JPH0279977A - γ−エンドルフィン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、γ−エンドルフィンの遺伝子組換え法による
新規な製造方法およびそれに係わる組換えプラスミド、
形質転換株、融合タンパク質に間する。

γ−エンドルフィンは、１７個のアミノ酸より構成され
るモルヒネ様生理活性を有するペプチドであり、下記ア
ミノ酸配列を有する。

γ−エンドルフィン：　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌｙｓ−５
ｅｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａ　Ｉ
　−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ 本発明の新規組換えプラスミドｐＥＮＤＣ１は。

第１図において示されるＤＮＡ配列を有する。本発明は
２発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。

［従来の技術］ γ−エンドルフィンは９モルヒネ様生理活性を示すエン
ドルフィン類に属するペプチドであり。

ロイシンエンケファリンの約５倍、メチオニンエンケフ
ァリンの約３倍の鎮痛活性を示す興味深い生理活性ペプ
チドである。

本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。しかしながら、遺伝子操作を利用した効率のよ
いγ−エンドルフィンの製造方法に間ＬｒＴｊ、ｔパ、
）で′″）　ｈ　１″Ｉ、Ｎ　＊　ｌ、ｔ・、Ｉ 既に１本発明貴らは、大腸菌由来のジヒドロ葉酸還元酵
素（Ｊ’Ｆ、　Ｄ　ＨＦ　Ｒと略す。）遺伝子に間して
、その遺伝子の改変の結果、異種遺伝子発現用プラスミ
ドベクターｐＴＰ７０−１　（特願昭６１−３１２８３
６）と、それを利用した融合遺伝子の作成方法（特願　
昭６２−３０２１５３）を開発している。また、ｐＴＰ
７０−１にメチオニンエンケファリン（以下、ＭＥＫと
略す、）を暗号化する化学ＤＮＡを組み込んで、ＭＥＫ
の効率よい生産方法を開発している（特願　昭６３−７
９６８０）、効率のよいＭＥＫの生産方法を開発する際
に得られた組換えプラスミドｐＭＥＫ２は、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩとＸｈｏ１部位の間の配列を異種ＤＮＡと取り
替えるだけで、ＤＨＦＲとの融合遺伝子を容易に作成で
きる。また、ｐＭＥＫ２を利用して融合遺伝子を作成し
た場合、融合遺伝子の発現の結果得られる融合タンパク
質の大腸菌菌体の蓄積量としては、全菌体タンパク質の
約２０％が期待される。しかしながら、γ−エンドルフ
ィンの生産に上記発現ベクターを用いた例はない。

［発明の目的］ 本発明の目的は、遺伝子操作の手法を用いたγ−エンド
ルフィンの大量生産方法を開発することにある。

本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究の結果、
γ−エンドルフィンを暗号化する遺伝子を設計・化学合
成し、ｐＭＥＫ２に組み込むことにより、γ−エンドル
フィン遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子との融合遺伝子を作成し
、融合遺伝子を大腸菌で発現させることにより、ＤＨＦ
Ｒ−γ−エンドルフィン融合タンパク質（以下、融合タ
ンパク質と略す、）を大量に生産できることを見いだし
。

さらに、ｖ＆合タンパク質を用いることにより効果的に
γ−エンドルフィンを作成できることを明らかにし９本
発明を完成させた。

［発明の構成］ ｐＥＮＤＣ１を含有する大腸菌が生産する融合タンパク
質、（４）ｐＥＮＤＣ１を含有する大腸菌からの融合タ
ンパク質の分離精製方法、および（５）融合タンパク質
を用いたγ−エンドルフィンの製造方法、の発明により
構成される。

（１）新規組換えプラスミドｐＥＮＤｃ１第１図は１本
発明のｐＥＮＤＣ１の全塩基配列を示している０図は、
２本鎖環状ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、プ
ラスミド中に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａＩ部位のう
ち制限酵素Ｈｉｎｄｍ部位に近い方の切断認識部位、　
５’−ＡＴＣＧＡＴ−３’、の最初の”Ａ１１を１番と
して数えて、５”末端から３′末端の方向に記述してい
る。本発明のｐＥＮＤＣＩは、新規な組換えプラスミド
である。

ｐＥＮＤＣｌは、４６７６塩基対の大きさであり。

宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシリン
耐性を付与することができる−　　ｐＥＮＤＣ１は、ｐ
ＭＥＫ２　（特願　昭６３−７９６８０に記載。）のＢ
ａｍＨＩとＸｈｏ　１部位の間のＭＥＫを暗号化する配
列を含む２６塩基対の配列を。

γ−エンドルフィンを暗号化する配列を含む６２塩基対
の化学合成りＮＡと置き換えた構造をしている。第１図
において、５３３３３番目５９４番目迄の配列が化学合
成りＮＡ由来の配列である。

それ以外の配列がｐＭＥＫ２由来の配列である。

第１図の５７番目から５９０９０番目配列は。

ＤＨＦＲのカルボキシ末端側にγ−エンドルフィンがア
ルギニン（Ａｒｇ）を介して結合した融合タンパク質を
暗号化している。

融合タンパク質を暗号化する配列の上流には。

遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（特願
　昭６ｌ−３１２８３６）。即ち、４３番目から５０番
目までの配列がＳＤ配列と呼ばれるもので、効率の良い
翻訳に、また、４６３４番目から４６６２番目までが、
コンセンサス転写プロた場合、多量の融嬌タンパク質を
作らせることが’ｖ＊ａ、ｈい一ρ７８ッッ７、つ。、
よ、。。２．ユ溶性の状態で２面体タンパク質の約２０
％程度蓄積する。このことによって、ｐＥＮＤＣ１を含
有する大腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。

また、ｐＥＮＤＣ１は、ｐＭＥＫ１由来の。

アンピシリン耐性遺伝子を有している。このことから、
ｐＥＮＤＣ１が導入された大腸菌は、アンピシリン耐性
をも示す。ｐＥＮＤＣ１は、大腸菌に導入されて安定状
態に保たれ、ｐＥＮＤＣ１を含有する大腸菌は２ｗＩ工
研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０３０として寄託されている
。

このような特長を有するｐＥＮＤＣ１は、実施例１に従
って作成することができるが２組換えプラスミドの作成
方法によって本発明が制限されるものではない。

（２）　ｐＥＮＤＣＩを含有する大腸菌ｐＥＮＤｃ１を
含有する大腸菌は、トリメトプリム及びアンピシリンに
対して耐性を示す。ｐＥＮＤＣ１を含有する大Ｉ！菌は
、融合タンパク質遺伝子の効率のよい発現の結果、融合
タンパク質を菌体内に可溶性の状態で大量に蓄積する。

　ｐＥＮＤＣＩを含有する大腸菌をＹＴ＋Ａｐ培地（培
地ｌｌ中に、５ｇのＮａＣ１，８ｇのトリプトン。

５ｇのイーストエキス、及び５０　ｍ　ｇのアンピシリ
ンナトリウムを含む液体培地）を用いて、３７℃で定常
期まで培養した場合、蓄積する融合タンパク質は、菌体
タンパク質の約２０％に達する。

培養菌体を、リンｉｉ＊＊衝液などの適当な緩衝液に懸
濁し、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、
これを遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、全
ての融合タンパク質は上清中に回収される。ｐＥＮＤＣ
１を含有する大腸菌は、微工研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−２
０３０として寄託されている。

（３）融合タンパク質 第２図は、　融合タンパク質を暗号化する部分のＤＮＡ
配列とそ、れから作られると予想されるタンパク質のア
ミン酸配列を示している。融合タンパク質は、１７８ア
ミノ酸よりなる新規なタンパク質である。アミノ末端側
から数えて、１から１５９５９番目の配列が、大１１３
ｍｍの野生型ＤＨＦＲに１箇所アミノＷＡｔＩ置換置換
が起こフた（　Ｃｙｓ−１５２（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ＞
　−＊　Ｇｌｕ−１５２）配列であり、１６２６２番目
１７８７８番目がγ−エンドルフィンの配列である。γ
−エンドルフィンの配列の直前のアミノ酸はアルギニン
（Ａ　ｒ　ｇ）である。γ−エンドルフィンはアルギニ
ンを含まない、このことから。

融合タンパク質をアルギニルエンドペプチダーゼ（Ａｒ
ｇｉｎｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、市販品として
入手可能）で処理することにより特異的に切り出すこと
ができる。１６０と１６１６１番目ソロイシン（ｌｉｅ
）−ロイシン（Ｌ　ｅ　ｕ）の配列は、ｐＭＥＫ２のＢ
ａｍＨ１部位にγ−エンドルフィンを暗号化するＤＮＡ
を導入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるため
に生じた配列である（ｐＭＥＫ２のもとどなったｐＴＰ
７０−１が作るＤＨＦＲは、１６２個のアミノ酸よりな
り、第２図の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、ア
ミノ末端側から数えて、１から１６０番目までの配列に
。

Ｇｌｎ−１１ｅの２個のアミノ酸配列が結合した配列を
している。）。融合タンパク質およびγ−エンドルフィ
ンの分子量は、それぞれ２０，１３５およｌ。

８５９である。

融合タンパク質は、新規なタンパク質である。

融合タンパク質はＤＨＦＲのカルボキシ末端側に。

γ−エンドルフィンが融合した構造をしているにもかか
わらず、ＤＨＦＲ酵禦活性を有する。このため、大腸菌
が融合タンパク質を多量につくると。

ＤＨＦＲの阻害剤であり抗細菌剤であるトリメトプリム
に対して、耐性を示すようになる。

（４）融合タンパク質の分離精製 本発明の融合タンパク質の分離精製法は、■面体の培養
、■菌体の破砕、■Ｄ　ＥＡＥ　−トヨパールカラム処
理、■メソトリキセー）　（ＭＴＸ）結合アフィニティ
クロマトグラフィー、および■ＤＥ　Ａ　Ｅ　−））７
．ヨバール力ラムクロマトグラフィーの、・・、（ 過程より成り立っている。

■菌体の培養 ｐＥＮＤＣ１を含有する大腸菌の培養は、ＹＴ＋ＡＩ）
培地（培地１１中に、５ｇのＮａＣ１，８ｇのトリプト
ン、５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇのアンピシリ
ンナトリウムを含む液体培地。

アンピシリンナトリウムを含む液体培地。）など。

菌体が成長する培地であれば、どの様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、ＹＴ＋Ａｐ培地が最
適であった。

ｐＥＮＤＣ１を含有する大腸菌を、培地に接種し、３７
℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する。培
養した菌体は、５，０００回転／分の遠心分離により集
める。培地１１より湿重量２から５ｇの菌体が得られる
。

集菌およびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温
（０から１０℃の間、４℃が望ましい）で行う。

■菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の緩衝液１　（
０，１ｍＭ　　エチレンジアミン４酢酸ナトリウム（Ｅ
ＤＴＡ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７
，０）に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕す
る。菌体破砕液を、３５゜０００回転、１時間超遠心分
離し、上清を得る（無細胞抽出液）。

■ＤＥＡＥ−）ヨバール力ラム処理 無細胞抽出液を、あらかじめ５０ｍＭのＫＣＩを含む緩
衝液１で平衡化したＤＥＡＥ）ヨバール力ラムにかけ、
カラム容量の５０ｍＭのＫＣＩを含む緩衝液１でカラム
を洗う。酵素の溶出は、緩衝液ｌを用いて０．１Ｍから
０．３ＭのＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液
を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する
。酵素の溶出は、０．３ＭのＫＣＩを含む緩衝液ｌを用
いて行う。溶出液を一定量ずつフラクションコレクター
を用いて分画する。分画した溶出液についてＤ）（ＦＲ
活性を測定し、酵素活性が含まれる画■ＭＴＸ結合アフ
ィニティクロマトグラフィーアフィニティ力ラムに吸着
させる。吸着後、ＩＭのＫＣＩを含む緩衝液２　（０，
１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、
ｐ）（８，５）で洗う。洗いは、カラムからの溶出液の
２８０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度が０．１以下にな
るまで同緩衝液を流し続ける。酵素の溶出は、１ＭのＫ
ＣＩと３ｍＭの葉酸を含む緩衝液２を用いて行い、溶出
液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画す
る０分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性を測定し、酵
素活性が含まれる両分を集める。得られた酵素液を、緩
衝液１に対して。

３回透析する。この段階で、純度９５％以上の融合タン
パク質が得られる。

■ＤＥＡＥ−）ヨパール力ラムク口マトグラフィ透析し
た酵素液を、あらかじめ緩衝液１で平衡化したＤＥＡＥ
−）ヨバール力ラムに吸着させる。

吸着後、５０ｍＭＫＣＩを含む緩衝液１で洗う。

酵素の溶出は、緩衝液１を用いて５０ｍＭから０゜３Ｍ
のＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液を一定量
ずつフラクションコレクターを用いて分画する。分画し
た溶出液について２８０ｎｍの吸光度とＤＨＦＲＨＦ上
を測定する。

酵素活性／２８０ｎｍの吸光度の値が、一定な両分を集
める。

以上の操作により、融合タンパク質の高度精製均一化を
、再現性良く行うことができる。

本発明に従うと、融合タンパク質の精製は、菌体の培養
を含めて一週間以内に行うことができ。

回収率５０％以上で、均一な酵素標品を得ることができ
る。

ＤＨＦＲ酵素活性は９反応液　（０，０５ｍＭのン酸緩
衝液（ｐＨ７，０））を、１ｍｌのキュベツトとり、こ
れに酵素液を加え、３４０ｎｍの吸光度の時間変化を測
定することにより行う。酵素１ユニツトは、上記反応条
件において、１分間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を
還元するのに必要な酵素量として定義する。この測定は
１分光光勘−Ｌ ンの製造 精製した融合タンパク質からのγ−エンドルフィンの切
断・分離は、アルギニルエンドペプチダーゼ（Ａｒｇｉ
ｎｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、市販品として入手
可能）で処理することにより行う。精製した融合タンパ
ク質１重量に対して、アルギニルエンドペプチダーゼ０
．０１重量の割合で加え、３７℃で５０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ１ｉｌ衝液、ｐＨ８，５中。

２４時間処理する。反応液に等量の５０％酢酸を加える
。この試料を、）ＩＰＬｃ装置（島津ＬＣ−リフルオロ
酢酸中、１５％から５０％のア七トニに１１＋１．／ｒ
１＃−Ｍｉｆ；ｌ？ＦＩＪｌｓｆａ中、ｎ曽＋２　−ｎ
山物は、２２０ｎｍにおける吸光度の測定により検出す
ることができる。第３図は、アルギニルエンドペプチダ
ーゼ処理した融合タンパク質試料の高速液体クロマトグ
ラムを示している。試料注入後約２０分後のピークがγ
−エンドルフィンである。

このピーク画分を分離する０分離した溶出液をエバボレ
ーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き
、γ−エンドルフィンを得ることができる。また、得ら
れたペプチドを酸加水分解後。

アミノ酸分析することによりアミノｖｉ組成を確かめる
ことができる。

本発明の実施例においては、３１の培地から湿重量的１
１ｇの菌体が得られ、この菌体く計算上。

約２５２ｍｇの融合タンパク質、約２３．３ｍｇのγ−
エンドルフィンを含む、）から、約１３２ｍｇの融合タ
ンパク質（収率、５２％、計算上的１２ｍｇのγ−エン
ドルフィンを含む、）を精製して得ることができ、この
うち、２０ｍｇの融合３ｍｇのγ−エンドルフィンを得
ることができた。

［発明の効果コ 本発明の、新規プラスミドｐＥＮＤｃ１およびｐＥＮＤ
Ｃ１を含有する大腸菌を用いることにより、融合タンパ
ク質を容易にかつ高収率で分！！精製することが得られ
ること、また、タンパク質分解酵素で処理することによ
り融合タンパク質から効率よくγ−エンドルフィンを切
り出すことができることからモルヒネ様生理活性を有す
ることが知られているγ−エンドルフィンの生産に有効
である。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ ｐＥＮＤＣ１の作成 γ−エンドルフィンを暗号化するＤＮＡとしては。

１、５’−ＧＡＴＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣＧＧＴＴＴＣＡ
ＴＧＡＣＣＴＣＡＧ−３’２、５’−ＡＡＡＡＡＴＣＡ
ＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧ−３’３、５’−ＴＣＧＡＧ
ＴＴＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧ−３’４、５’−Ｔ
ＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＧ−３’５、５’
−ＧＴＧＡＣＴＣＴＧＴＡＡＣ−３’６、５’−ＴＣＧ
ＡＧＴＴＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧＧ−３’
の６本のＤＮＡをホスホアミダイト法に従って化学合成
し、精製後、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、各Ｄ
ＮＡの５′末端をリン酸化した。リン酸化したＤＮＡを
約０．１ｍｌ　（約０．０１ｇｇのＤＮＡを含んでいる
。）ずつ取り、これを６０℃でインキュベートすること
によって両Ｄ　Ｎ　ＡをアニールさせたくこれをＤＮＡ
Ｉと呼ぶ）。

約１μｇのｐＭＩＥ　Ｋ　２を、ＢａｍＨｌおよびＸｈ
ｏｌで切断した後、アルカリホスファターゼ処理をした
。アルカリホスファターゼ処理したＤ　Ｉ’ＪＡをフェ
ノ−ノリ処理することにより、共存する酵素タンパク質
を変性除去し、その後エタノールでＤＮＡを沈澱空寸た
。沈澱したＤＮＡを７０％エタノールで洗った後、エタ
ノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥させた。ＢａｍＨＩ
およびＸｈｏ　１によるＤＮＡの切断、アルカリホスフ
ァターゼ処理、フェノール処理、およびエタノール沈澱
の各操作は、いずれも、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩ
ｏｎｉｎｇＡＬｏｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”　
（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、
　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｄｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９Ｂ２
）、以下８文献１と呼ぶ。）に記載している方法に従っ
て行った。乾燥させたＤＮＡを５０μｍのリガーゼ用反
応液（１０ｍＭＴｒｉｓ−）ＩＣＩ。

ｐＨ７，４，５ｍＭ　Ｍ３Ｃ１２，１０ｍＭジチオトレ
イトール、５ｍＭ　ＡＴＰ）に溶解後、５μｍのＤＮＡ
Ｉを加え、これに１ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼを
加えて。

１０℃で、１２時間ＤＮＡの連結反応を行わせた。

この反応物を、形質転換法（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ、上記文献１に記載）に従って、大
腸菌Ｈ８１０１株に取り込ませた。この処理をした菌体
を。

５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムおよび１０ｍ
ｇ／ｍｌのトリメトプリムを含む栄養寒天培地（培地１
１中に、２ｇのグルコース、１ｇのリン酸２カリウム、
５ｇのイーストエキス、５ｇのポリペプトン、１５ｇの
寒天を含む、）上に塗布し、３７℃で２４時間培養する
ことにより。

２６個のコロニーを得ることができた。これらのコロニ
ーのうちから適当に８個選び、各々を１゜５ｍｌのＹＴ
＋Ａｐ培地（培地Ｉｌ中に、５ｇのＮａＣ１，５ｇのイ
ーストエキス、８ｇのトリプトン、５０ｍｇのアンピシ
リンナトリウムを含む。

）で、３７℃、１晩、菌体を培養した。培養液を。

各々エッペンドルフ遠心管にとり、１２，０００回転／
分で１０分間遠心分離し、Ｗ体を沈澱として集めた。こ
れに、０．１ｍｌの電気泳動用サンプル調製液（０，０
６２５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ６，８，２１のラ
ウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０χのグリセリン
、　５Ｘ０２−メルカプトエタノール、　０．００１！
のブロムフェノールブルーを含む。）を加え２面体を懸
濁し、こ塾−を沸騰水中に５分間保ち、菌体を溶標準サ
ンプルとしてｐＭＥＫ２を含有する大腸菌に同様な処理
をしたもの、および分子量マーカーとしてラクトアルブ
ミン（分子量１４．２００）　、　　）リブシンインヒ
ビター（分子ｆ１２０，１００）　、トリプシノーゲン
（分子：１２４，０００）　、カルボニックアンヒドラ
ーゼ（分子ｊ１２９，０００）　、グリセロアルデヒド
３−リン酸デヒドロゲナーゼ（分子量３６，０００）　
、卵アルブミン（分子量４５．０００）　、および牛血
清アルブミン（分子ｆｔ６８，０００）を含むサンプル
をポリアクリルアミド濃度の１０から２０％濃度勾配ゲ
ルで泳動した。その結果、すべてのコロニーにおいて。

ｐＭＥＫ２のＤ　ＨＦ　Ｒ−ＭＥ　Ｋ融合タンパク質の
バンドが消失し、それより明らかに分子量が大きくなっ
たタンパク質（分子量約２４　、０００と推定される。

）が認められた。ｐＭＥＫ２のＤＨＦＲ−ＭＥＫ！合タ
ンパク質（分子ｆｉｔ、１８，９６３）は、この条件で
分子量約２２，０００のタンパク質として泳動する。

これらのうちから適当に一株を選び、これをＹＴ＋Ａｐ
培地で培養し、　ＴａｎａｋａとＷｅ　ｉ　ｓｂ　Ｉ　
１ｍの方法（Ｔ、Ｔａｎａｋａ、　　Ｂ、Ｗｅｉｓｂｌ
ｕｍ；　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ。

１２１　、ｐ、３５４（１９７５））に従って、プラス
ミドを調製した。得られたプラスミドをｐＥＮＤＣ１と
名づけた。ｐＥＮＤＣ１は、　ｐＭＥＫ２のＢａｍ１（
ＩとＸｈｏ　Ｉとの間の配列が、化学合成したＤＮＡ配
列と置き変わった構造をしているはずである。

ｐＥＮＤＣｌのＥｃｏＲＩ　（第１図の４７１−４７６
７６番目列）と５ａｉｌ（第１図の８９２−８９８９８
番目列）による切断によって得られる約４００ヌクレオ
チド長のＤＮＡについて２Ｍ１３フアージを用いたジデ
オキシ法（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ；Ｍｅｈｔｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１０１，１）−２
０（１９８３））に従って、塩基配列を決定した。その
結果、第１図に示す配列の４７１７１番目約８９８番日
進の配列が確かめられた。塩基配列を検討することによ
り、ｐＥＮＤＣ１が融合タンパク質を暗号化することが
明らかとなった。

ｐＭＥＫ２の塩基配列は２本発明者らによりて明らかに
されている（特願　昭６３−’７９６７９）は、Ｐｓｔ
ｌ、Ｈｉｎｄｍ、Ｈｐａｌ、Ａａｔｌｌ。

ＰｖｕＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＣ１ａｌを用いた制限
酵素による切断実験の結果、ｐＭＥＫ２のＥｃｏＲＩ−
Ｓａｉｌ切断によって得られる約４．２キロ塩基対のＤ
ＮＡと全く同一であることが示された。

以上の結果から、ｐＥＮＤＣ１の全塩基配列が第１図に
示した配列であることが決められた。

実施例２ ｐＥＮＤＣｌを含有する大腸菌が作る融合タンパク質 ｐＥＮＤＣ１を含有する大ｋｉ菌が作る融合タンパク質
のアミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予想すること
ができる。第１図の５７番目から５９０９０番目列が融
合タンパク質を暗号化していることから、トリブレット
暗号表を用いて、アミノ酸配列を推定した。その結果第
２図に示すアミノ酸配列が得られた。

ｐＥＮＤＣ１を含有する大腸菌から、エンドルフィン融
合タンパク質を分離精製し、精製したタンパク質の性質
を調べた。

融合タンパク質の精製 Ａ、用いた菌体量：湿重量　１１ｇ Ｂ、酵素精製表 表における精製過程は■無細胞抽出液、■ＤＥＡＥ−）
ヨパール力うム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフィー、および■ＤＥＡＥ−）ヨパー
ル力ラムクロマトグラフィーを表す。

精製　酵素液　回収タンパ　回収酵素　収率過程　の量
（１）り質（ｍｇ）　　　活性（ユニット）（χ）６．
７６３ ５．９０２ ４　、３８６ ３．５３９ ８７．３ ６４．９ ５２．３ 得られた酵Ｌｆｆ’ンパク質をＳＤＳ電気泳動法（上記
実施例に記載の方法）により分析したところ。

分子量的２４　、０００の単一なタンパク質バンドが示
され、得られた酵素標品が均一であることが示された。

分Ｍ精製した融合タンパク質の性質 精製したＤＨＦＲ活性を示すタンパク質をエンザイムイ
ムノアッセイにより検討したところ、γ−エンドルフィ
ンに対する抗体と反応することが示された。即ち、精製
して得られたタンパク質は免疫学的にγ−エンドルフィ
ンと同等の構造を含んでいることが明らかとなった。

精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端側のアミ
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼＹを１Ｍ製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量したくカルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
）、その結果。

−Ｖａｔ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ　（カルボキシ末端）である
ことが予想された。また、精製して得られたタンパク質
を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配
列の結果予想されるアミノＭ組成と一致した結果が得ら
れた。

実施例３ 精製分離した融合タンパク質からのγ−エンドルフィン
の分離 実施例２で得られた２ｍｌの精製均一化した融合タンパ
ク質の溶液（緩衝液１中、約２０　ｍ　ｇ　。

約１．ＯＯＯｎｍｏ　ｉ　ｅの融合タンパク質を含む）
に、０．２ｍｇのアルギニルエンドペプチダーゼを加え
、３７°Ｃで２４時間反応させる。反応後。

１ｍｌの酢酸を加える。そのうちの、０．５ｍ１（約１
６７ｎｍｏｌｅの融合タンパク質を含むはず）をとり、
高速液体クロマドグフィー装置（島津ＬＣ−４Ａ）を用
いＩｎｅｒｔｓｉｌ−００５５Ｂｍカラムで分離した。

溶出は、０．１％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル
の濃度勾配（１５％から５０は、１５％め゛ナセニトリ
ルを用い、２分から３２分までは、１５％から５０％の
アセトニトリルの直線濃度勾配をかけた。その結果、第
３図に示すような溶出曲線が得られた。試料注入後約２
３分後のピーク画分を分離し２分離した溶出液をエバボ
レーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除
き、ペプチドを得た。得られたペプチドを酸加水分解後
、その１０分の１をアミノ酸分析に用いた。その結果、
グルタミン＋グルタミン酸。

ロイシン、グリシン、リジン、メチオニン、フェニルア
ラニン、プロリン、セリン、スレオニン。

チロシン、およびバリンがそれぞれ、２３．１゜２４．
５，２２．０，１１．５．１０．８，１１゜１、１２．
４．２１．７．３３．１．１０．５および１１．５ｎｍ
ｏ　Ｉ　ｅずつ検出された。アミノＭ組成は、γ−エン
ドルフィンのそれと一致した。

また、アミノ酸分析に用いた標品は、約１１．３ｎｍｏ
ｌｅ（約２１．０μｇ）のγ−エンドルフィンを含んで
いたことになる。この結果から、精製均一化した融合タ
ンパク質を用いて、アルギニルエンドペプチダーゼ処理
した標品をＨＰＬＣを用いて分離することにより収率的
６８％でγ−エンドルフィンを回収できることが明かと
なった。

融合タンパク質の精製の収率が約５２％であり。

融合タンパク質からのγ−エンドルフィンの分離の収率
が約６８％であることから、大腸菌がつくるγ−エンド
ルフィンの単離収率が約３５％であると計算される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＥＮＤＣ１の全塩基配列を示した図であり
、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列だけを、５′
末端から３２末端の方向に記述している。図中符号は、
核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇ
はグアニンを、Ｔはチミンを示している。図中番号は、
ｐＥＮＤＣ１に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａｌ切断認
識部位のうち制限酵素Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ切断部位に
近い方′１ のＣ１ａｌ切断認識部位の、５’　−ＡＴＣＧＡＴ−３
′、の最初の”Ａ”を１番として数えた番号を示してい
る。 第２図は、ｐＥＮＤＣ１中に存在する融合タンパク質を
暗号化する部分の塩基配列およびタンパク質のアミノ酸
配列を示す図である。図中符号は。 核酸塩基およびアミノ酸を表し、Ａはアデニンを。 Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを。 Ａｌａはアラニンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓｎは
アスパラギンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｃｙｓは
システィンを、Ｇｉｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグルタ
ミン酸を、　Ｇｒｙはグリシンを、）ｌｉｓはヒスチジ
ンを、Ｉｌｅはイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシンを、
Ｌｙｓはリジンを。 Ｍｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、
Ｐｒｏはプロリンを、Ｓｅｔはセリンを。 Ｔｈｒはトレオニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔ
ｙｒはチロシンを、Ｖａｌはバリンを示している。図中
番号は、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化す
るＡＴＧコドンのｎ　Ａ　ＩＴを１番として数えた番号
を示している。 第３図は。 アルギニルエンドペプチダーゼ処理 した融合タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示
している。 横軸は試料注入後の時間を分車 位で。 縦軸は。 ２２０ｎｍの吸光度を任意単位で 表現している。 矢印で示したピークがγ−エンド ルフィンの溶出ピークである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
   にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
   ことができ、４６７６塩基対の大きさを有し、第１図に
   おいて示されるＤＮＡ配列を有する新規組換えプラスミ
   ドｐＥＮＤＣ１。 ２、ｐＥＮＤＣ１を含有する大腸菌。 ３、ｐＥＮＤＣ１を含有する大腸菌が生産し、第２図に
   よって示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元
   酵素−γ−エンドルフィン融合タンパク質。 ４、ｐＥＮＤＣ１を含有する大腸菌を培養し、ジヒドロ
   葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元酵素−γ
   −エンドルフィン融合タンパク質を、培養菌体の無細胞
   抽出液から、メソトリキセート結合アフィニティカラム
   クロマトグラフィー、および陰イオン交換カラムクロマ
   トグラフィーを用いて精製することを特徴とするジヒド
   ロ葉酸還元酵素−γ−エンドルフィン融合タンパク質の
   分離精製方法。 ５、ｐＥＮＤＣ１を含有する大腸菌の生産するジヒドロ
   葉酸還元酵素−γ−エンドルフィン融合タンパク質を分
   離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元酵素−γ−エンド
   ルフィン融合タンパク質をタンパク質分解酵素で消化し
   た後、γ−エンドルフィンを分離精製することを特徴と
   するγ−エンドルフィンの製造方法。