JPH02142481A - 新規組換えプラスミド、それを含む大腸菌、それを用いて得られるジヒドロ葉酸還元酵素及びその分離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、　ＤＨＦＲと
略す）が２分子つながったタンパク質（以下、ＤＨＦＲ
ダイマーと称する）およびその生産を可能とする新規組
換えブラスミ）”　ｐ　Ｄ　Ｄ　Ｍ　１に関するもので
ある。

本発明の新規組換えプラスミドｐＤＤＭ１は。

第１図において示されるＤＮＡ配列を有する。ＤＨＦＲ
ダイマーは、第２図において示されるアミノ酸配列を有
する。ｐＤＤＭｌ、ｐＤＤＭｌを含有する大腸菌、およ
び“ＤＨＦＲダイマーは１発酵工業、医薬品工業等の分
野に好適である。

［従来の技術および問題点コ 大腸菌が生産するＤＨＰＲは、アミノ酸１５９個よりな
る一木のポリペプチド鎖中に一つの酵素活性単位を有す
るモノメリックな酵素である。すでに９本発明者らは９
組換えＤＮＡ技術を駆使した大腸菌のＤ　ＨＦ　Ｒの大
量発現および生産方法を確立している（特許　昭５９−
１３５８８９．特開　昭（３２−６９９９０，特許　昭
６２−３０２１５２）。本発明のＤＨＰＲダイマーは、
上記モノメリックなりＨＰＲと異なり、−本のポリペプ
チド鎖中に２つの酵素活性単位を有するまったく新規な
タンパク質てあり２本発明が完成するまでには知られて
いなかった物質である。またＤＨＦＲダイマーを暗号化
するプラスミドｐＤＤＭ１も同様に新規なＭｉ換えプラ
スミドである。

本発明のＤＨＦＲダイマーを開発するための基礎となる
技術としては９本発明者が発明した融合タンパク質の作
製方法がある（特願　昭６２−３０２１５３）。

［発明の目的コ 本発明のＤ　ＨＦ　Ｒダイマーは、−本のポリペプチド
鎖中にＤＨＦＲ酵素活性を発現する２つの酵素活性単位
を有するタンパク質であり５本発明がなされるまではま
ったく未知の物質であった。

本発明者らは、新規なタンパク質であるＤＨＦＲダイマ
ーの作製を目的に鋭意研究した結果２本発明者が開発し
た融合タンパク質の作製方法を利用して、ＤＨＰＲ遺伝
子を結合することによりＤＨＦＲを２分子結合すること
を考案し、それに基つき組換えプラスミドｐ　Ｄ　Ｄ　
Ｍ　１の作製およびｐＤＤＭＩの大腸菌での発現を行い
、ｐＤＤＭｌを有する大腸菌′か・）のＤＨＦＲダイマ
ーの分宿精製に成功し本発明を完成させるに至った。

［発明の構成コ 本発明は、（１）新規組換えプラスミドｐＤＤＭｌ、（
２）ｐＤＤＭＩを含有する大腸菌、（３）ｐＤＤＭｌが
暗号化する新規な酵素タンパク質であるＤＨＰＲダイマ
ー、および（４）　ｐＤＤＭＩを含有する大腸菌からの
ＤＨＦＲダイマーの分離精製方法から構成される。

（１）新規組換えプラスミドｐｒ’ｌＤＭ］第１図は９
本発明のｐＤＤＭｌの全塩基配列を示している。図は、
２本鎖環状ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、プ
ラスミド中に２箇所存在する制限酵素ＣＩａＩ部位のう
ち制限酵素Ｈ１ｎｄｍ部位に近い方の切断認識部位、　
５’−ＡＴＣＧＡＴ−３°、の最初の”Ａ“′を１番と
して数えて、５′末端から３′末端の方向に記述してい
る。本発明のｐＤＤＭＩ：、ｔ、新規な組換えプラスミ
ドである。ｐＩ）ＤＭＩは、５７７９塩基対の大きさで
あり、宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピ
シリン耐性を付与することができる。ｐＤＤＭｌは。

実施例において示すように、すてに本発明者らが作製し
ているｐＴＰ６４−１（時開　昭６２−６９９９０に記
載。）の制限酵素ＢｇｌＩｒとＢｃ１１部位の間に、す
てに本発明者らが開発しているｐＴＰ７０−１　（特願
　昭６１−３１２８３６）の制限酵素Ｂｇｌｎ切断によ
って得られる約５００塩基対のＤＮＡ断片を挿入するこ
とによって作製することができる。しかしながら、−旦
配列が明らかにされた絽換えプラスミドの作製方法とし
ては２種々の方法が可能であり、従って２組換えプラス
ミドの作製方法によって本発明が制限されるものではな
い。

ＤＨＦＲダイマーを暗号化する配列は、第１図の５７番
目から１０１３＠目までの配列である。

Ｄ　ＨＦ　Ｒダイマーを暗号化する配列の上流には。

遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（時開
　昭６２−６９９９０）。即ち、４３番目から５０番目
までの配列がＳＤ配列と呼ばれるもので、効率の良い翻
訳に、また、５７３７＠目から５７６５ｅ目までが、コ
ンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転写に
貢献する。このことから、ｐＤＤへ４１は、大腸菌に導
入された場合、多量のＤＨＦＲダイマーを作らせること
ができる。作られたＤＨＦＲダイマーは、菌体内に可溶
性の状態で、菌体タンパク質の約２０％程度蓄積する。

このことによって、ｐＤＤＭｌを含有する大腸菌はトリ
メトプリム耐性を示すようになる。

また、ｐＤＤＭｌは、Ｊ）ＴＰ６４−１由来の、アンピ
シリン耐性遺伝子を有している。このことから、ｐＤＤ
Ｍｌが導入された大腸菌は、アンピシリン耐性をも示す
。ｐＤＤＭｌは、大腸菌に導入されて安定状態に保たれ
、Ｉ）ＤＤへ１１を含有する大腸菌は、微工研にＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−２１５０として寄託されている。

（２）９ＤＤＭ１を含有する大腸菌 ｐＤＤＭ１を含有する大腸菌は、トリメトプリム及びア
ンピシリンに対して耐性を示す。ｐＤＤＭｌを含有する
大腸菌は、ＤＨＰＲダイマー遺伝子の効率のよい発現の
結果、ＤＨＰＲダイマーを菌体内に可溶性の状態で大量
に蓄積する。ｐＤＤき４１を含有する大腸菌をＹＴ＋Ａ
ｐ培地（培地１１中に、５ｇのＮａＣｌ、８ｇのトリプ
トン、５ｇのイーストエキス、及び５０ｍｇのアンピシ
リンナトリウムを含む液体培地）を用いて、３７℃で定
常期まで培養した場合、蓄積するＤＨＦＲダイマー！ｉ
、Ｍ体タンパク質の約２０％に達する。

培養菌体を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液に懸濁し
、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、これ
を遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、全ての
ＤＨＦＲダイマーは上清中に回収される。ｐＤＤＭｌを
含有する大腸菌は、微工研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１５
０として寄託されている。

（３）ＤＨＦＲダイマー 第２図は、　　ＤＨＦＲダイマーを暗号化する部分のＤ
ＮＡ配列とそれから作られるタンパク質のアミノ酸配列
を示している。ＤＨＦＲダイマーは。

３１９アミノ酸よりなる新規なタンパク質である。

ＤＨＦＲダイマーの分子量は、それぞれ３６，１１６で
ある。ＤＨＦＲダイマーは、まったく新規なタンパク質
である。ＤＨＦＲダイマーは、ｐＴＰ７０−１由来のＤ
ＨＦＲ（第２図の１番目から１６２番目までのアミノ酸
配列）と、ｐＴＰ６４−１由来のＤＨＦＲからＮ末端の
メチオニンが取り除かれたタンパク質（第２図の１６３
番目から３１９番目までのアミノ酸配列）とが、２分子
直列に結合した構造である。このような構造にもかかわ
らず、ＤＨＦＲダイマーは、ＤＨＦＲ酵素活性を有する
。ＤＨＰＲダイマーの１分子当りの酵素活性は、ＤＨＦ
Ｒの１分子当りの活性の２倍である。また、ダイマー１
分子当り、阻害剤であるメソトリキセートが２分子量合
したときにＤＨＦＲダイマーが完全に阻害される。この
ように９本発明のＤＨＦＲダイマーは、−本のポリペプ
チド鎖中にＤＨＦＲ酵素活性を発現する２つの酵素活性
単位を有するタンパク質である。

また、大腸菌がＤＨＦＲダイマーを多量につくると、Ｄ
ＨＦＲの阻害剤であり抗細菌剤であるトリメトプリムに
対して、耐性を示すようになる。

（４）、　Ｄ　ｌｉ、ＰＲダイマーの分離精製本発明の
融合タンパク質の分離精製法は、■菌体の培養、■菌体
の破砕、■ＤＥＡＥ−）ヨパール力ラムクロマトグラフ
ィー９■トヨパールＨＷ５５カラムクロマトグラフィー
、および■ＤＥＡＥ−）ヨバール力ラムクロマトグラフ
ィーの過程より成り立っている。

■菌体の培養 ｐＤＤＭｌを含有する大腸菌の培養は、ＹＴ＋Ａｐ培地
（培地１１中に　５ｇのＮａＣ１，８ｇのトリプトン、
５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇのアンピシリンナ
トリウムを含む液体培地、）で培養することができる。

培地としては、この他にＳＴ＋Ａｐ培地（培地１１中に
、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウム、５ｇの
ポリペプトン１５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇの
アンピシリンナトリウムを含む液体培地。）など。

菌体が成長する培地であれば、どの様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、ＹＴ＋Ａｐ培地が最
適であった。

ｐ　Ｄ　Ｄ　Ｍ　）乞含有する大腸菌を、培地に接種し
。

３７℃で対数成長期の後間もしくは定常期まで培養する
。培養した菌体は、５．０００回転／分の遠心分離によ
り集める。培地１１より湿重量２から５ｇの菌体が得ら
れる。

集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
（０から１０℃の間、４°Ｃが望ましい）で行う。

■菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の２倍の緩衝１１２１
　（０，１ｍＭ　　エチレンジアミン４酢酸ナトリウム
（ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝ｔｆｆ
、ｐＨ７，０）に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体
を破砕する。菌体破砕液を、３５゜０００回転、１時間
超遠心分ｉｕシ、上清を得る（無細胞抽出液）。

■ＤＥＡＥ−）ヨバール力ラムクロマトグラフィ無細胞
抽出液を、あらかじめ５０ｍＭのＫＣＩを含む緩衝液１
で平衡化したＤＥＡＥトヨバールカラムにか′け、カラ
ム容量と同容量の５０ｍＭのＫＣＩを含む緩衝液１てカ
ラムを洗う。酵素の溶出は、緩衝液１を用いて０．ＩＭ
から０．３ＭのＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行い、溶
出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画
する。分画した溶出液についてＤ）（ＦＲ活性を測定し
、酵素活性が含まれる両分を集める。

■トヨパールＨＷ５５カラムクロマトグラフィー上記の
操作により得られた酵素液を、限外濾過膜を用いて１〜
４ｍｌにまで濃縮し、あらかじめ緩衝液ｌで平衡化した
トヨパールＨＷ　５５カラムにかけ、同緩衝液を用いて
酵素を溶出する。溶出液を一定量ずつフラクションコレ
クターを用いて分画する。分画した溶出液についてＤＨ
ＰＲ活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集める。

■ＤＥＡＥ−）ヨバール力ラムクロマトグラフィ上記の
操作により得られた酵素液を、あらかしめ緩衝液１で平
衡化したＤＥＡＥ−）ヨバール力ラムに吸着させる。吸
着後、５０ｍＭＫＣｌを含いて５０ｍＭから０．３Ｍの
ＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量ず
つフラクションコレクターを用いて分画する。分画した
溶出液について２８０ｎｍの吸光度とＤＨＦＲＨＦ上を
測定する。酵素活性／２８０ｎｍの吸光度の値が。

一定な両分を集める。

以上の操作により、融合タンパク質の高度精製均一化を
、再現性良く行うことができる。

本発明に従うと、融合タンパク質の精製は、菌体の培養
を含めて一週間以内に行うことができ。

回収率３５％以上で、均一な酵素標品を得ることができ
る。

ＤＨＦＲ酵素活性は９反応ｉ＆　　（０，０５ｍＭのジ
ヒドロ葉Ｒ，０，０６ｍＭのＮＡＤＰＨ，１２ｍＭの２
−メルカプトエタノール、５０ｍＭのリンＭｌｔｉン夜
（ｐＨ７，０））を、１ｍｌのキュヘットとり、これ−
に酵素液を加え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化を測定
することにより行う。酵素１ユニツトは、上記反応条件
において、１分間に要な酵素量として定義する。このｉ
ｌｌ定は９分光光度計を用いて容易に行うことができる
。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ ｐＤＤＭｌの作成 りＨＦＲを２分子直列に結合したタンパク質を暗号化す
るＤＮＡ配列を作製するために、ｐ’ｒｐ（３４−１（
時開　昭８２−６９９９０に記載。）の制限酵素Ｂｇｌ
ｎ（第１図の１２＠巨から１８８番目に相当する配列）
とＢｃ１１部位（第１図の５３８８目から５４３８目に
相当する配列）の間に、ｐＴＰ７０−１　（特許　昭６
ｌ−３１２８３６）の制限酵素ＢｇｌＩＩ切断によって
得られる約５００塩基対のＤＮＡ断片（第１図の１４番
目から５３８番目の間の配列に相当する）を挿入するこ
とを考えた。

約１μｇのｐＴＰ６４−１を制限酵素Ｂｅ１ｌターゼ処
理をした。アルカリホスファターゼ処理したＤＮＡをフ
ェノール処理することにより、共存する酵素タンパク質
を変性除去し、その後エタノールでＤＮＡを沈澱させた
。沈澱したＤＮＡを７０％エタノールで洗った後、エタ
ノールを除き。

減圧下に沈澱を乾燥させた。制限酵素によるＤＮＡの切
断、アルカリホスファターゼ処理、フェノール処理、お
よびエタノール沈澱の各操作は、いずれも、”ｔｌｏｌ
ｅｒｕｌａｒ　ＣｌｏｎｉｎｇＡ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ”（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ
、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｄｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　（１９８２）＋以下。

文献１と呼ぶ）に記載している方法に従って行った。約
１μｇのｐＴＰ７０−１を制限酵素Ｂｇｌ■で切断した
後、フェノール処理することにより。

共存する酵素タンパク質を変性除去し、その後エタノー
ルでＤＮＡを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを７０％エタ
ノールで洗った後、エタノールを除き、減圧下に沈澱を
乾燥させた。このように処理した２種類のＤＮＡをそれ
ぞれ２５μｍのリガーゼｆｆ１Ｍジチオトレイトール、
　５　ｍＭ　ＡＴＰ）に溶解し９両者を混ぜ合わせ、こ
れに１ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼを加えて、１０
’Ｃで、１２時間ＤＮＡの連結反応を行わせた。この反
応物を、形質転換法（ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
　ｍｅｔｈｏｄ、上記文献ｌに記載）に従って、大腸ｒ
ｊＩＪＨ８１０１株に取り込ませた。

この処理をした菌体な、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリン
ナトリウムおよび１０ｍｇ／ｍｌのトリメトブリ１、を
含む栄養寒天培地（培地１１中に、２ｇのグルコース、
１ｇのリン酸２カリウム＋５ｇのイーストエキス、５ｇ
のポリペプトン、１５ｇの寒天を含む。）上に塗布し、
３７＠Ｃで２４時間培養することにより、１００個以上
のコロニーを得ることができた。これらのコロニーから
適当に４０個選ひ、それぞれを１．５ｍｌのＹＴ＋Ａｐ
培地（培地１１中に、５ｇのＮａＣＩ、５ｇのイースト
エキス、８ｇのトリプトン、５０ｍｇのアンピシリンナ
トリウムを含む。）で、３７℃。

１晩、菌体を培養した。培養液を、各々エラペン０分間
遠心分難し、菌体な沈澱として集めた。これに、０．１
ｍｌの電気泳動用サンプル調製液（０，０６２５ＭのＴ
ｒｉｓ−ＨｃＩ、　ｐ）！　６．８．２’Ｘのラウリル
硫酸ナトリウム（Ｓｒ）Ｓ）　、　１０％（７）グリセ
リン、５Ｘ（７）２−メルカプトエタノール、　０．０
０１χのブロムフェノールブルーを含む。）を加え、菌
体を懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶か
した。この処理をしたサンプルを５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法（ｔＪ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ；Ｎ
ａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、２２７゜ｐ、６８０（＋９７０）
）に従って分析した。標準サンプルとしてｐＴＰ６４−
１およびｐＴＰ７０−１をそれぞれ含有する大腸菌に同
様な処理をしたもの、および分子量マーカーとしてラク
トアルブミン（分子ｆｆ１１４，２００）　、　　）リ
ブシンインヒビター（分子量２０．１００）　、　）リ
ブシノーゲン（分子量２４，０００）　、カルボニック
アンヒドラーゼ（分子ｆｉ２９，０００）　、グリセロ
アルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子量３６，
０００）　、卵アルブミン（分子量４５，０００）　。

および牛血清アルブミン（分子量６６．０００）を含む
０Ｘ濃度勾配ゲルで泳動した。その結果、４０個のうち
、２個のコロニーにおいては９分子量約３７．０００と
推定されるタンパク質を大量に生産することが明かとな
った。得られた２個のコロニーから適当に一株を選び、
これをＹＴ＋Ａｐ培地で培養し、　ＴａｎａｋａとＷｅ
ｉｓｂｌｕｍの方法（Ｔ、Ｔａｎａｋａ、　Ｂ、Ｗｅｉ
ｓ−ｂｌｕｍ：Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　ｖ
ｏｌ、Ｉ２１．ｐ、３５４（１９７５））に従って、プ
ラスミドを調製した。得られたプラスミドをｐＤＤＭｌ
と名づけた。

ｐＤＤへ４１は、ｐＴＰ６４−１にｐＴＰ７０−１由来
の配列が挿入している構造をとるはずであるので、この
ことを確かめるために、第１図の４９５４８目から４９
５９番目に位置するＰｓｔ１部位から第１図の９５１５
１番目９５６８目に位置するＥｃｏＲ１部位に至る。約
１．７キロ塩基対のＤＮＡ部分についてＭ１３ファージ
を用いたジデオキシ法（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ；Ｍｅｈｔ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

ｖｏｌ　、＋０１．ｐ、２０（＋９８３））に従って、
塩基配列を決定した。その結果、第１図に示す配列の４
９５４番目６番目までの配列が確かめられた。また、す
てに。

ｐＴＰ６４−１の全塩基配列は明かであり（（時開　昭
６２−６９９９０に記載）、また、残りの部分は、制限
酵素ＡａｔＩＩ、ＰｖｕｌＩ、およびＴａｑｌによる切
断実験の結果、ｐＴＰ６４−１を制限酵素ＥｃｏＲＩお
よびＰｓｔＩ切断によって得られる約４キロ塩基対のＤ
ＮＡ断片と全く同一であることが示された。

以上の結果から、ｐＤＤＭｌの全塩基配列が第１図に示
した配列であることが決められた。

実施例２ ｐＤＤＭｌを含有する大腸菌が作るＤＨＦＲダイマー ｐＤＤＭｌを含有する大腸菌が作るＤＨＦＲ融合タ融合
タンパクジノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予想する
ことができる。第１図の５７番目から１０１３番目の配
列が融合タンパク質を暗号化していることから、トリブ
レット暗号表を用いて・アミノ酸配列を推定した・そ０
拮果第２東示すアミノ酸配列が得られ、ＤＨＦＲダイマ
ーは。

３１９個のアミノ酸よりなり９分子量が３６．ｌ１６ダ
ルトンであった。

ｐＤＤへ１１を含有する大腸菌から、ＤＨＦＲダイマー
を分離精製し、タンパク質の性質を調べた。

［ＤＨＦＲダイマーの精製］ Ａ、用いた菌体量：湿重ｆｆｉ　　１０ｇＢ、酵素精製
表 表における精製過程は■無細胞抽出液、■ＤＥＡＥ−）
ヨバール力うム力うムクロマトグラフィー■トヨパール
）（Ｗ５５カラムクロマトグラフィーおよび■ＤＥＡＥ
−）ヨパール力ラムクロマトグラフィーを表す。

精製　酵素液　回収タンパ　回収酵素　収率過程　の員
（ｍｌ）り質（ｍｇ）　　　活性（］ニット）（２）■
　　　　３３　　　　　　６６１　　　８．８４１　　
　＋００■　　　　３０　　　　　　１２９　　　６，
７７７　　　７６．７■　　　　２８　　　　　　８５
　　　３，１９０　　　３５．７得られた酵素タンパク
質をＳＤＳ電気泳動法（上記実施例に記載の方法）によ
り分析したところ。

分子盟約３７　、０００の単一なタンパク質バントが示
され、得られた酵素標品が均一であることが示された。

［分離精製したＤ　ＨＦ　Ｒダイマーの性質コ精製した
ＤＨＦＲダイマーの活性およびその際に用いた酵素のの
タンパク質濃度をそれぞれ測定し、タンパク質１ｍｇ当
りの活性（比活性）を求めたところ、３５．２ユニット
／ｍｇタンパク質の１石であった。同様にして、野生型
のＤＨＦＲ（ｐＴＰ６４−１を含有する大腸菌がつくる
ＤＨＦＲ）の比活性を求めたところ、３４．８ユニット
／ｍｇタンパク質の値であり、ＤＨＦＲダイマーと野生
型ＤＨＦＲの酵素活性の比活性は同じ値を示した。ＤＨ
ＦＲダイマーの分子量は、野生型ＤＨＦＲの分子量の約
２倍であることから、この結野生型ＤＨＦＨの２倍であ
ることを示している。

また、ＤＨＦＲダイマー０．７４μＭおよび野生型ＤＨ
ＦＲ１，０２μＭの酵素に、ＤＨＦＨの阻害剤であるメ
ソトリキセートを種々の濃度加えて酵素活性に及ぼす影
響を調べたところ、それぞれＤＨＦＲダイマーでは、０
．１４５μＭのメソトリキセートおよび野生型ＤＨＦＲ
では１．１９μＮ１のメソトリキセートによって完全に
阻害されることが明かとなった。この結果はＤＨＦＲダ
イマー１分子に２分子のメソトリキセートが、また野生
型ＤＨＦＲ１分子に１分子のメソトリキセートが結合す
ることを示している。以上の結果により。

ＤＨＦＲダイマーは、−本のポリペプチド鎖中ζこＤＨ
ＦＲ酵素活性を発現する２つの酵素活性単位を有するタ
ンパク質であることが示された。

［発明の効果］ 上記のように、新規組換えブラスミＦ’　Ｉ）　Ｄ　Ｄ
　Ｍｌは、　ｊ７ｉ現な酵素タンパク質であるＤＨＦＲ
ダイマーを暗号化しており、かつｐＤＤＭｌを有するる
。さらに、生成したＤＨＦＲダイマー−本のボノペプチ
ト鎖中に２個の酵素活性単位を有し、新規なりＨＦＲ酵
素タンパク質である。このような。

物質は本発明がなされるまでは、存在しなかったもので
あり、これからの用途開発が期待される。

また、ＤＨＦＲは９葉酸補酵素合成のための重要な酵素
であり、また、この酵素活性を用いることにより、ジヒ
ドロ葉酸、テトラヒドロ￥酸の定量化も可能であり、少
なくともこのような分野での利用に貢献することは明か
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＤＤＭｌの全塩基配列を示した図であり、
２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、５′末
端から３′末端の方向に記述している。図中符号は、核
酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇは
グアニンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は、ｐ
ＤＤＭｌに唯一存在する制限酵素Ｃ１ａｌ切断認識部位
、５′て数えた番号を示している。 第２図は、ｐＤＤＭｌ中に存在するＤＨＦＲダイマーを
暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸
配列を示す図である。図中符号は。 核酸塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを。 Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンな。 Ａｌａはアラニンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓｎは
アスパラギンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｃｙｓは
システィンを、Ｇｌｎはグルタミンを、ＧＩＩＪはグル
タミン酸を、ｃｒｙはグリシンを、Ｈｉｓはヒスチジン
を、Ｉｌｅはイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｌ
ｙｓはリジンを。 Ｍｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、
Ｐｒｏはプロリンを、Ｓｅｔはセリンを。 Ｔｈｒはトレオニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔ
ｙｒはチロシンを、Ｖａｌはバリンを示している。図中
番号は、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るＡＴＧコドンの”Ａ”を１番として数えた番号を示し
ている。 第１図の１ ＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧ　ＣＡＡＡＡＣＧＴＣＴ　ＧＣＧ
ＡＣＣＴＧＡＧ　ＣＡＡＣＡＡＣＡＴＧ　ＡＡＴＧＧＴ
ＣＴＴＣ２９６０２９７０２９８０２９９０３００ＧＧ
ＧＴＴｒＣＣＧＴＧ　ＴＴＴＣＧＴＡＡＡＧ　ＴＣＴＧ
ＧＡＡＡＣＧ　ＣＧＧＡＡＧＴＣＡＧ　ＣＧＣＣＣＴＧ
ＣＡＣ第１図の２ 第１図の３ αχＫｉＡＧＣＡＧＡ　ＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧ
ＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＴＧｒＴ　Ｇｆχ℃α’；Ｔ
ＧＴＣＧＧＧＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧ　Ｔ
ＣＡＣＧＴＡＧＣＧ　ＡＴＡＧＣＧＧＡＧＴ　ＧＴＡＴ
ＡＣＴα℃ｎムＡＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧ　
ＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡ　ＣＣＡＴ
ＡＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡ丁ＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴ
Ｇ　ＣＧＴＡＡＧＧＡＧＡ　　ＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡ　
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ＡＴＧＴＡＴｒ　ＣＡＴＡＡＧＣＴＴ第１図の６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図において示されるＤＮＡ配列を有する新規組
   換えプラスミドｐＤＤＭ１。 ２、特許請求範囲第１項記載の新規組換えプラスミドｐ
   ＤＤＭ１を含有する大腸面。 ３、第２図において示されるアミノ酸配列を有するジヒ
   ドロ葉酸還元酵素。 ４、特許請求範囲第３項記載のジヒドロ葉酸還元酵素の
   分離精製方法。