JPH02138197A - 内皮細胞から誘導された組換え血小板由来成長因子ａ−鎖 - Google Patents
内皮細胞から誘導された組換え血小板由来成長因子ａ−鎖Info
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- JPH02138197A JPH02138197A JP63286918A JP28691888A JPH02138197A JP H02138197 A JPH02138197 A JP H02138197A JP 63286918 A JP63286918 A JP 63286918A JP 28691888 A JP28691888 A JP 28691888A JP H02138197 A JPH02138197 A JP H02138197A
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- C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、非転換ヒト細胞から誘導される血小板由来成
長因子（ＰＤＧＦ）Ａ−鎖又はその変種及び組換えＤＮ
Ａ技術の適用によるそのＤＮＡによる合成に関する。
長因子（ＰＤＧＦ）Ａ−鎖又はその変種及び組換えＤＮ
Ａ技術の適用によるそのＤＮＡによる合成に関する。
均質性へのヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の精製
が報告されている。報告された分子量は２７．５００〜
３５．０００ダルトンの範囲にある。ヒ）ＰＤＧＦは、
強カチオン性且疎水性の蛋白である。ＰＤＧＦは還元剤
に影響され易いまま残っているので、恐らく多くのジス
ルフィド結合による蛋白構造の安定化のために、それは
熱及び化学的変性に対して非常に抵抗性がある。過去１
３年間の研究は主要な関心の成長因子としてＰＤＧＦを
主証し、そして血管の損傷に対する血小板の放出反応に
関して正常の組織の修複過程において役割をはたすもの
と考えられる。
が報告されている。報告された分子量は２７．５００〜
３５．０００ダルトンの範囲にある。ヒ）ＰＤＧＦは、
強カチオン性且疎水性の蛋白である。ＰＤＧＦは還元剤
に影響され易いまま残っているので、恐らく多くのジス
ルフィド結合による蛋白構造の安定化のために、それは
熱及び化学的変性に対して非常に抵抗性がある。過去１
３年間の研究は主要な関心の成長因子としてＰＤＧＦを
主証し、そして血管の損傷に対する血小板の放出反応に
関して正常の組織の修複過程において役割をはたすもの
と考えられる。
ＰＤＧＦは開業起源の細胞について強力なミトゲン性で
ある。さらに、ＰＤＧＦは、単球ｌ、好中球ｌ、繊維芽
細胞及び平滑筋細胞を含むヒトの炎症細胞に関する強力
な化学的誘引物質として生体内で重要な生物学的活性を
有することが示されていた。潜在的なミトゲン及び化学
的誘引物質としてのＰＤＧＦの合わせた生物学的性質は
、ヒトのアテローム性動脈硬化の病因においてさらに炎
症及び傷の治癒における最初の事象のいくつかを含む主
要な剤としてＰＤＧＦｉ示唆している。ＰＤＧＦは、又
異常な血小板放出をともなう骨吸収及び腫瘍細胞の成長
にも関連している。
ある。さらに、ＰＤＧＦは、単球ｌ、好中球ｌ、繊維芽
細胞及び平滑筋細胞を含むヒトの炎症細胞に関する強力
な化学的誘引物質として生体内で重要な生物学的活性を
有することが示されていた。潜在的なミトゲン及び化学
的誘引物質としてのＰＤＧＦの合わせた生物学的性質は
、ヒトのアテローム性動脈硬化の病因においてさらに炎
症及び傷の治癒における最初の事象のいくつかを含む主
要な剤としてＰＤＧＦｉ示唆している。ＰＤＧＦは、又
異常な血小板放出をともなう骨吸収及び腫瘍細胞の成長
にも関連している。
ペプチド成長因子は、傷の治癒を促進することにより損
傷に対する体の反応において重要な役割を演する。唾液
に存在する上皮成長因子は、マウスがその傷をなめると
き、マウスの皮膚の損傷の治癒を加速するものと考えら
れる。
傷に対する体の反応において重要な役割を演する。唾液
に存在する上皮成長因子は、マウスがその傷をなめると
き、マウスの皮膚の損傷の治癒を加速するものと考えら
れる。
上皮成長因子の局所の適用は、中皮の皮膚の損傷、角膜
の剥離の上皮の再生並に角膜切開の増大した引張強さを
促進することが示されている。さらに、転換成長因子及
びワクシニア成長因子は、中皮の熱的損傷における上皮
の再生を促進することが最近示されている。これらの発
見は、成長因子の局所的な適用は、部分的な厚さの剥離
又は火傷の治ゆを促進するのに有用であることを示唆し
ている。ＰＤＧＦの独特な性質及び開業起源の細胞との
その相互関係は、炎症又はアテローム性動脈硬化に対す
る他の製薬上の応用をもたらす。最後に、非転換由来Ｐ
ＤＧＦ Ａ−鎖と細胞の転換から由来した他の変種との
間の相異は、ＰＤＧＦ遺伝子の転換機能の同定又はコン
トロールにとシ有意であることを立証する。
の剥離の上皮の再生並に角膜切開の増大した引張強さを
促進することが示されている。さらに、転換成長因子及
びワクシニア成長因子は、中皮の熱的損傷における上皮
の再生を促進することが最近示されている。これらの発
見は、成長因子の局所的な適用は、部分的な厚さの剥離
又は火傷の治ゆを促進するのに有用であることを示唆し
ている。ＰＤＧＦの独特な性質及び開業起源の細胞との
その相互関係は、炎症又はアテローム性動脈硬化に対す
る他の製薬上の応用をもたらす。最後に、非転換由来Ｐ
ＤＧＦ Ａ−鎖と細胞の転換から由来した他の変種との
間の相異は、ＰＤＧＦ遺伝子の転換機能の同定又はコン
トロールにとシ有意であることを立証する。
ヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、デュエル（ｐ
ｅｕｅｌ ）ら、（１９８４）ｒブラッド（Ｂｌｏｏｄ
）Ｊ６４．９５１〜９５０によｐＡ及びＢとして記述さ
れたポリペプチド鎖のホモダイマーの混合物又はヘテロ
ダイマーよりなる。しかし、ダイマーの構造は、還元又
は蛋白分解剤への曝ｉは不可逆的にＰＤＧＦのミトゲン
性活性を破壊するので、機能的に重要である。結合組織
由来細胞に存在するアフイニテイの高い細胞光面のＰＤ
ＧＦ受容体は、チロシン特異性キナーゼ活性によυＰＤ
ＧＦと反応して、洩々の細胞蛋白の燐酸化及び受容体の
自動燐酸化に導びかれる。ＰＤＧＦに対する他の細胞の
反応は、増大した細胞形質カルシウム濃度、蛋白キナー
ゼＣの活性化、細胞形質アルカリ化、アクチン締維の再
組織化、細胞のオンコージンを含む特異性遺伝子の発現
そしてＤＮＡ合成を含む。
ｅｕｅｌ ）ら、（１９８４）ｒブラッド（Ｂｌｏｏｄ
）Ｊ６４．９５１〜９５０によｐＡ及びＢとして記述さ
れたポリペプチド鎖のホモダイマーの混合物又はヘテロ
ダイマーよりなる。しかし、ダイマーの構造は、還元又
は蛋白分解剤への曝ｉは不可逆的にＰＤＧＦのミトゲン
性活性を破壊するので、機能的に重要である。結合組織
由来細胞に存在するアフイニテイの高い細胞光面のＰＤ
ＧＦ受容体は、チロシン特異性キナーゼ活性によυＰＤ
ＧＦと反応して、洩々の細胞蛋白の燐酸化及び受容体の
自動燐酸化に導びかれる。ＰＤＧＦに対する他の細胞の
反応は、増大した細胞形質カルシウム濃度、蛋白キナー
ゼＣの活性化、細胞形質アルカリ化、アクチン締維の再
組織化、細胞のオンコージンを含む特異性遺伝子の発現
そしてＤＮＡ合成を含む。
ＰＤＧＦ Ｂ−鎖７’Ｌ／カーサ−は、Ｃ−シスプロト
ーオンコージン、サル肉腫ウィルス（ＳＳＶ）の転換遺
伝子Ｖ−シス（ｓｉａ ）の細胞のホモローブによりエ
ンコードされる。
ーオンコージン、サル肉腫ウィルス（ＳＳＶ）の転換遺
伝子Ｖ−シス（ｓｉａ ）の細胞のホモローブによりエ
ンコードされる。
ＰＤＧＦ Ｂ−鎖の周知の配列のアミン末端部分とＶ−
シス生成物のそれとの比較は、１０９個のアミノ酸残基
の列上に９３％相同性の領域を示している。Ｂ ＠ ｍ
ＲＮ Ａは、数種のヒト腫瘍細胞系並に成る正常な細
胞型（内皮細胞、胎盤細胞トロホブラスト及び活性化し
たマクロファージを含む）に検出されてきた。
シス生成物のそれとの比較は、１０９個のアミノ酸残基
の列上に９３％相同性の領域を示している。Ｂ ＠ ｍ
ＲＮ Ａは、数種のヒト腫瘍細胞系並に成る正常な細
胞型（内皮細胞、胎盤細胞トロホブラスト及び活性化し
たマクロファージを含む）に検出されてきた。
■−シス遺伝子の一次翻訳生成物は、二量体化並にＮ−
及びＣ−末端における蛋白分解処理によυ修飾されるこ
とが示され、ＰＤＧＦ Ｂ−鎖のダイマーに似たそして
抗ＰＤＧＦ抗体にニジ認識される生成物を生じた。受容
体結合に関する１２ｓＩ−ＰＤＧＦとの競合に基づいて
、ＰＤＧＦ様生成物の分泌は、ＰＤＧＦ細胞表面受容体
を経るＳＳｖ転換細胞の成長を刺激するように見える。
及びＣ−末端における蛋白分解処理によυ修飾されるこ
とが示され、ＰＤＧＦ Ｂ−鎖のダイマーに似たそして
抗ＰＤＧＦ抗体にニジ認識される生成物を生じた。受容
体結合に関する１２ｓＩ−ＰＤＧＦとの競合に基づいて
、ＰＤＧＦ様生成物の分泌は、ＰＤＧＦ細胞表面受容体
を経るＳＳｖ転換細胞の成長を刺激するように見える。
ＳＳｖにより転換された細胞は、ＰＤＧＦ作用剤の活性
を含みしかも放出することが示されている。さらに、Ｓ
Ｓｖ転換ヒト繊維芽細胞は、ＰＤＧＦ刺激された細胞か
ら形態学的に区別されず、そして転換された表現型は、
培養培地への抗ＰＤＧＦ抗体の添加により完全に破壊さ
れる。
を含みしかも放出することが示されている。さらに、Ｓ
Ｓｖ転換ヒト繊維芽細胞は、ＰＤＧＦ刺激された細胞か
ら形態学的に区別されず、そして転換された表現型は、
培養培地への抗ＰＤＧＦ抗体の添加により完全に破壊さ
れる。
ＰＤＧＦ Ｂ−鎖即ちＳＳＶ転換細胞から０ＰＤＧＦ様
因子が活性ミトゲンを形成しうろことが立証されている
。Ｂ鎖のミトゲン性活性は、又ヒトＢ鎖に似たダイマー
を除いて構築されるブタＰＤＧＦに明らかである。ＰＤ
ＧＦ Ａ鎖は、又ヒト骨肉肝細胞系Ｕ−２Ｏ８から放出
されたＰＤＧＦ様ミトゲンの研究に基づく生物学的活性
を有するだろう。
因子が活性ミトゲンを形成しうろことが立証されている
。Ｂ鎖のミトゲン性活性は、又ヒトＢ鎖に似たダイマー
を除いて構築されるブタＰＤＧＦに明らかである。ＰＤ
ＧＦ Ａ鎖は、又ヒト骨肉肝細胞系Ｕ−２Ｏ８から放出
されたＰＤＧＦ様ミトゲンの研究に基づく生物学的活性
を有するだろう。
骨肉腫由来成長因子（ＯＤＧＦ）が、ＰＤＧＦと同様な
機能的且免疫学的な特徴を有することに加えて、ＰＤＧ
Ｆ受容体に結合することが分った。最近の研究は、蛋白
がＰＤＧＦ Ａ鎖のそれと同一の化学的分断パターン、
クロマトグラフィの性状及びＮ末端アミノ酸配列を示す
ポリペプチド鎖のホモダイマーであることを示している
。それ故、明らかにＰＤＧＦのＡ又はＢの伺れか一つの
遺伝子のホモダイマーの形成は、両方の鎖がＰＤＧＦ受
容体と相互反応することが示されているので、ＰＤＧＦ
作用剤活性の生成に導かれる。
機能的且免疫学的な特徴を有することに加えて、ＰＤＧ
Ｆ受容体に結合することが分った。最近の研究は、蛋白
がＰＤＧＦ Ａ鎖のそれと同一の化学的分断パターン、
クロマトグラフィの性状及びＮ末端アミノ酸配列を示す
ポリペプチド鎖のホモダイマーであることを示している
。それ故、明らかにＰＤＧＦのＡ又はＢの伺れか一つの
遺伝子のホモダイマーの形成は、両方の鎖がＰＤＧＦ受
容体と相互反応することが示されているので、ＰＤＧＦ
作用剤活性の生成に導かれる。
個々の遺伝子によりエンコードされるが、有意な相同性
がＰＤＧＦ Ａ−及びＢ−鎖の間には存在する。Ａ−及
びＢ−鎖のプレカーサーは、アミノ酸レベルで４０％の
相同性をともにする。特に、５６チという大きな相同性
が、成熟鎖内のアミノ酸領域８９〜１８１内に存在する
。ヒトＰＤＧＦの二本の構成鎖は、異る染色体に位置す
る遺伝子によジエンコードされるっヒトＰＤＧＦ Ｂ−
鎖（Ｃ−シス）遺伝子は、染色体２２の長いアームにマ
ツプされるが、ＰＤＧＦＡ−９は、染色体７に位置して
いる。しかし、これらの蛋白は、それらのそれぞれのＣ
−末端において配列の類似性をほとんど有しない。
がＰＤＧＦ Ａ−及びＢ−鎖の間には存在する。Ａ−及
びＢ−鎖のプレカーサーは、アミノ酸レベルで４０％の
相同性をともにする。特に、５６チという大きな相同性
が、成熟鎖内のアミノ酸領域８９〜１８１内に存在する
。ヒトＰＤＧＦの二本の構成鎖は、異る染色体に位置す
る遺伝子によジエンコードされるっヒトＰＤＧＦ Ｂ−
鎖（Ｃ−シス）遺伝子は、染色体２２の長いアームにマ
ツプされるが、ＰＤＧＦＡ−９は、染色体７に位置して
いる。しかし、これらの蛋白は、それらのそれぞれのＣ
−末端において配列の類似性をほとんど有しない。
ポリペプチド例えばＰＤＧＦ Ａ−鎖又はＰＤＧＦ Ａ
−鎖のフラグメントについてコーディングする遺伝子は
、ポリペプチドについてコーディングするＤＮＡフラグ
メン）ｆ組換えＤＮＡ媒体（例えば原核生物又は真核生
物のベクター）にそう人し、そして好適な宿主を形質転
換することによりクローンされる。このような組換えＤ
ＮＡ技術は、現在周知となってきておシ、そして［メソ
ッズ・イン・エンテモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄ８ Ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｊコロウィック（Ｃｏｌｏｗｉ
ｃｋ ）ら、６３．６８巻（１９７８）、１００及び１
０１巻（１９８３）、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ） 、ニュー ・ヨーク、ＮＹ
並にそこに引用されている参考文献（これらは本明細書
において参考文献として引用される）に記述されている
。最も普通に用いられる組換えＤＮＡ方法を具体化する
広範囲の技術的ｓ論は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉａ
）ら［モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ
−、マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）Ｊ （
１９８２）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ）、コールド−スプリング・ハーバ−
１ＮＹに見い出される。
−鎖のフラグメントについてコーディングする遺伝子は
、ポリペプチドについてコーディングするＤＮＡフラグ
メン）ｆ組換えＤＮＡ媒体（例えば原核生物又は真核生
物のベクター）にそう人し、そして好適な宿主を形質転
換することによりクローンされる。このような組換えＤ
ＮＡ技術は、現在周知となってきておシ、そして［メソ
ッズ・イン・エンテモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄ８ Ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｊコロウィック（Ｃｏｌｏｗｉ
ｃｋ ）ら、６３．６８巻（１９７８）、１００及び１
０１巻（１９８３）、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ） 、ニュー ・ヨーク、ＮＹ
並にそこに引用されている参考文献（これらは本明細書
において参考文献として引用される）に記述されている
。最も普通に用いられる組換えＤＮＡ方法を具体化する
広範囲の技術的ｓ論は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉａ
）ら［モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ
−、マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）Ｊ （
１９８２）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ）、コールド−スプリング・ハーバ−
１ＮＹに見い出される。
所望のポリペプチド例えばＰＤＧＦ Ａ−鎖をエンコー
ドしたＤＮＡフラグメントを得る一つの方法は、ｃＤＮ
Ａクローニングを経る。この方法において、メツセンジ
ャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）は、所望の蛋白を生成するこ
とが知られている又は予想される細胞から単離される。
ドしたＤＮＡフラグメントを得る一つの方法は、ｃＤＮ
Ａクローニングを経る。この方法において、メツセンジ
ャーＲＮＡ （ｍＲＮＡ）は、所望の蛋白を生成するこ
とが知られている又は予想される細胞から単離される。
一連の酵素的反応を通して、細胞のｍＲＮ人集団は、相
補性ＤＮＡ（ｃ ＤＮＡ ）にコピーされる。得られた
ｅＤＮＡは、次にクローニング媒体にインサートされ、
次に好適な原核生物又は真核生物の宿主を形質転換する
のに用いられる。得られた遺伝子「ライブラリー」は、
形質転換された宿主細胞の集団よりなり、そのそれぞれ
は単一の遺伝子又は遺伝子フラグメントを含む。それ故
、全ライブラリーは、原料として用いられるｍ ＲＮ
Ａ混合物に存在するコーディング情報の代表的なサンプ
ルを提供する。
補性ＤＮＡ（ｃ ＤＮＡ ）にコピーされる。得られた
ｅＤＮＡは、次にクローニング媒体にインサートされ、
次に好適な原核生物又は真核生物の宿主を形質転換する
のに用いられる。得られた遺伝子「ライブラリー」は、
形質転換された宿主細胞の集団よりなり、そのそれぞれ
は単一の遺伝子又は遺伝子フラグメントを含む。それ故
、全ライブラリーは、原料として用いられるｍ ＲＮ
Ａ混合物に存在するコーディング情報の代表的なサンプ
ルを提供する。
遺伝子ライブラリーは、特定の核酸又は抗体プローブを
用いてスクリーニングされる。核酸グローブは、交雑及
びオートラジオグラフィ技術によりｃＤＮＡの位置を調
べるのに有用である。しかし、このアプローチは、蛋白
のアミノ酸又はＤＮＡ配列の少くとも一部の従前の知識
を必要とする。又、興味のあるエンコードされた蛋白に
特異的な抗体による組換え遺伝子ライブラリーをプロー
ブすることにより、特異的なりローンを同定する方法が
開発されている。
用いてスクリーニングされる。核酸グローブは、交雑及
びオートラジオグラフィ技術によりｃＤＮＡの位置を調
べるのに有用である。しかし、このアプローチは、蛋白
のアミノ酸又はＤＮＡ配列の少くとも一部の従前の知識
を必要とする。又、興味のあるエンコードされた蛋白に
特異的な抗体による組換え遺伝子ライブラリーをプロー
ブすることにより、特異的なりローンを同定する方法が
開発されている。
この方法は、生成蛋白を苦心して調製しなければならな
いので、「発現ベクター」クローニング媒体とともに用
いられうるだけである。この例は、バクテリオファージ
・ラムダｇｔｌｌ系である。
いので、「発現ベクター」クローニング媒体とともに用
いられうるだけである。この例は、バクテリオファージ
・ラムダｇｔｌｌ系である。
一度単離されると、これらのｃＤＮＡは遺伝学的に処理
される。遺伝子フラグメン）Ｕ、完全な遺伝子に集めら
れる。二、三の方法が、宿主ベクター細胞に、限定され
た外来のＤＮＡセグメントを伝達するのに最近用いられ
ている。
される。遺伝子フラグメン）Ｕ、完全な遺伝子に集めら
れる。二、三の方法が、宿主ベクター細胞に、限定され
た外来のＤＮＡセグメントを伝達するのに最近用いられ
ている。
必要な遺伝学的な調節エレメントの添加後、ベクターは
、製造の象めに選択された細胞系から、異種遺伝子例え
ばＰＤＧＦ Ａ−鎖を正確に発現できる。これらの処理
された遺伝子フラグメントによυエンコードされた蛋白
は、天然に見い出せないが、それらは望ましくない生理
学的条件を処理するのに顕著な有用性を有する。
、製造の象めに選択された細胞系から、異種遺伝子例え
ばＰＤＧＦ Ａ−鎖を正確に発現できる。これらの処理
された遺伝子フラグメントによυエンコードされた蛋白
は、天然に見い出せないが、それらは望ましくない生理
学的条件を処理するのに顕著な有用性を有する。
ＰＤＧＦ Ａ−鎖クローンは、ヒ）！静脈内皮細胞由来
ｅＤＮＡライブラリーから単離され、そのＤＮＡ配列は
、悪性グリオームからの既述したｅＤＮＡクローンと比
較して６９塩基対欠失の遺伝子を同定する。このクロー
ンが、悪性グリオームからよりむしろ非転換正常ヒト細
胞から由来することは明白である。それ故、本発明で単
離された遺伝子によりエンコードされたＰＤＧＦ Ａ−
鎖は、正常のＰＤＧＦ Ａ−鎖を表し、そしてその変株
の配列も又含まれるだろう。
ｅＤＮＡライブラリーから単離され、そのＤＮＡ配列は
、悪性グリオームからの既述したｅＤＮＡクローンと比
較して６９塩基対欠失の遺伝子を同定する。このクロー
ンが、悪性グリオームからよりむしろ非転換正常ヒト細
胞から由来することは明白である。それ故、本発明で単
離された遺伝子によりエンコードされたＰＤＧＦ Ａ−
鎖は、正常のＰＤＧＦ Ａ−鎖を表し、そしてその変株
の配列も又含まれるだろう。
本発明は、非転換源から容易に入手しうる量のヒトＰＤ
ＧＦ Ａ−鎖を提供することを可能にした。官能性ＰＤ
ＧＦ Ａ−鎖は、製薬的な応用前に蛋白の同定及び確認
に十分であろう。これは、ヒトＰＤＧＦ Ａ−鎖蛋白を
エンコードするクローニング媒体の構築、陽性の組換え
細胞のスクリーニング並にヒト起源の他の蛋白をほとん
ど含まないヒ）ＰＤＧＦ Ａ−鎖を回収するための単離
／ｆｆ製方法に組換えＤＮＡ手法を応用することによυ
達成されている。
ＧＦ Ａ−鎖を提供することを可能にした。官能性ＰＤ
ＧＦ Ａ−鎖は、製薬的な応用前に蛋白の同定及び確認
に十分であろう。これは、ヒトＰＤＧＦ Ａ−鎖蛋白を
エンコードするクローニング媒体の構築、陽性の組換え
細胞のスクリーニング並にヒト起源の他の蛋白をほとん
ど含まないヒ）ＰＤＧＦ Ａ−鎖を回収するための単離
／ｆｆ製方法に組換えＤＮＡ手法を応用することによυ
達成されている。
同様なりローニング媒体は、他のユニークなヒト蛋白を
エンコードして構築されている。
エンコードして構築されている。
従って、本発明は、ヒト起源の他の蛋白をほとんど含ま
ないヒトＰＤＧＦ Ａ−鎖を提供する。本発明は、さら
にＰＤＧＦ Ａ−鎖をエンコードするＤＮＡ配列並にト
ランスフェクションされた自己複製宿主細胞系を組み入
れる複製可能な発現ベクターを提供し、それにより有用
な量及び純度でＰＤＧＦ Ａ−鎖又はその官能性フラグ
メントの生成をもたらす。さらに、それによシ生成し７
’ｊＰＤＧＦ Ａ−鎖は、その弁組換え細胞の環境にお
いて蛋白と結合する混入物を含まない。
ないヒトＰＤＧＦ Ａ−鎖を提供する。本発明は、さら
にＰＤＧＦ Ａ−鎖をエンコードするＤＮＡ配列並にト
ランスフェクションされた自己複製宿主細胞系を組み入
れる複製可能な発現ベクターを提供し、それにより有用
な量及び純度でＰＤＧＦ Ａ−鎖又はその官能性フラグ
メントの生成をもたらす。さらに、それによシ生成し７
’ｊＰＤＧＦ Ａ−鎖は、その弁組換え細胞の環境にお
いて蛋白と結合する混入物を含まない。
複製可能な発現ベクターをエンコードするＰＤＧＦＡ−
鎖は、ＰＤＧＦ Ａ−鎖ｒｎＲＮＡを代表する二本鎖相
補性ＤＮＡ （ｄｓ−ｅＤＮＡ）製品を製造し、そして
ｄａ−ｃＤＮＡを複製可能な発現ベクターに組み入れる
ことにより製造される。ＰＤＧＦ Ａ−鎖を回収する好
ましい態様は、組換え宿主系によシ発現される蛋白と、
回収工程に用いられるＰＤＧＦ Ａ−鎖に特異的な少く
とも１種の結合蛋白よりなる試薬組成物とを反応させる
ことよりなる。
鎖は、ＰＤＧＦ Ａ−鎖ｒｎＲＮＡを代表する二本鎖相
補性ＤＮＡ （ｄｓ−ｅＤＮＡ）製品を製造し、そして
ｄａ−ｃＤＮＡを複製可能な発現ベクターに組み入れる
ことにより製造される。ＰＤＧＦ Ａ−鎖を回収する好
ましい態様は、組換え宿主系によシ発現される蛋白と、
回収工程に用いられるＰＤＧＦ Ａ−鎖に特異的な少く
とも１種の結合蛋白よりなる試薬組成物とを反応させる
ことよりなる。
図面について説明すると、第１図はＡ−鎖クローンＢＴ
−１の配列である。ＰＤＧＦ Ａ−１及びＰＤＧＦ Ａ
−２グローブに交雑した各クローンからのｅ ＤＮＡ’
ｉＨ１組換えラムダ・ｇｔｌｌファージから単離しそし
てｐＧｅｍ２（プロメガ・バイオチック（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ Ｂｉｏｔｅｃ ） ）のＥｃ。
−１の配列である。ＰＤＧＦ Ａ−１及びＰＤＧＦ Ａ
−２グローブに交雑した各クローンからのｅ ＤＮＡ’
ｉＨ１組換えラムダ・ｇｔｌｌファージから単離しそし
てｐＧｅｍ２（プロメガ・バイオチック（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ Ｂｉｏｔｅｃ ） ）のＥｃ。
ＲＩ部位にサブクローンした。各クローンを、プロメガ
・バイオチックからのＳＦ３及びＴ−７プライマー又は
１７−２２塩基対の長さのオリゴヌクレオチド・プライ
マーの何れかを用いてジデオキシ法により配列した。最
大のオープン読み取りフレームの予想されるアミノ酸配
列を示す。
・バイオチックからのＳＦ３及びＴ−７プライマー又は
１７−２２塩基対の長さのオリゴヌクレオチド・プライ
マーの何れかを用いてジデオキシ法により配列した。最
大のオープン読み取りフレームの予想されるアミノ酸配
列を示す。
アミノ酸配列化によシ既に決定されたものと同じアミノ
酸は、実線によりアンダーラインされている。アミノ酸
配列化により既に決定されたのとは異るアミノ酸残基は
、２回アンダーラインされている。これは、ＢＴ−１及
びＤ−１間の６９塩基対の差の部位を示している。点線
は、ＰＤＧＦＡ−１プローブ又はＰＤＧＦ Ａ−２グロ
ーブの何れかの位置を示している。
酸は、実線によりアンダーラインされている。アミノ酸
配列化により既に決定されたのとは異るアミノ酸残基は
、２回アンダーラインされている。これは、ＢＴ−１及
びＤ−１間の６９塩基対の差の部位を示している。点線
は、ＰＤＧＦＡ−１プローブ又はＰＤＧＦ Ａ−２グロ
ーブの何れかの位置を示している。
第２図は、内皮細胞におけるＰＤＧＦ Ａ−鎖ｍＲＮＡ
の変調を示す。内皮細胞ｍＲＮＡを、「組換え及びスク
リーニング法」に記載されているように単離し、分画し
そしてノーザン分析にプロットした。フィルターをニッ
ク翻訳ＢＴ−１に交雑し、次に一７０℃で１晩デユポン
・クロネツクス（Ｃｒｏｎｅｘ） 増感スクリーンに
よりコダックＸＡＲ−５フィルムに露出した。矢印は、
３ＰＤＧＦ Ａ−鎖ｍ ＲＮＡの位置を示す。Ｈｉｎｄ
ｍ分解ラムダＤＮＡをサイズ・マーカーに用いた。レ
ーン１：２２ａｉのイーストｔＲＮＡ；レーン２：ラッ
ト前巨赤芽球細胞からのポリ囚含有ｍＲＮＡ５ｔｔｇ；
レーン３：器質化ヒト層静脈内皮細胞からのポリ囚含有
ｍ ＲＮ Ａ ５ ａ ｇ ；レーン４：単層ヒト請静
脈内皮細胞からのポリ囚含有ｍＲＮＡ５ｕｇ。
の変調を示す。内皮細胞ｍＲＮＡを、「組換え及びスク
リーニング法」に記載されているように単離し、分画し
そしてノーザン分析にプロットした。フィルターをニッ
ク翻訳ＢＴ−１に交雑し、次に一７０℃で１晩デユポン
・クロネツクス（Ｃｒｏｎｅｘ） 増感スクリーンに
よりコダックＸＡＲ−５フィルムに露出した。矢印は、
３ＰＤＧＦ Ａ−鎖ｍ ＲＮＡの位置を示す。Ｈｉｎｄ
ｍ分解ラムダＤＮＡをサイズ・マーカーに用いた。レ
ーン１：２２ａｉのイーストｔＲＮＡ；レーン２：ラッ
ト前巨赤芽球細胞からのポリ囚含有ｍＲＮＡ５ｔｔｇ；
レーン３：器質化ヒト層静脈内皮細胞からのポリ囚含有
ｍ ＲＮ Ａ ５ ａ ｇ ；レーン４：単層ヒト請静
脈内皮細胞からのポリ囚含有ｍＲＮＡ５ｕｇ。
第３図は、内皮細胞におけるＰＤＧＦ Ｂ−鎖ｍ ＲＮ
Ａの変調を示す。第２図のノーザン分析に用いられた
プロットを０．１ＭＮａＯＨを用いて取り去り、ニック
翻訳された■−シス（ａｉｓ）グローブに再交雑した。
Ａの変調を示す。第２図のノーザン分析に用いられた
プロットを０．１ＭＮａＯＨを用いて取り去り、ニック
翻訳された■−シス（ａｉｓ）グローブに再交雑した。
得られたフィルターを前述の如くオートラジオグラフィ
にかけた。矢印はＰＤＧＦ Ｂ−鎖ｍ ＲＮ Ａの位置
を示す。
にかけた。矢印はＰＤＧＦ Ｂ−鎖ｍ ＲＮ Ａの位置
を示す。
第４図は、ヒ）Ｉ’ｌｌ靜脈内皮細胞ポリ囚含有ＲＮＡ
における６９ｂｐインサートの不存在を示す。５ｕｇの
単層ヒト屓静脈内皮細胞からのポリ（４）含有ｍＲＮＡ
を電気透析し、前述のようにニトロセルロースに移した
。フィルターを次に４５℃で交雑した。グローブは、イ
ンサートを含まないｍＲＮＡにのみ交雑するであろう３
２−マーの欠失を側面に有する！！Ｐをラベルしたオリ
ゴヌクレオチド責レーン１）、又は欠失した部分のヌク
レオチド配列から由来する３°２−マーの３２ｐをラベ
ルしたオリゴヌクレオチドの倒れかであった。得られた
フィルターを前述のようにオートラジオグラフィーにか
けた。矢印は、ＰＤＧＦ Ａ−鎖ｍＲＮＡの位置を示す
。ＲＮＡラダー〔ペセスタ・リサーチ・ラボラトリーズ
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）：をサイズ・マーカーに用いた。
における６９ｂｐインサートの不存在を示す。５ｕｇの
単層ヒト屓静脈内皮細胞からのポリ（４）含有ｍＲＮＡ
を電気透析し、前述のようにニトロセルロースに移した
。フィルターを次に４５℃で交雑した。グローブは、イ
ンサートを含まないｍＲＮＡにのみ交雑するであろう３
２−マーの欠失を側面に有する！！Ｐをラベルしたオリ
ゴヌクレオチド責レーン１）、又は欠失した部分のヌク
レオチド配列から由来する３°２−マーの３２ｐをラベ
ルしたオリゴヌクレオチドの倒れかであった。得られた
フィルターを前述のようにオートラジオグラフィーにか
けた。矢印は、ＰＤＧＦ Ａ−鎖ｍＲＮＡの位置を示す
。ＲＮＡラダー〔ペセスタ・リサーチ・ラボラトリーズ
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）：をサイズ・マーカーに用いた。
定義
以下に用いられるとき、ｒＰＤＧＦＡ−鎖」とは、細胞
成長に影響する能力を有する生物学的に活性な形の細胞
又は無細胞培養系により生成されるヒト血小板由来成長
因子の八−鎖又はそのフラグメントを示す。
成長に影響する能力を有する生物学的に活性な形の細胞
又は無細胞培養系により生成されるヒト血小板由来成長
因子の八−鎖又はそのフラグメントを示す。
ＰＤＧＦ Ａ−鎖の異るアレルは、天然に存在する。こ
れらの変種の特徴は、同一の生物学的機能の蛋白につい
てコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列における一
つ以上の相違である。さらに、可能なグリコジル化の位
置及び程度は、他の翻訳後の修飾と同じく変化し、そし
て多少は宿主の性質釜に蛋白が生成される環境に依存す
るだろう。単−又はマルチプルのアミノ酸置換、欠失、
付加又は交換を有するアナローブを製造することができ
る。すべてのこのよりなアルレ的変化、修飾そしてＰＤ
ＧＦ Ａ−鎖′の誘導体をもたらすアナローブ（天然の
ＰＤＧＦ Ａ−鎖の生物学的活性を保持する）は、本発
明の範囲内に含まれる。
れらの変種の特徴は、同一の生物学的機能の蛋白につい
てコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列における一
つ以上の相違である。さらに、可能なグリコジル化の位
置及び程度は、他の翻訳後の修飾と同じく変化し、そし
て多少は宿主の性質釜に蛋白が生成される環境に依存す
るだろう。単−又はマルチプルのアミノ酸置換、欠失、
付加又は交換を有するアナローブを製造することができ
る。すべてのこのよりなアルレ的変化、修飾そしてＰＤ
ＧＦ Ａ−鎖′の誘導体をもたらすアナローブ（天然の
ＰＤＧＦ Ａ−鎖の生物学的活性を保持する）は、本発
明の範囲内に含まれる。
「発現ベクター」は、このような配列がそれらの発現に
影響しうる他の調節配列に結合するとき、そこに含まれ
たＤＮＡ配列の発現を支配しうるベクターに関する。こ
れらの発現ベクターは、エビソーム、バクテリオファー
ジとして又は染色体ＤＮＡの肝要な部分としての何れか
で宿主生物又は細胞培養系中で複製すべきである。
影響しうる他の調節配列に結合するとき、そこに含まれ
たＤＮＡ配列の発現を支配しうるベクターに関する。こ
れらの発現ベクターは、エビソーム、バクテリオファー
ジとして又は染色体ＤＮＡの肝要な部分としての何れか
で宿主生物又は細胞培養系中で複製すべきである。
「組換え宿主細胞」は、組換えＩ）ＮＡ核技術用いて構
築されしかも本明細書に記述されたベクターにより形質
転換される細胞に関する。本明細書で定義されたように
、ＰＤＧＦ Ａ−鎖は、この形質転換の結果として生成
することができる。このような細胞により生成されるＰ
ＤＧＦＡ−鎖又はそのフラグメントは、又「組換えＰＤ
ＧＦ Ａ−鎖」として言及される。
築されしかも本明細書に記述されたベクターにより形質
転換される細胞に関する。本明細書で定義されたように
、ＰＤＧＦ Ａ−鎖は、この形質転換の結果として生成
することができる。このような細胞により生成されるＰ
ＤＧＦＡ−鎖又はそのフラグメントは、又「組換えＰＤ
ＧＦ Ａ−鎖」として言及される。
ＤＮＡ及びＲＮＡに関するサイズの単位は、しばしば以
下のように省略される。１）ｐ＝塩基対；ｋｂ＝キロ（
１ｏｏｏ）塩基対。蛋白については以下のように省略す
る。Ｄ＝メダルン；ｋＤ＝キロダルトン。容ｉｈ、−＝
ミリリットル又はｕ Ｌ ＝ミクロリットルで測られ、
質量は２＝ダラム、岬＝ミリグラム又はｕｆ＝ミクログ
ラムで測定され、濃度はモルで測られ、Ｍ＝モル、ｍ
Ｍ ＝ ミリモル又はｕＭ＝ミクロモルである。温度は
常に℃である。放射能の単位は、ｃｐｍ＝＝１分当りの
カウントの測定とともにＣｔ＝キュリー又ｔｔｍｃｉ＝
ミリキュリーである。
下のように省略される。１）ｐ＝塩基対；ｋｂ＝キロ（
１ｏｏｏ）塩基対。蛋白については以下のように省略す
る。Ｄ＝メダルン；ｋＤ＝キロダルトン。容ｉｈ、−＝
ミリリットル又はｕ Ｌ ＝ミクロリットルで測られ、
質量は２＝ダラム、岬＝ミリグラム又はｕｆ＝ミクログ
ラムで測定され、濃度はモルで測られ、Ｍ＝モル、ｍ
Ｍ ＝ ミリモル又はｕＭ＝ミクロモルである。温度は
常に℃である。放射能の単位は、ｃｐｍ＝＝１分当りの
カウントの測定とともにＣｔ＝キュリー又ｔｔｍｃｉ＝
ミリキュリーである。
宿主細胞培養及びベクター
本明細書で開示された組換えベクター及び方法は、広い
範囲の真核生物及び原核生物を含む宿主細胞に用いられ
るのに好適である。一般に、原核生物がＤＮＡ配列のク
ローニング及び増殖釜にベクターの構築に好ましい。例
えば、Ｅ、コリ（ｃｏｌｔ）Ｋ１２株ＨＢＩＯＩ （Ａ
ＴＣＣＡ３３６９４）が特に有用である。他の微生物の
菌株も用いられうる。宿主細胞と融和しうる種から由来
する、複製及びコントロール配列を含むベクターが、こ
れらの宿主と関連して用いられる。ベクターは、元来複
製の起源を有しそして、又それ自身の蛋白の発現の之め
にベクターにょシ用いられるコントロール要素も含む。
範囲の真核生物及び原核生物を含む宿主細胞に用いられ
るのに好適である。一般に、原核生物がＤＮＡ配列のク
ローニング及び増殖釜にベクターの構築に好ましい。例
えば、Ｅ、コリ（ｃｏｌｔ）Ｋ１２株ＨＢＩＯＩ （Ａ
ＴＣＣＡ３３６９４）が特に有用である。他の微生物の
菌株も用いられうる。宿主細胞と融和しうる種から由来
する、複製及びコントロール配列を含むベクターが、こ
れらの宿主と関連して用いられる。ベクターは、元来複
製の起源を有しそして、又それ自身の蛋白の発現の之め
にベクターにょシ用いられるコントロール要素も含む。
好適な発現ベクターは、クローンされた遺伝子のｍ Ｒ
Ｎ Ａ転写物のポリアデニル化及び停止をも九らす停止
シグナルを含む。
Ｎ Ａ転写物のポリアデニル化及び停止をも九らす停止
シグナルを含む。
多細胞の生物から由来する細胞系又は真核生物のプロー
ブも又宿主として用いられる。原則として、を推動物又
は無を推動物の源の何れかでも、すべてのこのような細
胞培養が使用可能である。しかし、関心はを推動物の細
胞において最大であシ、そして組織培養におけるを推動
物の増殖が、最近普通に行われてきている。このような
細胞に関する発現ベクターは、元来は複製の起源、発現
されるべき遺伝子の前に位置するブロモ−ター、ＲＮＡ
切り継ぎ部位（もし必要ならば）、ポリアデニル化部位
そして転写停止配列を含む。
ブも又宿主として用いられる。原則として、を推動物又
は無を推動物の源の何れかでも、すべてのこのような細
胞培養が使用可能である。しかし、関心はを推動物の細
胞において最大であシ、そして組織培養におけるを推動
物の増殖が、最近普通に行われてきている。このような
細胞に関する発現ベクターは、元来は複製の起源、発現
されるべき遺伝子の前に位置するブロモ−ター、ＲＮＡ
切り継ぎ部位（もし必要ならば）、ポリアデニル化部位
そして転写停止配列を含む。
宿主細胞は、遺伝子工学的に操作されて、その−次アミ
ノ酸配列において天然のヒ）ＰＤＧＦＡ−鎖と同一の組
換えヒ）ＰＤＧＦ Ａ−鎖ベブチドを発現する。
ノ酸配列において天然のヒ）ＰＤＧＦＡ−鎖と同一の組
換えヒ）ＰＤＧＦ Ａ−鎖ベブチドを発現する。
下記の方法は、本発明の方法に有用な特定の試薬を生成
する友めの広範囲の十分に確立された方法の成るものに
過ぎない。
する友めの広範囲の十分に確立された方法の成るものに
過ぎない。
１、全ＲＮＡの調製
全ＲＮＡ （メツセンジャー、リボンーマル及び転移）
をチャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ）ら〔バイオケ
ミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １８：５２
９４（１９７９））によυ主として記載されたようなヒ
ト胴静脈内皮細胞から抽出した。組織を、４Ｍのグアニ
ジンチオシアナート、２５ｍＭのくえん酸ナトリウム（
ｐＨ７，０）、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）（ｐＨ７，４）、０．５％のＮ−ラウリルザル
コシン及び０．１Ｍの２−メルカプトエタノールを含む
１０容量の溶液中でホモゲナイズした。ホモジネートを
１０℃で１５分間ツルパル（５ｏｒｖ、ａｌｌ ）ＧＳ
ＡＳ−ローター中、０００ ｒｐｍ で遠心分離して破
片を透明にした。ホモジネートｉ１Ｍの酢酸の添加によ
υｐＨ５，０に調節し、そしてＲＮＡ１ｌ晩−２０℃で
０．７５容量のエタノールにより沈澱させた。ＲＮＡを
遠心分離によυ集めそして上述のグアニジン塩酸塩沈澱
工程を前述の容量の半分を用いて繰返した。遠心分離後
、ＲＮＡペレツ）’ｚ２５ｍＭのＥＤＴＡ （ｐＨ７，
０）に溶解しそしてフェノール：クロロホルム（１：１
）により抽出した。水性層を０．２ ＭのＮａＣ１に調
節し、そして１晩−２０℃で２５容量のエタノールの添
加により沈澱させた。ＲＮＡを、０℃でベックマン（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ）ＪＳ−１２振動パケツトローター中で２
０分間１０，０００ ｒｐｍでの遠心分離によシ集めた
。ペレットを、ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス、ｐ
Ｈ９，０，０、１ｍ ＭのＥＤＴＡ）中に再溶解し、０
．２Ｍの塩化ナトリウムに調節し、１晩−２０℃で２．
５容量のエタノールによシ再沈澱させた。ＲＮＡを、次
に２６０ｎｍの分光光度計の読みによυ決定される所望
の濃度に滅菌水に溶解しそして一２０℃に保った。
をチャーブウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ）ら〔バイオケ
ミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １８：５２
９４（１９７９））によυ主として記載されたようなヒ
ト胴静脈内皮細胞から抽出した。組織を、４Ｍのグアニ
ジンチオシアナート、２５ｍＭのくえん酸ナトリウム（
ｐＨ７，０）、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）（ｐＨ７，４）、０．５％のＮ−ラウリルザル
コシン及び０．１Ｍの２−メルカプトエタノールを含む
１０容量の溶液中でホモゲナイズした。ホモジネートを
１０℃で１５分間ツルパル（５ｏｒｖ、ａｌｌ ）ＧＳ
ＡＳ−ローター中、０００ ｒｐｍ で遠心分離して破
片を透明にした。ホモジネートｉ１Ｍの酢酸の添加によ
υｐＨ５，０に調節し、そしてＲＮＡ１ｌ晩−２０℃で
０．７５容量のエタノールにより沈澱させた。ＲＮＡを
遠心分離によυ集めそして上述のグアニジン塩酸塩沈澱
工程を前述の容量の半分を用いて繰返した。遠心分離後
、ＲＮＡペレツ）’ｚ２５ｍＭのＥＤＴＡ （ｐＨ７，
０）に溶解しそしてフェノール：クロロホルム（１：１
）により抽出した。水性層を０．２ ＭのＮａＣ１に調
節し、そして１晩−２０℃で２５容量のエタノールの添
加により沈澱させた。ＲＮＡを、０℃でベックマン（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ）ＪＳ−１２振動パケツトローター中で２
０分間１０，０００ ｒｐｍでの遠心分離によシ集めた
。ペレットを、ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス、ｐ
Ｈ９，０，０、１ｍ ＭのＥＤＴＡ）中に再溶解し、０
．２Ｍの塩化ナトリウムに調節し、１晩−２０℃で２．
５容量のエタノールによシ再沈澱させた。ＲＮＡを、次
に２６０ｎｍの分光光度計の読みによυ決定される所望
の濃度に滅菌水に溶解しそして一２０℃に保った。
２ ポリ囚含有ＲＮＡの調製
前述のようにして製造した全ＲＮＡ沈澱物を、１０ｍＭ
のＥＤＴＡ及び１％のＳＤＳ′ｆｔ含む２０ｍＭの４−
（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスル
ホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファー（ｐＨ７，２）中の４
０ Ａｘａｏ単位の濃度で溶解し、１０分間６５℃に加
熱し、次に２５℃に急冷した。ＲＮＡ溶液を次に同容量
の水により希釈し、セしてＮａＣ１を加えて最終濃度を
３００ｍＭのＮａＣ１とした。２４０ Ａｚｓｏ単位以
内のＲＮＡを含むサンプルを、標準の方法を用いてポリ
（Ｕ）−セファロースのクロマトグラフィにかけた。ポ
リ（Ａ）含有ＲＮＡを１ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（
ｐＨ７，２）及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む９゜チのホル
ムアミドにより溶離した。溶離物を０．２４ ＭのＮａ
Ｃ１に調節し、そしてＲＮＡを０℃で２５容量のエタノ
ールにより沈澱させた。
のＥＤＴＡ及び１％のＳＤＳ′ｆｔ含む２０ｍＭの４−
（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスル
ホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファー（ｐＨ７，２）中の４
０ Ａｘａｏ単位の濃度で溶解し、１０分間６５℃に加
熱し、次に２５℃に急冷した。ＲＮＡ溶液を次に同容量
の水により希釈し、セしてＮａＣ１を加えて最終濃度を
３００ｍＭのＮａＣ１とした。２４０ Ａｚｓｏ単位以
内のＲＮＡを含むサンプルを、標準の方法を用いてポリ
（Ｕ）−セファロースのクロマトグラフィにかけた。ポ
リ（Ａ）含有ＲＮＡを１ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（
ｐＨ７，２）及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む９゜チのホル
ムアミドにより溶離した。溶離物を０．２４ ＭのＮａ
Ｃ１に調節し、そしてＲＮＡを０℃で２５容量のエタノ
ールにより沈澱させた。
３、ｅＤＮＡプローブ及びニック翻訳
ニック翻訳反応を、５０ ｕｔの反応容量でｌｕｆの各
ｃＤＮＡを用いて行った。反応混合物は、ＩＸニック翻
訳バッファー（５０ｍＭのトリスｐＨ７，２，１０ｍＭ
のＭｇ５Ｏ，，０，１ｍＭのジチオスレイトール、５０
ｕｆ／−のウシ血清アルブミン）、それぞれ０．１ｍ
Ｍの未標ａｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、８０ｕＣ
１”Ｐ−ｄＣＴＰ （特異的活性＝１ ｍｃｉ ／ Ｌ
２５ Ｘ １０””モル）〔ニュー・イングランド・ニ
ュクレア（Ｎｅｖｒ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ
） ）、５Ｘ１０−’ｕｆのデオキシリボヌクレアー
ゼ及び１０単位のＥ、コリＤＮＡポリメラーゼＩ（ペー
リンガー・マンハイム）を含んだ。反応物を１時間１６
℃でインキュベートし、次にｃＤＮＡを、セファデック
スＧ−５０ミニ・スピンカラム〔クーパー・バイオメデ
ィカル（Ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ））のク
ロマトグラフィにより未組み入れデオキシヌクレオチド
トリホスフェートから分離した。３２ｐをラベルしたＤ
ＮＡは、１０’ｃｐｍ／ｕｌを超える特異的活性を有し
次。
ｃＤＮＡを用いて行った。反応混合物は、ＩＸニック翻
訳バッファー（５０ｍＭのトリスｐＨ７，２，１０ｍＭ
のＭｇ５Ｏ，，０，１ｍＭのジチオスレイトール、５０
ｕｆ／−のウシ血清アルブミン）、それぞれ０．１ｍ
Ｍの未標ａｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、８０ｕＣ
１”Ｐ−ｄＣＴＰ （特異的活性＝１ ｍｃｉ ／ Ｌ
２５ Ｘ １０””モル）〔ニュー・イングランド・ニ
ュクレア（Ｎｅｖｒ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ
） ）、５Ｘ１０−’ｕｆのデオキシリボヌクレアー
ゼ及び１０単位のＥ、コリＤＮＡポリメラーゼＩ（ペー
リンガー・マンハイム）を含んだ。反応物を１時間１６
℃でインキュベートし、次にｃＤＮＡを、セファデック
スＧ−５０ミニ・スピンカラム〔クーパー・バイオメデ
ィカル（Ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ））のク
ロマトグラフィにより未組み入れデオキシヌクレオチド
トリホスフェートから分離した。３２ｐをラベルしたＤ
ＮＡは、１０’ｃｐｍ／ｕｌを超える特異的活性を有し
次。
４、 ラムダｇｔｌｌ中のｃＤＮＡクローンの構築ヒ）
ＩＩ静脈内皮細胞から単離したポリ（Ａ）の多いＲＮＡ
（２０ｕｆ）”ｉ、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼ
エによりｄｓ−ｃＤＮＡにコピーした。ｄｓ−ｅＤＮＡ
をセファデックスＧ−５０カラムで脱塩し、ボイドボリ
ューム画分をさらに製造者の指示に従ってエルチップ（
Ｅｌｕｔｉｐ ） −Ｄカラム〔シュライバー・アンド
・シュウエル（５ｃｈｌｅｉｅｈｅｒ＆ ５ｅｈｕｅｌ
ｌ ））によダ精製した。ｄｓ−ｅＤＮＡを、Ｓ１ヌク
レアーゼとのインキュベーションによりブランド末端に
した。反応混合物は、０．２Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ
４，５）、０．４Ｍの塩化ナトリウム、１５ｍＭの酢酸
亜鉛及び０．１単位の８１ヌクレアーゼ（ｄｓ−ｅＤＮ
Ａナノ２当り）よりなり、これを１００ ｕｔの最終の
反応容量にした。ｄｓ−ｅＤＮＡｉ１時ｒｌＪ’１３７
℃でインキュベートし、フェノール：クロロホルムによ
り抽出し、次に前述のようにセファデックスＧ−５０で
脱塩した。
ＩＩ静脈内皮細胞から単離したポリ（Ａ）の多いＲＮＡ
（２０ｕｆ）”ｉ、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼ
エによりｄｓ−ｃＤＮＡにコピーした。ｄｓ−ｅＤＮＡ
をセファデックスＧ−５０カラムで脱塩し、ボイドボリ
ューム画分をさらに製造者の指示に従ってエルチップ（
Ｅｌｕｔｉｐ ） −Ｄカラム〔シュライバー・アンド
・シュウエル（５ｃｈｌｅｉｅｈｅｒ＆ ５ｅｈｕｅｌ
ｌ ））によダ精製した。ｄｓ−ｅＤＮＡを、Ｓ１ヌク
レアーゼとのインキュベーションによりブランド末端に
した。反応混合物は、０．２Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ
４，５）、０．４Ｍの塩化ナトリウム、１５ｍＭの酢酸
亜鉛及び０．１単位の８１ヌクレアーゼ（ｄｓ−ｅＤＮ
Ａナノ２当り）よりなり、これを１００ ｕｔの最終の
反応容量にした。ｄｓ−ｅＤＮＡｉ１時ｒｌＪ’１３７
℃でインキュベートし、フェノール：クロロホルムによ
り抽出し、次に前述のようにセファデックスＧ−５０で
脱塩した。
ｄ８−ｅＤＮＡを、次に前記のマニアチスに記載された
反応条件を用いて、ＥｃｏＲＩメチラーゼ及びＤＮＡポ
リメラーゼＩ（フレナラ）により処理した。ｃＤＮＡを
再び前述のようにセファデックスＧ−５０で脱塩し、エ
ルチップで精製し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて０
．５ｕｆのホスホリル化ＥｃｏＲＩ リンカ−にリゲー
トした。混合物をＥｃｏＲＩにより開裂し、そしてトリ
ス−ボレートバッファー中の８チのポリアクリルアミド
ゲル上に分画した。１キロベースより大きいサイズを有
するＤＮＡを、ゲルから溶離し、エルチッグーＤカラム
に結合することにより回収し、１ＭのＮａＣ１により溶
離し次にエタノール沈澱により集めた。
反応条件を用いて、ＥｃｏＲＩメチラーゼ及びＤＮＡポ
リメラーゼＩ（フレナラ）により処理した。ｃＤＮＡを
再び前述のようにセファデックスＧ−５０で脱塩し、エ
ルチップで精製し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて０
．５ｕｆのホスホリル化ＥｃｏＲＩ リンカ−にリゲー
トした。混合物をＥｃｏＲＩにより開裂し、そしてトリ
ス−ボレートバッファー中の８チのポリアクリルアミド
ゲル上に分画した。１キロベースより大きいサイズを有
するＤＮＡを、ゲルから溶離し、エルチッグーＤカラム
に結合することにより回収し、１ＭのＮａＣ１により溶
離し次にエタノール沈澱により集めた。
ＤＮＡフラグメントを、次にＴ４ Ｄ Ｎ Ａ ’）ガ
ーゼを用いてＥｅｏＲＩ開裂及びホスファターゼ処理ラ
ムダｇｔｌ ｌにインサートして、その約５０チがイン
サー）ｆ含む約１５０万のファージのライブラリーを生
成した（即ち、Ｘ−ガルプレート上の７５万の明確なプ
ラーク）。ライブラリーを、Ｅ、コリＹ １０８８［ｓ
ｕｐ Ｅ、ｓｕｐ Ｆ、ｍｅｔ Ｂ、ｔｒｐＲ，ｈｓｄ
Ｒ−１ｈ＋ｓｄ Ｍ ％ｔｏｎ Ａ ２１、ｓｔｒ
Ａ、 ｔａｕＵ １６９ （ｐｒｏ Ｃ： ：Ｔｎ
５）（ｐＭＣ９））（ＡＴＴＣ。
ーゼを用いてＥｅｏＲＩ開裂及びホスファターゼ処理ラ
ムダｇｔｌ ｌにインサートして、その約５０チがイン
サー）ｆ含む約１５０万のファージのライブラリーを生
成した（即ち、Ｘ−ガルプレート上の７５万の明確なプ
ラーク）。ライブラリーを、Ｅ、コリＹ １０８８［ｓ
ｕｐ Ｅ、ｓｕｐ Ｆ、ｍｅｔ Ｂ、ｔｒｐＲ，ｈｓｄ
Ｒ−１ｈ＋ｓｄ Ｍ ％ｔｏｎ Ａ ２１、ｓｔｒ
Ａ、 ｔａｕＵ １６９ （ｐｒｏ Ｃ： ：Ｔｎ
５）（ｐＭＣ９））（ＡＴＴＣ。
４３７１９５）に４２℃でプレート・ストックを調製す
ることにより、増巾させた。増巾したライブラリーの力
価を求めると約ｌＸｌ０” ｐｆｕ／−であった。
ることにより、増巾させた。増巾したライブラリーの力
価を求めると約ｌＸｌ０” ｐｆｕ／−であった。
５、ＰＤＧＦＡ−鎖含有クローンの同定１８個のｅＤＮ
Ａクローンを、ＰＤＧＦ Ａ−１プローブへの交雑化に
基づくヒト眉静脈内皮細胞ｍＲＮＡから構築され友ラム
ダｇｔｌｌ ｅＤＮＡライブラリーから単離した。
Ａクローンを、ＰＤＧＦ Ａ−１プローブへの交雑化に
基づくヒト眉静脈内皮細胞ｍＲＮＡから構築され友ラム
ダｇｔｌｌ ｅＤＮＡライブラリーから単離した。
ＰＤＧＦ Ａ−１プローブとも交雑するクローンの特徴
を求めた。インサートは９００〜１１００ ｂｐに及ん
だ。これらをｐＧｅｍ２のＥｃｏＲＩ部位にサブクロー
ンし、そして（ｚｅｍ Ｓｅｑ ｄｓ ＤＮＡ配列系を
用いて配列した。クローンしｆｃＤＮＡの配列は、次に
ＰＤＧＦ Ａ−鎖の周知のアミノ酸配列との比較により
、ＰＤＧＦ Ａ−鎖と証明された。
を求めた。インサートは９００〜１１００ ｂｐに及ん
だ。これらをｐＧｅｍ２のＥｃｏＲＩ部位にサブクロー
ンし、そして（ｚｅｍ Ｓｅｑ ｄｓ ＤＮＡ配列系を
用いて配列した。クローンしｆｃＤＮＡの配列は、次に
ＰＤＧＦ Ａ−鎖の周知のアミノ酸配列との比較により
、ＰＤＧＦ Ａ−鎖と証明された。
ｅＤＮＡライブラリーを、単層ヒト屓静脈内皮（ＨＵＶ
Ｅ）細胞からｍ ＲＮ Ａを用いて構築した。２個の３
６ ｂｐプローブ（ＰＤＧＦ Ａ−１、内部配列特異的
プローブ及びＰＤＧＦ Ａ−２、Ｎ末端プローブ）を、
Ａ−鎖クローン（Ｄ−１）の核酸配列に基づいて構築し
た。４Ｘ１０’のファージをＥ、コリＹ１０８８にプレ
ートしそして６時間４２℃ティンキュベートした。ファ
ージをニトロセルロースに移しそして０．５ＭのＮａＯ
Ｈ中で変性しそして２時間真空中で８０℃で焼いた。フ
ィルターを、５６℃で１晩５ＸＳＳＰＥ （ｌＸ５ＳＰ
Ｅ＝０．１８Ｍ ＮａＣ１，０，０１ＭＮａＰＯ４、ｐ
Ｈ７，２，１ｍＭＥＤＴＡ）及び１チプロツト（Ｂｌｏ
ｔｔｏ ） （０，２５％脱脂乾燥牛乳）中で予備交雑
化し、１晩キナーゼ化３６−マーオリゴヌクレオチドＡ
−１（ＩＸＩＯ’ ｃｐｍ／ゴ）に交雑化した。フィ
ルターを、５０℃で１０分間２ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ＝
０．１５Ｍ Ｍａｉｌ、０．０１５Ｍ（えん散ナトリウ
ム、ｐＨ７）０．１チＳＤＳで２回洗い、そして５０℃
で３０分間１×５ＳＣ１０，１％ナトリウムドデシルサ
ルフェート（ＳＤＡ）により２回洗った。
Ｅ）細胞からｍ ＲＮ Ａを用いて構築した。２個の３
６ ｂｐプローブ（ＰＤＧＦ Ａ−１、内部配列特異的
プローブ及びＰＤＧＦ Ａ−２、Ｎ末端プローブ）を、
Ａ−鎖クローン（Ｄ−１）の核酸配列に基づいて構築し
た。４Ｘ１０’のファージをＥ、コリＹ１０８８にプレ
ートしそして６時間４２℃ティンキュベートした。ファ
ージをニトロセルロースに移しそして０．５ＭのＮａＯ
Ｈ中で変性しそして２時間真空中で８０℃で焼いた。フ
ィルターを、５６℃で１晩５ＸＳＳＰＥ （ｌＸ５ＳＰ
Ｅ＝０．１８Ｍ ＮａＣ１，０，０１ＭＮａＰＯ４、ｐ
Ｈ７，２，１ｍＭＥＤＴＡ）及び１チプロツト（Ｂｌｏ
ｔｔｏ ） （０，２５％脱脂乾燥牛乳）中で予備交雑
化し、１晩キナーゼ化３６−マーオリゴヌクレオチドＡ
−１（ＩＸＩＯ’ ｃｐｍ／ゴ）に交雑化した。フィ
ルターを、５０℃で１０分間２ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ＝
０．１５Ｍ Ｍａｉｌ、０．０１５Ｍ（えん散ナトリウ
ム、ｐＨ７）０．１チＳＤＳで２回洗い、そして５０℃
で３０分間１×５ＳＣ１０，１％ナトリウムドデシルサ
ルフェート（ＳＤＡ）により２回洗った。
１８個のクローンがＰＤＧＦ Ａ−１プローブに交雑し
た。
た。
これらのクローンを、さらにＰＤＧＦ Ａ−１プローブ
に用いられたのと同じやり方で、ＰＤＧＦ Ａ−２プロ
ーブへの交雑化についてテストした。１８個のクローン
の中４個が、又ＰＤＧＦ Ａ−２グローブに交雑した。
に用いられたのと同じやり方で、ＰＤＧＦ Ａ−２プロ
ーブへの交雑化についてテストした。１８個のクローン
の中４個が、又ＰＤＧＦ Ａ−２グローブに交雑した。
制限マツプは、４個のクローンの中２個が同一のインサ
ートを含んだ。インサートのサイズは、９００ ｂｐ
（ＢＴ−１）から約１１００ｂｐ （ＢＴ−４）に及ん
だ。クローンをｐＧｅｍ２のＥｅ。
ートを含んだ。インサートのサイズは、９００ ｂｐ
（ＢＴ−１）から約１１００ｂｐ （ＢＴ−４）に及ん
だ。クローンをｐＧｅｍ２のＥｅ。
ＲＩ部位にサブクローンした。ｐ Ｇｅｍ ２のＴ７又
ｆｌｓＰ ６プライマーを、Ｇｅｍ Ｓｅｑ ｄｓ
ＤＮＡ配列系による配列化前に「予備配列化」に用いた
〔チェノ（Ｃｈｅｎ）、Ｅ。
ｆｌｓＰ ６プライマーを、Ｇｅｍ Ｓｅｑ ｄｓ
ＤＮＡ配列系による配列化前に「予備配列化」に用いた
〔チェノ（Ｃｈｅｎ）、Ｅ。
及びシーバーブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ ）、Ｐ、ｒＤＮＡｊ
４：１６５（１９８５）］。転換した細胞系から単離さ
れｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａりｏ−：／ （Ｄ−１） ［ペツ
ショルツ（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ）、 Ｃ。
４：１６５（１９８５）］。転換した細胞系から単離さ
れｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａりｏ−：／ （Ｄ−１） ［ペツ
ショルツ（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ）、 Ｃ。
ら（１９８６）「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ ） Ｊ
３２０．６９５〜６９９〕に比べたとき、ＢＴ−１は
ヌクレオチド３５０で＃ｌまりそしてＤ−１クローンの
３′末端を越えて約２５０ ｂｐ続いた（第４図）。Ｂ
Ｔ−１の３８ｂｐ５’−翻訳領域の配列は、クローンＤ
−１で観察されたそれと同一であった。ＢＴ−ＩＶｉ完
全に配列されそして予想されたアミノ酸配列が決定され
た。ＢＴ−１のヌクレオチド配列によシ予想された蛋白
配列は、アミノ酸１１９．１４１及び１４３（既に報告
されたＶａｌ、Ａｒｇ及びＴｈｒ の代シにＩｌｅ、
Ｇｉｎ及びＳｅｒであると予想されｆｃ）を除いて、Ｐ
ＤＧＦ Ａ−鎖のアミノ酸配列によシ決定されたのと一
致する。ＢＴ−１からの予想された蛋白配列は、Ｄ−１
の配列により予想されたそれと一致し、これらの残基に
おける既述の蛋白配列が恐らく誤っていたことを示す。
３２０．６９５〜６９９〕に比べたとき、ＢＴ−１は
ヌクレオチド３５０で＃ｌまりそしてＤ−１クローンの
３′末端を越えて約２５０ ｂｐ続いた（第４図）。Ｂ
Ｔ−１の３８ｂｐ５’−翻訳領域の配列は、クローンＤ
−１で観察されたそれと同一であった。ＢＴ−ＩＶｉ完
全に配列されそして予想されたアミノ酸配列が決定され
た。ＢＴ−１のヌクレオチド配列によシ予想された蛋白
配列は、アミノ酸１１９．１４１及び１４３（既に報告
されたＶａｌ、Ａｒｇ及びＴｈｒ の代シにＩｌｅ、
Ｇｉｎ及びＳｅｒであると予想されｆｃ）を除いて、Ｐ
ＤＧＦ Ａ−鎖のアミノ酸配列によシ決定されたのと一
致する。ＢＴ−１からの予想された蛋白配列は、Ｄ−１
の配列により予想されたそれと一致し、これらの残基に
おける既述の蛋白配列が恐らく誤っていたことを示す。
ＢＴ−１並に他の２種の内皮細胞由来クローン、ＢＴ−
２及びＢＴ−３は、Ｄ−１のそれとは異るＣ末端を予想
するＤＮＡ配列を含んだ。転換され之細胞（塩基対９６
７〜１０３６）から単離されｆｃＤ−１ｃＤＮＡクロー
ンの配列に存在する６９塩基対の配列は、ＢＴ−１、Ｂ
Ｔ−２及びＢＴ−３の配列に存在しなかつ友。この欠失
は、Ｄ−１に比べて最終の１８Ｃ末端アミノ酸を除きそ
して３個の異るアミノＰ１１をインサートした。従って
、欠失はＣ末端で一連のＡｒｇ及びＬｙａ残基を除き、
そしてＡ−鎖の全電荷を＋１１から＋４に変えた。未処
理ペプチドの予想された分子量は、２２，２５２であっ
た。ヌクレオチド２４３において、クローンＢＴ−１で
はＣがＤ−１のＴの代りに見いだされた。ＣＡＴ及びＣ
ＡＣの両方がヒスチジンにコードしているので、アミノ
酸配列における変化は生じないだろう。
２及びＢＴ−３は、Ｄ−１のそれとは異るＣ末端を予想
するＤＮＡ配列を含んだ。転換され之細胞（塩基対９６
７〜１０３６）から単離されｆｃＤ−１ｃＤＮＡクロー
ンの配列に存在する６９塩基対の配列は、ＢＴ−１、Ｂ
Ｔ−２及びＢＴ−３の配列に存在しなかつ友。この欠失
は、Ｄ−１に比べて最終の１８Ｃ末端アミノ酸を除きそ
して３個の異るアミノＰ１１をインサートした。従って
、欠失はＣ末端で一連のＡｒｇ及びＬｙａ残基を除き、
そしてＡ−鎖の全電荷を＋１１から＋４に変えた。未処
理ペプチドの予想された分子量は、２２，２５２であっ
た。ヌクレオチド２４３において、クローンＢＴ−１で
はＣがＤ−１のＴの代りに見いだされた。ＣＡＴ及びＣ
ＡＣの両方がヒスチジンにコードしているので、アミノ
酸配列における変化は生じないだろう。
さらに、（ＧＡ）ｓよりなるインサージョンが、ＢＴ−
１の８６８で始まる３′未翻訳領域に見いだされた。
１の８６８で始まる３′未翻訳領域に見いだされた。
ＢＴ−１のｃＤＮＡインサートが用いられて、内皮細胞
分化の機能としてＡ−鎖トランスクリプトの定常状態の
レベルを測定した。交雑化が、２．．８．２３及びＺＯ
ｋｂのトランスクリプトに観察された。単層から由来す
る内皮細胞の交雑化のレベルは、管状構造に組織化され
る内皮細胞について観察されるレベルに比べて２倍以内
に増大した（第２図）。対照的に、単層ＨＵＶＥ細胞中
細胞−鎖（Ｃ−シス）トランスクリプトのレベルは、組
織化されたＨＵＶＥ細胞に比べたとき、約５倍に増大し
た。
分化の機能としてＡ−鎖トランスクリプトの定常状態の
レベルを測定した。交雑化が、２．．８．２３及びＺＯ
ｋｂのトランスクリプトに観察された。単層から由来す
る内皮細胞の交雑化のレベルは、管状構造に組織化され
る内皮細胞について観察されるレベルに比べて２倍以内
に増大した（第２図）。対照的に、単層ＨＵＶＥ細胞中
細胞−鎖（Ｃ−シス）トランスクリプトのレベルは、組
織化されたＨＵＶＥ細胞に比べたとき、約５倍に増大し
た。
悪性グリオーマ由来Ａ鎖クローンＤ−１に存在する６９
ｂｐ配列を含むＰＤＧＦ Ａ−鎖ｍＲＮＡは、「欠失し
た」クローンのみの単離にかかわらず内皮細胞に存在で
きるだろう。この可能性をテストするために、オリゴヌ
クレオチドプローブを利用し、それｄｌ）−１及びＢＴ
−１ｉ区別できた。プローブ１は、欠失の領域に及ぶ３
２ｂｐ配列よυなり、それぞれの側において１６ヌクレ
オチドが６９ｂｐインサート（塩基対６０１〜６３２）
の領置にある。プローブ２は、前記のベツツショルツら
によシ名付けられたように、Ｄ−１の６９ｂｐインサー
トの一部（塩基対１００４〜１０３６）に相補的な３２
ｂｐよりなる。プローブの特異性は、ＢＴ−１及びＤ−
１ｃＤＮＡへの交雑化により決定された。インサート特
異性プローブＦ′１Ｄ−１へのみに交雑し、一方欠失に
及ぶプローブ１ｉＢＴ−１及びＤ−１の両方を認識した
。インサート特異性グローブに関する２、、８、ｚ３又
はＺＯｋｂＡ−鎖メッセージについて交雑化は観察され
なかったが、インサージョンに及ぶプローブについて交
雑化は観察された（第４図）。これは、内皮細胞により
合成され７ｔＰＤＧＦ Ａ−鎖が、転換された細胞系に
より作られたそれとは構造的に異ることを示唆している
。転換された細胞由来のＰＤＧＦＡ−鎖に比べて内皮細
胞から由来する蛋白の荷電及び−次配列の差は、これら
２樫の形のＰＤＧＦ Ａ−鎖が機能的に異ることを意味
する。
ｂｐ配列を含むＰＤＧＦ Ａ−鎖ｍＲＮＡは、「欠失し
た」クローンのみの単離にかかわらず内皮細胞に存在で
きるだろう。この可能性をテストするために、オリゴヌ
クレオチドプローブを利用し、それｄｌ）−１及びＢＴ
−１ｉ区別できた。プローブ１は、欠失の領域に及ぶ３
２ｂｐ配列よυなり、それぞれの側において１６ヌクレ
オチドが６９ｂｐインサート（塩基対６０１〜６３２）
の領置にある。プローブ２は、前記のベツツショルツら
によシ名付けられたように、Ｄ−１の６９ｂｐインサー
トの一部（塩基対１００４〜１０３６）に相補的な３２
ｂｐよりなる。プローブの特異性は、ＢＴ−１及びＤ−
１ｃＤＮＡへの交雑化により決定された。インサート特
異性プローブＦ′１Ｄ−１へのみに交雑し、一方欠失に
及ぶプローブ１ｉＢＴ−１及びＤ−１の両方を認識した
。インサート特異性グローブに関する２、、８、ｚ３又
はＺＯｋｂＡ−鎖メッセージについて交雑化は観察され
なかったが、インサージョンに及ぶプローブについて交
雑化は観察された（第４図）。これは、内皮細胞により
合成され７ｔＰＤＧＦ Ａ−鎖が、転換された細胞系に
より作られたそれとは構造的に異ることを示唆している
。転換された細胞由来のＰＤＧＦＡ−鎖に比べて内皮細
胞から由来する蛋白の荷電及び−次配列の差は、これら
２樫の形のＰＤＧＦ Ａ−鎖が機能的に異ることを意味
する。
第１図はＡ−鎖クローンＢＴ−１の配列を示し、第２図
は内皮細胞のＰＤＧＦ Ａ−鎖ｍＲＮＡの変調を示し、
第３図は内皮細胞のＰＤＧＦ Ｂ−鎖ｍＲＮＡの変調を
示し、第４図はヒトＲ静脈内皮細胞ポリ（Ａ）含有ＲＮ
Ａにおける６ ９ ｐｂインサートの不存在を示す。 特許出願人 ローラーバイオテクノロジーインコーホレ
ーテッド＼屹１−７ 図面の浄書（内容に変更なし） 、゛ス 。 ：ら゛ 、べ ４ ＦＩＧ、４ Ｌ、、、、−、、、、−５１、１１５１１，１ＦＩＧ、
２ ＦＩＧ 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ １事件の表示 昭和６３年特許願第２８６９１８号 ２発明の名称 内皮細胞から誘導された組換丸血小板由来成長因子へ−
鎖３補正をする者 事件との関係
は内皮細胞のＰＤＧＦ Ａ−鎖ｍＲＮＡの変調を示し、
第３図は内皮細胞のＰＤＧＦ Ｂ−鎖ｍＲＮＡの変調を
示し、第４図はヒトＲ静脈内皮細胞ポリ（Ａ）含有ＲＮ
Ａにおける６ ９ ｐｂインサートの不存在を示す。 特許出願人 ローラーバイオテクノロジーインコーホレ
ーテッド＼屹１−７ 図面の浄書（内容に変更なし） 、゛ス 。 ：ら゛ 、べ ４ ＦＩＧ、４ Ｌ、、、、−、、、、−５１、１１５１１，１ＦＩＧ、
２ ＦＩＧ 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ １事件の表示 昭和６３年特許願第２８６９１８号 ２発明の名称 内皮細胞から誘導された組換丸血小板由来成長因子へ−
鎖３補正をする者 事件との関係
Claims (6)
- （１）非転換哺乳動物細胞から誘導される血小板由来成
長因子Ａ−鎖。 - （２）請求項１記載の非転換哺乳動物細胞から誘導され
る血小板由来成長因子Ａ−鎖のためのコーディング配列
よりなるｃＤＮＡクローン。 - （３）ヒト臍静脈内皮細胞から誘導される請求項１記載
の血小板由来成長因子Ａ−鎖。 - （４）請求項１記載の組換え血小板由来成長因子Ａ−鎖
を生体外の培養系で発現しうる自己複製発現ベクター。 - （５）第１図に示された、請求項１記載の血小板誘導成
長因子Ａ−鎖。 - （６）血小板由来成長因子Ａ−鎖をエンコーデイングす
るＤＮＡ配列を合体した複製可能な発現ベクターを自己
複製宿主細胞系中に発現することよりなる非転換哺乳動
物細胞から誘導される血小板由来成長因子Ａ−鎖を製造
する方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP88118166A EP0366816A1 (en) | 1988-10-31 | 1988-10-31 | Recombinant platelet-derived growth factor A-chain derived from endothelial cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02138197A true JPH02138197A (ja) | 1990-05-28 |
Family
ID=8199507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63286918A Pending JPH02138197A (ja) | 1988-10-31 | 1988-11-15 | 内皮細胞から誘導された組換え血小板由来成長因子ａ−鎖 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0366816A1 (ja) |
| JP (1) | JPH02138197A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001027264A1 (en) * | 1999-10-15 | 2001-04-19 | Nihon University, School Juridical Person | Ribozymes to growth factor originating in human platelet |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0259632B1 (en) * | 1986-08-13 | 1995-12-13 | Zymogenetics, Inc. | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
| DE3855504T2 (de) * | 1987-04-22 | 1997-01-23 | Chiron Corp | Rekombinante Herstellung von A-Ketten-Polypeptiden von PDGF |
-
1988
- 1988-10-31 EP EP88118166A patent/EP0366816A1/en not_active Withdrawn
- 1988-11-15 JP JP63286918A patent/JPH02138197A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0366816A1 (en) | 1990-05-09 |
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