JPH02156892A - 光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法 - Google Patents
光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法Info
- Publication number
- JPH02156892A JPH02156892A JP63311030A JP31103088A JPH02156892A JP H02156892 A JPH02156892 A JP H02156892A JP 63311030 A JP63311030 A JP 63311030A JP 31103088 A JP31103088 A JP 31103088A JP H02156892 A JPH02156892 A JP H02156892A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- esterase
- group
- plasmid
- microorganism
- hydroxycarboxylic acid
- Prior art date
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- Granted
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、一般式
％式％
（式中Ｒ，はアルキル基、アリール基、アラルキル基ま
たはアリールオキシル基、Ｒ２は低級アルキル基、ＣＩ
〜４（メチル基、エチル基等）を示す）で表わされるヒ
ドロキシカルボン酸エステルを不斉加水分解するエステ
ラーゼ（エステラーゼと略す）遺伝子ＤＮＡをベクター
プラスミドに連結した組換え体プラスミドを宿主微生物
に導入した形質転換微生物による、一般式 ％式％ （ＩＩ） ＲＩ−ＣＨ−ＣＯＯＨ （式中Ｒ１はアルキル基、アリール基、アラルキル基ま
たはアリールオキシル基を示す）で表わされる光学活性
ヒドロキシカルボン酸の製造法に関する。
たはアリールオキシル基、Ｒ２は低級アルキル基、ＣＩ
〜４（メチル基、エチル基等）を示す）で表わされるヒ
ドロキシカルボン酸エステルを不斉加水分解するエステ
ラーゼ（エステラーゼと略す）遺伝子ＤＮＡをベクター
プラスミドに連結した組換え体プラスミドを宿主微生物
に導入した形質転換微生物による、一般式 ％式％ （ＩＩ） ＲＩ−ＣＨ−ＣＯＯＨ （式中Ｒ１はアルキル基、アリール基、アラルキル基ま
たはアリールオキシル基を示す）で表わされる光学活性
ヒドロキシカルボン酸の製造法に関する。
［従来の技術］
光学活性α−ヒドロキシカルボン酸誘導体の簡便な製造
法として、エステル加水分解能を有する菌を用いてラセ
ミ体エステルより製造する方法が知られている（特開昭
６３−６３３９７号）。しかし、同様の方法を光学活性
α−ヒドロキシカルボン酸の製造に利用した例はない。
法として、エステル加水分解能を有する菌を用いてラセ
ミ体エステルより製造する方法が知られている（特開昭
６３−６３３９７号）。しかし、同様の方法を光学活性
α−ヒドロキシカルボン酸の製造に利用した例はない。
本発明の特徴は、光学活性α−ヒドロキシカルボン酸を
微生物（及び酵素）を変換反応を利用し製造すること、
かつ遺伝子工学的手法により活性を増幅した菌を用いる
ことにある。
微生物（及び酵素）を変換反応を利用し製造すること、
かつ遺伝子工学的手法により活性を増幅した菌を用いる
ことにある。
遺伝子組換えの方法でクローン化されたエステラーゼ遺
伝子によるヒドロキシカルボン酸エステルの不斉加水分
解では、菌体内に多数の遺伝子を存在させることができ
るため微生物の触媒能力を従来の方法に比して飛躍的に
増大させることが期待できる。そこで、本発明者らは鋭
意研究を行いシュードモナス・フルオレッセンス（ｐ３
Ｂ（Ｉｄｏｍｏｎａｓｆ １ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のエ
ステラーゼ遺伝子をニジエリシア・コリ （Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のベクタープラスミドｐＵｃ
１８およびｐＵｃ１９に挿入して組換えプラスミドを得
、これをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに導入する
ことによりエステラーゼ遺伝子を発現させて本発明を完
成するに至った。
伝子によるヒドロキシカルボン酸エステルの不斉加水分
解では、菌体内に多数の遺伝子を存在させることができ
るため微生物の触媒能力を従来の方法に比して飛躍的に
増大させることが期待できる。そこで、本発明者らは鋭
意研究を行いシュードモナス・フルオレッセンス（ｐ３
Ｂ（Ｉｄｏｍｏｎａｓｆ １ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のエ
ステラーゼ遺伝子をニジエリシア・コリ （Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のベクタープラスミドｐＵｃ
１８およびｐＵｃ１９に挿入して組換えプラスミドを得
、これをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに導入する
ことによりエステラーゼ遺伝子を発現させて本発明を完
成するに至った。
本発明の、一般式
％式％
（式中、Ｒ１はアルキル基、アリール基、アラルキル基
またはアリールオキシル基、Ｒ２は低級アルキル基、０
１〜４（メチル基、エチル基等）で表わされるヒドロキ
シカルボン酸エステルに、微生物由来の該ヒドロキシカ
ルボン酸エステルを不斉加水分解するエステラーゼの遺
伝子ＤＮＡをベクタープラスミドに連結した組換え体プ
ラスミドをで形質転換された形質転換微生物の菌体また
は菌体処理物を作用させて、一般式 （式中、Ｒ１はアルキル基、アリール基、アラルキル基
またはアリールオキシル基）で表わされる光学活性ヒド
ロキシカルボン酸を製造する方法である。
またはアリールオキシル基、Ｒ２は低級アルキル基、０
１〜４（メチル基、エチル基等）で表わされるヒドロキ
シカルボン酸エステルに、微生物由来の該ヒドロキシカ
ルボン酸エステルを不斉加水分解するエステラーゼの遺
伝子ＤＮＡをベクタープラスミドに連結した組換え体プ
ラスミドをで形質転換された形質転換微生物の菌体また
は菌体処理物を作用させて、一般式 （式中、Ｒ１はアルキル基、アリール基、アラルキル基
またはアリールオキシル基）で表わされる光学活性ヒド
ロキシカルボン酸を製造する方法である。
式■のヒドロキシカルボン酸は光学活性を有する種々の
生理活性物質を合成するための原料として利用されてい
る。
生理活性物質を合成するための原料として利用されてい
る。
そして、上記組換え体プラスミドは下記で表わされるア
ミノ酸配列またはその一部の配列を含むエステラーゼ活
性を持ったベブタイドをコードするＤＮＡ遺伝子を含む
ものである。
ミノ酸配列またはその一部の配列を含むエステラーゼ活
性を持ったベブタイドをコードするＤＮＡ遺伝子を含む
ものである。
Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ
Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ｔｈｒ ｌ１ｅ
Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ ５ｅｒ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ
Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ
Ｇｉｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ
八ｒｇ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ ｌ１ｅ
Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
＾ｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
１１ｅ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ
１１ｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ
ｌｉｅ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ
ｌｉｅ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｈｉｓ
Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｇｉｎ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
１６１１ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｐｒ。
１１ｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｐｒ。
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
１１ｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ａｒｇ ｌ１ｅ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ ５ｅｒ
Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ
Ｇｉｎ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｐｒ。
Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｈｉｓ
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Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ａｒｇ Ｐｒ。
Ｐｒｏ Ｓｅｒ
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Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｇｉｎ
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Ｖａｌ Ｐｈｅ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ
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八ｌａ ５ｅｒ
Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｇｌｙ
Ａｒｇ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｉｌｅ
更に、エステラーゼ活性を持ったベプタイドをコードす
るＤＮＡ配列の例としては下記のものが挙げられる。
るＤＮＡ配列の例としては下記のものが挙げられる。
ＡＴＧ ＡＣＣＧＡＡ ＣＣＣＴＴＧ ＡＴＴ
ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＡ
ＧＣＡ ＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＴＴ ＡＴＣＴＧＧ
ＣＴＧ ＣＡＴ ＧＧＣＣＴＧ ＧＧＣＧＣ
ＣＧＡＴ ＣＧＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧ ＣＣ
Ｇ ＧＴＧＧＣＣＧＡＡ ＧＣＧ ＣＴＧ ＣＡＧ
ＧＡＡ ＡＣＣＴＴＧ ＣＴＧ ＡＧＣＡＣＣＣＧＣＴ
ＴＴ ＧＴＴ ＴＴＧ ＣＣＣＣＡＧ ＧＣＣＣＣＣＡ
ＣＧ ＣＧＣＣＣＧＧＴＧ ＡＣＧ ＡＴＴ Ａ
ＡＴ ＧＧＣＧＧＣＴＡＣＧＡＧ ＡＴＧ ＣＣ
Ｇ ＡＧＣＴＧＧ ＴＡＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧ ＧＣ
ＣＡＴＧ ＡＧＣＣＣＧ ＧＣＣＣＧＴＴＣＧ ＡＴ
ＣＡＧＣＣＴＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＴＧ Ｇ
ＡＡ ＡＣＧ ＴＣＧ ＧＣ八へＡＡ ＡＣＧ
ＧＴＴ ＡＣＧ ＧＡＣＣＴＧ ＡＴＣＧＡ
Ｇ ＡＣＡ ＣＡＡ ＣＡＧＡＧＡ ＡＣＣＧＧ
Ａ ＡＴＡ ＧＡＣＡＣＴ ＴＣＧ ＣＧＡ ＡＴＴ
ＴＴＣＣＴＣＧＣＴ ＧＧＴ ＴＴＴ ＴＣＴ ＣＡＡ
ＧＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧ ＧＴＴ ＴＴＴＣＡＣＡ
ＣＣＧＣＧ ＴＴＣＡＡＧ ＡＡＡ ＴＧＧ
ＧＡＧ ＧＧＧ ＣＣＣＴＴＧＧＧＣＧＧＴ Ｇ
ＴＧ ＡＴＣＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＡＴ Ｇ
ＣＧ ＣＣＣＡＣＣＴＴＣＧＡＴ ＡＡＴ ＧＡ
ＣＣＴＧ ＣＡＡ ＴＴＡ ＴＣＣＧＣＣＡＧＣ
ＣＡＧ ＣＡＡ ＣＧＣＡＴＣＣＣＴ ＡＣＧ
ＣＴＣＴＧＣＣＴＧ ＣＡＣＧＧＣＣＡＧ ＴＡ
ＣＧＡＣＧＡＡ ＧＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ Ａ
ＡＣＧＣＣＡＴＧ ＧＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＴＡＣ
ＧＡＧ （、ＡＴ ＴＴＧ Ａへ＾ ＧＧＣＣＧ
Ｔ ＧＧＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧ ＡＣＡ ＴＧＧ
ＣＡＧ ＧＡＡ ＴＡＣＣＣＡ ＡＴＧ
ＧＧＣＣＡＣＧＡＡ ＧＴＧ ＴＴＡ ＣＣＣＣ
へへ ＧＡＧ ＡＴＡ ＣＡＣＧＡＴ ＡＴＣＧ
ＧＣＧＣＣＴＧＧ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ
ＣＧＧ ＣＴＧ ＣＧＣ本発明におけるＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｉ Ｆ０３０
８１のエステラーゼ遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉへのクローニングは次のようにして行われる。
ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＣＡ
ＧＣＡ ＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＴＴ ＡＴＣＴＧＧ
ＣＴＧ ＣＡＴ ＧＧＣＣＴＧ ＧＧＣＧＣ
ＣＧＡＴ ＣＧＣＴＡＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧ ＣＣ
Ｇ ＧＴＧＧＣＣＧＡＡ ＧＣＧ ＣＴＧ ＣＡＧ
ＧＡＡ ＡＣＣＴＴＧ ＣＴＧ ＡＧＣＡＣＣＣＧＣＴ
ＴＴ ＧＴＴ ＴＴＧ ＣＣＣＣＡＧ ＧＣＣＣＣＣＡ
ＣＧ ＣＧＣＣＣＧＧＴＧ ＡＣＧ ＡＴＴ Ａ
ＡＴ ＧＧＣＧＧＣＴＡＣＧＡＧ ＡＴＧ ＣＣ
Ｇ ＡＧＣＴＧＧ ＴＡＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧ ＧＣ
ＣＡＴＧ ＡＧＣＣＣＧ ＧＣＣＣＧＴＴＣＧ ＡＴ
ＣＡＧＣＣＴＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＴＧ Ｇ
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ＴＧ ＡＴＣＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＡＴ Ｇ
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へへ ＧＡＧ ＡＴＡ ＣＡＣＧＡＴ ＡＴＣＧ
ＧＣＧＣＣＴＧＧ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ
ＣＧＧ ＣＴＧ ＣＧＣ本発明におけるＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｉ Ｆ０３０
８１のエステラーゼ遺伝子のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉへのクローニングは次のようにして行われる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓより
Ｔｈｏｍａｓらの方法（Ｃａｎｔｏｎｉ ａｎｄ Ｄａ
ｖｉｅｓ ｅｄ、 ”Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｉｎ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
” Ｖｏｌ、１ ｐ５３５．Ｈａｒｐｅｒａｎｄ
Ｒｏｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６））にしたがって
染色体ＤＮＡを調製する。これを制限酵素ＥｃｏＲＩで
完全分解しＤＮＡ断片を得る。一方、ベクタープラスミ
ドｐＵｃ１８を同酵素で切断する。ｐＵｃ１８はそのマ
ルチクローニング部位にのみ一ケ所のＥｃｏＲＩ切断部
位を有する。ＥｃｏＲＩ切断により直線状となったｐＵ
、ｃ１８とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｓ Ｉ Ｆ ０３０８１からのＤＮＡ断片とを混ぜ
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで末端を結合させることにより雑
種ＤＮＡを形成させる。これを、あらかじめＣａＣｌ２
処理により外来ＤＮＡを受は入れやすくした宿主微生物
のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の一
つであるＪＭ１０９株に導入する。ｐｔＪｃ１８を含む
ＪＭ１０９株をアンピシリンとＩＰＴＧＳＸＧａ １を
含むＬＢ寒天培地で増殖させるとＪＭ１０９株内で発現
されたβ−ガラクトシダーゼ活性によりＸＧａ １が切
断され青色のコロニーを形成する。ここでｐＵｃ１８の
マルチクローニング部位に外来ＤＮＡ断片が挿入された
場合はβ−ガラクトシダーゼ活性は発現されずコロニー
は無色になる。従って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆ ｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のエステラーゼ遺伝子を発現
する形質転換株を選び出すために、アンピシリンとＩＰ
ＴＣ；、ＸＧａ １を含むＬＢ寒天培地において無色の
コロニーを選択し、そのうちでエステラーゼ活性を発現
する株をスクリーニングする。エステラーゼ遺伝子を持
つＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３株
の検索は以下のように行う。１０ｍＭ ）リス−ＨＣ１
（ｐＨ７，５）、０．０１％ブロモクレゾールパープル
、１％（±）−β−アセチルチオ−α−メチルプロピオ
ン酸メチルを染み込ませた口紙にコロニーを移し室温に
て数時間放置する。エステラーゼ活性を持つコロニーは
酸を生成しコロニー付近のｐＨは低下する。ｐＨ指示薬
であるブロモクレゾールパープルは青紫色から黄色に変
化するため、肉眼観察によりエステラーゼ遺伝子を持つ
株を得ることが出来る。
Ｔｈｏｍａｓらの方法（Ｃａｎｔｏｎｉ ａｎｄ Ｄａ
ｖｉｅｓ ｅｄ、 ”Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓｉｎ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
” Ｖｏｌ、１ ｐ５３５．Ｈａｒｐｅｒａｎｄ
Ｒｏｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６））にしたがって
染色体ＤＮＡを調製する。これを制限酵素ＥｃｏＲＩで
完全分解しＤＮＡ断片を得る。一方、ベクタープラスミ
ドｐＵｃ１８を同酵素で切断する。ｐＵｃ１８はそのマ
ルチクローニング部位にのみ一ケ所のＥｃｏＲＩ切断部
位を有する。ＥｃｏＲＩ切断により直線状となったｐＵ
、ｃ１８とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｎｓ Ｉ Ｆ ０３０８１からのＤＮＡ断片とを混ぜ
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで末端を結合させることにより雑
種ＤＮＡを形成させる。これを、あらかじめＣａＣｌ２
処理により外来ＤＮＡを受は入れやすくした宿主微生物
のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２株の一
つであるＪＭ１０９株に導入する。ｐｔＪｃ１８を含む
ＪＭ１０９株をアンピシリンとＩＰＴＧＳＸＧａ １を
含むＬＢ寒天培地で増殖させるとＪＭ１０９株内で発現
されたβ−ガラクトシダーゼ活性によりＸＧａ １が切
断され青色のコロニーを形成する。ここでｐＵｃ１８の
マルチクローニング部位に外来ＤＮＡ断片が挿入された
場合はβ−ガラクトシダーゼ活性は発現されずコロニー
は無色になる。従って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆ ｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のエステラーゼ遺伝子を発現
する形質転換株を選び出すために、アンピシリンとＩＰ
ＴＣ；、ＸＧａ １を含むＬＢ寒天培地において無色の
コロニーを選択し、そのうちでエステラーゼ活性を発現
する株をスクリーニングする。エステラーゼ遺伝子を持
つＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３株
の検索は以下のように行う。１０ｍＭ ）リス−ＨＣ１
（ｐＨ７，５）、０．０１％ブロモクレゾールパープル
、１％（±）−β−アセチルチオ−α−メチルプロピオ
ン酸メチルを染み込ませた口紙にコロニーを移し室温に
て数時間放置する。エステラーゼ活性を持つコロニーは
酸を生成しコロニー付近のｐＨは低下する。ｐＨ指示薬
であるブロモクレゾールパープルは青紫色から黄色に変
化するため、肉眼観察によりエステラーゼ遺伝子を持つ
株を得ることが出来る。
この形質転換株から再びプラスミドＤＮＡを取り出し、
これを種々の制限酵素で切断し、より小さなりＮＡ断片
を持つプラスミドを作成する。これらのプラスミドによ
って形質転換された株のエステラーゼ活性の有無によっ
て、エステラーゼ遺伝子の位置を知ることが出来る。本
発明では、エステラーゼ遺伝子をｐＵｃ１９上の１ａｃ
ＵＶ５プロモーターの支配化におくことにより、形質転
換株のエステラーゼ活性を親株のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｉ Ｆ ０３０８１の持
つ活性に対し飛躍的に上げることが出来る。
これを種々の制限酵素で切断し、より小さなりＮＡ断片
を持つプラスミドを作成する。これらのプラスミドによ
って形質転換された株のエステラーゼ活性の有無によっ
て、エステラーゼ遺伝子の位置を知ることが出来る。本
発明では、エステラーゼ遺伝子をｐＵｃ１９上の１ａｃ
ＵＶ５プロモーターの支配化におくことにより、形質転
換株のエステラーゼ活性を親株のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｉ Ｆ ０３０８１の持
つ活性に対し飛躍的に上げることが出来る。
本発明のエステラーゼ遺伝子の供与微生物としてはシュ
ードモナス属の微生物の他にニジエリシア属、スタフィ
ロコッカス属、アルカリ土類金属、ストレプトマイセス
属、ノカルデイア属、マイコバクテリア属、トルロプシ
ス属、バシルス属、アスペルギルス属、キャンディダ属
、ポツリチス属、オフィロルス属、ケトミウム属または
タラトスポリウム属に属する微生物が挙げられ、具体的
にはそれぞれニジエリシア・コリＩ Ｆ ０１３５００
、スタフィロコッカス・アウレウスＩ Ｆ ０１２７
３２ 、ストレプトマイセス・グリセウスＩ Ｆ ０３
３５５、ノカルデイア・エルスロポリスＴ Ｆ ０１２
５３８ 、マイコバクテリウム・フレイＩ Ｆ ０１３
１６０ 、ストレプトマイセス・タラブリゲルスＩ Ｆ
０１３３０７、トルロプシス・グロベンギエセリＩ
Ｆ ００６５９、バチルス・ズブチリス・パール・ニガ
ーＩＦ○３１０８、アスペルギルス・ソージャエＴ Ａ
Ｍ２７０３、キャンディダ・ルゴーザＩ Ｆ ００７
５０．ポツリチス・シネリア■ＡＭ５１２６、オフィロ
ラス・ミャビアヌスＩＡＭ８０５３、ケトミウム・セミ
スピレールＩ Ｆ ０８３６３、及びタラトスボリウム
・レシナエー・ファーアペラネウムＨＵ Ｔ５０５０が
挙げられる。
ードモナス属の微生物の他にニジエリシア属、スタフィ
ロコッカス属、アルカリ土類金属、ストレプトマイセス
属、ノカルデイア属、マイコバクテリア属、トルロプシ
ス属、バシルス属、アスペルギルス属、キャンディダ属
、ポツリチス属、オフィロルス属、ケトミウム属または
タラトスポリウム属に属する微生物が挙げられ、具体的
にはそれぞれニジエリシア・コリＩ Ｆ ０１３５００
、スタフィロコッカス・アウレウスＩ Ｆ ０１２７
３２ 、ストレプトマイセス・グリセウスＩ Ｆ ０３
３５５、ノカルデイア・エルスロポリスＴ Ｆ ０１２
５３８ 、マイコバクテリウム・フレイＩ Ｆ ０１３
１６０ 、ストレプトマイセス・タラブリゲルスＩ Ｆ
０１３３０７、トルロプシス・グロベンギエセリＩ
Ｆ ００６５９、バチルス・ズブチリス・パール・ニガ
ーＩＦ○３１０８、アスペルギルス・ソージャエＴ Ａ
Ｍ２７０３、キャンディダ・ルゴーザＩ Ｆ ００７
５０．ポツリチス・シネリア■ＡＭ５１２６、オフィロ
ラス・ミャビアヌスＩＡＭ８０５３、ケトミウム・セミ
スピレールＩ Ｆ ０８３６３、及びタラトスボリウム
・レシナエー・ファーアペラネウムＨＵ Ｔ５０５０が
挙げられる。
本発明で用いるベクターは例えばｐ Ｕ Ｃ１Ｂ＋ ｐ
ＵＣｌ３及びＭ１３ｍ ｐ １８であって、その制限
酵素地図は第１図、第２図及び第３図の通りである。こ
れらはいずれも宝酒造株式会社から購入することができ
る。形質転換される微生物としては、Ｅｓｃｈｅ−ｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｔ Ｊ Ｍ２Ｏ３株が挙げられ、これ
も宝酒造株式会社から購入することができる。また、形
質転換され得る微生物としては上記Ｅｓｃｈｅｒ ｉｃ
ｈ １ａｃｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３株 の他に酵母、枯草
菌、放線菌等が挙げられる。
ＵＣｌ３及びＭ１３ｍ ｐ １８であって、その制限
酵素地図は第１図、第２図及び第３図の通りである。こ
れらはいずれも宝酒造株式会社から購入することができ
る。形質転換される微生物としては、Ｅｓｃｈｅ−ｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｔ Ｊ Ｍ２Ｏ３株が挙げられ、これ
も宝酒造株式会社から購入することができる。また、形
質転換され得る微生物としては上記Ｅｓｃｈｅｒ ｉｃ
ｈ １ａｃｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３株 の他に酵母、枯草
菌、放線菌等が挙げられる。
前記式■及びＨの化合物の置換基Ｒ１のためのアルキル
基としては例えばメチル基、エチル基などが、アラルキ
ル基としては例えばベンジル基が、アリール基としては
例えばフェニル基が、アリールオキシル基としては例え
ばフェノキジル基がそれぞれ挙げられ、そして、ヒドロ
キシカルボン酸エステル（１）としては、例えばマンデ
ル酸メチル、乳酸メチル等が挙げられる。
基としては例えばメチル基、エチル基などが、アラルキ
ル基としては例えばベンジル基が、アリール基としては
例えばフェニル基が、アリールオキシル基としては例え
ばフェノキジル基がそれぞれ挙げられ、そして、ヒドロ
キシカルボン酸エステル（１）としては、例えばマンデ
ル酸メチル、乳酸メチル等が挙げられる。
本発明の形質転換微生物は、これを含む培養液、分離し
た菌体または菌体処理物として用いられる。
た菌体または菌体処理物として用いられる。
これら形質転換微生物の培養は、通常は液体培養で行わ
れるが、固体培養によっても行うことができる。培地と
しては、例えばＬＢ培地が用いられる。培養は１０〜５
０°Ｃの温度で、ｐＨ２〜１１の範囲で行われる。微生
物の生育を促進させるために通気撹拌を行ってもよい。
れるが、固体培養によっても行うことができる。培地と
しては、例えばＬＢ培地が用いられる。培養は１０〜５
０°Ｃの温度で、ｐＨ２〜１１の範囲で行われる。微生
物の生育を促進させるために通気撹拌を行ってもよい。
加水分解反応を行うに際しては、培養の開始時又は途中
で培地にヒドロキシカルボン酸エステル（Ｉ）を添加し
てもよく、あらかじめ微生物を培養したのち培養液にヒ
ドロキシカルボン酸エステル（１）を添加してもよい。
で培地にヒドロキシカルボン酸エステル（Ｉ）を添加し
てもよく、あらかじめ微生物を培養したのち培養液にヒ
ドロキシカルボン酸エステル（１）を添加してもよい。
また増殖した微生物の菌体を遠心分離等により採取し、
これをヒドロキシカルボン酸エステルを含む反応媒体に
加えてもよい。この場合菌体は取り扱い上の便宜から、
乾燥菌体例えば凍結乾燥菌体、噴霧乾燥菌体又は有機溶
媒例えばアセトン、トルエン等で処理した菌体、あるい
は菌体破壊物、菌体抽出物等の菌体処理物を用いること
もできる。反応媒体としては例えばイオン交換水又は緩
衝液が用いられる。反応媒体又は培養液中のヒドロキシ
カルボン酸エステルの濃度は０．０１〜５０重量％が好
ましい。ヒドロキシカルボン酸エステルは水に懸濁した
状態で加えることもできる。メタノール、アセトンなど
の有機溶媒を反応液に加えてエステルの溶解性を向上さ
せることもできる。反応液のｐＨは２〜１１、好ましく
は５〜８の範囲である。反応が進行するに伴い生成した
ヒドロキシカルボン酸により反応液のｐＨが低下してく
るが、この場合は適当な中和剤で最適ｐＨに維持するこ
とが好ましい。反応温度は５〜５０°Ｃである。
これをヒドロキシカルボン酸エステルを含む反応媒体に
加えてもよい。この場合菌体は取り扱い上の便宜から、
乾燥菌体例えば凍結乾燥菌体、噴霧乾燥菌体又は有機溶
媒例えばアセトン、トルエン等で処理した菌体、あるい
は菌体破壊物、菌体抽出物等の菌体処理物を用いること
もできる。反応媒体としては例えばイオン交換水又は緩
衝液が用いられる。反応媒体又は培養液中のヒドロキシ
カルボン酸エステルの濃度は０．０１〜５０重量％が好
ましい。ヒドロキシカルボン酸エステルは水に懸濁した
状態で加えることもできる。メタノール、アセトンなど
の有機溶媒を反応液に加えてエステルの溶解性を向上さ
せることもできる。反応液のｐＨは２〜１１、好ましく
は５〜８の範囲である。反応が進行するに伴い生成した
ヒドロキシカルボン酸により反応液のｐＨが低下してく
るが、この場合は適当な中和剤で最適ｐＨに維持するこ
とが好ましい。反応温度は５〜５０°Ｃである。
反応液又は培養液からの生成物の分離精製は、通常の方
法例えば抽出、再結晶、カラムクロマトグラフィ等によ
り行うことができる。
法例えば抽出、再結晶、カラムクロマトグラフィ等によ
り行うことができる。
参考例１
（組換え体プラスミドの調製）
１） 染色体ＤＮＡの調製：
２００ｍ１のＬＢ培地（１％バタトトリプトン、０．５
％バクトイ−ストエキス、０．５％ＮａＣ１）にＰｓｅ
ｕｄ。
％バクトイ−ストエキス、０．５％ＮａＣ１）にＰｓｅ
ｕｄ。
ｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｉ Ｆ ０３
０８１株を植菌し、−夜培養を行った。培養後、遠心分
離によって菌体を集める。菌体を３０ｍ１のＳ Ｓ Ｃ
（０，１５Ｍ ＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナトリウム
）、２５％ショ糖、１０ｍＭＥＤＴＡに懸濁し、１２ｍ
ｇのリゾチームを加えた後数分間放置し、３ｄの１０％
ＳＤＳを加え撹拌する。３７°ＣＩＯ分間インキュベー
トした後、２４■のプロナーゼＥを加え引き続き３７°
Ｃにて９０分間インキュベートした。これに等容の水及
び２倍容のフェノール（１０ｍＭＴＲＩ ５−ＨＣＩ（
ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡで飽和）を加えゆっくり撹拌
した。室温にて遠心にかけ、水層を取り、再度同フェノ
ールによる抽出を行った。得た水層に等容のクロロホル
ム（０，４％のイソアミルアルコールを含む）を加えゆ
っくり撹拌した。遠心復水層を取り再度同クロロホルム
による抽出を行った。水層に等容のエーテルを加え抽出
操作を行った。水層を取り残存するエーテルを窒素ガス
により除いた後、ＲＮａ ｓ ｅＡを５０μｇ／ｄにな
るように加え３７°Ｃ３０分間インキュベートし、更に
上記プロナーゼＥを１００μｇ／ｄになるように加え３
７°Ｃ３０分間インキュベートした。その後、先に述べ
たようにフェノール抽出を２回、クロロホルム抽出を２
回、エーテル抽出を１回行い、窒素ガス通気によりエー
テルを除いた。水層に２．５倍容のエタノールを加え遠
心によりＤＮＡを回収し乾燥後水に溶解した。
０８１株を植菌し、−夜培養を行った。培養後、遠心分
離によって菌体を集める。菌体を３０ｍ１のＳ Ｓ Ｃ
（０，１５Ｍ ＮａＣ１，１５ｍＭクエン酸ナトリウム
）、２５％ショ糖、１０ｍＭＥＤＴＡに懸濁し、１２ｍ
ｇのリゾチームを加えた後数分間放置し、３ｄの１０％
ＳＤＳを加え撹拌する。３７°ＣＩＯ分間インキュベー
トした後、２４■のプロナーゼＥを加え引き続き３７°
Ｃにて９０分間インキュベートした。これに等容の水及
び２倍容のフェノール（１０ｍＭＴＲＩ ５−ＨＣＩ（
ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡで飽和）を加えゆっくり撹拌
した。室温にて遠心にかけ、水層を取り、再度同フェノ
ールによる抽出を行った。得た水層に等容のクロロホル
ム（０，４％のイソアミルアルコールを含む）を加えゆ
っくり撹拌した。遠心復水層を取り再度同クロロホルム
による抽出を行った。水層に等容のエーテルを加え抽出
操作を行った。水層を取り残存するエーテルを窒素ガス
により除いた後、ＲＮａ ｓ ｅＡを５０μｇ／ｄにな
るように加え３７°Ｃ３０分間インキュベートし、更に
上記プロナーゼＥを１００μｇ／ｄになるように加え３
７°Ｃ３０分間インキュベートした。その後、先に述べ
たようにフェノール抽出を２回、クロロホルム抽出を２
回、エーテル抽出を１回行い、窒素ガス通気によりエー
テルを除いた。水層に２．５倍容のエタノールを加え遠
心によりＤＮＡを回収し乾燥後水に溶解した。
２） エステラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドの
作成：・ 上で得た染色体ＤＮＡに制限酵素ＥｃｏＲＩを作用させ
染色体ＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＵｃ１８
にも同制限酵素を作用させ直鎖上のプラスミドを得た。
作成：・ 上で得た染色体ＤＮＡに制限酵素ＥｃｏＲＩを作用させ
染色体ＤＮＡ断片を得た。一方、プラスミドｐＵｃ１８
にも同制限酵素を作用させ直鎖上のプラスミドを得た。
Ｔ４リガーゼを用い４°Ｃ−夜反応させることにより、
両ＤＮＡ断片の結合を行った。
両ＤＮＡ断片の結合を行った。
３） 組換え体プラスミドのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉへの導入： Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ Ｊ Ｍ２Ｏ３株を
ＬＢ培地で３７°Ｃ２−３時間培養した後集菌し、水冷
した５０ｍＭ ＣａＣ１ｚ溶液に懸濁した。遠心集菌後
、氷冷した５０ｍＭ ＣａＣ１ｚ溶液に再度懸濁し、水
中で３０分間静置した。約１００−２００μ！を試験管
に取り２）で得た組換えプラスミドを加え水中で３０分
間静置した。３７°ｃ２分間加熱しＬＢ培地を１１１１
／加え３７’Ｃ６０分間振盪した。
ｃｏｌｉへの導入： Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ Ｊ Ｍ２Ｏ３株を
ＬＢ培地で３７°Ｃ２−３時間培養した後集菌し、水冷
した５０ｍＭ ＣａＣ１ｚ溶液に懸濁した。遠心集菌後
、氷冷した５０ｍＭ ＣａＣ１ｚ溶液に再度懸濁し、水
中で３０分間静置した。約１００−２００μ！を試験管
に取り２）で得た組換えプラスミドを加え水中で３０分
間静置した。３７°ｃ２分間加熱しＬＢ培地を１１１１
／加え３７’Ｃ６０分間振盪した。
１００ｕｆをＬＢ寒天培地（１００μｇ／Ｉｎｌアンピ
シリン、０．５ｍＭ Ｉ ＰＴＧ、 ０．２％ＸＧａ
ｌを含む）にひろげ３７°Ｃで一夜保ちコロニーを形
成させた。
シリン、０．５ｍＭ Ｉ ＰＴＧ、 ０．２％ＸＧａ
ｌを含む）にひろげ３７°Ｃで一夜保ちコロニーを形
成させた。
青色を呈していない無色のコロニーについて、下記の方
法でエステラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドが導入
されている形質転換株を選択した。
法でエステラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドが導入
されている形質転換株を選択した。
１０ｍＭ ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、０．０１％
ブロモクレゾールパープル、１％（±）−β−アセチル
チオ−α−メチルプロピオン酸メチルを染み込、ませた
口紙にコロニーを移し室温にて数時間放置する。
ブロモクレゾールパープル、１％（±）−β−アセチル
チオ−α−メチルプロピオン酸メチルを染み込、ませた
口紙にコロニーを移し室温にて数時間放置する。
エステラーゼ活性を持つコロニーは酸を生成しコロニー
付近のｐＨは低下する。ｐＨ指示薬であるブロモクレゾ
ールパープルは青紫色から黄色に変化するため、肉眼観
察によりエステラーゼ遺伝子を持つ株を得ることが出来
る。
付近のｐＨは低下する。ｐＨ指示薬であるブロモクレゾ
ールパープルは青紫色から黄色に変化するため、肉眼観
察によりエステラーゼ遺伝子を持つ株を得ることが出来
る。
こうして得られた形質転換微生物（微工研条寄第１４６
８号）を増殖させ、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｒｙの方法
（Ｎｕｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 ７．１５１３〜１５
２３（１９７９））に従いプラスミドを調製し、これに
各種制限酵素を作用させその切断部位を決定した（第４
図）。このプラスミドＤＮＡをｐＦＹ５０１ と命名し
た。
８号）を増殖させ、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｒｙの方法
（Ｎｕｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ、 ７．１５１３〜１５
２３（１９７９））に従いプラスミドを調製し、これに
各種制限酵素を作用させその切断部位を決定した（第４
図）。このプラスミドＤＮＡをｐＦＹ５０１ と命名し
た。
参考例２ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ形質転
換株によるエステラーゼの発現 １）（±）−β−アセチルチオ−α−メチルプロピオン
酸メチルの不斉加水分解： 上記の形質転換株をアンピシリン５０μｇ／−を含む５
００−のＬＢ培地にて３７°Ｃ−夜振盪培養した後、遠
心分離により菌体を得た。この菌体全量を２％（±）−
β−アセチルチル−α−メチルプロピオン酸メチル１５
０ｄに懸濁して、０．ＩＮ ＮａＯＨでｐＨ７，０に制
御しながら、３０°Ｃにて５時間反応を行った。反応終
了後、菌体を遠心分離により除き、上清より未反応のβ
−アセチルチオ−α−メチルプロピオン酸メチルを酢酸
エチルで抽出除去した。
換株によるエステラーゼの発現 １）（±）−β−アセチルチオ−α−メチルプロピオン
酸メチルの不斉加水分解： 上記の形質転換株をアンピシリン５０μｇ／−を含む５
００−のＬＢ培地にて３７°Ｃ−夜振盪培養した後、遠
心分離により菌体を得た。この菌体全量を２％（±）−
β−アセチルチル−α−メチルプロピオン酸メチル１５
０ｄに懸濁して、０．ＩＮ ＮａＯＨでｐＨ７，０に制
御しながら、３０°Ｃにて５時間反応を行った。反応終
了後、菌体を遠心分離により除き、上清より未反応のβ
−アセチルチオ−α−メチルプロピオン酸メチルを酢酸
エチルで抽出除去した。
次いで抽出残液の水層のｐＨを希硫酸で２．０以下に下
げた後、β−アセチルチオ−α−メチルプロピオン酸を
酢酸エチルで抽出した。そしてその抽出液に無水硫酸ナ
トリウムを加えて脱水処理したのち溶媒を蒸発除去し、
油状物を得た。一部を取り水で希釈後ＨＰＬＣによりβ
−アセチルチオ−α−メチルプロピオン酸を定量した。
げた後、β−アセチルチオ−α−メチルプロピオン酸を
酢酸エチルで抽出した。そしてその抽出液に無水硫酸ナ
トリウムを加えて脱水処理したのち溶媒を蒸発除去し、
油状物を得た。一部を取り水で希釈後ＨＰＬＣによりβ
−アセチルチオ−α−メチルプロピオン酸を定量した。
また一部はクロロホルムに溶解し、デジタル自動旋光度
計（日本分光製ＤＩＰ−３６０型）で旋光度を測定した
。
計（日本分光製ＤＩＰ−３６０型）で旋光度を測定した
。
その結果、目的の生成物は２７０■得られ、比旋光度は
［α］６°＝−４８．６ （Ｃ＝１．１０ＣＨｃｔ：＋
で親株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｓ ＩＦ０３０８１株）による生成物の比旋光度−４
８，１とほぼ同等であった。
［α］６°＝−４８．６ （Ｃ＝１．１０ＣＨｃｔ：＋
で親株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｓ ＩＦ０３０８１株）による生成物の比旋光度−４
８，１とほぼ同等であった。
なお、対照実験としては、ベクタープラスミド（ｐＵｃ
１８）による形質転換株を用いたが反応中のＮａＯＨ消
費はなかったし、また目的の生成物も得られなかった。
１８）による形質転換株を用いたが反応中のＮａＯＨ消
費はなかったし、また目的の生成物も得られなかった。
２） プラスミドｐＦＹ５０１上のエステラーゼ遺伝子
の位置及び新しいプラスミドの作成と形質転換株におけ
るエステラーゼ活性の増幅：ｐＦＹ５０１上のエステラ
ーゼ遺伝子の位置を明らかにするため、まずｐＦＹ５０
１を各制限酵素で切断し、得られた親株由来のＤＮＡ断
片をｐＵＣ１８に結合させ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３株に導入した。その中で、４．
９ＫｂＨｉｎｄＩ［［断片を含むプラスミドｐＦＹ５０
３の導入された形質転換株がエステラーゼ活性を保持し
ていた（第５図Ａ）。
の位置及び新しいプラスミドの作成と形質転換株におけ
るエステラーゼ活性の増幅：ｐＦＹ５０１上のエステラ
ーゼ遺伝子の位置を明らかにするため、まずｐＦＹ５０
１を各制限酵素で切断し、得られた親株由来のＤＮＡ断
片をｐＵＣ１８に結合させ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３株に導入した。その中で、４．
９ＫｂＨｉｎｄＩ［［断片を含むプラスミドｐＦＹ５０
３の導入された形質転換株がエステラーゼ活性を保持し
ていた（第５図Ａ）。
更に詳細に検討した結果、４．９ＫｂＨｉｎｄＩＩ［断
片の２．２ＫｂＳｍａＩ断片中にエステラーゼ遺伝子の
存在することが確認された（第５図Ｂ）。この２．２Ｋ
ｂＳｍａｌ断片を持つプラスミドｐＦＹ５１３のエステ
ラーゼ活性がイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド（和光純薬製；略称ＩＰＴＧ）により誘導されるこ
とから、エステラーゼ遺伝子はベクタ一部分にあるＩａ
ｃＵＶ５プロモーター支配下におかれていることが明ら
かとなった。また、このことよりエステラーゼ遺伝子の
方向が確認された。
片の２．２ＫｂＳｍａＩ断片中にエステラーゼ遺伝子の
存在することが確認された（第５図Ｂ）。この２．２Ｋ
ｂＳｍａｌ断片を持つプラスミドｐＦＹ５１３のエステ
ラーゼ活性がイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノ
シド（和光純薬製；略称ＩＰＴＧ）により誘導されるこ
とから、エステラーゼ遺伝子はベクタ一部分にあるＩａ
ｃＵＶ５プロモーター支配下におかれていることが明ら
かとなった。また、このことよりエステラーゼ遺伝子の
方向が確認された。
さらにＳｍａ Ｉ断片の一端からＥｘｏｎｕｃｌｅａｓ
ｅ ＩＩＩ ＋Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ
（宝酒造製ＴＡＫＡＲＡキロシーケンス用プリージョ
ンキット使用）を用いてエステラーゼ遺伝子の５″ ｆ
ｌａｎｋｉｎｇ領域を削り取りｐＦＹ５２０（第６図
）を作成した。このプラスミドｐＦＹ５２０を含む形質
転換株（微工研条寄第１４６９号）もエステラーゼ遺伝
子を持ち、また１ａｃＵＶ５プロモーター支配下にあっ
た。
ｅ ＩＩＩ ＋Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ
（宝酒造製ＴＡＫＡＲＡキロシーケンス用プリージョ
ンキット使用）を用いてエステラーゼ遺伝子の５″ ｆ
ｌａｎｋｉｎｇ領域を削り取りｐＦＹ５２０（第６図
）を作成した。このプラスミドｐＦＹ５２０を含む形質
転換株（微工研条寄第１４６９号）もエステラーゼ遺伝
子を持ち、また１ａｃＵＶ５プロモーター支配下にあっ
た。
ρＦＹ５２０を含む形質転換株について、０．２ｍＭＩ
ＰＴＧ存在下で培養した以外は上記１）と同様な方法に
よりエステラーゼ活性を定量した結果、下記に示した通
りｐＦＹ５０１形質転換株の約１９倍の比活性を持つこ
とが明らかとなった。
ＰＴＧ存在下で培養した以外は上記１）と同様な方法に
よりエステラーゼ活性を定量した結果、下記に示した通
りｐＦＹ５０１形質転換株の約１９倍の比活性を持つこ
とが明らかとなった。
形質転換株 比活性〔ユニ７ ）／ｇ乾燥菌体
］Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＦＹ５０１
２６０Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＦＹ５２０
４９００但し、前述の反応条件下において、初期
１時間に於ける目的の酸１ ｍｇを生成する酵素量を１
ユニツトと定義した。
］Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＦＹ５０１
２６０Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＦＹ５２０
４９００但し、前述の反応条件下において、初期
１時間に於ける目的の酸１ ｍｇを生成する酵素量を１
ユニツトと定義した。
第５図において、（Ａ）活性の有無は実施例１で述べた
ように、ブロモクレゾールパープルの、色の変化を口紙
上で観察することにより求めた。
ように、ブロモクレゾールパープルの、色の変化を口紙
上で観察することにより求めた。
（Ａ）ｐＦＹ５０３（第６図参照）とｐＦＹ５０８はそ
れぞれｐＦＹ５０１からの４．９ Ｋ ｂおよび２．７
Ｋ ｂＨｉｎｄＩＩ［断片をｐＵｃ１８のＨｉｎｄＩ
［Ｉ切断部位に挿入することにより作成した。ｐＦＹ５
０６とρＦＹ５０９はｐＦＹ５０１をそれぞれＨｉｎｄ
Ｉ［［、ＸｈｏＩで切断後、セルフライゲーションによ
り作成した。
れぞれｐＦＹ５０１からの４．９ Ｋ ｂおよび２．７
Ｋ ｂＨｉｎｄＩＩ［断片をｐＵｃ１８のＨｉｎｄＩ
［Ｉ切断部位に挿入することにより作成した。ｐＦＹ５
０６とρＦＹ５０９はｐＦＹ５０１をそれぞれＨｉｎｄ
Ｉ［［、ＸｈｏＩで切断後、セルフライゲーションによ
り作成した。
（Ｂ）ｐＦＹ５１３はｐＦＹ５０３の２．２ Ｋ ｂ
Ｓ ｍ ａ■断片をｐＵｃ１８のＳｍａ Ｉ切断部位に
挿入することにより作成した。ｐＦＹ５１０とｐＦＹ５
１２はｐＦＹ５０３を゛それぞれ５ａｉｌ、ＰｓｔＩで
切断後セルフライゲーションにより作成した（第６図参
照） 参考例３ エステラーゼ遺伝子の塩基配列の決定と予想
されるアミノ酸配列 プラスミドｐＦＹ５２０から更にＨｉｎｃＩＩ−３ｍａ
ｒ領域を欠失したプラスミドｐＦＹ５２５を作成したが
（第６図）、このｐＦＹ５２５の形質転換株も参考例２
の１）に示した方法で試験したところ、エステラーゼ活
性を保持していた。そこで、ｐＦＹ５２５に含まれる親
株由来のＤＮＡ断片の全塩基配列を、Ｍ１３ファージベ
クターを用いたＣｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ法（Ｓ
ａｎｇｅｒ、Ｆ、５ｃｉｅｎｃｅ ２１４．１２０５−
１２１０（１９８１） ）により決定した。その結果、
この親株由来の約ＩＫｂのＤＮＡ断片の塩基配列は第８
回に示した通りであった。この塩基配列中にはエステラ
ーゼ遺伝子をコードしていると想定されるＯｐｅｎｒｅ
ａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅはただ一つしか存在しないこと
、またＰｓｔｌ切断部位より上流を欠いたｐＦＹ５１２
はエステラーゼ活性を持たないこと（第５図Ｂ）および
前述したエステラーゼ遺伝子の方向により、この０ｐｅ
ｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅがエステラーゼ遺伝子
をコードしており、これから予想されるアミノ酸配列ま
たはその一部が目的のエステラーゼのアミノ酸配列であ
ることが、明らかとなった。
Ｓ ｍ ａ■断片をｐＵｃ１８のＳｍａ Ｉ切断部位に
挿入することにより作成した。ｐＦＹ５１０とｐＦＹ５
１２はｐＦＹ５０３を゛それぞれ５ａｉｌ、ＰｓｔＩで
切断後セルフライゲーションにより作成した（第６図参
照） 参考例３ エステラーゼ遺伝子の塩基配列の決定と予想
されるアミノ酸配列 プラスミドｐＦＹ５２０から更にＨｉｎｃＩＩ−３ｍａ
ｒ領域を欠失したプラスミドｐＦＹ５２５を作成したが
（第６図）、このｐＦＹ５２５の形質転換株も参考例２
の１）に示した方法で試験したところ、エステラーゼ活
性を保持していた。そこで、ｐＦＹ５２５に含まれる親
株由来のＤＮＡ断片の全塩基配列を、Ｍ１３ファージベ
クターを用いたＣｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ法（Ｓ
ａｎｇｅｒ、Ｆ、５ｃｉｅｎｃｅ ２１４．１２０５−
１２１０（１９８１） ）により決定した。その結果、
この親株由来の約ＩＫｂのＤＮＡ断片の塩基配列は第８
回に示した通りであった。この塩基配列中にはエステラ
ーゼ遺伝子をコードしていると想定されるＯｐｅｎｒｅ
ａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅはただ一つしか存在しないこと
、またＰｓｔｌ切断部位より上流を欠いたｐＦＹ５１２
はエステラーゼ活性を持たないこと（第５図Ｂ）および
前述したエステラーゼ遺伝子の方向により、この０ｐｅ
ｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅがエステラーゼ遺伝子
をコードしており、これから予想されるアミノ酸配列ま
たはその一部が目的のエステラーゼのアミノ酸配列であ
ることが、明らかとなった。
実施例１ ｐｃＦＯＯ５の作成
プラスミドｐｃＦＯＯ５は以下のようにして得られた（
第７図）。ｐＦＹ５２０を制限酵素ＮａｅＩで切断し、
切断部分に制限酵素旧ｎｄＩＩＩ リンカ−を挿入した
。こうして得られたプラスミドｐｃＦＯＯ１を制限酵素
旧ｎｄＩＩＩで切断し、エステラーゼ遺伝子を含む薬ａ
ｏｏｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断したプラスミドベクターＰＵＣ１８に挿入した
。こうして得られたプラスミドｐＣＦ００５においては
、エステラーゼ遺伝子はベクターｐＵｃ１８由来の１ａ
ｃＵＶ５プロモーター支配下にある。
第７図）。ｐＦＹ５２０を制限酵素ＮａｅＩで切断し、
切断部分に制限酵素旧ｎｄＩＩＩ リンカ−を挿入した
。こうして得られたプラスミドｐｃＦＯＯ１を制限酵素
旧ｎｄＩＩＩで切断し、エステラーゼ遺伝子を含む薬ａ
ｏｏｂｐのＤＮＡ断片を得た。この断片をＨｉｎｄＩＩ
Ｉで切断したプラスミドベクターＰＵＣ１８に挿入した
。こうして得られたプラスミドｐＣＦ００５においては
、エステラーゼ遺伝子はベクターｐＵｃ１８由来の１ａ
ｃＵＶ５プロモーター支配下にある。
実施例２
組換え体プラスミドｐｃＦＯＯ５のＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉへの導入 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３株を
ＬＢ培地で３７°Ｃ２−３時間培養した後集菌し、氷冷
した５０ｍＭ ＣａＣ１ｚ溶液に懸濁した。遠心集菌後
、水冷した５０ｍＭ ＣａＣＩｚ溶液に再度懸濁し、水
中で３０分間静置した。約１００−２００μｌを試験管
に取り実施例１で得た組換えプラスミドｐｃＦＯＯ５を
加え水中で３０分間静置した。
ｉａｃｏｌｉへの導入 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３株を
ＬＢ培地で３７°Ｃ２−３時間培養した後集菌し、氷冷
した５０ｍＭ ＣａＣ１ｚ溶液に懸濁した。遠心集菌後
、水冷した５０ｍＭ ＣａＣＩｚ溶液に再度懸濁し、水
中で３０分間静置した。約１００−２００μｌを試験管
に取り実施例１で得た組換えプラスミドｐｃＦＯＯ５を
加え水中で３０分間静置した。
３７°Ｃ２分間加熱しＬＢ培地を１ｒｎ１加え３７°Ｃ
６０分間振盪した。１００μｆｆｉをＬＢ寒天培地（ｌ
ｏＯｕｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にひろげ３７°Ｃ
で一夜保ちコロニーを形成させた。
６０分間振盪した。１００μｆｆｉをＬＢ寒天培地（ｌ
ｏＯｕｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にひろげ３７°Ｃ
で一夜保ちコロニーを形成させた。
微生物のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ１
０９／ ｐ ＣＦ ００５は微工研条寄第２１６６号と
して寄託されている。
０９／ ｐ ＣＦ ００５は微工研条寄第２１６６号と
して寄託されている。
実施例３
Ｊ Ｍ１０９／ ｐ Ｆ Ｙ５２５およびＪ Ｍ １０
９／ ｐ ＣＦ ００５によるマンデル酸メチルの不斉
加水分解Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ１
０９／ ｐ Ｆ Ｙ５２５およびＪＭ１０９／ ｐ Ｃ
Ｆ ００５を１００／ｄのＬＢ培地（０，１ｍＭのＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）を含む）
で３７°Ｃ１１５時間培養後、菌体を遠心により回収し
た。遺伝子供与菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｓＩ Ｆ ０３０８１は、１００ｄの
肉エキス培地で２５°Ｃ１４０時間培養後、同様にして
菌体を回収した。これらを冷水に懸濁し、その一部を反
応に用いた。
９／ ｐ ＣＦ ００５によるマンデル酸メチルの不斉
加水分解Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ１
０９／ ｐ Ｆ Ｙ５２５およびＪＭ１０９／ ｐ Ｃ
Ｆ ００５を１００／ｄのＬＢ培地（０，１ｍＭのＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）を含む）
で３７°Ｃ１１５時間培養後、菌体を遠心により回収し
た。遺伝子供与菌であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｓＩ Ｆ ０３０８１は、１００ｄの
肉エキス培地で２５°Ｃ１４０時間培養後、同様にして
菌体を回収した。これらを冷水に懸濁し、その一部を反
応に用いた。
１戚の０．１ Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０
）１％Ｄ、Ｌ−マンデル酸メチルに菌体？Ａ濁液を加え
、３０°Ｃで反応を行った。反応液の菌体濃度はＥ、ｃ
ｏｌｉ Ｊ Ｍ１０９／ ｐＦ Ｙ５２５およびＪ
Ｍ１０９／ ｐＣＦ００５については０．３５１１１ｇ
／ｍＬ Ｉ Ｆ ０３０８１については５．０ｍｇ／
ｍに設定した（いずれも乾燥重量）。
）１％Ｄ、Ｌ−マンデル酸メチルに菌体？Ａ濁液を加え
、３０°Ｃで反応を行った。反応液の菌体濃度はＥ、ｃ
ｏｌｉ Ｊ Ｍ１０９／ ｐＦ Ｙ５２５およびＪ
Ｍ１０９／ ｐＣＦ００５については０．３５１１１ｇ
／ｍＬ Ｉ Ｆ ０３０８１については５．０ｍｇ／
ｍに設定した（いずれも乾燥重量）。
途中５０μ２のサンプリングを数回行い４５０μｇの０
．２Ｎ塩酸に加えることにより反応を停止させた。
．２Ｎ塩酸に加えることにより反応を停止させた。
反応停止後、基質および生成物を高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）により分析し、マンデル酸メチルか
らマンデル酸への変換率を算出した。
フィー（ＨＰＬＣ）により分析し、マンデル酸メチルか
らマンデル酸への変換率を算出した。
（条件）
カラム： ＯＤＳ−８０ＴＭ （東ソー■）溶 媒：メ
タノール；水；りん酸； （５０１５０１０，０２５）
温度：４０°Ｃ 流速：１戚／ｍｉｎ 検 出： ２５４ｎｍ また、生成物（マンデル酸）立体異性はＣＨＩＲＡＬＰ
ＡＣＫ−ＷＨカラム（ダイセル化学工業■）を用いたＨ
ＰＬＣにより分析した。その結果、Ｌ−マンデル酸メチ
ルが選択的に加水分解されることがわかった。
タノール；水；りん酸； （５０１５０１０，０２５）
温度：４０°Ｃ 流速：１戚／ｍｉｎ 検 出： ２５４ｎｍ また、生成物（マンデル酸）立体異性はＣＨＩＲＡＬＰ
ＡＣＫ−ＷＨカラム（ダイセル化学工業■）を用いたＨ
ＰＬＣにより分析した。その結果、Ｌ−マンデル酸メチ
ルが選択的に加水分解されることがわかった。
（条件）
溶 媒：０．２５ｍＭ硫酸銅
流速： ｌ Ｉｎ１／ｍｉｎ
検 出： ２５４ｎｍ
第１表に変換率および生成したマンデル酸の光学純度の
経時変化を示す。
経時変化を示す。
また、−分間に１μｍｏ＋のマンデル酸を生成する活性
を１ユニツトとすると、Ｊ Ｍ１０９／ ｐ Ｆ Ｙ５
２５およびＪ Ｍ１０９／ ｐ ＣＦＯＯ５、Ｉ Ｆ
０３０８１の比活性はそれぞれ１．１．１．４．０．０
０８ユニット／■乾燥菌体となった。
を１ユニツトとすると、Ｊ Ｍ１０９／ ｐ Ｆ Ｙ５
２５およびＪ Ｍ１０９／ ｐ ＣＦＯＯ５、Ｉ Ｆ
０３０８１の比活性はそれぞれ１．１．１．４．０．０
０８ユニット／■乾燥菌体となった。
第１表
第２表
実施例４
Ｊ Ｍ１０９／ ｐ ＣＦＯＯ５による乳酸エステルの
不斉加水分解 実施例２と同様にした得られた菌体を反応に用いた。１
Ｉｎ１．の０． Ｉ Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，０）−１％Ｄ、Ｌ乳酸メチルに菌体懸濁液を加え、
３０″Ｃ１時間反応を行った。反応後、実施例３と同様
にして分析を行った。ＯＤＳカラムでの検出には２１０
ｎｍを使用した。
不斉加水分解 実施例２と同様にした得られた菌体を反応に用いた。１
Ｉｎ１．の０． Ｉ Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，０）−１％Ｄ、Ｌ乳酸メチルに菌体懸濁液を加え、
３０″Ｃ１時間反応を行った。反応後、実施例３と同様
にして分析を行った。ＯＤＳカラムでの検出には２１０
ｎｍを使用した。
実施例５
酵素の精製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｔ Ｊ Ｍ１０９／
ｐ ＣＦ ００５を３ＬのＬＢ培地（０，１ｍＭのＩＰ
ＴＧを含む）で３７°Ｃ１１５時間培養後、菌体を遠心
により回収した。冷水で２回洗浄した後、約２０ｇの湿
菌体が得られた。菌体を２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液
（ｐ Ｈ８）で懸濁し、セルミル（Ｅｄｍｕｎｄ Ｂｊ
ｉｈｌｅｒ社製、直径０．１ｍｒｎのグラスビーズ使用
）を用いて破壊した。遠心により膜画分を除き、可溶性
画分を２０ｍＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８）に対して
透析した後イオン交換クロマトグラフィーにより分画し
た。イオン交換体は同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセル
ロファイン（生化学工業■）を用い、エステラーゼの溶
出にはＯ−０，８Ｍ塩化ナトリウム濃度匂配を用いた。
ｐ ＣＦ ００５を３ＬのＬＢ培地（０，１ｍＭのＩＰ
ＴＧを含む）で３７°Ｃ１１５時間培養後、菌体を遠心
により回収した。冷水で２回洗浄した後、約２０ｇの湿
菌体が得られた。菌体を２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液
（ｐ Ｈ８）で懸濁し、セルミル（Ｅｄｍｕｎｄ Ｂｊ
ｉｈｌｅｒ社製、直径０．１ｍｒｎのグラスビーズ使用
）を用いて破壊した。遠心により膜画分を除き、可溶性
画分を２０ｍＭＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８）に対して
透析した後イオン交換クロマトグラフィーにより分画し
た。イオン交換体は同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセル
ロファイン（生化学工業■）を用い、エステラーゼの溶
出にはＯ−０，８Ｍ塩化ナトリウム濃度匂配を用いた。
活性画分を濃縮しゲル濾過カラム（東ソー■、Ｇ３００
０ＳＷ）を用いたＨＰＬＣによりさらに精製した。溶媒
としては５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０
）を使用した。
０ＳＷ）を用いたＨＰＬＣによりさらに精製した。溶媒
としては５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０
）を使用した。
こうして得られたエステラーゼをＳＤＳゲル電気泳動で
分析したところ、はぼ単一のバンドを示した。精製エス
テラーゼは以下の実験に用いられた。
分析したところ、はぼ単一のバンドを示した。精製エス
テラーゼは以下の実験に用いられた。
実施例６
精製エステラーゼによる乳酸エステルの不斉加水分解
ｌｄの０．１ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）−
１％Ｄ、Ｌ乳酸メチル（あるいは乳酸エチル）に１Ｍｇ
の精製エステラーゼを加え、３０°Ｃ１３０時間反応さ
せた。反応後、実施例２と同様にして分析を行った。Ｏ
ＤＳカラムでの検出には波長２１０ｎｍを用いた。
１％Ｄ、Ｌ乳酸メチル（あるいは乳酸エチル）に１Ｍｇ
の精製エステラーゼを加え、３０°Ｃ１３０時間反応さ
せた。反応後、実施例２と同様にして分析を行った。Ｏ
ＤＳカラムでの検出には波長２１０ｎｍを用いた。
Ｌ−乳酸エステルが選択的に加水分解をうけＬ〜乳酸が
生成した。第３表に反応３０時間後の変換率および生成
した乳酸の光学純度を示す。
生成した。第３表に反応３０時間後の変換率および生成
した乳酸の光学純度を示す。
第３表
実施例７
精製エステラーゼによる乳酸メチルの不斉加水分解
１成の０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）
−１％Ｄ、Ｌ乳酸メチルに１Ｍｇの精製エステラーゼを
加え、３０°Ｃ１３０時間反応させた。反応後、実施例
５と同様にして分析を行った。結果を第４表に示す。
−１％Ｄ、Ｌ乳酸メチルに１Ｍｇの精製エステラーゼを
加え、３０°Ｃ１３０時間反応させた。反応後、実施例
５と同様にして分析を行った。結果を第４表に示す。
第４表
実施例８
精製エステラーゼによるマンデル酸メチルの不斉加水分
解 １ ｍｌの０．１ Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）−１％Ｄ、Ｌマンデル酸メチルに１Ｍｇの精製エ
ステラーゼを加え、３０″Ｃで反応を行った。途中４０
μ！のサンプリングを数回行い４５０μｌの０．２ Ｎ
塩酸に加えることにより反応を停止させた。分析は実施
例３と同様にして行った。第５表に変換率及び生成した
マンデル酸の光学純度の経時変化を示す。
解 １ ｍｌの０．１ Ｍりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
，０）−１％Ｄ、Ｌマンデル酸メチルに１Ｍｇの精製エ
ステラーゼを加え、３０″Ｃで反応を行った。途中４０
μ！のサンプリングを数回行い４５０μｌの０．２ Ｎ
塩酸に加えることにより反応を停止させた。分析は実施
例３と同様にして行った。第５表に変換率及び生成した
マンデル酸の光学純度の経時変化を示す。
第５表
〔発明の効果〕
本発明により得られる組換え体プラスミドｐＦＹ５０１
、ｐＦＹ５２０、ｐＦ Ｙ５２５ 、ｐ ＣＦＯＯ５お
よびこれにより形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌ、ｉ形質転換株は、ヒドロキシカルボン酸エス
テル（１）を不斉加水分解するエステラーゼ遺伝子を含
有する。そして、ｐｃＦＯ０５等の形質転換株のエステ
ラーゼ活性はその親株のそれに比して飛躍的に増大させ
ることができた。更に、この形質転換株の菌体またはそ
の処理物をヒドロキシカルボン酸エステル（１）に作用
させて光学活性カルボン酸を効率的に得ることができた
。
、ｐＦＹ５２０、ｐＦ Ｙ５２５ 、ｐ ＣＦＯＯ５お
よびこれにより形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌ、ｉ形質転換株は、ヒドロキシカルボン酸エス
テル（１）を不斉加水分解するエステラーゼ遺伝子を含
有する。そして、ｐｃＦＯ０５等の形質転換株のエステ
ラーゼ活性はその親株のそれに比して飛躍的に増大させ
ることができた。更に、この形質転換株の菌体またはそ
の処理物をヒドロキシカルボン酸エステル（１）に作用
させて光学活性カルボン酸を効率的に得ることができた
。
第１図、第２図及び第３図は、それぞれベクター ｐＵ
Ｃ１８，ｐＵ Ｃ１９及びＭ１３ｍ ｐ １８の制限
酵素地図を示す。第４図はエステラーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドｐＦＹ５０１の制限酵素地図を示す。第５図は
ｐＦＹ５０１より作成された欠失プラスミドとエステラ
ーゼ活性を示す。第６図は本発明において使用される主
要プラスミドの作成過程を示す。 第７図はプラスミドｐｃＦＯ０５作成過程を示す。 第８図はｐＦＹ５２５中の親株由来ＤＮＡの全塩基配列
とその中に含まれる０ｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａ
ｍｅがら予想されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す
。
Ｃ１８，ｐＵ Ｃ１９及びＭ１３ｍ ｐ １８の制限
酵素地図を示す。第４図はエステラーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドｐＦＹ５０１の制限酵素地図を示す。第５図は
ｐＦＹ５０１より作成された欠失プラスミドとエステラ
ーゼ活性を示す。第６図は本発明において使用される主
要プラスミドの作成過程を示す。 第７図はプラスミドｐｃＦＯ０５作成過程を示す。 第８図はｐＦＹ５２５中の親株由来ＤＮＡの全塩基配列
とその中に含まれる０ｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａ
ｍｅがら予想されるエステラーゼのアミノ酸配列を示す
。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中Ｒ＿２はアルキル基、アリール基、アラルキル基
またはアリールオキシル基、Ｒ＿２は低級アルキル基Ｃ
＿１＿〜＿４（メチル基、エチル基等）を示す）で表わ
されるヒドロキシカルボン酸エステルに、微生物由来の
該ヒドロキシカルボン酸エステルを不斉加水分解するエ
ステラーゼの遺伝子ＤＮＡをベクタープラスミドに連結
した組換え体プラスミドで形質転換された形質転換微生
物の培養液、菌体または菌体処理物を作用させることを
特徴とする、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中Ｒ＿１はアルキル基、アリール基、アラルキル基
またはアリールオキシル基を示す）で表わされる光学活
性ヒドロキシカルボン酸の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63311030A JP2764814B2 (ja) | 1988-12-10 | 1988-12-10 | 光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63311030A JP2764814B2 (ja) | 1988-12-10 | 1988-12-10 | 光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02156892A true JPH02156892A (ja) | 1990-06-15 |
| JP2764814B2 JP2764814B2 (ja) | 1998-06-11 |
Family
ID=18012267
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63311030A Expired - Fee Related JP2764814B2 (ja) | 1988-12-10 | 1988-12-10 | 光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2764814B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5084387A (en) * | 1990-12-18 | 1992-01-28 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Microbiological hydrolysis for the preparation of (exo,exo)-7-oxabicyclo(2.2.1) heptane-2,3, monoacyl ester dimethanol |
| WO2001032847A1 (en) * | 1999-11-01 | 2001-05-10 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Novel esterases derived from pseudomonas aeruginosa, its gene and process for production of optically active carboxylic acids using them |
| WO2002070726A1 (en) * | 2001-03-07 | 2002-09-12 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for preparation of optically active propoxyaniline derivatives |
| JP2003079392A (ja) * | 2001-09-10 | 2003-03-18 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 光学活性α−トリフルオロメチル乳酸の製造方法 |
| JP2009232693A (ja) * | 2008-03-26 | 2009-10-15 | Daiichi Fine Chemical Co Ltd | 新規加水分解酵素 |
-
1988
- 1988-12-10 JP JP63311030A patent/JP2764814B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5084387A (en) * | 1990-12-18 | 1992-01-28 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Microbiological hydrolysis for the preparation of (exo,exo)-7-oxabicyclo(2.2.1) heptane-2,3, monoacyl ester dimethanol |
| WO2001032847A1 (en) * | 1999-11-01 | 2001-05-10 | Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology | Novel esterases derived from pseudomonas aeruginosa, its gene and process for production of optically active carboxylic acids using them |
| WO2002070726A1 (en) * | 2001-03-07 | 2002-09-12 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for preparation of optically active propoxyaniline derivatives |
| US7217560B2 (en) | 2001-03-07 | 2007-05-15 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for preparation of optically active propoxyaniline derivatives |
| KR100868619B1 (ko) * | 2001-03-07 | 2008-11-13 | 다이이찌 세이야꾸 가부시기가이샤 | 광학활성인 프로폭시아닐린 유도체의 제조방법 |
| JP2003079392A (ja) * | 2001-09-10 | 2003-03-18 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 光学活性α−トリフルオロメチル乳酸の製造方法 |
| JP2009232693A (ja) * | 2008-03-26 | 2009-10-15 | Daiichi Fine Chemical Co Ltd | 新規加水分解酵素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2764814B2 (ja) | 1998-06-11 |
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