JPH02100683A - フタル酸および／またはその塩の分解系遺伝子を組み込んだハイブリツドプラスミドおよびこれを含有する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、フタル酸および／またはその塩分解系遺伝子
を組み込んだハイブリッドプラスミドおよびそれを含有
する微生物に関する。

〔従来の技術〕

現在、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、
アルカリジェネス（Ａｌｃａｌｉ　ｅｎｅｓ）属、アエ
ロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ミクロコツカス（
Ｍｉｃｒｏ−ｃｏｃｃｕｓ）属、ノカルデイア（Ｎｏｃ
ａｒｄｔａ）属、アリスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒ　ｎｅｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）属、そして、バチルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）属などに属するフタル酸分解菌が、分離、同定さ
れている。また、フタル酸の分解経路については、シュ
ードモナス属に代表されるような、フタル酸、４．５−
ジヒドロキシフタル酸、プロトカテキン酸、そして、芳
香環の開裂と続く経路、ミクロコツカス属に代表される
ような、フタル酸、３．４−ジヒドロキシフタル酸、プ
ロトカテキン酸、そして、芳香環の開裂と続く経路；さ
らに、バチルス属に代表されるような、フタル酸、安息
香酸を経て、芳香環の開裂へと分解されていく経路など
が知られている。

（発明が解決しようとする課題） しかし、従来のフタル酸分解菌は、フタル酸の分解能は
高いものの増殖力が弱いものや、増殖力は強いがフタル
酸の分解能が十分でないものなどが多く、未だ工業的な
利用に対して満足すべきものではなかった。

（課題を解決するための手段） そこで本発明者らは、微生物によるフタル酸および／ま
たはその塩の分解系について遺伝子レベルで検討した結
果、シュードモナス属に属する微生物の遺伝子を組み込
んだプラスミドを調製し、これにより形質転換された微
生物が良好なフタル酸および／またはその塩の分解能を
発揮することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はシュードモナス属に属する微生物に
由来するフタル酸および／またはその塩の分解系遺伝子
であって、フタル酸および／またはその塩をフタル酸お
よび／またはその塩、　４，５−ジヒドロ−４，５−ジ
ヒドロキシフタル酸および／またはその塩、４．５−ジ
ヒドロキシフタル酸および／またはその塩、プロトカテ
キン酸および／またはその塩の順に分解するために必要
な遺伝子を組み込んでなるハイブリッドプラスミド（以
下、単に「ハイブリッドプラスミド」と称する）、およ
びハイブリッドプラスミドを含有するフタル酸および／
またはその塩の分解能を有する微生物を提供するもので
ある。

なお、本発明において塩とは、ナトリウム塩、カリウム
塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などを示すものであ
る。

本発明のハイブリッドプラスミドは、例えば次の如くし
て製造される。

すなわち、（１）シュードモナス属に属し、フタル酸お
よび／またはその塩（以下、これらを「フタル酸」と総
称する）の分解能を育する微生物より、フタル酸分解系
遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離し、次いで（２）得られ
たＤＮＡ断片を適当なベクターＤＮＡに組み込むことに
より、本発明のハイブリッドプラスミドが製造される。

次にこの各々の工程について説明する。

（１）フタル酸分解系遺伝子を含むＤＮＡ断片の分離本
発明のハイブリッドプラスミドを構成するフタル酸分解
系遺伝子の供給源としては、フタル酸を唯一の炭素源ま
たはエネルギー源として利用しつる能力を有し、かつ、
フタル酸を４．５−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシフ
タル酸および／またはその塩、　４，５−ジヒドロキシ
フタル酸および／またはその塩、プロトカテキン酸およ
び／またはその塩と分解するシュードモナス属に属する
微生物であればよく、例えば本発明者が自然界より初め
てフタル酸分解菌として分離し同定したシュードモナス
・プチダＮＭ）１１０２−２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　匹旦ハＮＭＨ１０２−２）などを挙げることができる
。

なお、木菌株の蘭学的性質は以下のとおりである。

ａ）形態的性質 （１）形　　　　　　　　　桿菌 大きさ （２）運動性 鞭毛 （３）胞子 （４）ダラム染色 ｂ）生理的性質 （１）脱窒反応 （２ＭＲテスト （３ＶＰテスト （４インドールの生成 （５硫化水素の生産 （６澱粉加水分解能 （７）ゼラチン加水分解能 （８）カゼイン加水分解能 （９）色素の生成 （ｌＯ）ウレアーゼ （１１）オキシダーゼ （１２）カタラーゼ （１３）リバーセ ｏ、ｓ　　ｘ　　ｔ　　〜　２　μ　ｍあり 極鞭毛１〜４本 なし 陰性 陰性 陰性 陰性 なし なし なし なし なし キングＢ培地で水溶 性蛍光色素生成 陰性 陽性 陽性 陰性 （１４）アルギニンジヒドロラーゼ　　　陽性（１５）
ポリ−β−ヒドロキシ ブチレート（ＰＨＢ）の蓄積　　　　なしく１６）プロ
トカテキン酸の開裂　　　オルト開裂（１７）４１℃で
の生育　　　　　　　　陰性（１８）［）Ｈ３，６陰性 （１９）栄養要求性　　　　　　　　　　なしく２０）
酸素に対する特性　　　　　　絶対好気性（２１）Ｏ−
Ｆテスト　　　　　　　　　酸化的（２２）資化性　　
　Ｄ−グルコース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−アラビノー
ス、 Ｄ−フラクトース、クエン酸 プロピオン酸、安息香酸、ｐ −ヒドロキシ安息香酸、酢酸 Ｃ）各種培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板　　　生育良好、円形、金縁、淡黄
褐色 （２）肉汁寒天斜面　　　生育良好、糸状（３）肉汁液
体　　　　　生育良好、白濁、被膜形成、沈漬あり （４）肉汁ゼラチン穿刺　生育良好、液化せず（５）リ
ドマスミルク　　アルカリ性 以上の菌学的性質は、バージイーズ・マニュアル・オブ
・システマチック・バクテリオロジー第１巻（Ｂｅｒｇ
ｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、１）　　に記載さ
れたシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　ｐｕｔｉｄａ）の菌学的性質と同一のものである。

なお、ＮＭＨ１０２−２は、通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所に徹工研菌寄第１０２０１号（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ−１０２０１）として寄託されている。

フタル酸分解系遺伝子を含むＤＮＡ断片を得るために先
立つ全ＤＮＡの微生物細胞からの抽出は、例えばＭａｒ
ｍａｒの方法（Ｍａｒｍｕｒ、　Ｊ、　１９６１゜Ｊ、
　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、３：２０８−２１８）によって
行うことができる。微生物細胞から抽出した全ＤＮＡの
断片化は、制限酵素による処理、塩基配列特異性のない
エンドヌクレアーゼによる処理、機械的処理などによっ
ても行うことができるが、制限酵素による処理が好まし
い。

（２）　　ＤＮＡ断片のベクターＤＮＡへの組み込み（
１）で得たＤＮＡ断片を組み込むベクターＤＮＡとして
は、シュードモナス属に属する微生物内で安定に保持さ
れるプラスミドであれば、特に制限されない。このよう
なプラスミドとしては、例えば、Ｐ群、Ｗ群などに分類
されるプラスミドから得られたクローニングベクターな
どが挙げられる。

このベクターＤＮＡに（１）で得たＤＮＡ断片を組み込
む方法としては、例えば微生物細胞から抽出した全ＤＮ
Ａの断片化において、接着末端を生じる制限酵素による
処理を行った場合には、同じ制限酵素でベクターＤＮＡ
を切断し、両ＤＮＡをアニーリングした後、適当なりガ
ーゼでこれらを連結することによりハイブリッドプラス
ミドを得る方法を挙げることができる。また、微生物細
胞から抽出した全ＤＮＡの断片化に平滑末端を生じる制
限酵素による処理または塩基配列特異性のないエンドヌ
クレアーゼによる処理を行った場合、あるいは機械的処
理を行った場合には、適当な制限酵素でベクターＤＮＡ
を切断した後、ホモポリマー結合法を用いて結合するこ
とによりハイブリッドプラスミドを得る方法を挙げるこ
とができる。

さらに、本発明のハイブリッドプラスミドとしては、上
記のようにして得られたハイブリッドプラスミドを適当
な制限酵素で切断しりガーゼで再結合して得られる縮小
ハイブリッドプラスミドであって、フタル酸をプロトカ
テキン酸および／またはその塩へ分解するのに必要な遺
伝子を保有するハイブリッドプラスミドを挙げることも
できる。

このようにして得られた本発明のハイブリッドプラスミ
ドの受容菌として用い得る微生物としては、用いたクロ
ーニングベクターが安定に保持される宿主菌であればよ
く、Ｐ−４群のＲ５ＦＩＯＩＯから得られたクローニン
グベクターを用いれば、広くダラム陰性菌に適用するこ
とができる。しかし、シュードモナス属に属する微生物
に由来のフタル酸分解系遺伝子の発現を良好にならしめ
るためには、受容菌としてシュードモナスに属する微生
物を用いることが好ましい。

このような受容菌にハイブリッドプラスミドを含有せし
める方法としては、例えばＭｏ１ｈｏｌｔらの方法（Ｍ
ｏｌｈｏｌｔ、　Ｂ、、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｄｏｓｌｒｆ
３ｃｉｌ。

１９７８、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕ
ｎｓ、８２：４７７−４８３）Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ
らの方法（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ、　Ｍ、。

ａｎｄに、Ｔ、Ｔｌａｍｉｓ、１９８２．　Ｃｕｒｒ、
Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、９６．４７−６７）などの形質転換方
法、またはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ）にハイブリッドプラスミドを形質転換し
、ヘルパープラスミドの補助下でシュードモナス属に属
する微生物などの受容菌に接合伝達する方法が挙げられ
る。

なお、本発明のハイブリッドプラスミドが有する遺伝子
のフタル酸分解様式と遺伝子群との関係は例えばフタル
酸を例にすると次に示すとおりである。

ここで、Ｅｌ、Ｅ２およびＥ、は反応を司る酵素を示し
、Ｅｌはフタル酸オキシゲナーゼとフタル酸オキシゲナ
ーゼリダクターゼ、Ｅ２は２．６−シクロへキサジエン
−４，５−ジオール−１，２−ジカルボン酸デヒドロゲ
ナーゼ、Ｅ、は４，５−ジヒドロキシフタル酸デカルボ
キシラーゼを示す。

また、本発明のハイブリッドプラスミドにはこれらの酵
素を産生ずる遺伝子が存在し、これらの遺伝子はオペロ
ンを形成している。また、これらの遺伝子にはプロモー
ターが接続している。

（実施例） 以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ （１）フタル酸資化性細菌のスクリーニングフタル酸を
唯一の炭素源、エネルギー源として生育することができ
る微生物を獲得するために、各地の土壌、ヘドロ、活性
汚泥、廃水などを４６試料集め、これらをフタル酸を唯
一の炭素源とする培地による集積培養を行い、１１６株
のフタル酸資化性菌を分離した。このうち、３４株を選
びフタル酸の分解経路を検討した結果、フタル酸を４．
５−ジヒドロキシフタル酸からプロトカテキン酸へと分
解する代謝系をもつ菌株が３２株あり、同定の結果、こ
れらのうち２０株はすべてシュードモナス属に属してい
ることがわかった。その内訳は、シュードモナス・プチ
ダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）が５株、
シュードモナス・シェードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　　ｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）
が１株、シュードモナス・アシトポランス（ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）が５株、シュー
ドモナス・テストステロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）が８株、そしてシュードモ
ナス・シュードフラバ（２）フタル酸分解系遺伝子を含
む全ＤＮＡの抽出（１）で得たシュードモナス・プチダ
のうちのＮＭＨ１０２−２をＬ培地（トリプトン１重量
％、酵母エキス０．５重量％、塩化ナトリウム１重量％
、グルコース０．１重量％、ｐＨ７）で３０℃で１晩培
養し、菌体を集菌後、Ｍａｒｍａｒの方法に準拠して全
ＤＮＡを抽出し常法により精製した。

（３）ベクターＤＮＡの調製 ベクタープラスミド　ｐＭＦＹ４０（Ｆｕｋｕｄａ、Ｍ
、、に。

Ｙａｎｏ、　１９８５．　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、　４９：２７１９−２７２４）は、これらのプラ
スミドを保有する大腸菌をテトラサイクリン（１０μｇ
／ｍｊ２）を含有するし培地で３７℃で１晩培養し、菌
体を集菌後、従来公知の方法（（：ｌｅ＊ａｌｌ、　Ｄ
、Ｂ、、　ａｎｄ　Ｄ、ＲＨｅｌｉｎｓｋｉ、　　１９
８９．Ｐｒｏｃ、ＮａｔｊＺ　　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ｌＩＳ八、６２１１５９−１１６６）に従って抽出、精
製した。

（４）　　ＤＮＡ断片のベクターＤＮＡへの組み込み（
２）で得たＮＭＨ１０２−２の全ＤＮＡ　と（３）で得
たベクタープラスミドｐＭＦＹ４０を、それぞれＥｃｏ
ＲＩで切断した後、混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理
してハイブリッドプラスミドを形成させた。

（５）エシェリヒア・コリの形質転換 （４）で得たハイブリッドプラスミドを用いて、エシェ
リヒア・コリ　ＪＡ２２１（Ｃ１ａｒｋｅ、　Ｌ、。

ａｎｄ　Ｊ、（：ａｒｂｏｎ、　１９７８．Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、　１２０：５１７−５３２）の形質転換を
行い、これをＬ寒天培地（テトラサイクリン１０μｇ／
ｍｕ含有）にコロニがプレート１個当たり２００個ぐら
い生じるように塗布した。３７℃でコロニーを形成させ
た後、し培地を使りてコロニーを洗い取り、（４）で得
たハイブリッドプラスミドにより形質転換されたエシェ
リヒア・コリ　ＪＡ２２１をＦバンクと命名した。

（６）フタル酸分解能マイナス（Ｐｈｔ−）株の取得ト
ランスボゾン５をもつＣｏ１１ｂプラスミド由来のプラ
スミドであるｐＬＧ２２１（Ｂｏｕｌｎｏｉｓ、　Ｇ、
Ｌ、。

Ｊ、Ｍ、　Ｖａｒｉｅｙ、　Ｇ、Ｓ、５ｈａｒｐｅ、　
（：、Ｈ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ。

１９８５、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２００：６
５−６７）をエシェリヒア・コリからＮＭ）１１０２−
２に接合伝達させることによって、トランスボゾン５を
ＮＭＨ１０２−２の遺伝子内に任意に組み込ませ、突然
変異を導入する方法を用い、フタル酸分解能マイナスの
突然変位株（ｐｈｔ−ミュータント）を得た。

次いで、ｐｈｔ−ミュータントを、フタル酸を炭素源と
して生育できる菌株のみを特異的に殺すペニシリンＧ−
Ｄ−シクロセリン法により濃縮し、フタル酸を責化でき
なくなった菌株からなるコロニーをレプリカ法で選別し
た。このコロニーについては、実験操作時の他の菌の混
入でないことを確認し、その１ミユータントをシュード
モナス・プチダＭ２と命名した。

（５）で得たＦバンクから、（６）　で取得したシュー
ドモナス・プチダＭ２に接合伝達法を用いてハイブリッ
ドプラスミドを導入した。ヘルパープラスミドには、ｐ
ＲＫ２０１３（Ｆｉｇｕｒｓｋｉ、　Ｄ、Ｈ，。

ａｎｄ　Ｄ、Ｒ，Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ、　１９７９．　Ｐ
ｒｏｃ、ＮａｔＩＬ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８：１６４８−１６５２）を用
いた。

（８）フタル酸　解能プラス（Ｐｈｔ”）株のスクリー
ニング 接合伝達法の選択は、フタル酸オキシゲナーゼの有無に
よって第１次スクリーニングを行い、フタル酸オキシゲ
ナーゼ陽性の株については更にフタル酸の資化性が回復
していることを確認した。このようにして得られた、フ
タル酸を唯一の炭素源として良好な生育を示す株１０株
を任意に選び、プラスミドの制限酵素切断パターンを検
討した結果、すべて同一のプラスミドであることが分か
り、このプラスミドをｐＨＴｃ１０と命名した。

（９）　ｐＨＴｃ１０プラスミドの解析（８）で得られ
たｐＨＴｃ１０プラスミドの制限酵素切断点地図を第１
図に示す。

ｐＨＴｃ１０は、１１．６Ｋｂのベクタープラスミドｐ
ＭＦＹ４０のＥｃｏＲＩサイトに、７ＫｂのＤＮＡ断片
が挿入されたハイブリッドプラスミドである。

次いで、ＮＭＨ１０２−２の全ＤＮＡのＥｃｏＲＩ完全
消化物をアガロース電気泳動で分画し、ｐＨＴｃ１０プ
ラスミドの１．３ＫｂのＢａｍＨＩ　−ＢａｍＨＩ断片
を３２ｐでラベルしたプローブＤＮＡを用いてサザンハ
イプリダイゼーションを行い、プローブＤＮＡが７にｂ
に相応するＥｃｏＲＩ消化断片のみにハイブリダイゼー
ションしたことにより、前記ＤＮＡ断片はシュードモナ
ス・プチダＮＭＨ１０２−２由来であることを確認した
。

（５）および（７）と同様の方法を用いて、（４）で得
られたｐＨＴｃ１ｏでエシェリヒア・コリ　Ｊへ２２１
の形質転換を行い、続いてシュードモナス・エルギノー
ザ　ＩＦｏ　１３２−７ｌ３２−７５（Ｐｓｅｕｄｏ　
ａｅｒｕｇｉ−ｎｏｓａ　ＩＦＯ１３２７５）　　シュ
ードモナス・プチダＩＦＯ１２６５３（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＩＦＯ１２８５３）およびシ
ュードモナス・フルオレッセンスＩＦＯ１２０５５（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ＩＦ
Ｏ１２０５５）に接合伝達法を用いて、ｐＨＴｃ１０を
各々導入した（これらの菌株は、プロトカテキン酸およ
び／またはその塩以降の代謝酵素群を有しているが、フ
タル酸からプロトカテキン酸および／またはその塩への
代謝酵素群を有していない）。

その結果得られた新規ｐＨＴｃ１０含有株はすべてフタ
ル酸を唯一の炭素源として生育を示すようになった。

（１１）　ＨＴＣＩＯプラスミドの持つ遺伝情報の検討
（１０）と同様の方法を用い、（９）で得られたｐＨＴ
ｃ１０プラスミドを、フタル酸資化能を有していないが
、弱いながらプロトカテキン酸および／またはその塩の
資化能を有しているシュードモナス・プチダＰｐＹ１０
１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａＰｐＹｌｏ
ｌ）　　に導入した。この株をシュードモナス・プチダ
ＰｏＹ１０１／ｐＨＴｃ１０と命名した〔微工研菌寄第
１０２０３号〕。

次いで、ｐＨＴｃ１０プラスミドを導入したシュードモ
ナス・プチダＰｐＹ１０１のフタル酸培養菌株（０，２
重量％フタル酸と　０．２重量％コハク酸を炭素源とし
、２０μｓ／ｍＪｌのテトラサイクリンと２０μｇ／ｍ
ＩＬのメチオニンを含む合成培地で対数増殖後期まで生
育させる）を集菌洗浄し、３ｍｇ蛋白質／ｎ＋Ｑになる
ようにあらかじめ３０℃に保温しておいた２、５ｍＭフ
タル酸ナトリウムを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ８）に懸濁した。この条件下で産生される酵素を使
い、トリス緩衝液中で３０℃９０分間フタル酸を変換さ
せる静止菌体変換実験を行った。この結果、反応液中に
フタル酸に相応するＵｖ吸収スペクトルがなくなり、か
つ変換物質らしきＵＶ吸収も観察されなかった。

従って、ｐＨＴＣ１０プラスミドには、フタル酸をプロ
トカテキン酸および／またはその塩に分解する酵素群を
コードする遺伝子が存在することが判明した。

（発明の効果） 本発明のハイブリッドプラスミドを利口９゛ることによ
り、増殖力は強力だがフタル酸分解能を有さない微生物
を、フタル酸分解能を有する新規な微生物に転換せしめ
ることができる。

このような新規な微生物を用いることにより、例えばプ
ラスチック製造膜内で廃水中に多量混入するフタル酸誘
導体の処理を効率的に行うことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ハイブリッドプラスミドｐｉ（ＴＣ：１０の
制限酵素切断点地図を示す。 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シュードモナス属に属する微生物に由来するフタル
   酸および／またはその塩の分解系遺伝子であつて、フタ
   ル酸および／またはその塩をフタル酸および／またはそ
   の塩、４，５−ジヒドロ−４，５−ジヒドロキシフタル
   酸および／またはその塩、４，５−ジヒドロキシフタル
   酸および／またはその塩、プロトカテキン酸および／ま
   たはその塩の順に分解するために必要な遺伝子を組み込
   んでなるハイブリッドプラスミド。 ２、請求項１記載のハイブリッドプラスミドを含有する
   フタル酸分解能を有する微生物。