JPH0217154B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は蛋白質の精製法に関する。さらに詳し
くは動物臓器、植物、醗酵培養液等に含まれる酵
素等の蛋白質を精製する方法に関する。

動物臓器、植物、醗酵培養液等に含まれる酵素
等の蛋白質を精製する手段として従来より知られ
ているものは、例えば次のごとくである。

(1) 食塩や硫酸アンモニウム等の無機塩を使用す
る塩析法 (2) アセトン、メタノール、エタノール等の有機
溶媒を使用する有機溶媒沈澱法 (3) 結晶化法 (4) イオン交換樹脂による選択的な吸着脱離を利
用して精製する方法 通常工業的にはこれらの方法を適宜組み合わせ
て目的物を精製する。例えば、牛の膵臓を原料と
してトリプシンやキモトリプシンを工業的に製造
する場合には、まず膵臓に含まれる多種類の他の
成分と共に硫酸酸性下で抽出し、次に硫酸アンモ
ニウムで塩析濃縮し、結晶化、脱塩を経て、最終
的には凍結乾燥あるいは噴霧乾燥で目的標品を得
ているのである。

しかしながら、かくのごとき従来技術によつて
製造する場合には、一般に収率が悪く、また後記
実施例において示すごとく混入異種蛋白を完全に
除去することができず、高純度のものが得られな
い状態である。しかし現在、酵素等の異種蛋白質
を生体に投与し、各種疾患を治療する機会が増加
するに伴ない、安全性の面から高純度の製品が提
供されることが望まれているのである。

かかる実情にかんがみ本発明者は蛋白質を効率
よく、しかも高純度に精製する方法について検討
をおこない、その結果、アニオン型カウンターイ
オンを粗蛋白質溶液または移動相に添加した上で
逆相液体クロマトグラフイーを実施すれば、所期
の目的が達成されることを知り本発明を完成し
た。

本発明の特徴は粗蛋白質溶液または移動相にア
ニオン型カウンターイオンを添加し、逆相液体ク
ロマトグラフイーをおこなうことによつて、目的
物を夾雑物から分離する点にある。

すなわち、目的蛋白質と夾雑蛋白質が共存する
場合、通常、両者は逆相系の固定相で分離、保持
されず共存したままであり、分離困難なものであ
る。しかし、ここにアニオン型カウンターイオン
を添加すると、それによつて蛋白質相互間の若干
の等電点の差あるいはアミノ酸組成の差が増幅さ
れ、固定相への保持時間が大きく異なるようにな
り、その結果分離が可能になるのである。つまり
解離状態にある蛋白に対してアニオン型カウンタ
ーイオンを添加するとイオンペアーコンプレツク
スが形成し、蛋白質自体は刺水性を増し逆相固定
相での分離、保持が可能となるのである。

ここでアニオン型カウンターイオンとは解離状
態においてアニオンとなつているものであり、本
発明に係るアニオン型カウンターイオンを与える
代表的物質を示せば次のごとくなる。

１ アルキルスルホン酸塩 メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ペン
タンスルホン酸、ヘプタンスルホン酸、オクタ
ンスルホン酸、ラウリルスルホン酸、カンフア
ースルホン酸等 ２ アルキル硫酸塩 メタン硫酸、ラウリル硫酸 ３ 過塩素酸、リン酸、酢酸等 ４ トリクロル酢酸、トリフルオロ酢酸等 しかし、本発明は上記物質に限定されるもので
はない。また逆相系の固定相となるものはシアノ
プロピル基をシリカゲルに化学結合せしめた充填
剤を使用することができ、入手しうるものの商品
名およびメーカー名を示せば、例えば次のごとく
なる。

μ−Bondapak CN （ウオーターズ） Nucleosil CN （ナーゲル） Polygosil CN （ナーゲル） zorbax CN （デユポン） Unisil CN （ガスクロ工業） Unisil Ｑ CN （ガスクロ工業） CPS−HYPERSIL CN （シヤドン社） SPHERISORB CN （PS） また本発明の対象となる蛋白質については特に
限定はなく、例えばリゾチーム、エラスターゼ、
キモトリプシ等をあげることができる。

蛋白質とアニオン型カウンターイオンとの間の
イオンペアーコンプレツクスの形成は、液体クロ
マトグラフイーの実施に先立ち、粗蛋白質溶液に
アニオン型カウンターイオンを直接添加すること
によつて形成せしめてもよいし、あるいはあらか
じめ蛋白質を固定相に負荷し、アニオン型カウン
ターイオンを移動相に添加しておいて、液体クロ
マトグラフイーが実施される過程で形成せしめて
もよい。

次に逆相液体クロマトグラフイーによつて夾雑
物から分離した目的イオンペアーコンプレツクス
から目的蛋白質を得るためには電気透析あるいは
イオン交換樹脂によるイオン交換によつて強制的
にアニオン型カウンターイオンを脱離除去せしめ
ればよい。イオン交換樹脂を使用する場合には、
例えばアンバーライト120Bおよびアンバーライ
トIRA401等を使用することができる。

最後に、アニオン型カウンターイオンを脱離せ
しめた目的蛋白質は常法により濃縮、凍結乾燥
（噴霧乾燥でもよい）をおこない収得する。

次に本発明の効果を以下に記載する効果例をも
つて示す。

効果例 １ 試 料 実施例１において得られた最終目的物および実
施例１において本発明に係る精製をおこなう以前
の清澄液 方 法 以下に記載するＡ液、Ｂ液、Ｃ液を用意し、Ａ
液、Ｂ液、Ｃ液および水を１：２：４：１の比率
をもつて混合し、脱気後垂直に立てたカラムに注
入し、水を積層してゲル化させ細孔ゲルとした。

細孔ゲル上に50％グリセリン試料溶液（蛋白質
量約50μｇ）を乗せ、その上に泳動用緩衝液を積
層し、電気泳動装置にセツトし、一本当り３ｍＡ
で２時間通電した。ゲルをとり出し、５％トリフ
ロル酢酸液に２時間浸漬後、染色液（アミドブラ
ツク）で一夜染色し、７％酢酸で脱色した。

Ｎ−KOH 4.8ml Ａ液氷酢酸 17.3ml テトラメチルエチレンジアミン 4.0ml 100mlにメスアツプ（PH4.3） Ｂ液アクリルアミド 48.0ｇ ビスアクリルアミド 0.8ｇ 100mlにメスアツプ Ｃ液 過硫酸アンモニウム 0.14ｇ 100mlにメスアツプ（用時調整） なお、泳動用緩衝液は以下のごとくである。

β−アラニン 31.2ｇ 氷酢酸 8.0ml 1000mlにメスアツプ（PH4.5） 結 果 図１に示す。図１より本発明方法により目的エ
ラスターゼが夾雑物より分離精製されたことが判
明する。

効果例 ２ 試 料 実施例２において得られた最終目的物および実
施例２において本発明に係る精製をおこなう以前
の清澄液 方 法 効果例１方法の項に記載と同一の方法 結 果 図２に示す。図２より本発明方法により目的リ
ゾチームが夾雑物より分離精製されたことが判明
する。

以下に記載する実施例をもつて本発明をさらに
詳細に説明する。

実施例 １ できるだけ新鮮な豚膵臓活性化物１Kgを塩化ナ
トリウムを含む３の水でよく撹拌し、懸濁せし
めて内容物を抽出した。次いで硫酸アンモニウム
を抽出物１当り300ｇの割合で添加溶解せしめ、
エラスターゼを多量に含む硫安塩析物を得た。硫
安塩析物を100mlの水に溶解し、不溶物を除去し、
清澄液を得た。

別に固定相としてシリカゲルにシアノプロピル
基を化学結合せしめた担体（商品名Nucleosil
CN）20ｇをカラムに充填し水にてよく洗滌し
た。この固定相に先の清澄液を通過させ、エラス
ターゼおよびその他の蛋白質成分を吸着せしめ
た。次に移動相１を流し、各蛋白質を分割し、
エラスターゼ劃分を分取した。

なお、移動相はカウンターイオンとしてのオク
タンスルホン酸ナトリウム32.4ｇ、アセトニトリ
ル420mlおよび酢酸20mlをもつて調製した。分取
したエラスターゼ劃分について電気透析をおこな
い、共存する電解質やカウンターイオンを除き、
限外過法で濃縮し、凍結乾燥をおこなつて最終
目的物としてのエラスターゼ乾燥物1.5ｇを得た。

実施例 ２ 鶏卵白１Kgを2N−NaOHによりPH9.5に調整
し、50ｇの塩化ナトリウムを加え、４日間５℃で
撹拌し、リゾチームの粗結晶を得た。次いでこの
粗結晶を100mlの水に懸濁し、2N−HClでPH3.5
にして溶解せしめ、不溶物を過して除去し、清
澄液を得た。

別に固定相としてシリカゲルにシアノプロピル
基を化学結合せしめた担体（商品名Nucleosil
CN）30ｇをカラムに充填し、水にてよく洗滌し
た。

この固定相に先の清澄液を通常のカラムクロマ
トグラフイー操作に準じて通過させ、リゾチーム
およびその他の蛋白質成分を吸着せしめた。次い
で移動相１を流し、各蛋白質を分劃し、リゾチ
ーム活性劃分と分取した。

なお、移動相はカウンターイオンとしてのエタ
ンスルホン酸ナトリウム26.4ｇ、アセトニトリル
50mlと酢酸10mlをもつて調製した。

分取したリゾチーム劃分について電気透析をお
こない、共存する電解質やカウンターイオンを除
き、限外過法で濃縮し、凍結乾燥をおこなつて
最終目的としてのリゾチーム乾燥物３ｇを得た。

実施例 ３ 実施例１において、電気透析をおこなう代わり
にアンバーライト120Bおよびアンバーライト
IRA401を用いてイオン交換をおこなつた点を除
いて実施例１記載と同様におこないエラスターゼ
乾燥物を得た。

実施例 ４ 実施例２において、電気透析をおこなう代りに
アンバーライトＢおよびアンバーライトIRA401
を用いてイオン交換をおこなつた点を除いて実施
例２記載と同様におこないエラスターゼ乾燥物を
得た。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１において得られた最終目的物
A₁および実施例１において本発明に係る精製を
おこなう以前の清澄液A₂についてデイスク電気
泳動をおこなつた結果を示すクロマトグラムであ
り、a₀，a₁，a₂およびa₃はエラスターゼ、カルボ
キシペプチダーゼ、キモトリプシンおよびトリプ
シンの各バンドの位置を示す。 図２は実施例２において得られた最終目的物
B₁および実施例１において本発明に係る精製を
おこなう以前の清澄液B₂についてデイスク電気
泳動をおこなつた結果を示すクロマトグラムであ
り、b₀，b₁，b₂およびb₃はリゾチーム、オボアル
ブミン、コンアルブミンおよびオボムコイドの各
バンドの位置を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 逆相系の固定相を使用する液体クロマトグラ
   フイーによつて蛋白質を精製するにあたり、アニ
   オン型カウンターイオンを粗蛋白質溶液または移
   動相に添加して液体クロマトグラフイーをおこな
   い、目的蛋白質を夾雑物から分離し、次にアニオ
   ン型カウンターイオンを除去することを特徴とす
   る蛋白質の精製法。 ２ アニオン型カウンターイオンがアルキルスル
   ホン酸イオンである特許請求の範囲第１項記載の
   蛋白質の精製法。 ３ 逆相系の固定相がシアノプロピル化シリカゲ
   ルである特許請求の範囲第１項および第２項記載
   の蛋白質の精製法。