JPH02109997A - パーオキシダーゼ酵素反応を用いた特定成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は特定成分の測定方法に関し、特にパーオキシダ
ーゼの酵素反応を用いる特定成分の測定方法、更に該反
応における形成色素の安定化に関する。

〔発明の背景〕

生体成分などの特定成分を検出する各種の分析法が開発
されて来ているが、それらの方法の中膜も精度の高い方
法として、該特定成分とこれに対して特異的に結合しう
る物質（以後特異結合物質と称する）、例えば抗原と抗
体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン、プ
ロティンＡとＩ　ｇ　Ｇ　ｓホルモンとレセプタ、酵素
と基質等の間の特異的結合反応を用いる方法が知られて
いる。

一般的には何らかの標識（ラベル）を付した特異結合物
質（以後標識体と称する）を用い特定成分に応じて変化
した該標識のシグナルを検出することにより特定成分の
測定が行われる。

特に支持体に直接的にまたは間接的に担持させた特定成
分を標識体と反応させ、両者の複合体として標識体を固
定し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナルを
検出する方法が適宜用いられる。

例えば電気泳動した蛋白質生体成分（特定成分）をゲル
からニトロセルローズ膜上に転写担持し、標識体たとえ
ば抗体標識体と反応させシグナルを検出する方法、ＴＬ
Ｃプレート上に展開した脂質等の特定成分に標識体を反
応させシグナルを検出する方法、膜上でＤＮＡと該ＤＮ
Ａに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応させシグナル
を検出する方法或は免疫組織化学染色法などである。

これらの方法により、特定成分の定量や特定成分の特異
結合物質との反応性だけでなく、特定成分もしくは特異
結合物質の性質、存在状態などに対する多大な情報をう
ろことができる。例えば電気泳動後膜上に転写、担持さ
れた蛋白質や核酸、またはＴＬＣ上に展開した脂質成分
等の生体の特定成分と該特定成分に対する標識体とを結
合させた複合体上にシグナルを検出する方法に於ては特
定成分のシグナルの位置、移動度から該特定成分の分子
量、等電点或は極性等の情報かえられる。

また免疫組織化学染色法に於ては、組織上の目的とする
特定成分の存在場所、状態等の情報かえられる。

前記した、支持体上に直接または間接的に担持させた複
合結合体上に実質的に特定成分量に応じてシグナルを検
出する特定成分の測定では対象とする特定成分が微量で
あるため標識が高感度に検出されること、また特定成分
に対するより多くの情報をうるため標識の検出法が高い
分解能をもったものであることが必須である。

この要求を満たすために、従来から特異結合物質の標識
としては、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素
等が用いられている。

しかしながら、これらのうち放射性同位元素を用いた場
合は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は投資に巨費を要す
る等の問題があり、更に支持体に担持させｔ；標識体上
にシグナルを検出する際には写真感光材料の感光、現像
など長い時間と煩雑な操作を要する欠点がある。

また、蛍光物質もしくは発光物質を用いる場合は特殊な
装置、設備が必要である。

一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成色素
はたやすく可視化でき、定量も可能である。従来、標識
酵素としてパーオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼ等が用いられてきた。支持体
上に担持せしめた複合結合体上に酵素反応により色素を
生成、沈着させる方法において、標識酵素としてパーオ
キシダーゼが主として用いられ、その際、基質として、
従来ジアミノベンジジン、０−ジアニシジン、４−クロ
ル−１−ナフトール等が使用されてきた。

しかしながら、ジアミノベンジジンや０−ジアニシジン
は毒性が強くバックグランドが出やすい欠点がある。４
−クロル−１−す７トールは他に比べやや感度が高いが
、より微量の特定成分を測定するため、もしくは、特定
成分に対するより多くの情報を明確に得るには、感度は
充分とは言えない。

本発明者は、すでに簡易に且つ高感度、高分解であり、
しかも迅速な特定成分の測定方法を開発し、特開昭６１
−１５０７２３号、同６１−２１６２９９号に開示した
。すなわち、測定対象の特定成分と、パーオキシダーゼ
を標識として有する標識体とからなる複合結合体を支持
体上に担持せしめ、該複合結合体上にパーオキシダーゼ
の酵素反応によって色素を形成、沈着せしめる測定方法
において、該酵素反応の基質として、前者は過酸化水素
、芳香族第一級アミン化合物及びフェノール化合物の三
者を用いる測定方法であり、後者は過酸化水素、芳香族
第一級アミン化合物及び活性メチレン化合物の三者を用
いる測定方法である。

測定対象の特定成分とパーオキシダーゼを標識として有
する標識体とからなる複合結合体を支持体上に担持せし
め、該複合結合体上にパーオキシダーゼの酵素反応によ
って色素を形成、沈着せしめ′る特定成分の測定方法に
おいて、特にパーオキシダーゼの酵素反応の基質として
、過酸化水素、芳香族第一級アミン化合物及びフェノー
ル化合物の王者を用いる上記特定成分の高感度測定方法
においては、膜上に形成、沈着された色素が長期保存に
おいて特に光による影響で経時的に分解される事が明ら
かとなった。このような色素分解は、特定成分の測定の
正確さや、記録の長期保存の面で大きな問題となる。

〔発明の目的〕

前記の状況に照し、本発明の目的は生成色素の分解が抑
制された安定なかつ高感度な特定成分の測定方法の提供
にある。

〔発明の構成〕

前記した本発明の目的は、測定対象の特定成分と、パー
オキシダーゼを標識として有する標識体とから成る複合
結合体を支持体上に担持せしめ、該複合結合体上に、パ
ーオキシダーゼの酵素反応によって色素を形成、沈着せ
しめる特定成分の測定方法において、該酵素反応後に支
持体をポリビニルピロリドンに接触させる過程を含むこ
とを特徴とする特定成分の測定方法により達せられる。

本発明に使用し得るポリビニルピロリドンはビニルピロ
リドンのホモポリマーであることが望ましいが、例えば
酢酸ビニルやスチレン等その他の七ツマ−とのコポリマ
ーであっても良い。その分子量は特に限定されないがｉ
ｏ、ｏｏｏカら１．０００．０００が好ましい。

ポリビニルピロリドンは本発明の使用に際しては溶液状
態で使用されることが望ましい。溶媒としては生成色素
が溶解しない溶剤であれば有機溶媒或いは水との混合溶
媒であっても良いが、水系溶媒が好ましい。溶液中のポ
リビニルピロリドンの濃度は０．０１％〜５０％が好ま
しく、ｏ、ｉ％〜２０％が特に好ましい。

本発明において、特定成分は支持体に物理的吸着、イオ
ン結合や共有結合のような化学的結合等により直接的に
担持されてもよく、１つ以上の特異結合物質を介して間
接的に担持されてもよい。

又、特定成分を支持体上に直接もくくは間接的に担持せ
しめた後、前記標識体を反応させ前記複合結合体を形成
させてもよいし、・或は複合結合体を形成せしめた後に
該複合結合体を支持体上に直接もしくは間接的に担持せ
しめてもよい。更に標識体は該特定成分と複合結合体を
形成し、支持体に担持されるが、この場合、特定成分と
標識体は直接結合してもよく、１つ以上の他の特異結合
物質を介して結合してもよい。

尚ここで支持体に担持せしめるとは、支持体の表面又は
内部に固定化し支持体から離脱できない状態にすること
を意味する。

また本発明に於て標識体はパーオキシダーゼと抗パーオ
キシダーゼ抗体とで特異結合物質を重複して標識したも
のであってもよい。

本発明において、対象とする特定成分は、その特定成分
に特異的に結合する特異結合物質が得られる物質又は物
質群である。

例えば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂
質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙げられ
る。

また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又は
他の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、特
定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。例えば、蛋白質
、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖類、
酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロティンＡ
１アビジン、ビオチン、レセプター、補酵素、酵素の基
質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられる。

本発明に使用し得る支持体としては、セルロースアセテ
ート、ニトロセルロース、ポリ弗化ビニリデン等の膜；
ポリアクリルアミド等のゲル状支持体ｉＴ　Ｌ　Ｃプレ
ート等のシリカゲル担体；デキストラン、アガロース等
の多糖類及びその誘導体；プレート状、ビーズ状のプラ
スチック、ガラス、金属、繊維、活性炭等が挙げられる
。また組織化学染色においては、組織そのものも支持体
として使用できる。

本発明に係るパーオキシダーゼの酵素反応は、過酸化水
素とパーオキシダーゼの作用により、色原体である基質
を酸化し、色素を生成させるものである。

本発明に使用し得るパーオキシダーゼの基質は、酸化さ
れることにより不溶性の色素を生成し得る化合物であれ
ば良い。一般に酵素免疫染色法や組織染色法に用いられ
る基質が使用可能であり、その例としては、ジアミノベ
ンジジン、０−ジアニシジン、テトラメチルベンジ、ジ
ン、４−クロル−１−ナフトール、３−アミノ−９−エ
チルカルバゾール等が挙げられ、又、特開昭６１−１５
０７２３号で開示した芳香族第一級アミン化合物とフェ
ノール化合物の組合せ、又、特開昭６１−２１６２９９
号で開示した芳香族第一級アミン化合物と活性メチレン
化合物の組合せが挙げられる。特に芳香族第一級アミン
化合物とフェノール化合物を基質として用いる測定方法
に本発明はより有効である。支持体上に担持された特定
成分をパーオキシダーゼ標識体との複合結合体上に色素
を生成沈着せしめるためには、発色用基質試液中に支持
体を浸漬させればよい。

発色用基質試液は適当なｐＨの緩衝液中に基質である過
酸化水素及び色原体を溶解し調製される。

酵素反応により支持体上に色素が充分生成沈着した後、
未反応物質を洗流し、反応を停止する。

支持体とポリビニルピロリドンとの接触は、ポリビニル
ピロリドン溶液中に浸漬する、或いはスプレーにして吹
きつける等により行われる。発色後の洗浄時に洗浄剤と
してポリビニルピロリドン溶液を用いても良く、又、洗
浄後にポリビニルピロリドン溶液に浸漬或いはポリビニ
ルピロリドン溶液を吹きつけても良い。ポリビニルピロ
リドンと接触した支持体は、湿った状態のままで保存し
ても良いが、乾燥して保存した方が有利である。

生成色素についての情報は、目視にて、もしくは技術的
に公知な方法例えば分光光度計を用いて読取る事ができ
る。

ポリビニルピロリドンと接触する事を特徴とする本発明
の測定方法は、該操作を行わない従来法と比較し、生成
色素の分解、特に光による分解が制御され、検出感度が
低下する事なく、色素シグナルの長期間の保存及び正確
な情報の解析が可能となった。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はその実施例によりその範囲を限定されるものではな
い。

実施例１ 燐酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，４：以下ＰＢＳと称す）
に５分間浸漬したニトロセルロース膜を、プロッティン
グ装置（バイオラッド社）に装着した後、膜上に抗原と
して、ＰＢＳに溶解したマウスモノクローナルＩｇＭ抗
体３０ｎｇをドツトプロットした。抗原が担持した膜を
１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳ溶液により４
℃にて１晩ブロツキングを行い、次いでパーオキシダー
ゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体（カッペル社製　；　１
％ＢＪＡ−ＰＢＳ溶液にて２０００倍希釈）と室温にて
２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（和光
純薬社製）−ＰＢＳ溶液にて洗浄後、発色用基質試液中
に浸漬し、発色反応を行った。発色用基質試液は４−ク
ロル−１−ナフトール３０−ｇを含むメタノール１０ｍ
ｆｆにＮ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミドエチ
ル−３−メチル−４−アミノアニリン３／２硫酸ｌ水塩
を含む５０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４；　２
００ａ＋Ｍ塩化ナトリウム含有）５０−〇を加え、更に
、３％過酸化水素水２００μａを加え調製した。

１５分後に膜を発色用基質試液から取り出し、純水にて
５分間ずつ３回洗浄後、各種濃度のポリビニルピロリド
ン（以下ＰｖＰと称す）水溶液に３０分間浸漬した後乾
燥した。安定性の評価は、膜を１８Ｗの蛍光灯から７ｃ
ｍ離れた位置に静置し経時的に色素スポットの反射濃度
を６５０ｎｓ＋にて測定することにより行った。結果を
表１に示す。

表１ 実施例２ 実施例１と同様に発色し、純水にて５分間ずつ３回洗浄
後３％ＰｖＰ水溶液に一定時間浸漬した後乾燥した。評
価は実施例１と同様に行った。結果を表２に示す。

〃　３３％ＰｖＰにて５分間１回洗浄後純水にて５分間
ずつ洗浄 〃　４３％ＰＶＰにて５分間ずつ３回洗浄結果を表３に
示す。

表３ 表２ 水洗によるＰＶＰの除去は、乾燥後の安定性効果を減す
る傾向が示され、乾燥直前のＰＶＰとの接触実施例３ 実施例１と同様に発色した後、以下の種々の洗浄操作を
行った後乾燥し、実施例１と同様に評価し　Ｉこ　。

洗浄操作ｌ　純水にて５分間ずつ３回洗浄〃　２　純水
にて５分間ずつ２回洗浄後３％が有利である事が確認さ
れた。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）測定対象の特定成分と、パーオキシダーゼを標識
   として有している標識体とからなる複合結合体を支持体
   上に担持せしめ、該複合結合体上に、パーオキシダーゼ
   の酵素反応によって色素を形成、沈着せしめる特定成分
   の測定方法において、該酵素反応後に支持体をポリビニ
   ルピロリドンに接触させる過程を含むことを特徴とする
   特定成分の測定方法。
2. （２）パーオキシダーゼの酵素反応の基質として過酸化
   水素、芳香族第一級アミン化合物及びフェノール化合物
   の三者を用いることを特徴とする請求項１記載の特定成
   分の測定方法。
3. （３）パーオキシダーゼの酵素反応により支持体上に形
   成された色素のポリビニルピロリドンとの接触による安
   定化方法。