸量を測定
したところ98％の核酸が除去された。

しかしこの上清液中に残存しているカチオン化ヒドロキ
シエチルセルロースの含量を測定したところ、核酸溶液
に加えた元の核酸除去剤の20％が上清液中に残存してい
た。

（実施例１）カチオン化剤としてグリシジルトリメチルアンモニウム
クロリドを用いたカチオン化ヒドロキシエチルセルロー
ス（カチオン化剤の置換度1.1,ヒドロキシエチル基の置
換度1.7）に架橋剤である1,3−ジクロル−２−プロパノ
ールをグルコースのモル数に対して２％加えて反応させ
架橋した。

この架橋したカチオン化ヒドロキシエチルセルロース0.
1gを、仔牛の胸線核酸1mgを0.15M NaCl,10ccに溶解した
液中に加えた後10分間スターラで撹拌する。その後10分
間2000rpmで架橋ゲルを遠心分離し、上清液を分取し
た。

この上清液に含まれる核酸量を測定したところ98％の核
酸が除去された。

またこの上清液中には架橋したカチオン化ヒドロキシエ
チルセルロースは全く存在していない。

（実施例２）カチオン化剤としてグリシジルトリメチルアンモニウム
クロリドを用いたカチオン化ヒドロキシエチルセルロー
ス（カチオン化剤の置換度1.1,ヒドロキシエチル基の置
換度1.7）に架橋剤であるエピクロルヒドリンをグルコ
ースのモル数に対して２％加えて反応させ架橋した。

（実施例３）カチオン化剤としてグリシジルトリメチルアンモニウム
クロリドを用いたカチオン化ヒドロキシエチルセルロー
ス（カチオン化剤の置換度1.1,ヒドロキシエチル基の置
換度1.7）に架橋剤である1,3−ジクロル−２−プロパノ
ールをグルコースのモル数に対して２％加えて反応させ
架橋した。

この架橋したカチオン化ヒドロキシエチルセルロース0.
1gをプラスチック製のミニカラムに充填し、上部より蒸
留水を流して洗浄した後、仔牛の胸線核酸1mgを0.15M N
aCl,10ccに溶解した液を流して、その流出液を回収し
た。この流出液に含まれる核酸量を測定したところ99.5
％の核酸が除去された。

またこの流出液中には架橋したカチオン化ヒドロキシエ
チルセルロースは全く存在していない。

（実施例４）カチオン化剤として３−クロロ−２−ヒドロキシプロピ
ルトリメチルアンモニウムブロミドを用いたカチオン化
ヒドロキシエチルセルロース（カチオン化剤の置換度0.
6,ヒドロキシエチル基の置換度1.7）に架橋剤である1,3
−ジクロル−２−プロパノールをグルコースのモル数に
対して２％加えて反応させ架橋した。

この上清液に含まれる核酸量を測定したところ96％の核
酸が除去された。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】架橋された第４級窒素含有水溶性高分子か
らなる、パイロジェン、核酸、及び核酸関連物質から選
ばれる生化学物質の分離剤。
【請求項２】架橋された第４級窒素含有水溶性高分子は
架橋されたカチオン性ヒドロキシアルキルセルロースで
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のパイ
ロジェン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる生化学
物質の分離剤。
【請求項３】架橋された第４級窒素含有水溶性高分子は
架橋されたカチオン性ヒドロキシエチルセルロースであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載のパイロ
ジェン、核酸、及び核酸関連物質から選ばれる生化学物
質の分離剤。
【請求項４】架橋された第４級窒素含有水溶性高分子は
架橋されたカチオン性キトサンであることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載のパイロジェン、核酸、及び
核酸関連物質から選ばれる生化学物質の分離剤。