JPH02150760A - 電気泳動における染色処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は蛋白等の生体高分子成分、またはその他の高分
子の分離または分析のために用いられるアクリルアミド
系水性ゲル電気泳動媒体の電気泳動後の染色処理方法に
関するものであり、特に染色処理工程におけるゲル媒体
の寸度変化が少なく、支持体からの剥離が生じない処理
方法に関する。

［従来技術とその欠点］ 近年、電気泳動法は生体高分子成分の分離または分析に
多く用いられており、特に蛋白の分離・分析は疾病診断
のための生化学検査において頻繁に用いられている。

膜またはシート状の電気泳動媒体として、最近では分離
性能のすぐれたアガロースまたはポリアクリルアミド水
性ゲル膜から成る電気泳動媒体が多く用いられるように
なり、特に分子ふるい効果を有するポリアクリルアミド
ゲル膜が現在量も多く用いられている。

疾病診断のための生化学検査における蛋白の分離・分析
に適する、分子ふるい効果を有するポリアクリルアミド
ゲル膜は、通常アクリルアミドのような単量体とＮ、Ｎ
’−メチレンビスアクリルアミドのような二官能性（ま
たは多官能性）の架橋剤の混合物と重合開始剤を含む約
３〜３０ｗ＄の水溶液中で、単量体と架橋剤を架橋重合
させることにより形成されている。

ポリアクリルアミドゲル膜を電気泳動媒体として用いる
際、従来はガラス板等の平坦な支持体を用いて、実験者
がその都度製作していた。この作業は大変面倒で、電気
泳動を利用する実験者の大きな負担となっていた。この
負担を軽減するために、２枚の電気絶縁性・可とう性・
水不透過性シート（支持体シートとカバーシート）をそ
れらの幅方向の両端部にスペーサーをはさんで対向させ
、形成された空間に電気泳動媒体となるゲル膜を収容し
た電気泳動用シート材料が、最近市販されるようになっ
た。

電気泳動後の検出方法、すなわち電気泳動像の可視化方
法としては、色素による染色としてクマジー染色、金属
を用いる方法として銀染色、金集色、放射性アイソトー
プの放射能を、利用するオートラジオグラフィー等があ
る。蛋白質の電気泳動では一般にクマシー染色が一般的
である。

ポリマーフィルム上に形成されたゲル膜を用いて電気泳
動を行った後、色素による染色（例えばクマシー染色）
および脱色を行った際、ポリマーフィルムからゲル膜が
剥がれないことが大切である。しかしこれまでは、ゲル
膜の一部が剥がれてゲル膜が破損することが多く、大変
問題であった。

［発明の解決すべき技術的課題〕 ポリマーフィルム上に形成されたポリアクリルアミドゲ
ル膜を用いて電気泳動を行った後、色素染色の操作の際
、ポリマーフィルムからゲル膜が剥がれないように、色
素染色の操作を改良することである。

［技術的課題の解決手段］ ポリマーフィルム上に形成されたポリアクリルアミドゲ
ル膜から成る電気泳動媒体シートを、電気泳動後に色素
溶液中で染色・脱色する方法において、ポリアクリルア
ミドゲル膜の膨潤・収縮を体積比で±４％以下に制限す
ることにより、上記課題は解決された。

［発明の具体的構成の詳細］ 従来電気泳動ゲル媒体を電気泳動後に色素で染色するに
は、アルコール類と水の約１：１（体積比）混合溶媒に
色素を溶解した溶液中でゲル媒体を染色した後、色素を
含まないアルコール類と水の約１：３（体積比）混合液
（脱色液）で脱色し、さらに約１０％程度のアルコール
類と水の混合液（洗浄液）で洗浄するのが、普通であっ
た０本発明では、染色液および脱色液のアルコール類と
水の混合比を２＝３（体積比）程度に変え、洗浄液のア
ルコール類含有量を約３０％以上に高めた。

これによって、ポリアクリルアミドゲル膜の染色過程で
の収縮、および脱色過程、洗浄過程での膨潤を、いずれ
も体積比で±４％以下に制限することができ、それとと
もに染色、脱色、洗浄の過程を経てもゲル膜のはがれは
全く生じなかった。

染色液、脱色液、洗浄液に用いるアルコール類は、通常
多くの場合に用いられるのはエタノールであるが、メタ
ノール、イン１０パノール、ｎ−１０パノール等でもよ
い０本発明で染色液および脱色液中のアルコール類の含
有率は３０ないし４０％（重量比）とするが、３３ない
し３７％が好ましい。

゛染色液、脱色液には、通常のように蛋白質の固定のた
め有機酸、例えば酢酸を、うないし２０重量％含有して
もよい。

染色、脱色、洗浄の操作は通常室温付近で行なわれるが
、勿論１８℃以下、さらに４℃付近の低温で行ってもよ
い。

染色のための色素として最も広く用いられているのはク
マシーブリリアントプＩレー（ＣｏｏｍａｇｓｉｅＢｒ
ｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０であるが、それ
以外の同じ用途に公知の色素、例えばアミドブラック（
Ａｍｉｄｏ　Ｂｌａｃｋ）　１０　Ｂ、ポンソー（Ｐｏ
ｎｓｅａｕ）　３　Ｒも、用いることができる。

水性ゲル膜のポリマー濃度は、単量体、架橋剤、水を含
むゲルの容積に対する、単量体と架橋剤の合計重量の比
で、約３から３０ｗ／ｖ％の範囲番二選ばれるが、好ま
しいのは６ないし２０ｗ／−ｖ％の範囲である。

ゲル膜の厚さは約５０ないし２０００μ−の範囲から選
ばれるが、通常は約８０ないし５００μｍである。

本発明で処理されるゲル膜は、アクリルアミド系化合物
と架橋剤が水の存在下に架橋重合して成るポリアクリル
アミド系親水性高分子と、変性剤とを含む、ポリアクリ
ルアミド系水性ゲル膜である。

本発明で処理されるゲル膜に用いることができるアクリ
ルアミド系化合物（単量体）の例は、アクリルアミド、
Ｎ−メチルアクリルアミド、　Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、
ジアセトンアクリルアミド等である。

これらの化合物は単独で、または２種以上を組合せて用
いることができる。

架橋剤としてはｒＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」、
　Ｖｏｌ、２゜Ｎｏ、４，２１３−２１９，２２０−２
２８（１９８１）等に記載された二官能性化合物、特開
昭６１−２０５８等に記載された三官能性以上の化合物
を用いることができる。二官能性架橋剤の具体例として
Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（Ｂ　Ｉ　Ｓ）
、エチレンウレアビスアクリルアミド（ＥＵＢ）、三官
能性架橋剤の具体例として１，３．５−）リアクリロイ
ルへキサヒドロ−３−トリアジン（ＴＡＨＴ）等がある
。架橋剤は２種以上を組合わせて用いることもできる。

架橋剤の添加量は、単量体と架橋剤の合計重量に対して
約１ｗ％から約３０ｗ％、好ましくは約２ｗ％から約１
０ｗ％の範囲である。

本発明で処理されるゲル媒体にはアガロースを含むこと
ができる。アガロースの添加量は単量体とｍ＃ＩＩＲを
会む水性ゲルのｖｉ積に対して約０．２ｗ／Ｖ％から約
２．０ｗ／ｖ％の範囲である。

本発明で処理されるゲル媒体にはポリビニルピロリドン
等の水溶性ポリマーを添加することができる。ポリビニ
ルピロリドン以外の水溶性ポリマーとしては特開昭５９
−１２６２３８．特開昭６０−６０５４８等に記載の分
子量約１万から約１００万の範囲の付加重合型または縮
重合型の水溶性の非イオン性ポリマニ（例えばポリビニ
ルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレ
ングリコール）、特開昭６１−１８８５２に記載のビニ
ルスルホニル基等含有の架橋性アクリルアミド系コポリ
マーを用いることができる。

本発明で処理される電気泳動用ゲル媒体には公知のｐＨ
Ｍ衝剤を含有させて、電気泳動実施時のｐＨ値を８．０
から９．０の範囲に調節することができる。用いうるｗ
ｉｆＩＩ剤としては９日本化学会編「化学便覧　基礎編
」（東京、丸善關、１９６６年発行）１３１２−１３２
０頁、　　Ｒ，１，Ｃ、Ｄａｗｓｏｎ　　ｅｔ　ａ１編
ｒ　Ｄ　＠ｔａｆｏｒ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓ
ｅａｒｃｈ」第２版（Ｏｘｆｏｒｄ＠ｔ　ｔｈｅ　Ｃ１
ａｒ＊ｎｄｏｎＰｒ＝ｍｓ、１９８９年発行）４フ８−
５０８頁、ｒＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」５．４６７
頁以降（１９６６年）、ｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ」　１０４．　３００＝３１
０頁（１９８０年）等に記載のｐＨＮＩｆｌｔ剤系があ
る。ｐＨＭ街剤の具体例として、 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）
。

Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉ
ｃｉｎｅ）。

ト［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ
プロパンスルホン酸Ｎａ塩またはに塩等、およびこれら
のいずれかと酸、アルカリまたは塩がある。好ましいｐ
ＨＭ衝剤基剤系としてＴｒｉｓ硼酸−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　
４Ｎａ塩（ｐＨ８，２〜８．３）がある。

ゲル膜は実質的に電気絶縁性で水不浸透性の平滑なシー
ト状または平板状支持体の上に設けるのが好ましい、支
持体としてはガラス板、有機ポリマーフィルム等を用い
ることができる。有機ポリマーフィルムの具体例は、ポ
リエチレンテレフタレート、ビスフェノールＡのポリカ
ルボネート。

ポリスチレン、セルロースエステル（例えばセルロース
ジアセテート、セルローストリアセテート。

セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマー
から成る、厚さ約８０μ輪から約５００μ鋤のフィルム
である。有機ポリマー支持体は、その表面を親水化しゲ
ル膜との接着を良好にするために、紫外線照射、グロー
放電処理、コロナ放電処理、火焔処理、電子線照射、ケ
ミカルエツチング、電解エツチング等の公知の表面処理
方法を適用することができる。有機ポリマー支持体の表
面には必要に応じて下塗層または接着層を設けて支持体
の上に設けられるゲル膜と支持体との接着を強固にする
ことができる。

以下に本発明をさらに具体的に説明するため、実施例を
示す。

［実施例１］ ！）　ル　　　　の−２ １００＋１中に アクリルアミド　　　　　　　　７．８９Ｎ、Ｎ’−メ
チレンビス アクリルアミド　　　　　　　０．２ｙドデシル硫酸ナ
トリウム　　　　０．１ｇトリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン　　　　　　　　４．５ｇグリシン　　　
　　　　　　　　２．８ｇを含有するアクリルアミド水
溶液に、重合開始剤として下記のものを加えた。

ベルオクソニ硫酸アンモニウム （５％溶液　１．３　ｍｌ）　　　６５ｍｇＮ、Ｎ、Ｎ
’　、Ｎ’−テトラメチル エチレンンジアミン　　　　３３μ！ リボフラビンリン酸エステル ナトリウム塩　　　　　　　　　１０１゜２）・　゛・
　　シー　の 表面が平滑な厚さ２−転縦２０ｃ鍮横２０ｃ翔のガラス
平板の上に、厚さ１７５μｍのポリエチレンテレフタレ
ート（ＰＥＴ）フィルムの縦２０ｃ−１横２０ｃｍのシ
ート（ゲル膜の支持体となる）を水で張り付け、ＰＥＴ
シートの周縁に厚さ４００μ転幅１０鴎−のＰＥＴ製の
テープを接着し、スペーサーの間に形成されな凹部に前
記ゲル膜組成物を流しこんだ、２５℃で放置して架橋重
合させ、厚さ４００μ肩のポリアクリルアミドゲル膜を
得た。

３Ｉじｍ このゲル電気泳動媒体を用いて、下記４種の標準蛋白質
試料の電気泳動を行った。

チトクロームＣ（分子量１２４００） キモトリプシノーゲンＡ（分子量２５０００）オボアル
プミン　　　　（分子量４５０００）ウシ血清アルブミ
ン　　（分子１６７０００）各試料とも０．１ｍｇづつ
を、ドデシル硫酸ナトリウム１％を含む０．ＯＩＭリン
酸Ｍ街液（Ｄ）（７，０）０．４社に溶解した。各試料
液には０．０５％相当のプロムフェノールブｌレー０．
０５％相当のキシレンシアノ−７し、１０％相当のグリ
セリン を加えた。

電気泳動は３０ｍＡの定電流条件で、ブロムフェノール
ブルーがゲル膜の末端に達するまで続けた。

４）染色処理 電気泳動後のゲル膜を下記組成の染色液を用いて染色し
た。

エタノール　　　　　　　　　　７０ｍ１氷酢酸　　　
　　　　　　　　２０ｍ１水　　　　　　　　　　　　
　　　　１１０ｍｆクマシーブリリアントブル−（Ｃｏ
ｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）Ｒ−２
５００，２ｇ染色後、上記組成から色素を除いた組成の
脱色液で脱色し、エタノール６０ｍ１、水１２０ｍｆの
混合液で洗浄した。ゲル膜が支持体フィルムから剥がれ
ることなく、染色処理できた。

［比較例］ 比較のため、電気泳動後のゲル膜を従来用いられた下記
組成の染色液を用いて染色した。

エタノール　　　　　　　　　　９０ｍＮ氷酢酸　　　
　　　　　　　　２０ｍ１水　　　　　　　　　　　　
　　　　　９０ｍ１クマシーブリリアントブルー（Ｃｏ
ｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔ　　Ｂｌｕｅ）Ｒ−
２５００，２ｇ染色後、下記組成の脱色液および洗浄液
で脱色および洗浄した。

脱色液： エタノール　　　　　　　１２５ｍ１ 氷酢酸　　　　　　　　　　４０ｍ１ 水　　　　　　　　　　　　　　３２５ｍｆ洗浄液： エタノール　　　　　　　１００ｍ１ 水　　　　　　　　　　　　　　　９００ｍ１染色処理
の途中でゲル膜が支持体フィルムから剥離し、泳動像の
観察が困難であった。

［参考例］ 実施例と同じガラス平板に、ＰＥＴフィルムを貼らない
で、周縁に厚さ４００μ層、幅１０＋鵬のＰＥＴのテー
プを接着し、テープで囲まれた凹部にゲル膜組成物を流
しこんでゲル膜を形成させた。

ゲル膜を１０１０Ｘ１０の大きさに切り出し、実施例お
よび比較例で用いた染色液、脱色液、洗浄液をそれぞれ
用いて、染色処理を行い、各工程でのゲル膜の大きさを
測定した。ゲル膜の寸度変化率は第１表に示す通りであ
った（表中土は拡大、−は収縮を示す）。

第１表 表に示すごとく、本発明の処理方法ではゲル膜の伸縮が
小さい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ポリマーフィルム上にポリアクリルアミドゲル膜を
   有する電気泳動媒体シートを用いて蛋白質の電気泳動後
   に色素溶液中で染色し、さらに脱色および洗浄する方法
   において、染色、脱色、洗浄の過程におけるポリアクリ
   ルアミドゲル膜の膨潤・収縮を体積比で±４％以下に制
   限することを特徴とする電気泳動媒体シートの染色、脱
   色および洗浄方法。 ２）ポリマーフィルム上にポリアクリルアミドゲル膜を
   有する電気泳動媒体シートを用いて蛋白質の電気泳動後
   に色素溶液中で染色し、さらに脱色および洗浄する方法
   において、染色過程に用いる染色液および脱色過程に用
   いる脱色液中のアルコール類の含有率を３０ないし４０
   ％（重量比）とすることを特徴とする電気泳動媒体シー
   トの染色、脱色および洗浄方法。 ３）洗浄過程に用いる洗浄液のアルコール類含有量を約
   ３０％以上としたことを特徴とする特許請求の範囲２）
   の染色、脱色および洗浄方法。