JPH07501563A - 界面動電法およびクロマトグラフィー法におけるポリアクリルアミドマトリックスのための新規な配合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 法およびクロマトグラフィー去におけるポリアクリルアミドマトリックスのため の　夫な　ム勿本発明は、以下のような独自の特徴を有する新規なポリアクリル アミドマトリックスに関する。すなわち、ａ）非常に高い耐アルカリ加水分解性 ；ｂ）高分子との疎水性相互作用を回避するための高い親木性；Ｃ）高めのポロ シティ−（大きめの分子質量のモノマーの使用による、あるいは重合段階での側 方凝集剤の使用のいずれかによる）； ｄ）Ｉ準的な酸化還元の対（過硫酸塩とＮ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチレ ンジアミン、ＴＥＭＥＤ）で重合されたマトリックスに典型的な、酸化性の欠如 という特徴である。

発明の背景 本発明によると、上記の特徴を示すマトリックスが、同じく本発明に属する方法 を使用することにより、独自の分類のＮ−モノ−もしくはジー置換アクリルアミ ドモノマーの重合または共重合を経て得られる。同様に本発明に含まれるものは 、上に述べたアクリルアミドのそのようなポリマーまたはコポリマーの混合物に よって、あるいは、そのようなポリマーおよびコポリマーと、アガロース、デキ ストランもしくは他の親水性ポリマーとの混合物によって得られるマトリックス である。

ゾーン電気泳動における分離のためのポリアクリルアミドマトリックスは、Ｒａ ｙｍｏｎｄとＷｅｉｎｔｒａｕｂにより、すでに１９５９年に導入され（Ｓｃｉ ｅｎｃｅ、　１３０．１９５９．７１１−７１２　）　、　Ｄａｖｉｓ　（Ａｎ ｎ、　Ｎ、　Ｙ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　１２１．１９６４．４０４−４２７　）　、０ｒｎｓｔ ｅｉｎ　（Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　１２１．１９６４．３２１−３４９　）およびＨｊｅｒｔｅｎ　（Ｊ 、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　１１゜１９６３、６６−７０　）により、ディス ク電気泳動における使用についてさらに促進された。電気泳動の支持体としての それらの普及は、ａ）紫外線をはじめとする光の透過性；ｂ）帯電基の不在によ る電気的中性；ｃ）広い間隔のポロシティ−においてゲルを合成する能力のよう な、いくつかの基本的な特性に由来する。何年もの間、最大の普及を得たモノマ ーの対は、アクリルアミドと、架橋剤であるＮ、Ｎ’　−メチレンビスアクリル アミドとを対にしたものであった（Ｐ、　Ｇ、　Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、　Ｊ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９．１９８９゜１−２ ０）。しかし、長らく使用されると、そのようなマトリックスのい（つかの欠点 が注意をよぶようになった。もっとも劇的な障害は、アルカリ性ｐＨ値でのその 不安定性である。電気泳動を実施した後（タンパク質および核酸のいずれについ ても大部分の界面動電的分離はアルカリ性ｐＨ値で起こる）、ダングリングアミ ドボンドが部分的に加水分解されてカルボキシル基を生み、このカルボキシル基 はポリマーに共有結合したままとどまり、このようにして、このポリマーがポリ アクリレートに転換される。この現象が強い電気浸透を生み、同時にマトリック スが膨潤し、がなりひずむ。実際には、電気泳動を１回実施しただけで、ポリア クリルアミドマトリックスは再利用できなくなる。このことは、再利用性マトリ ックスが利用できれば分析時間が大幅に短縮され、世界中でそのようなプロジェ クトの迅速な進展が可能になるであろうヒトゲノムの配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃ ｉ　ｎｇ）のような大規模プロジェクトにおいて、その使用を厳しく制限する。

安定なマトリックスはまた、毛管ゾーン電気泳動（ＣＺＥ）において、部分的に 加水分解されるか、誤動作を起こして、ゲルを毛管から押し出すことができない 場合に、実に有用であろう。

もう一つの一般的な問題は、ポリアクリルアミドによって効率的にふるい分ける ことができる分子の大きさの範囲が限られることである。このようなポロシティ −（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）の範囲は、数ｎｍ（２〜３　ｎｍ）から希釈度の高いマ トリックスにおける約２０〜３０ｎｍまでの孔の大きさを包含する。このことが タンパク質分離へのポリアクリルアミドの利用を制限し、これに対してアガロー スゲルは、今日、核酸断片の分離にほぼ独占的に使用されている。このように、 ポロシティ−の高いポリアクリルアミドマトリックスは、核酸の、長手方向の、 ある間隔における分画をも可能にするであろう。

第三の問題は、標準的な酸化還元の対の触媒、すなわち過硫酸塩とＴＥＭＥＤと の触媒の使用に関連する。これは、酸化還元の対であるため、アミノ基（第一級 から第三級まで）を含む多くの物質を酸化させて、Ｎ−酸化物を生成することが ある。過剰の過硫酸塩を陽極に放出した後でもゲルの中に残るこのようなＮ−酸 化物は、タンパク質、特に−ＳＨ残基を酸化させてジスルフィド結合（−５−５ −）にすることがある。

いくつかの初期の特許出願は、上に述べた問題のいくつかを取り上げ、異なるタ イプのモノマーを提案している。ある例（Ｋｏｚｕｌｉｃ。

Ｂ、およびＭｏ５ｂａｃｈ、　Ｋ、の特許、ＰＣＴ／ＥＰ８８１００５１５．１ ９８８年６月１０日）には、Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　［Ｎ−アクリロイルトリス（ ヒドロメチル）アミノメタン、ＮＡＴＩが、電気泳動のための親水性の大孔ゲル を製造することが提唱されている。該Ｔｒｉｓａｃｒｙｌモノマーは、実際に、 クロマトグラフィー支持媒体に提案されていた（Ｇｉｒｏｔ、　Ｐ、およびＢｏ ｓｃｈｅｔｔｉ、　Ｅ、　、Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、２１３．１９８１゜ ３８９−３９６　）。以下に示すように、このモノマーは、親水性の強いもので はあるが、零次の反応速度で崩壊するため、固有の不安定性をこうむるものであ る。たとえば再利用性マトリックスまたは長期貯蔵マトリックスへのその使用を 、明確に提唱することはできない。もう一つの特許出願（Ｋｏｚｕｌｉｃ、　Ｂ 、の欧州特許第８８８１０７１７．４号、１９８８年１０月１９日）には、Ｎ− アクリロイル（またはメタクリロイル）−１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グリ シドールまたは相当するＤ−キシリトール誘導体のようなアクリルアミド糖類が 提案されている。良好な親水性と、非置換アクリルアミドよりも大きな分子量を たしかに有するこの分類のアクリルアミドモノマーもまた、零次の反応速度で崩 壊するため、きわめて不安定であり、したがって、上に述べたポリ（ＮＡＴ）と 同様、有効な代替品になりつるとは考えられない。もう一つの出願（Ｓｈｏｒｒ 、　Ｒ，およびＪａｉｎ、　Ｔ、の欧州特許第８９１０７７９１．９号、１９８ ９年４月２８日）には、電気泳動支持媒体として、上述の七ツマ−のいくつかを はじめとする、広範囲のＮ−モノ−およびジー置換アクリルアミドモノマーが提 案されている。しかし、５ｈｏｒｒおよびＪａｉｎは、この大きな分類の電位性 モノマーのうち、わずか２種の好ましい混合物を取り出している（そして市販化 している）、次のように述べている（原文どおり）。「ある好ましい実施態様に おいては、ポリマーは、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミドとエチレングリコール メタクリレートとの架橋重合によって形成される。もう一つの好ましい実施態様 においては、ポリマーは、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミドおよびヒドロキシエ チルメタクリレートとＮ、Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの架橋重合によって形 成される。」これらの処方も最適なものとは考えられない。

以下に示すように、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミドおよび同様なアルキル置換 アクリルアミドはあまりにも疎水性であり、一方、種々のメタクリレート架橋剤 も同様に加水分解を受けやすく、疎水性である。この結果として、このような処 方を含有する市販の製品（Ｈｙｄｒｏｌｉｎｋ　）は、モノマーの可溶化を助け るために洗剤を含有しなければならない。相当するエマルションはしばしば凝集 する。これらの例は、さきに明瞭に述べた問題、すなわち、高い親水性と、高い 耐加水分解性と、大きめの孔の大きさとを同時に有する新規なマトリックスの設 計が適切に取り上げられたことはな（、解決からはほど遠いことを示す。

発明の記載 本発明は、そのような不都合を解消して、界面動電的分離において大きく優れた 結果を出すことができる新規な配合物を提案する。

このような配合物は、以下の式（Ｉ）で示される独自の分類のモノマーの重合ま たは共重合を経て得られる。

式中、Ｒは、水素またはＣＨｓを表し；Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素また は式−［（ｃｏｔ）、、−ｏ−（ｃｏ、）Ｉｌ−ｏ）Ｎ）！　（式中、ｎ＝２ま たは３であり、Ｎ＝１〜５、好ましくは１である）で示される基を表す。

ただし、Ｒ１およびＲ２の一方は水素とは異なる。式（Ｉ）の好ましいモノマー は、Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアクリルアミド（＝Ｎ−アクリロイ ルアミノエトキシエタノール）もしくはＮ−置換誘導体または相当するメタクリ ルアミド誘導体である。

これらのモノマーのポリマーおよびコポリマー（たとえばＮ、Ｎ−ジメチルアク リルアミドとの）は、良好な親水性、きわめて高い耐加水分解性、および従来の ポリアクリルアミドよりも大きなポロシティ−を示す。そのような特徴は、アガ ロース／ポリアクリルアミドのような混合床マトリックスにおいても見出すこと ができる。

後者は、前記のモノマーによって得ることができる。

本発明はまた、酸化還元または好ましくは光触媒作用を介して、しかし側方凝集 剤（たとえばポリエチレングリコール）の存在において、高いＭｒのタンパク質 および核酸断片を分解することができるポロシティ−の高いマトリックスを製造 するためのゲルを得る（重合または共重合による）ための手法を包含する。後者 の手法において、重合（または共重合）を側方凝集剤の勾配の存在において実施 するならば、一定量のモノマーがゲル中に存在する場合でさえ、ポロシティ−の 勾配を得ることが可能である。また、上記のモノマーを、たとえばリボフラビン と光によって、しかし好ましくはメチレンブルーによって光重合（または光共重 合）させて（一般的にはトルエンスルフィン酸ナトリウムおよび塩化ジフェニル ヨードニウムの存在において）、上に述べたように、Ｎ−酸化物を含まず、それ ゆえ、タンパク質を酸化させることのないマトリックスを形成することもできる 。本発明はまた、工業、研究および分析の用途のためのすべての界面動電法に使 用されたり、クロマトグラフィー支持媒体として粒状物質（単独で、またはプラ スチックもしくはガラスのビーズの表面コーティングとして、あるいはアガロー スおよび他の親水性ポリマーと組み合わせて）の形態で使用される、長期貯蔵の ためのゲルスラブを製造するための、上記の式（Ｉ＞のモノマーの使用を含む。

本発明によるマトリックスの利点を以下に論じ、例示する。

新規な分類のＮ−モノ−およびジー置換モノマーアクリルアミドに基づくポリア クリルアミドマトリックス図１の実施例は、従来のアクリルアミドの加水分解速 度を、従来のＮ−モノ−およびジー置換アクリルアミドおよび本発明による新規 な分類のモノマーと比較して示す。０．ＩＮのＮａＯＨに溶解した遊離モノマー を、表示の時間、７０℃で装置し、中和し、ついでマンデル酸を内標準として使 用する毛管ゾーン電気泳動によって分析した。ＢｅｃｋｍａｎシステムＧｏｌｄ によって、ピーク積分を得た。

Ｋｏｚｕｌｉｃによって報告された親水性の高いモノマー（アクリルアミド糖類 ）ならびにＫｏｚｕｌｉｃとＭｏ５ｂａｃｈによって報告された親水性の高いモ ノマー（ＮＡＴもしくはＴｒｉｓａｃｒｙｌ　）のすべてが、どのように零次の 崩壊速度を示し、そのような分子固有の不安定性を示唆するかを理解することが できる。従来のタイプの種々のＮ−モノ−およびジー置換アクリルアミドはすべ て、アクリルアミドの一次崩壊速度と形状でそれほど違わない一次崩壊速度を示 す。対照的に、本発明に報告されるモノマー［たとえばＡＡＥＥ、Ｎ−（２−ヒ ドロキシエトキシ）エチルアクリルアミド］は、きわめて高い加水分解安定性の 独自の挙動を明らかに示す。

モノマーを、溶液中に遊離させるのではなく、ポリマーマトリックスに係合させ ると、安定性における相違はさらに強められる。図２において再び、従来のＮ− 置換アクリルアミドの安定性を、ここではポリマー網状質で比較している。この 実験では、すべてのポリアクリルアミドを球体として合成しく乳化重合により） 、ついでそれを０．ＩＮのＮａＯＨ中、７０℃で、図２に表示した時間、加水分 解した。ポリマーの加水分解の程度の評価は、前端分析により、アミド結合が加 水分解したときに得られる遊離カルボキシルの滴定によって実施した。従来のポ リアクリルアミドにおいて、わずか２時間の（Ｍ置で少な（とも３０％のモノマ ーがいかに加水分解されたかがわかる。逆に、ポリ（ＡＡＥＥ）においては、同 じ期間において加水分解の証拠はなく、従来のＮ−置換アクリルアミドから作ら れた他のすべてのマトリックスは、異なった程度に加水分解する。（この図およ び他の図の詳述については、後の「解説」の章を参り、りされたい）。

図３の実施例では、等電集束実験における新規な分類のＮ−置換アクリルアミド の耐加水分解性を示す。一方はポリ（アクリルアミド）、他の一方はポリ（ＡＡ ＥＥ）である２枚のスラブを用意し、０．ＩＮのＮａＯＨ中に７０℃で２０分間 温装する（曲線ｌ）が、１００ｍＭのトリスホウ酸塩緩衝液（ＤＮＡ解析に典型 的な緩衝液）中、ｐＨ８，５で一夜装置する（曲線２）。過剰のＮａＯＨまたは トリスホウ酸塩を除去するために蒸留水で洗浄したのち、ゲルを乾燥保存して、 ２％のＡｍｐｈｏｌｉｎｅ中、ｐＨ３〜ｌＯで再び膨潤させる。

等電集束の後、陽極と陰極との間でゲルスライスを切断する（５ｍｍ間隔で）こ とにより、ｐＨ勾配を測定する。ポリ（ＡＡＥＥ）においては、ｐｔ＋勾配は、 予想どおりの間隔（ｐＨ３〜１０）で普通に延び、一方、ポリ（アクリルアミド ）においては、ｐＨ勾配は、非常に穏やかな加水分解条件、たとえばゾーン電気 泳動に一般的な緩衝液の存在において一夜装置する条件でも、完全に酸性化した ことがわかる。この最後の現象は、ｐＨ勾配を強（酸性化し、実質的な電気浸透 流を生み出す、マトリックス中の多数のヒドロキシル基の存在を明確に示すもの である（Ｐ、　Ｇ、　Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ ｈｙｓ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９．１９８９．１−２０）　、固定化されたｐＨ勾配を含む ゲルにおいても、同様な結果が得られる。

発明者らの見出した新規な分類のＮ−置換モノマーの親水性を実証するために、 水溶液をｎ−オクタツール中で分配処理に付した。

平衡に達した後、毛管ゾーン電気泳動（ＣＺＥ）によって水相を分析し、このよ うにして、二つの相におけるモル比を決定した。図４は、アクリルアミド、その 従来のＮ−置換誘導体、および本発明の新規なモノマーそれぞれの分配係数を示 す。Ｔｒｉｓａｃｒｙｌおよびアクリルアミド糖類一般はきわめて親水性である （同時にきわめて加水分解を受けやすい）が、他のすべての従来のＮ−置換アク リルアミドは、明らかにアクリルアミドよりも疎水性であることがわかる。

ここに報告する新規なモノマー（ＡＡＥＥによって例証されるようなもの）は、 加水分解処理に対して独自の耐性を示しながらも、著しく低い分配係数（Ｐ＝０ ．１３）　、ひいてはアクリルアミドに比べてより顕著な親水性を示すことにお いて、他に類を見ないものである（図Ｘ〜３を参照）。親水性ゲルを得るための 最大Ｐ値はＰ＝０．４である。このような値を越えると、ポリマー、たとえばポ リ（ＤＭＡ）は、タンパク質との間で疎水性相互作用を示す。

Ｐ＝０．８を越えると、ポリマーはもはやプロトン性溶媒の中で再び膨潤するこ とはできない。

このようなアルカリによる加水分解に耐えるマトリックスはまた、ＣＺＨにおい て電気浸透流（ＥＥＯ）を除去するために、毛管の内壁〔普通は石英ガラス（ｆ ｕｓｅｄ　５ｉｌｉｃａ）のもの〕を被覆するのに極めて有用である。ＥＥＯの 抑制は、毛管壁土に固着した電荷によってｐＨ勾配がただちに破壊される等電集 束法において基本的であり、また、タンパク質およびペプチドの分離の場合にも 、通常、それらが負の電荷を帯びた毛管壁に強力に吸着されるために基本的であ る。毛管を被覆するのに用いられる標準的な方法の一つは、Ｈｊｅｒｔｅｎによ って提案されている（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　３４７．１９８５゜１９ １−１９８　）　、毛管を二官能性試薬（たとえばＢｉｎｄ　５Ｌ１ａｎｅ、３ −メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン）で処理し、ついで、架橋剤の 非存在において、ポリアクリルアミドの゛ひも゛　（ｓｔｒｉｎｇ）で被覆する 。このように、長い線状の°ひも°が形成され、これらのひもが壁に共有結合し 、ＥＥＯフラックスを消滅させる。しかし、このような被覆はアルカリ性条件に きわめて敏感である。等電集束法に毛管を使用するならば、ＥＥＯフラックスは 、たった５回の実施の後に早くもはっきりと表れる。しかし、同様にして事前に 処理した毛管を綿状のポリ（ＡＡＥＥ）鎖で被覆するならば、５０回実施した後 でもＥＥＯフラックスは認められない。石英ガラス壁と二官能性試薬（Ｂｉｎｄ 　５Ｌｌａｎｅ　）　（−３１−０−３ｉ−タイプのもの）との間の結合もまた 、被覆の不安定性に寄与する。代替方法は、Ｃｏｂｂらの方法（に、　Ａ、　Ｃ ｏｂｂ、　Ｖ、　ＤｏｌｎｉｋおよびＭ、　Ｎｏｖｏｔｎｙ、Ａｎａｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　６２．１９９０．２４７８−２４８３　）を使用することである。この 方法は、グリニヤール試薬を利用して、該石英壁と二官能性試薬との間に直接的 な一３ｔ−Ｃミ結合を生じさせる。この代替方法を使用することにより、そして 直鎖状ポリ（アクリルアミド）で壁を被覆することにより、被覆の安定性は５回 から１０回に増すだけである。しかし、直鎖状のポリ（ＡＡＥＥ）と組み合わせ てＣｏｂｂの方法を使用すると、１００回もの実施の後でもＥＥＯフラックスは 表れない（表Ｉ）。

ＥＥＯ”フラックスに対する毛管被覆のタイプの影響架橋剤のタイプ　ポリマー 鎖のタイプ　電気泳動の回数−５ｉ−０−３ｔ−ポリ（アクリル１ミド）　５− ５ｉ−０−５ｉ−ポ１バＮ−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル−アクリル１ミ ド）　〉５０ −５ｉ−Ｃミ　ポリアクリルアミド）　１Ｏ−５ｉ−Ｃミ　ポリ（Ｎ−（２−七 ドロＮジェトキシ）エチル−アクリル１ミド）　＞１００ ”ＥＥＯ：電気浸透フラックス ポリ（ＡＡＥＥ）でできたマトリックスは、化学的に架橋したポリマーおよび未 架橋のポリマーの両方として、被覆だけでなく。

ＣＺＥにおける充填ポリマーとしても使用することができる。他に類を見ない用 途は、粘稠な溶液としての、すなわち、液状で直鎖状の未架橋ポリマーとしての 、　゛からみ合いしきい値°を越える濃度でのそれらの用途である。このような 充填材は、普通ＣＺＥ中の電気回路を混乱させる、高電界中でのポリマーの網状 構造のひずみや気泡の形成が起こらないため、ＣＺＥに非常に有用である。図５ は、１０％の粘稠な（未架橋）ポリ（ＡＡＥＥ）溶液中で、大きさが１２５塩基 対（ｂｐ）から２２，２２６ｂｐまでの範囲のＤＮＡ断片を分離する例を示す。

このエレクトロフェログラムは、５．１および４．９ｋｂｐの断片が一つの領域 にともに移行するところの、欄準アガロースゲル中でも達成することができない 分離である、混合物に含まれる１３個の断片すべての完全な分解を示す。

また、本発明においては、望ましくない毒性の遊離アクリルアミドモノマーを除 去するための方法を提案する。゛化学的°または°物理的°ゲルのいずれかを重 合させると、１０〜１５％もの未反応モノマーが液相中に残る。このようなモノ マーは、タンパク質と反応し、それらの残基（たとえば、−３Ｈ基、末端−ＮＨ ，、Ｌｙｓの５−アミノ基、Ｈｉｓのイミダゾール部分）を改質することがある 。さらに、これらは、核酸の検出に典型的な波長である２６０ｎｍで強い吸収を 示す。開いたゲルスラブの中では、洗浄によってこれらを除去してもよいけれど も（完全に除去することができる保証はないが）、密閉系の中（たとえば毛管充 填中）においては、簡単な拡散法は存在しない。このような場合（また、アクリ ルアミドの完全な除去が必要な場合、たとえば等電膜法および予備的な電気泳動 法の場合）、マトリックス（または粘稠な溶液）中でスルフィドリル化合物を電 気泳動的に駆動しく弱アルカリ性のｐＨ値、たとえばｐＨ８，５〜９で）、−５ Ｈ基がアクリルアミドの二重結合に完全に付加されるまで、そのようなスルフィ ドリル化合物を反応させることからなる化学掃去法が見出された。そして、この ようにして形成された付加物を、電気泳動的に駆動して、分離カラムの外に追い 出すことができる。このような掃去法の例を図６に示す。

アクリルアミド−Ｃｙｓ付加物の後方の境界線が毛管から出現するにつれて、バ ックグラウンド吸光度が急激にゼロに落ち込むことがわかる。システィン、チオ グリコール酸および他のスルフィドリル化合物を用いても、同一の結果が得られ る。この掃去法はまた、電界の非存在において、たとえば、容器から取り出すこ とができるすべてのゲルマトリックスに適用することもできる。

側方凝集（ｌａｔｅｒａｌｌｙ　ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）ポリアクリルアミドマ トリックス ポリアクリルアミドのポロシティ−を増すための周知の方法は、％Ｔ（−官能性 および二官能性のモノマーの総量）を一定に維持しながら、高い％Ｃ（＝架橋剤 ）を利用することからなる。高い％Ｃ（〉５０％）では、ポリアクリルアミドマ トリックスがきわめて高いポロシティ−（５００ｎｍまでの孔径）をもつように なることが実証されており［Ａ、　Ｂｉａｎｃｈｉ　Ｂｏｓｉｓｉｏ、　Ｃ，Ｌ ｏｅｈｅｒｌｅｉｎ　、　Ｒ，Ｓ。

５ｎｙｄｅｒおよびＰ、　Ｇ、　Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏ ｇｒ、　１８９　（１９８０）３１？−３３０３、これが、このようなマトリッ クスを、大きなＭｒのＤＮＡ断片とウィルス粒子との分画にとって興味深いもの にする。

残念ながら、このようなマトリックスは、高い％Ｃでは疎水性になり、重力場で 崩壊し、水をしみ出させるため、界面動電法には用いられない。発明者らは、こ こに、ポリアクリルアミドマトリックスに高いポロシティ−を与えるための新規 な方法を記載する。この方法は、発生状態の鎖を側方に凝集させる特別な薬剤を 、重合するモノマー混合物に添加することからなる。このような薬剤は一般に、 特定の濃度でモノマー混合物に添加されると、分子鎖を凝集させて、普通のポリ アクリルアミドゲルの直径（約０．５％ｍと思われる）よりもずっと大きな直径 の繊維を有するゲル網を形成させる親水性のポリマー（たとえば、ポリエチレン グリコール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシメチルセルロース）である。必 然的に、これはポロシティ−の増大を伴う。架橋度の高いゲルとは対照的に、側 方に凝集したゲルは、水和水をしみ出させず、崩壊する傾向を示さない。一般に 、このようなゲルは、異なる量の、通常は０．５〜１０％の側方凝集剤の存在に おいて重合される。重合を、一定量のそのような薬剤の存在においてではなく、 その勾配の存在において実施するならば（たとえば、１０．０００Ｄａの平均分 子量をもつポリエチレングリコール、ＰＥＧ）、広範囲の分子の大きさにわたっ て最適な分離を可能にするポロシティ−勾配をゲルに得ることが可能である。こ のような側方凝集ゲルは、大きさにおいて数百〜数千の塩基対（ｂｐ）にまで及 ぶＤＮＡ断片の分離に利用されてきた。これらの実験は、従来のポリアクリルア ミド（４％Ｔ）およびアガロースゲル（１，２％）の両方と並行的に実施された ものである。分解能は、対数（ｂｐ）　（横軸）を移動距離に対してプロットす ることにより、片対数グラフで表す。回帰線の傾きが、いかなるゲルのタイプに おける分画にも有用な範囲を示す。図７の実施例においては、従来のポリアクリ ルアミドゲルにおいて有用な分画範囲は約５０〜約１，０ＯＯｂｐに及び、一方 、１．２％アガロースは、約５００〜約１０，０ＯＯｂｐのＭ、の範囲を包含す ることがわかる。２本の線は、準平行な傾きを有し、分子の大きさの尺度の約１ オーダの距離をおいて位置する。同じポリアクリルアミドゲルは、側方凝集剤の 存在下において重合すると、他の２本の線の間を斜めに横切り、２００〜４．０ ＯＯｂｐの範囲の分子の大きさを最適なやり方で包含する。このように、そのよ うな側方凝集ゲルが。

ポリアクリルアミドとアガロースとの間の°暗い°領域、すなわち、ポリアクリ ルアミドがあまりにもふるいにかけすぎ、アガロースのポロシティ−が高すぎる ところのＭ、値の範囲を包含しうることがわかる。側方凝集ゲルは、標準条件の もとで重合された同等なゲルに比べて、一般に２オーダだけ高いポロシティ−を 有する。

たとえば、従来の６％Ｔ、４％Ｃのゲルは、約５〜６ｎｍの平均孔径を有する。

逆に、ｌＯ％ＰＥＧ−１０にの存在で重合された同じゲルは、走査型電子顕微鏡 で見ると、約５００ｎｍの平均ポロシティ−を示す。このようなポロシティ−の 高いゲルは、最小限のふるい分けを必要とする技術、たとえば等電集束法および 固定化されたｐｉ（勾配における支持体のマトリックスとして有用であるだけで な（、たとえば膜装置に基づく電気泳動法またはクロマトグラフィー法における 膜としても有用である。最近、このような方法の一つである、多室型電解槽中で の等電膜によるタンパク質の等電集束法（固定化ｐｏ勾配の概念に基づ（）が記 載された（Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、　Ｐ。

Ｇｏ、Ｗｅｎｉｓｃｈ、　Ｅ、およびＦａｕｐｅｌ、　Ｍ、、Ｊ、　（：ｈｒｏ ｍａｔｏｇｒ、　４７５．１９８９゜２９３−３０９　）。この機器の速度制限 要因の一つは、室から室へのタンパク質の移行を相当に遅らせる膜の多孔度（ｐ ｏｒｏｓｉｔｙ）である。これらの膜が°側方凝集°ゲルでできたものであった とき、タンパク質の移行は約１オーダだけ増大した。

ポリアクリルアミドマトリックスの光重合最近、標準的な酸化還元の対（過硫酸 塩とＴＥＭＥＤ）で重合されたマトリックスにおいては、アミノ基（第一級〜第 三級）を含むすべての緩衝液（たとえば等電集束法のための担体両性電解質緩衝 液、Ｐ、　Ｇ、　Ｒｉｇｈｅｔｔｉ％ｌ５ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｆｏｃｕｓｉｎ ｇ：　Ｔｈｅｏｒｙ。

Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅ ｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８３または固定化ｐＨ勾配のためのＩｍｍｏｂｉ ｌｉｎｅ緩衝液、Ｐ、　Ｇ、　Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｐ ＨＧｒａｄｉｅｎｔｓ：　Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、　 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。

Ａｍ’ｓｔｅｒｄａｍ、　１９９０　）が、Ｎ−酸化物の生成とともに酸化され るということが実証された［Ｐ、　Ｇ、　Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、　Ｍ、　Ｃｈｉａ ｒｉ　、　Ｅ、　Ｃａ５ａｌｅおよびＣ，Ｃｈｉｅｓａ　、　Ａｐｐｌｉｅｄ　 Ｔｈｅｏｒ、　Ｅｌｅｃｔｒ、　１　（１９８９）　１１５−１２１；Ｇ、Ｃｏ ５５ｕ、Ｍ、Ｇ、Ｐｉｒａｓｔｒｕ、Ｍ、５ａｔｔａ、Ｍ、Ｃｈｉａｒｉ　、Ｃ ，ＣｈｉｅｓａおよびＰ、　Ｇ、　Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔ ｏｇｒ、　４７５　（１９８９）　２８３−２９２１゜電気泳動による移行の前 に過剰の過硫酸塩を陽極に放出するときでさえ、このようにして生成されたＮ− 酸化物はゲルの中に残り、電気泳動の実施の間にタンパク質の−ＳＨ基を酸化さ せて、人工生成物を生成することができる。化学重合に代わる方法は、たとえば リボフラビン（またはりボフラビンー５゛−ホスフェート）と光の存在における 光重合である。この方法は、過去に広範囲にわたって研究されてきたが、その低 い収率（モノマーのポリマーマトリックスへの転換率〈６０％、それに対して、 過硫酸塩重合における転換率〉９０％）のために放棄されたものである（Ｐ、　 Ｇ、　Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、Ｃ，Ｇｅ１ｆｉおよびＡ、　Ｂｉａｎｃｈｉ−Ｂｏｓ ｉｓｉｏ、　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　２．１９８１゜２９１−２９５ 　）。本発明においては、〉９８％の転換率（過硫酸塩を用いる場合をも越える ）を可能にする最適な光重合条件が初めて記載される。このような条件は、 ａ）大きめの出力（＞１００Ｗ）およびよりきわたった紫外線スペクトル（ＵＶ −Ａ）をもつ光源を利用しく過去に記載された標準的な条件は、１６Ｗのネオン 電球を用いるものであった）；および／または ｂ）特に低いワット数の電球で実施するときに、光重合温度を〉５０℃に高める ことを含む。

本発明に記載された新たな条件は、光重合を、現在まで利用されてきた酸化還元 化学よりも有効な方法にする。光重合には、もう一つの大きな利点、つまり、重 合処理の間の酸化力の完全な欠如という利点が加えられている。図８は、このよ うな現象の一例を示す。

第三級アミン（ｐに７．０のＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅの類似物、アクリル二重結合 をもたない）を、過硫酸塩／ＴＥＭＥＤの対、またはりボフラピンと光のいずれ かにより、標準条件（いずれの場合も５０℃で１時間）のもとで温度した。反応 後、ＣＺＥによって第三級アミンを分析した。図８Ａに示すように、ｐＫ７．ｏ の化合物のピークは、第二のピークを生み出す（ＮＭＲ分析により、Ｎ−酸化物 に帰属する）。このＮ−酸化物種は、光重合された生成物のエレクトロフェログ ラムにはまったく見られない。リボフラビンでの光重合に加えて、発明者らは、 トルエンスルフィン酸ナトリウムおよび塩化ジフェニルヨードニウム（通常はそ れぞれ１ｍＭおよび５０ＫＭ）の存在において、メチレンブルー（たとえば５０ ＫＭ）を用いる光重合からなる、もっとも効率的なシステムをここに報告する。

このシステムは、リボフラビン重合と同じ利点（すなわち、酸化力の欠如）を有 し、それに加えて、過硫酸塩重合の場合よりも優れた粘弾性をもつゲルを生成す る（図９を参照）。

本発明による新規なマトリックスの製造に関するいくつかの非制限的な例を、以 下に報告する。

実施例１ Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル−アクリルアミドの合成 次のようにして、上記のモノマーを得た。ＣＨｘ　Ｃ１−１２０ｍＬに、アミノ エトキシエタノール２０ｍＬ（０，２７８ｍｏｌ）およびトリエチルアミン２７ ．６ｍＬ　（０，１９８ｍｏｌ）を加えた。この溶液を塩化アクリロイル１６ｍ ｌ　（０，１９８ｍｏｌ）で滴下処理しく約０℃で）、室温で約２時間攪拌を続 けた。沈殿した塩をろ過したのち、ＮａＣ１の存在下に、有機相をｐＨ５，５の リン酸塩緩衝液で洗浄した（２回、それぞれ１００ｍ１）。ＮａｔＳＯ４上で乾 燥させたのち、有機溶媒の最後の残留物を回転エバポレータで蒸発させた。この 生成物を、溶離剤としてのＣＨＣｌ３／ＣＨ，０Ｈ（７：３、その後９：１）中 、ＴＬＣによって分析した。収量：約８ｇ、この生成物をシリカカラム上で精製 し、まずＣＨ，ＣＩ□／ＣＨ，ＯＨ（９５：　５）　で、次にｃＨｉ　Ｃ１，／ ＣＨ，０Ｈ（９：１）で溶離させた。

この同じ方法により、Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルメタクリルアミド およびＮ、Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアクリルアミドを得た。

実施例２ トリス酢酸エステル緩衝液４０ｍＭ、酢酸ナトリウム２０ｍＭおよびＥＤＴＡ２ ｍＭ中、ｐＨ８，４で、Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）エチルアクリルアミド クリルアミドもしくはＤＨＥＢＡまたはビスアクリロイルピペラジンもしくは同 様な化合物のような架橋剤４％を使用）を調製した。この溶液を水流ポンプで１ ｕ分間脱ガスし、ついでＴＥＭＥＤ（ゲル化溶液１ｍｌあたり１μｌ）を加えた 。この溶液を二つのアリコートに分け、一方をＰＥＧ−１０に中で０、２％にし 、もう一方をＰＥＧ−１　０に中で２％にした。各溶液１０ｍＬっづを２室型勾 配ミキサに移し、ゲル化溶液１ｍＬあたり１０ｍＬの４％過硫酸アンモニウムを 加えた（攪拌しながら）。２個の弁を開放し、電気泳動カセットを、一定のモノ マー濃度で、直線的勾配（０．２〜２％のＰＥＧ−１０Ｋ）２０ｍＬで満たした 。室温で１時間重合した後、図５の解説に記載のようにして．ＤＮＡ断片の電気 泳動分離を実施した。同様にして、しかしＰＥＧ−１０にの非存在において、ポ リアクリルアミド対照物を重合した。Ｎ−　（２−ヒドロキシエトキシ）エチル アクリルアミドまたはアクリルアミド−Ｎ，Ｎ−ジェトキシエタノールを使用す ると、同様な結果が得られた。この種のマトリックス（一定のポロシティ−また は可変性のポロシティ−のいずれでも）は、洗浄し、乾燥させ、所望の添加物（ たとえば簡易的な溶剤、８Ｍ尿素、イオン系、非イオン系または両イオン系の洗 剤、担体両性電解質などまたはそれらの混合物）で再び膨潤させた後に利用する ことができる。

実施例３ 実施例２と同様に、しカルＰＥＧ−１０にの非存在において実施した。発明者ら の新規な分類のＮ−モノおよびジ−置換アクリルアミドによって得られるマトリ ックスは、ＰＥＧ−１０にの存在にょる大きめの孔をもたなくても、きわめて耐 アルカリ加水分解性であり、長期間の貯蔵に対して優れていることが見出された 。

実施例４ 本発明に記載されたモノマーは、実施例２のように（ＰＥＧ−１０にの存在また は非存在のいずれにおいても）、反応促進剤としてのＴＥＭＥＤｏ、４ｕｌ／１ ｍＬと、ゲル化溶液１ｍＬあたり２、３２　Ｘ　１０−’ｍＭｏ１の最終濃度の りボフラビン（もしくはりボフラビンー５′−ホスフェート）とを加えることに より、光重合させることができた。光重合は、室温で１０５ＷのＵＶ−Ａ灯から １０ｃｍ離れたところで、あるいは、７０℃で１６Ｗのネオン灯の正面で、１時 間続けて実施した。あるいはまた、光重合は、メチレンブルー５０μＭ、トルエ ンスルフィン酸ナトリウム１ｍＭおよび塩化ジフェニルヨードニウム５０μＭの 存在において実施した。また、この場合、ゲルをただちに使用することもできる し、洗浄し、乾燥させ、実施例２に記載されたような所望の添加物の存在におい て、再び膨潤させることによる将来の使用に備えて貯蔵することもできる。

解説 図１ 種々のアクリルアミドモノマーの加水分解速度。０．ＩＮのＮａＯＨ中、７０℃ で表示の時間、加水分解を実施した。量は、各時点でトリブリケートを取り出し 、中和し、ＣＺＥ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｐ／ＡＣＥ　）に注入することによっ て評価した。条件：１００ｍＭのホウ酸塩−ＮａＯＨ緩衝液、ｒ＋Ｈ９，ｏ、１ ５ｋＶ、８６μＡ、２５℃。長さ５０ｃｍ、内径７５μｍの被覆のない石英ガラ ス毛管。ＢｅｃｋｍａｎシステムＧｏｌｄを用いるピーク積分（内部標準として マンデル酸を使用した）。略号：Ａｃｒニアクリルアミド、ＤＭＡ：Ｎ、Ｎ−ジ メチルアクリルアミド、ＡＣＭニアクリロイルモルホリン、ｄｄ−Ｔｒｉｓニジ デオキシトリスアクリル、Ｔｒｉｓ−Ａｓトリスアクリル。トリス−Ａ（および 他すべてのタイプのアクリルアミド糖類も同様）は零次の崩壊速度を示し、一方 、他の大部分のモノ−およびジー置換モノマー（未置換アクリルアミドを含む） は−次反応速度を示すことに注意されたい。比較すると、崩壊速度は、ここに提 案する新規な分類のＮ−置換モノマ−１たとえばＡＡＥＥ　（アクリルアミド− Ｎ−エトキシエタノール）については、それほど顕著ではなかった。

図２ ポリマーゲルへのモノマーの崩壊速度。種々のモノマーをビーズ状に重合しく乳 化重合による）、０．ＩＮのＮａＯＨ中、７０℃で表示の時間加水分解に付し、 加水分解生成物について分析した。前端分析により、アミド結合の加水分解によ って生成した遊離アクリル酸残渣を滴定することによって、ビーズにおける加水 分解を評価した。本発明において提案された新規なモノマー、たとえばアクリル アミド−Ｎ−エトキシエタノールのきわめて高い安定性に注目されたい。

図３ 種々のマトリックスの加水分解の検証。ポリアクリルアミド（ＦＡＡ）およびポ リアクリルアミド−Ｎ−エトキシエタノール（ＡＡＥＥ）ゲルを、３ｉｎｄ−３ ｉｌａｎｅで被覆したガラス上に流延し、０．１ＭのＮａＯＨ中、７０℃で２０ 分間加水分解に付した（曲線１）。何度も洗浄し、乾燥させたのち、ゲルを２％ のｐＨ３〜１０の担体両性電解質の中で再び膨潤させ、等電集束に付した（１５ ００Ｖ、４℃で２時間）。電極の距離に沿ってゲルをスライスし、ｌｏｍＭＮａ ｃｌの３００μＬ中で平衡化したのち、ｐＨを測定した。ポリ（ＡＡＥＥ）マト リックスのきわめて高い安定性に比較して、ＦＡＡゲル中のｐＨ勾配の扁平化し た顕著な酸性化（アクリル酸のｐＫ値であるｐＨ４，７に変曲点がある）に注目 されたい。ポリアクリルアミドゲルはまた、１００ｍＭのトリスホウ酸塩緩衝液 中、ｐＨ８，５で一夜装置しただけで、実に安定であるように見える（曲線２） 。

図４ ７種のアクリルアミドポリマーの疎水性の尺度。これは、室温で水／ｎ−オクタ ノール中で分配を行い、二つの相の濃度をＣＺＥによって定量することによって 得た。条件ニホウ酸塩−ＮａＯＨ緩衝１Ｍ　１００ｍＭ、　ｐＨ９、０，１５ｋ Ｖ、８６ｕＡ、２５℃。長さ５０ｃｍ、内径７５μｍの石英ガラス毛管。Ｂｅｃ ｋｍａｎシステムＧｏｌｄを用いるピーク積分（内部標準としてｐＫ９．３のＩ ｍｍｏｂｉｌｉｎｅを使用した）。

略号：ＴｒｉｓＡ：）リスアクリル、ＡＥＥ　ニアクリルアミド−Ｎ−エトキシ エタノール、Ａｃｒニアクリルアミド、ＭＭＡ　：モノメチルアクリルアミド、 ＤＭＡ：Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ａ　ＣＭ　ニアクリロイルモルホリ ンシトリスアクリル。

図５ 直鎖状ポリ（ＡＡＥＥ）の粘稠な溶液におけるＤＮＡ制限断片の分離。ＡＡＥＥ の１０％溶液を、架橋剤の非存在下に、毛管中で重合した。未反応モノマーを除 去したのち（図６を参照）、毛管をトリスホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．　５）　１ 　０　０ｍＭおよびＥＤＴＡ２ｍＭ中で、電気泳動的に平衡化した。ＤＮＡ制限 断片０．２５μｇ／ｍＬの溶液を、電気泳動（４　０　０　０　Ｖ、７μＡ、３ 秒）によって毛管に導入し、Ｗａｔｅｒｓ　Ｑｕａｎｔａ　４０００ｉ器に入れ て１００ｇｍ　（内径）の石英ガラス毛管の中で、５００Ｖ　（８．８μＡ）で 分離させた（２５８ｎｕｎでの検出）。断片は（左から右に）：１２５、５６４ 、８３１、９４７、１３７５、１５８４、１９０４、２０２７、３５３０、４２ ６８、４９７３、５１４８および２２２２６塩基対（ｂｐ）である。

図６ スルフィドリル化合物による遊離した未反応アクリルアミドの掃去。ゲル（また は粘稠な溶液）を重合させたのち、システィン１００ｍＭを含むトリスホウ酸塩 緩衝液（ｐＨ９．０）２００ｍＭを、毛管中、電気泳動的に１０時間、３ｋＶで 陽極に向かって駆動する。

この処理ののち、陽極容器の溶液をトリスホウ酸塩（ｐＨ９，０）２００ｍＭで 置き換え、電気泳動を４時間、５ｋＶで続けることにより、Ｃｙｓ−アクリルア ミド付加物を追い出す。５０分後、反応生成物の鋭い後方の境界が出現し、吸光 度（ｍＡ、２５４　ｎｍ）がゼロに落ちることに注目されたい、この時点で、毛 管が新たな緩衝液で満たされると、電流（μＡ）は安定化する傾向を見せる。分 析の前に、毛管を所望の作業緩衝液（たとえばＤＮＡ分析の場合、トリスホウ酸 塩（ｐＨ８，５）１００ａ＋Ｍ）中で電気泳動的に平衡化する。

図７ 側方凝集ゲル（４％Ｔ）、標準的なポリアクリルアミドゲル（４％Ｔ）およびア ガロースゲル（１，２％）におけるＤＮＡ断片（二重鎖）の電気泳動の比較。２ 種の異なるポリアクリルアミドゲル中、５０Ｖで３時間、また、アガロースゲル 中、６０Ｖで１時間３０分、一連のＤＮＡ断片（１２３〜６０００ｂｐ）を移行 させる（総試料装填量：ＤＮＡ１．６７μｇ）。ゲルはすべて以下の寸法を有し ていた。７ｘ７ｃｍ、厚さ１．２ｍｍ０試料装填ウエルから各領域の中心までの 移行距離（臭化エチジウム染色によって発現した）を断片の分子量（ｂｐ）の対 数に対してプロットしている。移行緩衝液ニドリス酢酸塩４０ｍＭ、酢酸ナトリ ウム２０ｍＭおよびＥＤＴＡ２ｍＭ、ｐＨ８，４゜側方凝集ゲルは、２室勾配ミ キサから、凝集剤の直線的な勾配（ＰＥＧ−１０に０．２〜５％）の存在におい て、一定のモノマー濃度（４％Ｔ、４％Ｃ）の溶液を溶離させることによって得 た。

図８ 化学重合中のＮ−酸化物の形成。ｐＫ７．０のＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ　（モルホ リノプロピルアセトアミド）の類似物のｌＯａＭの溶液を、過硫酸塩１．２％と ＴＥＭＥＤｌｍＭの存在下、またはりボフラビン（２ｍＭ）と光（１０５Ｗのｔ ＪＶ−Ａ灯）の存在下のいずれかにおいて温室（５０℃で１時間）する、温室の 後、生成物を、リン酸塩緩衝液５０ｍＭ中、ｐＨ７，０で、毛管ゾーン電気泳動 （Ｗａｔｅｒｓ　Ｑｕａｎｔａ４０００）によって分析する（１５ｋＶ、８６μ Ａ　、２５４ｎｍで検出）。

上の区画：過硫酸塩渦電、下の区画：リボフラビン部属。下の区画には、上のエ レクトロフェログラムにはっきりと見えるＮ−酸化物のピークが存在しないこと に注目されたい。メチレンブルー重合によっても同じ結果（酸化力の不在）が得 られる。

図９ メチレンブルー重合（上）、過硫酸塩（中）および側方凝集剤の存在下における 過硫酸塩（下）の場合の曲線における弾性率（Ｅ、　Ｎ／ｃｍ’　）の重合時間 への依存性。最後の場合、２％ポリエチレングリコール１０．０ＯＯＤａの存在 下においてゲルを化学的に重合した。光重合の場合、より遅い速度で平坦部分に 達しているが、最高の弾性特性が示されていることに注目されたい。

ド嵌φ謀栄 ド　昼子余謀 −〜 中隔＄拐 Ｓｌｒ’ｌＶ　２−０＄　Ｘ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３０／８８ 　Ｊ　８３１０−２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ｈ丁Ｃ，ＮＬ、　ＳＥ）、 ＣＡ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　Ｍ Ｒ，ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３ ，ＦＩ、　ＨＵ。

ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ ，ＲＵ、ＳＤ、ＵＳ Ｉ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．式（Ｉ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、Ｒは、水素またはＣＨ２を表 し、Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素または式−［（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ ２）ｎ−Ｏ］ｎＨ（式中、ｎ＝２または３であり、Ｎ＝１〜５、好ましくは１で ある）で示される基を表すが、ただし、Ｒ１およびＲ２の一方は水素とは異なる ）を有するモノマーの（共）重合によって、あるいは、同モノマーと他の（メタ ）アクリルアミドとの共重合によって得られる、界面動電法またはクロマトグラ フィー法に使用するための、ポリ−（Ｎ−置換）アクリルアミドマトリックス。
2. ２．Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル（メタ）アクリルアミドまたはＮ、 Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエトキシ）エチル（メタ）アクリルアミドの重合によっ て、あるいは、該モノマーとＮ、Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドとの共重 合によって得られる請求の範囲第１項記載のマトリックス。
3. ３．毛管ゾーン電気泳動を含むすべての界面動電的分離法のための、請求の範囲 第１項または第２項記載のマトリックスの使用。
4. ４．−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−結合を形成する二官能性試薬を使用するか、直接的な− Ｓｉ−Ｃ≡結合を形成する二官能性試薬を使用するかのいずれかによって毛管ゾ ーン電気泳動の毛管の内壁を被覆するための、あるいは、毛管を充填するための 、いずれも架橋したマトリックスまたは未架橋の粘稠な溶液としての、式（Ｉ） で示されるモノマーの使用。
5. ５．毛管ゾーン電気泳動を用いるか、ゲルスラブもしくはシリンダーを用いるか のいずれかによる、核酸配列決定およびＤＮＡ断片分析を含むすべての界面動電 法における、また、ドデシル硫酸ナトリウム電気泳動によってタンパク質分子の 大きさを測定するための、および固定化ｐＨ勾配を含むすべての集束技術のため の、請求の範囲第１項または第２項記載のマトリックスの使用。
6. ６．側方鎖凝集をもたらす親水性ポリマーの存在における（共）重合によって得 られる請求の範囲第１項または第２項記載のマトリックス。
7. ７．一定濃度または変動する濃度の側方凝集剤でゲルを（共）重合させることを 特徴とする請求の範囲第６項記載のマトリックス。
8. ８．側方鎖凝集剤としてポリエチレングリコールおよびポリビニルビロリドンの 群の親水性ポリマーを使用することを特徴とする請求の範囲第６項または第７項 記載のマトリックス。
9. ９．従来の等電集束法および固定化ｐＨ勾配を包含する、高ポロシティー支持体 上でのすべてのタイプの電気泳動のための、請求の範囲第６項〜第８項のいずれ か一項に記載のマトリックスの使用。
10. １０．クロマトグラフィーまたはろ過の目的の膜としての、請求の範囲第６項〜 第８項のいずれか一項に記載のマトリックスの、単独での、あるいは他の膜の上 に被覆されての使用。
11. １１．タンパク質を精製するための、該タンパク質調製物から発熱因子、核酸断 片およびウイルス粒子を除去するのための多室電解槽における、一般に耐引裂き 性の支持体に被覆された等電緩衝膜としての、請求の範囲第６項〜第８項のいず れか一項に記載のマトリックスの使用。
12. １２．式（Ｉ）で示されるモノマーの光（共）重合によって得られる請求の範囲 第１項または第２項記載のマトリックス。
13. １３．リポフラビンの存在において、ワット数＞５０−ＷのＵＶ−Ａ灯を用いて 、および／または＞５０℃の温度で、光（共）重合を実施することを特徴とする 請求の範囲第１２項記載のマトリックス。
14. １４．メチレンブルーならびにトルエンスルフィン酸ナトリウムおよび塩化ジフ ェニルヨードニウムの存在において光共重合を実施することを特徴とする請求の 範囲第１２項記載のマトリックス。
15. １５．すべての界面動電法（可溶性両性緩衝液の存在における、または固定化ｐ Ｈ勾配を用いての等電集束法を包含する）のための長期貯蔵のためのゲルスラブ であって、溶剤で含浸された状態で貯蔵されるか、洗浄および乾燥ののち、使用 の際に再び膨潤させるためのゲルスラブを調製するための、請求の範囲第１項記 載の式（１）で示されるアクリルアミドの使用。
16. １６．クロマトゲラフィーピースを製造するための、請求の範囲第１項記載の式 （Ｉ）で示されるアクリルアミドの、単独で、またはプラスチックもしくはガラ スのビースヘの被覆としての、あるいはアガロースもしくは他の親水性ポリマー と混合されての使用。
17. １７．該マトリックスが、未反応アクリルアミドの二重結合に付加され、それを 破壊することができる１種以上の化学的掃去剤で処理されていることを特徴とす る‘化学的′または‘物理的′ゲルとしての請求の範囲第１項または第２項記載 のマトリックス。
18. １８．請求の範囲第１項記載の式（Ｉ）で示される（メタ）アクリルアミド。