JPH0354556B2 - - Google Patents
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- JPH0354556B2 JPH0354556B2 JP63079680A JP7968088A JPH0354556B2 JP H0354556 B2 JPH0354556 B2 JP H0354556B2 JP 63079680 A JP63079680 A JP 63079680A JP 7968088 A JP7968088 A JP 7968088A JP H0354556 B2 JPH0354556 B2 JP H0354556B2
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- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は、モルヒネ様鎮痛作用を示すペプチド
であるメチオニンエンケフアリン（チロシン
（Tyr）−グリシン（Gly）−グリシン（Gly）−フ
エニルアラニン（Phe）−メチオニン（Met）の
５個のアミノ酸配列よりなるペプチド、以下、
MEKと略す。）を含む融合タンパク質を大量に生
産可能とする新規組換えプラスミドpMEK2、
pMEK2に含有する大腸菌、MEKを酵素のカル
ボキシ末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵素−
MEK融合タンパク質（以下、DHFR−MEKと
略す。）、DHFR−MEKの分離精製方法、および
MEKの製造方法に関するものである。本発明の
新規組換えプラスミドpMEK2は、第１図におい
て示さえるDNA配列を有する。本発明は、発酵
工業、医薬品工業等の分野に好適である。 従来の技術 MEKは、ロイシンエンケフアリン（以下、
LEKと略す。）と同様、モルヒネ様鎮痛作用を示
す内因性ペプチドとして知られ、習慣性のない鎮
痛剤また麻酔薬としての利用が期待される興味深
い生理活性ペプチドである。MEKの鎮痛効果は、
LEKの約1.5倍であるとされている。 本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。しかしながら、遺伝子操作を利
用した効率のよいMEKの製造方法に関しては、
知られていない。 一方、既に、本発明者らは、大腸菌由来のジヒ
ドロ葉酸還元酵素（以下、DHFRと略す。）遺伝
子に関して、その遺伝子の改変の結果、異種遺伝
子発現用プラスミドベクターpTP70−１（特開昭
63−46193号公報）及びそれを利用した融合遺伝
子の作成方法（特開平１−144992号公報）を開発
している。これらの方法を利用した場合、融合遺
伝子の発現の結果得られる融合タンパク質の大腸
菌菌体の蓄積量は、全菌体タンパク質の約20％が
期待される。しかしながら、MEKの生産に上記
発現ベクターを用いた例はない。 発明の目的 本発明の目的は、いまだ確立されていない、遺
伝子操作の手法を用いたMEKの大量生産方法を
開発することにある。 既に、本発明者らは(1)大腸菌のDHFRを大量
に発現する発現プラスミドを構築していること
（特開昭62−69990号公報）、(2)大腸菌のDHFRの
カルボキシ末端側の配列を変化させても、酵素活
性が失われないこと、(3)大腸菌のDHFRのカル
ボキシ末端側に異種ペプチドを融合させることを
可能とするプラスミドベクターpTP70−１を構
築していること（特開昭63−46193号公報）、(4)
pTP70−１上の改変DHFRは、大腸菌で効率良
く発現すること、を明らかにしている。 本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究
の結果、MEK遺伝子を化学合成し、pTP70−１
に組み込むことにより、MEK遺伝子とDHFR遺
伝子の融合遺伝子を作成し、融合遺伝子を大腸菌
で発現させることにより、DHFR−MEKを大量
に生産できることを見いだし、さらに、DHFR
−MEKを用いることにより効果的にMEKを作成
できることを明らかにし、本発明を完成させた。 発明の構成 本発明は、(1)DHFR−MEKの大量発現を可能
にする新規組換えプラスミドpMEK2、(2)
pMEK2を含有する大腸菌菌体、(3)pMEK2を含
有する大腸菌が生産するDHFR−MEK、(4)
pMEK2を含有する大腸菌からのDHFR−MEK
の分離精製、および(5)DHFR−MEKを用いた
MEKの製造方法、の発明により構成される。 (1) 新規組換えプラスミドpMEK2 第１図は、本発明のpMEK2の全塩基配列を
示している。図は、２本鎖環状DNAのうち片
方のDNA鎖配列だけを、プラスミド中に２箇
所存在する制限酵素Cla部位のうちHind部
位に近い方の切断認識部位、5′−ATCGAT−
3′、の最初の“Ａ”を１番として数えて、5′末
端から3′末端の方向に記述している。本発明の
pMEK2は、新規な組換えプラスミドである。
pMEK2は、4640塩基対の大きさであり、宿主
である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシ
リン耐性を付与することができる。pMEK2
は、pTP70−１のBamH部位にMEKを暗号
化する配列を含む32塩基対の化学合成DNAが
結合した構造をしていてる。第１図において、
533番目から564番目迄の配列が化学合成DNA
由来の配列である。それ以外の配列がpTP70
−１由来の配列である。 化学合成したDNAの配列には、制限酵素
Xhoの認識切断部位、5′−CTCGAG−3′（第
１図の、558番目から563番目までの配列）、を
含ませてある。pTP70−１由来の部分には、
Xho部位が存在しない。従つて、pMEK2の
BamH部位（第１図の532番目から537番目
までの配列）からXho部位までの配列を他の
配列に置き換えることにより、方向を定めて異
種DNAの導入を行い、DHFR遺伝子との融合
遺伝子の作成をさらに容易に行うことができ
る。 第１図の57番目から554番目まで配列は、
DHFRのカルボキシ末端側にMEKがアルギニ
ンを介して結合したDHFR−LEKを暗号化し
ている。 DHFR−LEKを暗号化する配列の上流には、
DHFR−LEK遺伝子の発現を効率良く行わせ
る配列が存在する（特開昭63−46193号公報）。
即ち、43番目から50番目までの配列がSD配列
と呼ばれるもので、効率の良い翻訳に、また、
4598番目から4626番目までが、コンセンサス転
写プロモーターであり、効率の良い転写に貢献
する。このことから、pMEK2は、大腸菌に導
入された場合、多種のDHFR−MEKを作る。
作られたDHFR−LEKは、菌体内に可溶性の
状態で、菌体タンパク質の約20％程度蓄積す
る。このことによつて、pMEK2を含有する大
腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。
また、pMEK2は、pTP70−１由来の、アンピ
シリン耐性遺伝子を有している。このことか
ら、pMEK2が導入された大腸菌は、アンピシ
リン耐性をも示す。pMEK2は、大腸菌に導入
されて安定状態に保たれ、pMEK2を含有する
大腸菌は、微工研にFERMBP−1816として寄
託されている。 このような特長を有するpMEK2は、実施例
１に従つて作成することができるが、組換えプ
ラスミドの作成方法によつて本発明が制限され
るものではない。 (2) pLEK1を含有する大腸菌 pMEK2を含有する大腸菌は、トリメトプリ
ム及びアンピシリンに対して耐性を示す。
pMEK2を含有する大腸菌は、pMEK2上の
DHFR−MEK遺伝子の効率のよい発現の結
果、DHFR−MEKを菌体内に可溶性の状態で
大量に蓄積する。pMEK2を含有する大腸菌を
YT＋Ap培地（培地1l中に、５ｇのNaCl、８
ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキス、及び
50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体培
地）を用いて、37℃で定常期まで培養した場
合、蓄積するDHFR−MEKは、菌体タンパク
質の約20％に達する。培養菌体を、リン酸緩衝
液などの適当な緩衝液に懸濁し、フレンチプレ
ス法もしくは音波破砕法で破砕し、これを遠心
分離法により上清と沈澱に分離した場合、ほと
んど全てのDHFR−MEKは上清中に回収され
る。pMEK2を含有する大腸菌は、微工研に
FERMBP−1816として寄託されている。 (3) DHFR−MEK 第２図は、DHFR−MEKを暗号化する部分
のDNA配列とそれから作られると予想される
タンパク質のアミノ酸配列を示している。
DHFR−MEKは、166アミノ酸よりなる新規
なタンパク質である。アミノ末端側から数え
て、１から159番目までの配列が、大腸菌の野
生型DHFRに１箇所アミノ酸置換置換が起こ
つた（Cys−152（Wild type）→Glu−152）配
列であり、162番目から166番目までがMEKの
配列である。MEKの配列の直前のアミノ酸は
アルギニン（Arg）である。このことにより、
DHFR−MEKをトリプシンで処理することに
より、MEKを特異的に切り出すことができる。
160番目ののイソロイシン（Ile）は、pTP70−
１のBamH部位にMEKを暗号化するDNA
を導入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わ
せるために生じた配列である。pTP70−１が
作るDHFRは、162個のアミノ酸よりなり、第
２図のDHFR−MEKのアミノ酸配列のうち、
アミノ末端側から数えて、１から160番目まで
の配列に、Gln−Ileの２個のアミノ酸配列が結
合した配列をしている。DHFR−MEKの分子
量は、18850である。 DHFR−MEKは、新規なタンパク質であ
る。DHFR−MEKはDHFRのカルボキシ末端
側に、MEKが融合した構造をしているにもか
かわらず、DHFR酵素活性を有する。このた
め、大腸菌がDHFR−MEKを多量につくる
と、DHFRの阻害剤であり抗細菌剤であるト
リメトプリムに対して、耐性を示すようにな
る。 (4) DHFR−MEKの分離精製 本発明のDHFR−MEKの分離精製法は、
菌体の培養、菌体の破砕、DEAE−トヨパ
ールカラム処理、メソトリキセート
（MTX）結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー、およびDEAE−トヨパールカラムクロマ
トグラフイーの過程より成り立つている。 菌体の培養 pMEK2を含有する大腸菌の培養は、YT
＋Ap培地（培地1l中に、５ｇのNaCl、８ｇ
のトリプトン、５ｇのイーストエキスおよび
50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体培
地。）で培養することができる。培地として
は、この他にST＋Ap培地（培地1l中に、２
ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウム、
５ｇのポリペプトン、５ｇのイーストエキス
および50mgのアンピシリンナトリウムを含む
液体培地。）など、菌体が成長する培地であ
れば、どの様な培地でも用いることができる
が、調べた限りでは、DHFR−MEKの生産
にはYT＋Ap培地が最適であつた。 pMEK2を含有する大腸菌を、培地に接種
し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常期
まで培養する。培養温度により菌体中の
DHFR−MEKの蓄積量が変動し、調べた限
りでは、培養温度が高いほど蓄積量が大であ
つた。培養した菌体は、5000回転／分の遠心
分離により集める。培地1lより湿重量２から
４ｇの菌体が得られる。 集菌およびこれ以後の操作は、特に断わら
ない限り低温（０から10℃の間、４℃が望ま
しい）で行う。 菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の
緩衝液１（0.1ｍＭ エチレンジアミン４酢酸
ナトリウム（EDTA）を含む10ｍＭリン酸
カリウム緩衝液、PH7.0）に懸濁し、フレン
チプレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕
液を5000回転、10分間遠心分離し、上清を得
る。さらに、上清を、35000回転、１時間超
遠心分離し、上清を得る（無細胞抽出液）。 DEAE−トヨパールカラム処理 この操作は、次の精製過程の前処理の目的
で行う。無細胞抽出液を、あらかじめ0.1M
のKClを含む緩衝液１で平衡化したDEAEト
ヨパールカラムにかけ、0.1MのKClを含む
緩衝液１でカラムを洗う。酵素の溶出は、
0.3MのKClを含む緩衝液１を用いて行う。
溶出液を一定量ずつフラクシヨンコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液について
DHFR活性を測定し、酵素活性が含まれる
画分を集める。 MTX結合アフイニテイクロマドグラフイ
ー 上記の操作により得られた酵素液を、あら
かじめ緩衝液１で平衡化したMTX結合
Sepharoseアフイニテイカラムに吸着させ
る。吸着後、1MのKClを含む緩衝液２（0.1
ｍＭ EDTAを含む10ｍＭリン酸カリウム
緩衝液、PH8.5）で洗う。洗いは、カラムか
らの溶出液の280nｍの吸光度を測定し、吸
光度が0.1以下になるまで同緩衝液を流し続
ける。酵素の溶出は、1MのKClと３ｍＭの
葉酸を含む緩衝液２を用いて行い、溶出液を
一定量ずつフラクシヨンコレクターを用いて
分画する。分画した溶出液についてDHFR
活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集
める。得られた酵素液を、緩衝液１に対し
て、３回透析する。この段階で、純度90％以
上のDHFR−MEKが得られる。 DEAE−トロパールカラムクロマトグラフ
イー 透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液１で
平衡化したDEAE−トヨパールカラムに吸着
させる。吸着後、0.1MKClを含む緩衝液１
で洗う。洗いは、カラムからの溶出液の
280nｍの吸光度を測定し、吸光度が0.01以下
になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶
出は、緩衝液１を用いて0.1Mから0.3Mの
KClの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を
一定量ずつフラクシヨンコレクターを用いて
分画する。分画した溶出液について280nｍ
の吸光度とDHFR活性とを測定する。酵素
活性／280nｍの吸光度の値が、一定な画分
を集める。 以上の操作により、DHFR−MEKの高度精
製均一化を、再現性良く行うことができる。 本発明に従うと、DHFR−MEKの精製は、
培養を含めて一週間以内に行うことができ、回
収率50％以上で、均一な酵素標品を得ることが
できる。 DHFR酵素活性は、反応液（0.05ｍＭのジヒ
ドロ葉酸、0.06ｍＭのNADPH、12ｍＭの２−
メルカプトエタノール、50ｍＭのリン酸緩衝液
（PH7.0））を、１mlのキユベツトとり、これに
酵素液を加え、340nｍの吸光度の時間変化を
測定することにより行う。酵素１ユニツトは、
上記反応条件において、１分間に１マイクロモ
ルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素量
として定義する。この測定は、分光光度計を用
いて容易に行うことができる。 (5) DHFR−MEKを用いたMEKの製造 精製したDHFR−MEKからのMEKの切
断・分離は、トリプシン処理することにより行
う。緩衝液１中、30℃で、DHF−MEKの百分
の１量のトリプシンを作用させる。トリプシン
による切断反応は、約90分でほぼ完全に完了す
る。トリプシン処理液に、２分の１容の酢酸を
加える。 トリプシン処理した試料をHPLC装置（島津
LC−4A、inertsil−0DSカラム）を用いて、
0.1％トリフルオロ酢酸中、15％から50％のア
セトニトリルの濃度勾配を用いて溶出・分離す
ることができる。溶出物は、220nｍにおける
吸光度の測定により検出することができる。第
３図は、トリプシン処理したDHFR−MEK試
料の高速液体クロマトグラムを示している。試
料注入後約15分後のピークがMEKである。こ
のピーク画分を分離する。分離した溶出液をエ
バホレーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾
燥し溶媒を除き、MEKを得ることができる。
また、得られたペプチドを酸加水分解後、アミ
ノ酸分析することによりアミノ酸組成を確かめ
ることができる。 本発明の実施例においては、3lの培地から湿重
量約11ｇの菌体が得られ、この菌体（計算上、約
115mgのDHFR−MEK、約3.5mgのMEKを含む。）
から、約63mgのDHFR−MEK（収率、54.7％、計
算上約1.9mgのMEKを含む。）を精製して得るこ
とができ、20mgのDHFR−MEKをトリプシン処
理後、HPLCで分離・精製することにより、約
0.48mgのMEKを得ることができた。 次に本発明の実施例および参考例を示す。 実施例 １ pMEK2の作成 MEKを暗号化するDNAとしては、 １ 5′− GATCCGTTACGGTGGTTTCATGTAAC
ＴＣＧＡＧＡ−3′ ２ 5′− GATCTCTCGAGTTACATGAAACCACCG
ＴＡＡＣＧ−3′ の２本の32ヌクレオチドからなるDNAをホスホ
アミダイト法に従つて化学合成し、精製後、ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて、各DNAの5′末
端をリン酸化した。リン酸化したDNAを約0.1ml
（約0.01μｇのDNAを含んでいる。）ずつ取り、こ
れを60℃でインキユベートすることによつて両
DNAをアニールさせた（これをDNA1と呼ぶ）。 約1μｇのpTP70−１を、BamHで切断した
後、アルカリホスフアターゼ処理をした。アルカ
リホスフアターゼ処理したDNAをフエノール処
理することにより、共存する酵素タンパク質を変
性除去し、その後エタノールでDNAを沈澱させ
た。沈澱したDNAを70％エタノールで洗つた後、
エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥させた。
BamHによるDNAの切断、アルカリホスフア
ターゼ処理、フエノール処理、およびエタノール
沈澱の各操作は、いずれも、“Molecular
Cloning Ａ Loboratory Manual”（T.
Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook、eds.Cold
Spring Harbor Laboratory（1982）、以下、文献
１と呼ぶ。）に記載している方法に従つて行つた。
乾燥させたDNAを50μlのリガーゼ用反応液（10
ｍＭ Tris−HCl、PH7.4、５ｍＭ MgCl2、10
ｍＭジチオトレイトール、５ｍＭ ATP）に溶
解後、5μlのDNA1を加え、これに１ユニツトの
T4−DNAリガーゼを加えて、10℃で、12時間
DNAの連結反応を行わせた。この反応物を、形
質転換法（transformation method、上記文献１
に記載）に従つて、大腸菌に取り込ませた。この
処理した菌体を、50mg／mlのアンピシリンナトリ
ウムおよび10mg／mlのトリメトプリムを含む栄養
寒天倍地（倍地11中に、２ｇのグルコース、１ｇ
のリン酸２カリウム、５ｇのイーストエキス、５
ｇのポリペプトン、15ｇの寒天を含む。）上に塗
布し、37℃に24時間培養することにより、19個の
コロニーを得ることができた。これらのコロニー
から適当に８個選び、1.5mlのYT＋Ap倍地（倍
地11中に、５ｇのNaCl、５ｇのイーストエスキ、
８ｇのトリプトン、50mgのアンピシリンナトリウ
ムを含む。）で、37℃、１晩、菌体を培養した。
培養液を、各々エツペンドルフ遠心管にとり、
12000回転／分で10分間遠心分離し、菌体を沈澱
として集めた。これに、0.1mlの電気泳動用サン
プル調製液（0.0625MのTris−HCl、PH6.8、２％
のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、10％のグリ
セン、５％の２−メルカプトエタノール、0.001
％のブロムフエノールブルーを含む。）を加え、
菌体を懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌
体を溶かした。この処理をしたサンプルをSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（U.K.
Lammli；Nature、vol.227、p.680（1970））に従
つて分析した。標準サンプルとしてpTP70−１
を含有する大腸菌に同様な処理をしたもの、およ
び分子量マーカーとしてラクトアルブミン（分子
量14200）、トリプシンインヒビター（分子量
20100）、トリプシノーゲン（分子量24000）、カル
ボニツクアンヒドラーゼ（分子量29000）、グリセ
ロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子
量36000）、卵アルブミン（分子量45000）、および
牛血清アルブミン（分子量66000）を含むサンプ
ルをポリアクリルアミド濃度の10から20％濃度勾
配ゲルで泳動した。その結果、８個のコロニーの
うち、４個では（以下、これら、Ｃ型の組換え体
と称する。）、pTP70−１のDHFRのバンドが消
失し、それより明らかに分子量が大きくなつたタ
ンパク質（分子量約22000と推定される。）を新た
に生産していること、また、３個のコロニーでは
（以下、これを、Ｒ型の組換え体と称する。）
pTP70−14のDHFRのバンドが消失し、それよ
り明らかに分子量が大きくなつたタンパク質が２
種類（それぞれ、分子量約21500と23500推定され
る。）が新たに生産されている、また、残りの１
個では、DHFRとほぼ同じ大きさのタンパク質
を生産すること、pTP70−１のDHFR（分子量
18379）は、この条件で分子量約21000のタンパク
質として泳動することが明らかになつた。Ｃ型お
よびＲ型の組換え体から、それぞれ一株づつ選
び、各々、これをYT＋Ap倍地で培養し、
TanakaとWeisblumの方法（T.Tanaka、B.
Weisblum；J.Bacteriology、vol.121、p.354
（1975））に従つて、プラスミドを調製した。得ら
れたプラスミドをpMEK2およびpMEK1と名づ
けた。pMEK1もしくはpMEK2は、pTP70−１
のBamH部位に、化学合成してDNA配列が挿
入した構造をしているはずである。合成DNAに
は、制限酸素Xhoで切断認識される配列、5′−
CTCGAG−3′が、含まれているので、Xhoで
pLEK1およびpMEK2の切断を試みたところ、確
かに切断された。また、pMEK1およびpMEK2
のEcoR（第１図の471−476番目の配列）とSal
（第１図の85−862番目の配列）による切断に
よつて得られる約400ヌクレオチド長のDNAにつ
いて、M13フアージを用いたジデオキシ法（J.
Messing；Mehtods in Enzymology、vol.101、
p.20（1983））に従つて、塩基配列を決定した。そ
の結果、pMEK2については、第１図に示す配列
の471番目から約857番目迄の配列が確かめられ
た。一方、pME1では、533番目から567番目の配
列が逆転している配列であることが明らかにされ
た。即ち、pMEK1とpMEK2は、化学合成した
DNA配列が、pTP70−１のBamH部位に互い
に逆向きに挿入された構造をしていることが明ら
にされた。また、塩基配列を検討することによ
り、pMEK2がDHER−MEKを暗号化すること
が明らかとなつた。従つて、pMEK2が、目的の
組換えプラスミドである。 pTP70−１の塩基配列は、本発明者らによつ
て明らかにされている（特開昭63−46193号公
報）、pMEK2のEcoR−Salの配列は、
pTP70−１のEcoR−Salの間にあるBamH
部位に、32ヌクレオチド長の配列が挿入された
配列である。 また、pMEK2のEcoR−Sal切断によつて
得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、Pst、
Hind、Pha、Aat、Pvu、Bgl、およ
びClaを用いた制限酵素による切断実験の結
果、pTP70−１のEcoR−Sal切断によつて
得られる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であ
ることが示された。 以上の結果から、pMEK2の全塩基配列が第１
図に示した配列であることが決められた。 実施例 ２ pMEK2を含有する大腸菌が作るDHFR−
MEK pMEK2を含有する大腸菌が作るDHFR−
MEKのアミノ酸配列は、DHFR−MEK遺伝子
の塩基配列から予想することができる。第１図の
57番目から554番目の配列がDHFR−MEKを暗
号化していることから、トリプレツト暗号表を用
いて、アミノ酸配列を推定した。その結果第２図
に示すアミノ酸配列が得られた。 pMEK2を含有する大腸菌から、DHFR−
MEKを分離精製し、精製したタンパク質の性質
を調べた。 DHFR−MEKの精製 Ａ 用いた菌体量：湿重量 11ｇ Ｂ 酵素精製表 表における精製過程は無細胞抽出液、
DEAE−トヨパールカラム処理、メソトリキ
セート結合アフイニテイクロマトグラフイー、
およびDEAE−トヨパールカラムクロマトグ
ラフイーを表す。
であるメチオニンエンケフアリン（チロシン
（Tyr）−グリシン（Gly）−グリシン（Gly）−フ
エニルアラニン（Phe）−メチオニン（Met）の
５個のアミノ酸配列よりなるペプチド、以下、
MEKと略す。）を含む融合タンパク質を大量に生
産可能とする新規組換えプラスミドpMEK2、
pMEK2に含有する大腸菌、MEKを酵素のカル
ボキシ末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵素−
MEK融合タンパク質（以下、DHFR−MEKと
略す。）、DHFR−MEKの分離精製方法、および
MEKの製造方法に関するものである。本発明の
新規組換えプラスミドpMEK2は、第１図におい
て示さえるDNA配列を有する。本発明は、発酵
工業、医薬品工業等の分野に好適である。 従来の技術 MEKは、ロイシンエンケフアリン（以下、
LEKと略す。）と同様、モルヒネ様鎮痛作用を示
す内因性ペプチドとして知られ、習慣性のない鎮
痛剤また麻酔薬としての利用が期待される興味深
い生理活性ペプチドである。MEKの鎮痛効果は、
LEKの約1.5倍であるとされている。 本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子
操作技術がある。しかしながら、遺伝子操作を利
用した効率のよいMEKの製造方法に関しては、
知られていない。 一方、既に、本発明者らは、大腸菌由来のジヒ
ドロ葉酸還元酵素（以下、DHFRと略す。）遺伝
子に関して、その遺伝子の改変の結果、異種遺伝
子発現用プラスミドベクターpTP70−１（特開昭
63−46193号公報）及びそれを利用した融合遺伝
子の作成方法（特開平１−144992号公報）を開発
している。これらの方法を利用した場合、融合遺
伝子の発現の結果得られる融合タンパク質の大腸
菌菌体の蓄積量は、全菌体タンパク質の約20％が
期待される。しかしながら、MEKの生産に上記
発現ベクターを用いた例はない。 発明の目的 本発明の目的は、いまだ確立されていない、遺
伝子操作の手法を用いたMEKの大量生産方法を
開発することにある。 既に、本発明者らは(1)大腸菌のDHFRを大量
に発現する発現プラスミドを構築していること
（特開昭62−69990号公報）、(2)大腸菌のDHFRの
カルボキシ末端側の配列を変化させても、酵素活
性が失われないこと、(3)大腸菌のDHFRのカル
ボキシ末端側に異種ペプチドを融合させることを
可能とするプラスミドベクターpTP70−１を構
築していること（特開昭63−46193号公報）、(4)
pTP70−１上の改変DHFRは、大腸菌で効率良
く発現すること、を明らかにしている。 本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究
の結果、MEK遺伝子を化学合成し、pTP70−１
に組み込むことにより、MEK遺伝子とDHFR遺
伝子の融合遺伝子を作成し、融合遺伝子を大腸菌
で発現させることにより、DHFR−MEKを大量
に生産できることを見いだし、さらに、DHFR
−MEKを用いることにより効果的にMEKを作成
できることを明らかにし、本発明を完成させた。 発明の構成 本発明は、(1)DHFR−MEKの大量発現を可能
にする新規組換えプラスミドpMEK2、(2)
pMEK2を含有する大腸菌菌体、(3)pMEK2を含
有する大腸菌が生産するDHFR−MEK、(4)
pMEK2を含有する大腸菌からのDHFR−MEK
の分離精製、および(5)DHFR−MEKを用いた
MEKの製造方法、の発明により構成される。 (1) 新規組換えプラスミドpMEK2 第１図は、本発明のpMEK2の全塩基配列を
示している。図は、２本鎖環状DNAのうち片
方のDNA鎖配列だけを、プラスミド中に２箇
所存在する制限酵素Cla部位のうちHind部
位に近い方の切断認識部位、5′−ATCGAT−
3′、の最初の“Ａ”を１番として数えて、5′末
端から3′末端の方向に記述している。本発明の
pMEK2は、新規な組換えプラスミドである。
pMEK2は、4640塩基対の大きさであり、宿主
である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシ
リン耐性を付与することができる。pMEK2
は、pTP70−１のBamH部位にMEKを暗号
化する配列を含む32塩基対の化学合成DNAが
結合した構造をしていてる。第１図において、
533番目から564番目迄の配列が化学合成DNA
由来の配列である。それ以外の配列がpTP70
−１由来の配列である。 化学合成したDNAの配列には、制限酵素
Xhoの認識切断部位、5′−CTCGAG−3′（第
１図の、558番目から563番目までの配列）、を
含ませてある。pTP70−１由来の部分には、
Xho部位が存在しない。従つて、pMEK2の
BamH部位（第１図の532番目から537番目
までの配列）からXho部位までの配列を他の
配列に置き換えることにより、方向を定めて異
種DNAの導入を行い、DHFR遺伝子との融合
遺伝子の作成をさらに容易に行うことができ
る。 第１図の57番目から554番目まで配列は、
DHFRのカルボキシ末端側にMEKがアルギニ
ンを介して結合したDHFR−LEKを暗号化し
ている。 DHFR−LEKを暗号化する配列の上流には、
DHFR−LEK遺伝子の発現を効率良く行わせ
る配列が存在する（特開昭63−46193号公報）。
即ち、43番目から50番目までの配列がSD配列
と呼ばれるもので、効率の良い翻訳に、また、
4598番目から4626番目までが、コンセンサス転
写プロモーターであり、効率の良い転写に貢献
する。このことから、pMEK2は、大腸菌に導
入された場合、多種のDHFR−MEKを作る。
作られたDHFR−LEKは、菌体内に可溶性の
状態で、菌体タンパク質の約20％程度蓄積す
る。このことによつて、pMEK2を含有する大
腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。
また、pMEK2は、pTP70−１由来の、アンピ
シリン耐性遺伝子を有している。このことか
ら、pMEK2が導入された大腸菌は、アンピシ
リン耐性をも示す。pMEK2は、大腸菌に導入
されて安定状態に保たれ、pMEK2を含有する
大腸菌は、微工研にFERMBP−1816として寄
託されている。 このような特長を有するpMEK2は、実施例
１に従つて作成することができるが、組換えプ
ラスミドの作成方法によつて本発明が制限され
るものではない。 (2) pLEK1を含有する大腸菌 pMEK2を含有する大腸菌は、トリメトプリ
ム及びアンピシリンに対して耐性を示す。
pMEK2を含有する大腸菌は、pMEK2上の
DHFR−MEK遺伝子の効率のよい発現の結
果、DHFR−MEKを菌体内に可溶性の状態で
大量に蓄積する。pMEK2を含有する大腸菌を
YT＋Ap培地（培地1l中に、５ｇのNaCl、８
ｇのトリプトン、５ｇのイーストエキス、及び
50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体培
地）を用いて、37℃で定常期まで培養した場
合、蓄積するDHFR−MEKは、菌体タンパク
質の約20％に達する。培養菌体を、リン酸緩衝
液などの適当な緩衝液に懸濁し、フレンチプレ
ス法もしくは音波破砕法で破砕し、これを遠心
分離法により上清と沈澱に分離した場合、ほと
んど全てのDHFR−MEKは上清中に回収され
る。pMEK2を含有する大腸菌は、微工研に
FERMBP−1816として寄託されている。 (3) DHFR−MEK 第２図は、DHFR−MEKを暗号化する部分
のDNA配列とそれから作られると予想される
タンパク質のアミノ酸配列を示している。
DHFR−MEKは、166アミノ酸よりなる新規
なタンパク質である。アミノ末端側から数え
て、１から159番目までの配列が、大腸菌の野
生型DHFRに１箇所アミノ酸置換置換が起こ
つた（Cys−152（Wild type）→Glu−152）配
列であり、162番目から166番目までがMEKの
配列である。MEKの配列の直前のアミノ酸は
アルギニン（Arg）である。このことにより、
DHFR−MEKをトリプシンで処理することに
より、MEKを特異的に切り出すことができる。
160番目ののイソロイシン（Ile）は、pTP70−
１のBamH部位にMEKを暗号化するDNA
を導入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わ
せるために生じた配列である。pTP70−１が
作るDHFRは、162個のアミノ酸よりなり、第
２図のDHFR−MEKのアミノ酸配列のうち、
アミノ末端側から数えて、１から160番目まで
の配列に、Gln−Ileの２個のアミノ酸配列が結
合した配列をしている。DHFR−MEKの分子
量は、18850である。 DHFR−MEKは、新規なタンパク質であ
る。DHFR−MEKはDHFRのカルボキシ末端
側に、MEKが融合した構造をしているにもか
かわらず、DHFR酵素活性を有する。このた
め、大腸菌がDHFR−MEKを多量につくる
と、DHFRの阻害剤であり抗細菌剤であるト
リメトプリムに対して、耐性を示すようにな
る。 (4) DHFR−MEKの分離精製 本発明のDHFR−MEKの分離精製法は、
菌体の培養、菌体の破砕、DEAE−トヨパ
ールカラム処理、メソトリキセート
（MTX）結合アフイニテイクロマトグラフイ
ー、およびDEAE−トヨパールカラムクロマ
トグラフイーの過程より成り立つている。 菌体の培養 pMEK2を含有する大腸菌の培養は、YT
＋Ap培地（培地1l中に、５ｇのNaCl、８ｇ
のトリプトン、５ｇのイーストエキスおよび
50mgのアンピシリンナトリウムを含む液体培
地。）で培養することができる。培地として
は、この他にST＋Ap培地（培地1l中に、２
ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウム、
５ｇのポリペプトン、５ｇのイーストエキス
および50mgのアンピシリンナトリウムを含む
液体培地。）など、菌体が成長する培地であ
れば、どの様な培地でも用いることができる
が、調べた限りでは、DHFR−MEKの生産
にはYT＋Ap培地が最適であつた。 pMEK2を含有する大腸菌を、培地に接種
し、37℃で対数成長期の後期もしくは定常期
まで培養する。培養温度により菌体中の
DHFR−MEKの蓄積量が変動し、調べた限
りでは、培養温度が高いほど蓄積量が大であ
つた。培養した菌体は、5000回転／分の遠心
分離により集める。培地1lより湿重量２から
４ｇの菌体が得られる。 集菌およびこれ以後の操作は、特に断わら
ない限り低温（０から10℃の間、４℃が望ま
しい）で行う。 菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の
緩衝液１（0.1ｍＭ エチレンジアミン４酢酸
ナトリウム（EDTA）を含む10ｍＭリン酸
カリウム緩衝液、PH7.0）に懸濁し、フレン
チプレスを用いて菌体を破砕する。菌体破砕
液を5000回転、10分間遠心分離し、上清を得
る。さらに、上清を、35000回転、１時間超
遠心分離し、上清を得る（無細胞抽出液）。 DEAE−トヨパールカラム処理 この操作は、次の精製過程の前処理の目的
で行う。無細胞抽出液を、あらかじめ0.1M
のKClを含む緩衝液１で平衡化したDEAEト
ヨパールカラムにかけ、0.1MのKClを含む
緩衝液１でカラムを洗う。酵素の溶出は、
0.3MのKClを含む緩衝液１を用いて行う。
溶出液を一定量ずつフラクシヨンコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液について
DHFR活性を測定し、酵素活性が含まれる
画分を集める。 MTX結合アフイニテイクロマドグラフイ
ー 上記の操作により得られた酵素液を、あら
かじめ緩衝液１で平衡化したMTX結合
Sepharoseアフイニテイカラムに吸着させ
る。吸着後、1MのKClを含む緩衝液２（0.1
ｍＭ EDTAを含む10ｍＭリン酸カリウム
緩衝液、PH8.5）で洗う。洗いは、カラムか
らの溶出液の280nｍの吸光度を測定し、吸
光度が0.1以下になるまで同緩衝液を流し続
ける。酵素の溶出は、1MのKClと３ｍＭの
葉酸を含む緩衝液２を用いて行い、溶出液を
一定量ずつフラクシヨンコレクターを用いて
分画する。分画した溶出液についてDHFR
活性を測定し、酵素活性が含まれる画分を集
める。得られた酵素液を、緩衝液１に対し
て、３回透析する。この段階で、純度90％以
上のDHFR−MEKが得られる。 DEAE−トロパールカラムクロマトグラフ
イー 透析した酵素液を、あらかじめ緩衝液１で
平衡化したDEAE−トヨパールカラムに吸着
させる。吸着後、0.1MKClを含む緩衝液１
で洗う。洗いは、カラムからの溶出液の
280nｍの吸光度を測定し、吸光度が0.01以下
になるまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶
出は、緩衝液１を用いて0.1Mから0.3Mの
KClの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を
一定量ずつフラクシヨンコレクターを用いて
分画する。分画した溶出液について280nｍ
の吸光度とDHFR活性とを測定する。酵素
活性／280nｍの吸光度の値が、一定な画分
を集める。 以上の操作により、DHFR−MEKの高度精
製均一化を、再現性良く行うことができる。 本発明に従うと、DHFR−MEKの精製は、
培養を含めて一週間以内に行うことができ、回
収率50％以上で、均一な酵素標品を得ることが
できる。 DHFR酵素活性は、反応液（0.05ｍＭのジヒ
ドロ葉酸、0.06ｍＭのNADPH、12ｍＭの２−
メルカプトエタノール、50ｍＭのリン酸緩衝液
（PH7.0））を、１mlのキユベツトとり、これに
酵素液を加え、340nｍの吸光度の時間変化を
測定することにより行う。酵素１ユニツトは、
上記反応条件において、１分間に１マイクロモ
ルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素量
として定義する。この測定は、分光光度計を用
いて容易に行うことができる。 (5) DHFR−MEKを用いたMEKの製造 精製したDHFR−MEKからのMEKの切
断・分離は、トリプシン処理することにより行
う。緩衝液１中、30℃で、DHF−MEKの百分
の１量のトリプシンを作用させる。トリプシン
による切断反応は、約90分でほぼ完全に完了す
る。トリプシン処理液に、２分の１容の酢酸を
加える。 トリプシン処理した試料をHPLC装置（島津
LC−4A、inertsil−0DSカラム）を用いて、
0.1％トリフルオロ酢酸中、15％から50％のア
セトニトリルの濃度勾配を用いて溶出・分離す
ることができる。溶出物は、220nｍにおける
吸光度の測定により検出することができる。第
３図は、トリプシン処理したDHFR−MEK試
料の高速液体クロマトグラムを示している。試
料注入後約15分後のピークがMEKである。こ
のピーク画分を分離する。分離した溶出液をエ
バホレーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾
燥し溶媒を除き、MEKを得ることができる。
また、得られたペプチドを酸加水分解後、アミ
ノ酸分析することによりアミノ酸組成を確かめ
ることができる。 本発明の実施例においては、3lの培地から湿重
量約11ｇの菌体が得られ、この菌体（計算上、約
115mgのDHFR−MEK、約3.5mgのMEKを含む。）
から、約63mgのDHFR−MEK（収率、54.7％、計
算上約1.9mgのMEKを含む。）を精製して得るこ
とができ、20mgのDHFR−MEKをトリプシン処
理後、HPLCで分離・精製することにより、約
0.48mgのMEKを得ることができた。 次に本発明の実施例および参考例を示す。 実施例 １ pMEK2の作成 MEKを暗号化するDNAとしては、 １ 5′− GATCCGTTACGGTGGTTTCATGTAAC
ＴＣＧＡＧＡ−3′ ２ 5′− GATCTCTCGAGTTACATGAAACCACCG
ＴＡＡＣＧ−3′ の２本の32ヌクレオチドからなるDNAをホスホ
アミダイト法に従つて化学合成し、精製後、ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて、各DNAの5′末
端をリン酸化した。リン酸化したDNAを約0.1ml
（約0.01μｇのDNAを含んでいる。）ずつ取り、こ
れを60℃でインキユベートすることによつて両
DNAをアニールさせた（これをDNA1と呼ぶ）。 約1μｇのpTP70−１を、BamHで切断した
後、アルカリホスフアターゼ処理をした。アルカ
リホスフアターゼ処理したDNAをフエノール処
理することにより、共存する酵素タンパク質を変
性除去し、その後エタノールでDNAを沈澱させ
た。沈澱したDNAを70％エタノールで洗つた後、
エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥させた。
BamHによるDNAの切断、アルカリホスフア
ターゼ処理、フエノール処理、およびエタノール
沈澱の各操作は、いずれも、“Molecular
Cloning Ａ Loboratory Manual”（T.
Maniatis，E.F.Fritsch，J.Sambrook、eds.Cold
Spring Harbor Laboratory（1982）、以下、文献
１と呼ぶ。）に記載している方法に従つて行つた。
乾燥させたDNAを50μlのリガーゼ用反応液（10
ｍＭ Tris−HCl、PH7.4、５ｍＭ MgCl2、10
ｍＭジチオトレイトール、５ｍＭ ATP）に溶
解後、5μlのDNA1を加え、これに１ユニツトの
T4−DNAリガーゼを加えて、10℃で、12時間
DNAの連結反応を行わせた。この反応物を、形
質転換法（transformation method、上記文献１
に記載）に従つて、大腸菌に取り込ませた。この
処理した菌体を、50mg／mlのアンピシリンナトリ
ウムおよび10mg／mlのトリメトプリムを含む栄養
寒天倍地（倍地11中に、２ｇのグルコース、１ｇ
のリン酸２カリウム、５ｇのイーストエキス、５
ｇのポリペプトン、15ｇの寒天を含む。）上に塗
布し、37℃に24時間培養することにより、19個の
コロニーを得ることができた。これらのコロニー
から適当に８個選び、1.5mlのYT＋Ap倍地（倍
地11中に、５ｇのNaCl、５ｇのイーストエスキ、
８ｇのトリプトン、50mgのアンピシリンナトリウ
ムを含む。）で、37℃、１晩、菌体を培養した。
培養液を、各々エツペンドルフ遠心管にとり、
12000回転／分で10分間遠心分離し、菌体を沈澱
として集めた。これに、0.1mlの電気泳動用サン
プル調製液（0.0625MのTris−HCl、PH6.8、２％
のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、10％のグリ
セン、５％の２−メルカプトエタノール、0.001
％のブロムフエノールブルーを含む。）を加え、
菌体を懸濁し、これを沸騰水中に５分間保ち、菌
体を溶かした。この処理をしたサンプルをSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（U.K.
Lammli；Nature、vol.227、p.680（1970））に従
つて分析した。標準サンプルとしてpTP70−１
を含有する大腸菌に同様な処理をしたもの、およ
び分子量マーカーとしてラクトアルブミン（分子
量14200）、トリプシンインヒビター（分子量
20100）、トリプシノーゲン（分子量24000）、カル
ボニツクアンヒドラーゼ（分子量29000）、グリセ
ロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子
量36000）、卵アルブミン（分子量45000）、および
牛血清アルブミン（分子量66000）を含むサンプ
ルをポリアクリルアミド濃度の10から20％濃度勾
配ゲルで泳動した。その結果、８個のコロニーの
うち、４個では（以下、これら、Ｃ型の組換え体
と称する。）、pTP70−１のDHFRのバンドが消
失し、それより明らかに分子量が大きくなつたタ
ンパク質（分子量約22000と推定される。）を新た
に生産していること、また、３個のコロニーでは
（以下、これを、Ｒ型の組換え体と称する。）
pTP70−14のDHFRのバンドが消失し、それよ
り明らかに分子量が大きくなつたタンパク質が２
種類（それぞれ、分子量約21500と23500推定され
る。）が新たに生産されている、また、残りの１
個では、DHFRとほぼ同じ大きさのタンパク質
を生産すること、pTP70−１のDHFR（分子量
18379）は、この条件で分子量約21000のタンパク
質として泳動することが明らかになつた。Ｃ型お
よびＲ型の組換え体から、それぞれ一株づつ選
び、各々、これをYT＋Ap倍地で培養し、
TanakaとWeisblumの方法（T.Tanaka、B.
Weisblum；J.Bacteriology、vol.121、p.354
（1975））に従つて、プラスミドを調製した。得ら
れたプラスミドをpMEK2およびpMEK1と名づ
けた。pMEK1もしくはpMEK2は、pTP70−１
のBamH部位に、化学合成してDNA配列が挿
入した構造をしているはずである。合成DNAに
は、制限酸素Xhoで切断認識される配列、5′−
CTCGAG−3′が、含まれているので、Xhoで
pLEK1およびpMEK2の切断を試みたところ、確
かに切断された。また、pMEK1およびpMEK2
のEcoR（第１図の471−476番目の配列）とSal
（第１図の85−862番目の配列）による切断に
よつて得られる約400ヌクレオチド長のDNAにつ
いて、M13フアージを用いたジデオキシ法（J.
Messing；Mehtods in Enzymology、vol.101、
p.20（1983））に従つて、塩基配列を決定した。そ
の結果、pMEK2については、第１図に示す配列
の471番目から約857番目迄の配列が確かめられ
た。一方、pME1では、533番目から567番目の配
列が逆転している配列であることが明らかにされ
た。即ち、pMEK1とpMEK2は、化学合成した
DNA配列が、pTP70−１のBamH部位に互い
に逆向きに挿入された構造をしていることが明ら
にされた。また、塩基配列を検討することによ
り、pMEK2がDHER−MEKを暗号化すること
が明らかとなつた。従つて、pMEK2が、目的の
組換えプラスミドである。 pTP70−１の塩基配列は、本発明者らによつ
て明らかにされている（特開昭63−46193号公
報）、pMEK2のEcoR−Salの配列は、
pTP70−１のEcoR−Salの間にあるBamH
部位に、32ヌクレオチド長の配列が挿入された
配列である。 また、pMEK2のEcoR−Sal切断によつて
得られる約4.2キロ塩基対のDNAは、Pst、
Hind、Pha、Aat、Pvu、Bgl、およ
びClaを用いた制限酵素による切断実験の結
果、pTP70−１のEcoR−Sal切断によつて
得られる約4.2キロ塩基対のDNAと全く同一であ
ることが示された。 以上の結果から、pMEK2の全塩基配列が第１
図に示した配列であることが決められた。 実施例 ２ pMEK2を含有する大腸菌が作るDHFR−
MEK pMEK2を含有する大腸菌が作るDHFR−
MEKのアミノ酸配列は、DHFR−MEK遺伝子
の塩基配列から予想することができる。第１図の
57番目から554番目の配列がDHFR−MEKを暗
号化していることから、トリプレツト暗号表を用
いて、アミノ酸配列を推定した。その結果第２図
に示すアミノ酸配列が得られた。 pMEK2を含有する大腸菌から、DHFR−
MEKを分離精製し、精製したタンパク質の性質
を調べた。 DHFR−MEKの精製 Ａ 用いた菌体量：湿重量 11ｇ Ｂ 酵素精製表 表における精製過程は無細胞抽出液、
DEAE−トヨパールカラム処理、メソトリキ
セート結合アフイニテイクロマトグラフイー、
およびDEAE−トヨパールカラムクロマトグ
ラフイーを表す。
【表】
DHFR酵素活性は、反応液（0.05ｍＭのジヒド
ロ葉酸、0.06ｍＭのNADPH、12ｍＭの２−メル
カプトエタノール、50ｍＭのリン酸緩衝液（PH
7.0））を、１mlのキユベツトとり、これに酵素液
を加え、340nｍの吸光度の時間変化を測定する
ことにより行つた。酸素１ユニツトは、上記反応
条件において、１分間に１マイクロモルのジヒド
ロ葉酸を還元するのに必要な酵素量として定義し
た。 得られた酵素タンパク室をSDS電気泳動法（上
記実施例に記載の方法）により分析したところ、
約22000の単一なタンパク質バンドが示され、得
られた酵素標品が均一であることが示された。 分離精製したDHFR−MEKの性質 精製したDHFR活性を示すタンパク質をエン
ザイムイムノアツセイにより検討したところ、
MEに対する抗体と反応することが示された。即
ち、精製して得られたタンパク質は免疫学的に
MEKと同等の構造を有することが明らかとなつ
た。 精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端
側のアミノ酸配列を明らかにするために、カルボ
キシペプチダーゼＹを、精製タンパク質に時間を
変化させて作用させ、遊離してくるアミノ酸を定
量した（カルボキシペプチダーゼ法によるカルボ
キシ末端側のアミノ酸配列の決定法）。その結果、
−Gly−Gly−Met（カルボキシ末端）であること
が予想された。また、精製して得られたタンパク
質を酸加水分解した後、アミノ酸分析したとこ
ろ、塩基配列の結果予想されるアミノ酸組成と一
致した結果が得られた。 実施例 ３ 精製分離したDHFR−MEKからのMEKの分
離 実施例２で得られた２mlの精製タンパク質溶液
（緩衝液１中、約20mg、約1060nmoleのDHFR−
MEKを含む）に、0.2mgのトリプシンを加え、30
℃で90分反応させる。反応後、１mlの酢酸を加え
る。そのうちの、0.5ml（約177nmoleのDHFR−
MEKを含むはず）をとり、高速液体クロマトグ
ラフイー装置（島津LC−4A）を用いlnertsil−
0DS5μｍカラムで分離した。溶出は、0.1％トリ
フルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾配（15
％から50％）をかけることにより行つた。０から
２分までは、15％のアセニトリルを用い、２分か
ら32分までは、15％から50％のアセトニトリルの
直線濃度勾配にかけた。その結果、第３図に示す
ような溶出曲線が得られた。試料注入後約15分後
のピーク画分を分離し、分離した溶出液をエバホ
レーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶
媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプチドを
酸加水分解後、その10分の１をアミド酸分析に用
いた。その結果、チロシン、グリシン、フエニル
アラニン、およびメチオニンがそれぞれ14.1、
27.5、13.8および13.9nmoleずつ検出された。ア
ミノ酸組成は、MEKのそれと一致した値であり、
また分析した試料は、約13.9nmole（約8.0μｇ）の
MEKを含んでいることが明らかとなつた。この
結果を用いると、トリプシン処理して得られたサ
ンプル0.5mlをHPLCを用いて分離することによ
り、収率約79％（13.9x10nmole／177nmole）で
MEKを回収できたこと、またこの操作を繰り返
すことにより、20mgのDHFR−MAKから約480μ
ｇ（8.0μｇx10x6）のMEKが得られることが示
される。 また、DHFR−MEKの精製の収率が約55％で
あり、DHFR−MEKからLEKの分離の収率が約
80％であることから、大腸菌がつくるMEKのペ
プチド部分の単離収率が、約44％程度であること
が算出される。 発明の効果 上記のように、新規繰換えプラスミドpMEK2
は、DHFR−MEKを暗号化しており、かつ
pMEK2を有する大腸菌は、DHFR−MEKを可
溶性の状態で大量に蓄積生産する。さらに、生成
したDHFR−MEKは、DHFR酵素活性を保持し
ており、精製を容易に行うことができる。また、
DHFR−MEKをトラプシン処理後、HPLCで分
離することにより、MEKを容易に単離すること
ができる。このような性質を有することから、本
発明は、DHFR−MEKとそれを利用したMEK
の生産に有益である。 また、pMEK2には、Xho部位が新たに付け
加えられており、異種遺伝子の発現ベクターとし
て有用であると考えられる。
ロ葉酸、0.06ｍＭのNADPH、12ｍＭの２−メル
カプトエタノール、50ｍＭのリン酸緩衝液（PH
7.0））を、１mlのキユベツトとり、これに酵素液
を加え、340nｍの吸光度の時間変化を測定する
ことにより行つた。酸素１ユニツトは、上記反応
条件において、１分間に１マイクロモルのジヒド
ロ葉酸を還元するのに必要な酵素量として定義し
た。 得られた酵素タンパク室をSDS電気泳動法（上
記実施例に記載の方法）により分析したところ、
約22000の単一なタンパク質バンドが示され、得
られた酵素標品が均一であることが示された。 分離精製したDHFR−MEKの性質 精製したDHFR活性を示すタンパク質をエン
ザイムイムノアツセイにより検討したところ、
MEに対する抗体と反応することが示された。即
ち、精製して得られたタンパク質は免疫学的に
MEKと同等の構造を有することが明らかとなつ
た。 精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端
側のアミノ酸配列を明らかにするために、カルボ
キシペプチダーゼＹを、精製タンパク質に時間を
変化させて作用させ、遊離してくるアミノ酸を定
量した（カルボキシペプチダーゼ法によるカルボ
キシ末端側のアミノ酸配列の決定法）。その結果、
−Gly−Gly−Met（カルボキシ末端）であること
が予想された。また、精製して得られたタンパク
質を酸加水分解した後、アミノ酸分析したとこ
ろ、塩基配列の結果予想されるアミノ酸組成と一
致した結果が得られた。 実施例 ３ 精製分離したDHFR−MEKからのMEKの分
離 実施例２で得られた２mlの精製タンパク質溶液
（緩衝液１中、約20mg、約1060nmoleのDHFR−
MEKを含む）に、0.2mgのトリプシンを加え、30
℃で90分反応させる。反応後、１mlの酢酸を加え
る。そのうちの、0.5ml（約177nmoleのDHFR−
MEKを含むはず）をとり、高速液体クロマトグ
ラフイー装置（島津LC−4A）を用いlnertsil−
0DS5μｍカラムで分離した。溶出は、0.1％トリ
フルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度勾配（15
％から50％）をかけることにより行つた。０から
２分までは、15％のアセニトリルを用い、２分か
ら32分までは、15％から50％のアセトニトリルの
直線濃度勾配にかけた。その結果、第３図に示す
ような溶出曲線が得られた。試料注入後約15分後
のピーク画分を分離し、分離した溶出液をエバホ
レーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶
媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプチドを
酸加水分解後、その10分の１をアミド酸分析に用
いた。その結果、チロシン、グリシン、フエニル
アラニン、およびメチオニンがそれぞれ14.1、
27.5、13.8および13.9nmoleずつ検出された。ア
ミノ酸組成は、MEKのそれと一致した値であり、
また分析した試料は、約13.9nmole（約8.0μｇ）の
MEKを含んでいることが明らかとなつた。この
結果を用いると、トリプシン処理して得られたサ
ンプル0.5mlをHPLCを用いて分離することによ
り、収率約79％（13.9x10nmole／177nmole）で
MEKを回収できたこと、またこの操作を繰り返
すことにより、20mgのDHFR−MAKから約480μ
ｇ（8.0μｇx10x6）のMEKが得られることが示
される。 また、DHFR−MEKの精製の収率が約55％で
あり、DHFR−MEKからLEKの分離の収率が約
80％であることから、大腸菌がつくるMEKのペ
プチド部分の単離収率が、約44％程度であること
が算出される。 発明の効果 上記のように、新規繰換えプラスミドpMEK2
は、DHFR−MEKを暗号化しており、かつ
pMEK2を有する大腸菌は、DHFR−MEKを可
溶性の状態で大量に蓄積生産する。さらに、生成
したDHFR−MEKは、DHFR酵素活性を保持し
ており、精製を容易に行うことができる。また、
DHFR−MEKをトラプシン処理後、HPLCで分
離することにより、MEKを容易に単離すること
ができる。このような性質を有することから、本
発明は、DHFR−MEKとそれを利用したMEK
の生産に有益である。 また、pMEK2には、Xho部位が新たに付け
加えられており、異種遺伝子の発現ベクターとし
て有用であると考えられる。
第１図は、pMEK2の全塩基配列を示した図で
あり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけ
を、5′末端から3′末端の方向に記述している。図
中符号は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃ
はシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示
している。図中番号は、pLEK2に２個所存在す
る制限酵素Claのうち、Hind部位に近い方の
Cla切断認識部位、5′−ATCGAT−3′、の最初
の“Ａ”を１番として数えた番号を示している。 第２図は、pMEK2に存在するDHFR−MEK
を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸
塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃ
はシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、
Alaはアラニンを、Argはアルギニンを、Asnは
アスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cys
はシステインを、Glnはグルタミンを、Gluはグ
ルタミン酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチ
ジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシン
を、Lysはリジンを、Mutはメチオニンを、Phe
はフエニルアラニンを、Proはプロリンを、Ser
はセリンを、Thrはトレオニンを、Trpはトリプ
トフアンを、Tyrはチロシンを、Valはバリンを
示している。図中番号は、１番目のアミノ酸であ
るメチオニンを暗号化するATGコドンの“Ａ”
を１番として数えた番号を示している。 第３図は、トリプシン処理したDHFR−MEK
試料の高速液体クロマトグラムを示している。横
軸は、試料注入後の時間を分単位で、縦軸は、
220nｍの吸光度を任意単位で表現している。矢
印で示したピークがMEKの溶出ピークである。
あり、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だけ
を、5′末端から3′末端の方向に記述している。図
中符号は、核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃ
はシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを示
している。図中番号は、pLEK2に２個所存在す
る制限酵素Claのうち、Hind部位に近い方の
Cla切断認識部位、5′−ATCGAT−3′、の最初
の“Ａ”を１番として数えた番号を示している。 第２図は、pMEK2に存在するDHFR−MEK
を暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質の
アミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸
塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを、Ｃ
はシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、
Alaはアラニンを、Argはアルギニンを、Asnは
アスパラギンを、Aspはアスパラギン酸を、Cys
はシステインを、Glnはグルタミンを、Gluはグ
ルタミン酸を、Glyはグリシンを、Hisはヒスチ
ジンを、Ileはイソロイシンを、Leuはロイシン
を、Lysはリジンを、Mutはメチオニンを、Phe
はフエニルアラニンを、Proはプロリンを、Ser
はセリンを、Thrはトレオニンを、Trpはトリプ
トフアンを、Tyrはチロシンを、Valはバリンを
示している。図中番号は、１番目のアミノ酸であ
るメチオニンを暗号化するATGコドンの“Ａ”
を１番として数えた番号を示している。 第３図は、トリプシン処理したDHFR−MEK
試料の高速液体クロマトグラムを示している。横
軸は、試料注入後の時間を分単位で、縦軸は、
220nｍの吸光度を任意単位で表現している。矢
印で示したピークがMEKの溶出ピークである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 大腸菌において安定に複製され、宿主である
大腸菌にトリメトプリム耐性およびアンピシリン
耐性を与えることができ、4640塩基対の大きさを
有し、下記に示すDNA配列を有する新規組換え
プラスミドpMEK2。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 ２ pMEK2を含有する大腸菌。 ３ pMEK2を含有する大腸菌が生産し、下記に
示すアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元酵素
−メチオニンエンケフアリン融合タンパク質。 【表】 ４ pMEK2を含有する大腸菌を培養し、ジヒド
ロ葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元
酵素−メチオニンエンケフアリン融合タンパク質
を、培養菌体の無細胞抽出液から、イオン交換カ
ラム処理、メソトリキセート結合アフイニテイカ
ラムクロマトグラフイー、および陰イオン交換カ
ラムクロマトグラフイーを用いて精製することを
特徴とするジヒドロ葉酸還元酵素−メチオニンエ
ンケフアリン融合タンパク質の分離精製方法。 ５ pMEK2を含有する大腸菌の生産するジヒド
ロ葉酸還元酵素−メチオニンエンケフアリン融合
タンパク質をトリプシンを用いて分解した後、メ
チオニンエンケフアリンを分離精製することを特
徴とするメチオニンエンケフアリンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63079680A JPH01252289A (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | メチオニンエンケファリン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63079680A JPH01252289A (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | メチオニンエンケファリン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01252289A JPH01252289A (ja) | 1989-10-06 |
| JPH0354556B2 true JPH0354556B2 (ja) | 1991-08-20 |
Family
ID=13696913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63079680A Granted JPH01252289A (ja) | 1988-03-31 | 1988-03-31 | メチオニンエンケファリン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01252289A (ja) |
-
1988
- 1988-03-31 JP JP63079680A patent/JPH01252289A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01252289A (ja) | 1989-10-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |