JPS6234060A - 尿素の定量方法 - Google Patents
尿素の定量方法Info
- Publication number
- JPS6234060A JPS6234060A JP17312485A JP17312485A JPS6234060A JP S6234060 A JPS6234060 A JP S6234060A JP 17312485 A JP17312485 A JP 17312485A JP 17312485 A JP17312485 A JP 17312485A JP S6234060 A JPS6234060 A JP S6234060A
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- Japan
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- ammonia
- urea
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は尿素の定量方法に関するものである。
更に詳細には、本発明は、検体中にすでに存在するアン
モニアをあらかじめ消費させ、尿素を正確に測定する方
法に関するものである。
モニアをあらかじめ消費させ、尿素を正確に測定する方
法に関するものである。
従来、生体に由来する尿、血液等の検体に存在する反応
生成物としてアンモニアを生ずる尿素の定量は尿素と特
異的に反応するジアセチルモノオキシム（Ｆｅａｒｏｎ
反応）を添加し、化学反応により生じた物質の吸収極大
をもって測定する方法があった。しかしながら、この化
学的呈色法は検体中に目的物質と同様の呈色を示す物質
が多数存在するという欠点があって好ましくない。
生成物としてアンモニアを生ずる尿素の定量は尿素と特
異的に反応するジアセチルモノオキシム（Ｆｅａｒｏｎ
反応）を添加し、化学反応により生じた物質の吸収極大
をもって測定する方法があった。しかしながら、この化
学的呈色法は検体中に目的物質と同様の呈色を示す物質
が多数存在するという欠点があって好ましくない。
また、尿素の検出において、アンモニアを生成させ、生
成したアンモニアをＧ２Ｄ）＋ （グルタミン酸脱水素
酵素）によってグルタミン酸に変換し、この際ＮＡＤＨ
（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）→Ｎ
ＡＤ“にコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の共役
反応によって減少するＮＡＤＨの量を３４ｏｎ膿で測定
して定量していた。
成したアンモニアをＧ２Ｄ）＋ （グルタミン酸脱水素
酵素）によってグルタミン酸に変換し、この際ＮＡＤＨ
（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）→Ｎ
ＡＤ“にコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の共役
反応によって減少するＮＡＤＨの量を３４ｏｎ膿で測定
して定量していた。
しかし、この反応系では必ずアンモニアを生成するため
に、そもそも検体中に存在するアンモニアが測定値に含
まれてしまって、正確な定量を困難にしていた。
に、そもそも検体中に存在するアンモニアが測定値に含
まれてしまって、正確な定量を困難にしていた。
そこで、あらかじめ検体中に存在するアンモニアを前処
理でＧｆｌＤ）ｌによってα−ＫＧ （α−ケトグルタ
ル酸）と反応させてグルタミン酸に変換させてしまえば
問題はなくなるのである。そして、このアンモニア→グ
ルタミン酸の系にはＮＡＤ （Ｐ）Ｈ→ＮＡＤ（Ｐ）＋
の変化を伴なうために、ＮＡＤ（Ｐ）＋→ＮＡＤ（Ｐ）
ＩＩの逆反応でＮＡＤ （Ｐ）Ｈに戻す必要があり、こ
の際インクエン酸を基質として１ｃＤｌｌ （イソクエ
ン酸脱水素酵素）とマグネシウムイオン又はマンガンイ
オンなどの金属イオンによって共役反応を生起させるこ
とができる。この反応系は、次の弐〇）に示される。
理でＧｆｌＤ）ｌによってα−ＫＧ （α−ケトグルタ
ル酸）と反応させてグルタミン酸に変換させてしまえば
問題はなくなるのである。そして、このアンモニア→グ
ルタミン酸の系にはＮＡＤ （Ｐ）Ｈ→ＮＡＤ（Ｐ）＋
の変化を伴なうために、ＮＡＤ（Ｐ）＋→ＮＡＤ（Ｐ）
ＩＩの逆反応でＮＡＤ （Ｐ）Ｈに戻す必要があり、こ
の際インクエン酸を基質として１ｃＤｌｌ （イソクエ
ン酸脱水素酵素）とマグネシウムイオン又はマンガンイ
オンなどの金属イオンによって共役反応を生起させるこ
とができる。この反応系は、次の弐〇）に示される。
式（１）に示されるように、検体中のアンモニアの消費
と分解して得たアンモニアの測定は同じ共役反応によっ
て行うことができるのであるが、検体中のアンモニアの
消費が完了したらＮＡＤ （Ｐ）＋→ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの
反応が完全に停止されてはじめて尿素を分解して得たア
ンモニアの正確な定量が行なえるのである。
と分解して得たアンモニアの測定は同じ共役反応によっ
て行うことができるのであるが、検体中のアンモニアの
消費が完了したらＮＡＤ （Ｐ）＋→ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの
反応が完全に停止されてはじめて尿素を分解して得たア
ンモニアの正確な定量が行なえるのである。
そこで、問題となるのは、式（Ｉ）におけるＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ＝＝ＮＡＤ（Ｐ）＋においてＮＡＤ（Ｐ）＋→ＮＡ
Ｄ（Ｐ）ＩＩの反応をいかにして完全に停止させるかで
あった。従来、ＮＡＤ（Ｐ）”→ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの反応
を完全に停止させることは知られていなかった。
）Ｈ＝＝ＮＡＤ（Ｐ）＋においてＮＡＤ（Ｐ）＋→ＮＡ
Ｄ（Ｐ）ＩＩの反応をいかにして完全に停止させるかで
あった。従来、ＮＡＤ（Ｐ）”→ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの反応
を完全に停止させることは知られていなかった。
本発明者らは、上述の式（１）及び式（ＩＩ）における
インクエン酸→αＫＧの反応を完全に停止させＣＤＨ アンモニアを反応生成物とする生体物質を正確に測定す
る方法を求めて鋭意研究したところ、ＡＴＰ又は／及び
キレ−１〜剤の添加によって、ＣＤＨ の反応を完全に停止させることに成功したのである。
インクエン酸→αＫＧの反応を完全に停止させＣＤＨ アンモニアを反応生成物とする生体物質を正確に測定す
る方法を求めて鋭意研究したところ、ＡＴＰ又は／及び
キレ−１〜剤の添加によって、ＣＤＨ の反応を完全に停止させることに成功したのである。
本発明は検体に（ＪＤｌｌ、α−ＫＧ、 ＮＡＤ（Ｐ）
＋１、イソクエン酸、マグネシウムイオンまたはマンガ
ンイオンなどの金属イオン、およびｉＣＤＨを添加混合
し、検体中にすでに存在するアンモニアを消費せしめ、
次いでＡＴＰ又は／及びキレート剤を添加し、１ＣＤＨ
反応を停止し、これと同時もしくはしかる後ウレアーゼ
を添加して、生成するアンモニアを測定することを特徴
とする尿素の定量方法である。
＋１、イソクエン酸、マグネシウムイオンまたはマンガ
ンイオンなどの金属イオン、およびｉＣＤＨを添加混合
し、検体中にすでに存在するアンモニアを消費せしめ、
次いでＡＴＰ又は／及びキレート剤を添加し、１ＣＤＨ
反応を停止し、これと同時もしくはしかる後ウレアーゼ
を添加して、生成するアンモニアを測定することを特徴
とする尿素の定量方法である。
ここで、金属イオンとはマグネシウムイオン、マンガン
イオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオン
、カルシウムイオンなどを云うが、これらのイオン種に
制限されることはない。
イオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオン
、カルシウムイオンなどを云うが、これらのイオン種に
制限されることはない。
また、キレート剤とはＥＤＴＡおよびその塩、■、２−
ビス（０−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、 Ｎ、 Ｎ
’、 Ｎ’−四酢酸およびその塩、トランス−１，２−
シクロヘキサンジアミン−Ｎ、 Ｎ、 Ｎ’、 Ｎ’−
四酢酸およびその塩、ジヒドロキシエチルグリシンおよ
びその塩、１，３−ジアミノプロパノ−ルーＮ、 Ｎ、
Ｎ’、 Ｎ−四酢酸およびその塩、ジエチレントリア
ミン五酢酸およびその塩、エチレンジアミンジオルトヒ
ドロキシフェニル酢酸およびその塩、エチレンジアミン
ニ酢酸およびその塩、エチレンジアミンニプロピオン酸
およびその塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢
酸およびその塩、エチレンジアミンテトラキス（メチレ
ンホスホン酸）およびその塩、グリコールエーテルジア
ミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシエチルイミノニ酢
酸およびその塩、イミノ二酢酸およびその塩、ジアミノ
プロパン四酢酸およびその塩、ニトリロ三酢酸およびそ
の塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、ニトリロ
トリス（メチレンホスホンＭ）およびその塩、トリエチ
レンテトラミン六酢酸およびその塩などを云うが、これ
らのキレート剤に制限されることはない。
ビス（０−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、 Ｎ、 Ｎ
’、 Ｎ’−四酢酸およびその塩、トランス−１，２−
シクロヘキサンジアミン−Ｎ、 Ｎ、 Ｎ’、 Ｎ’−
四酢酸およびその塩、ジヒドロキシエチルグリシンおよ
びその塩、１，３−ジアミノプロパノ−ルーＮ、 Ｎ、
Ｎ’、 Ｎ−四酢酸およびその塩、ジエチレントリア
ミン五酢酸およびその塩、エチレンジアミンジオルトヒ
ドロキシフェニル酢酸およびその塩、エチレンジアミン
ニ酢酸およびその塩、エチレンジアミンニプロピオン酸
およびその塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢
酸およびその塩、エチレンジアミンテトラキス（メチレ
ンホスホン酸）およびその塩、グリコールエーテルジア
ミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシエチルイミノニ酢
酸およびその塩、イミノ二酢酸およびその塩、ジアミノ
プロパン四酢酸およびその塩、ニトリロ三酢酸およびそ
の塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、ニトリロ
トリス（メチレンホスホンＭ）およびその塩、トリエチ
レンテトラミン六酢酸およびその塩などを云うが、これ
らのキレート剤に制限されることはない。
本発明はＡＴＰ又は／及びキレート剤の添加によって上
記式（ｎ）→式（ｍ）への変化を行わせるものである。
記式（ｎ）→式（ｍ）への変化を行わせるものである。
即ち、検体中のアンモニアの完全消費を式（ｎ）で行わ
せ、完全消費ののち反応系にＡＴＰ又は／及びキレート
剤を添加し、ＮＡＤ（Ｐ）＋→ＮＡＤ（Ｐ）ＩＩｃＤＩ
Ｉ の反応を停止させるものである。
せ、完全消費ののち反応系にＡＴＰ又は／及びキレート
剤を添加し、ＮＡＤ（Ｐ）＋→ＮＡＤ（Ｐ）ＩＩｃＤＩ
Ｉ の反応を停止させるものである。
１ｃＤＩＩの反応を停止させた後は、ＡＴＰ又は／及び
キレート剤の添加と同時もしくはその後で検体中にウレ
アーゼを添加し、アンモニアからグルタミン酸への共役
反応としてＮＡＤ（Ｐ）Ｉ（−＋ＮＡＤ（Ｐ）＋の反応
にともなう３４０ｎｍ吸光度の減少によってそれぞれの
物質を定量するものである。
キレート剤の添加と同時もしくはその後で検体中にウレ
アーゼを添加し、アンモニアからグルタミン酸への共役
反応としてＮＡＤ（Ｐ）Ｉ（−＋ＮＡＤ（Ｐ）＋の反応
にともなう３４０ｎｍ吸光度の減少によってそれぞれの
物質を定量するものである。
反応としては次の式（■）が示される。
本発明においては、検体中の尿素を分解し、ＮＡＤ（Ｐ
）Ｈ→ＮＡＤ（Ｐ）＋の反応によってＮＡＤ（Ｐ）Ｉ＋
を消費して正確な被検物の定量を行うものである。
）Ｈ→ＮＡＤ（Ｐ）＋の反応によってＮＡＤ（Ｐ）Ｉ＋
を消費して正確な被検物の定量を行うものである。
本発明において用いる、ＡＴＰ又は／及びキレート剤に
よるｉＣ叶反応の停止は、反応を停止したそのままの媒
質でＮＡＤ（Ｐ）Ｉ＋−＋ＮＡＤ（Ｐビの反応を用い各
種反応が行える点できわめて有用である。
よるｉＣ叶反応の停止は、反応を停止したそのままの媒
質でＮＡＤ（Ｐ）Ｉ＋−＋ＮＡＤ（Ｐビの反応を用い各
種反応が行える点できわめて有用である。
反応系に対するＡＴＰの添加量は１５ｍＭ以上であれば
よい。
よい。
また、反応系に対するキレート剤、例えばＥＤＴＡの添
加量は１ｍＭ以上であればよい。
加量は１ｍＭ以上であればよい。
次に、本発明の実施例を示す。
実施例１
α−ＫＧ １０ ｍＭ
ＮＡＤＨ０，１８ｍＭ
インクエン酸 ５ ｍＭ
八ＤＰ Ｏ，５ｍＭＭ
ｇＣＱ、、 ０．５ ｍＭＧＱＤＩＩ
５０ ｕ／ｍ ＱｉｃＤＩＩ
２ ｕ／ｍＱ以上を含有する０、１Ｍトリエタノ
ールアミン塩酸（ｐＨ７，５） ２．４ｍＱに１６０ｍ
Ｍアンモニアを含む様々な濃度に調整したクレアチニン
含有検体（尿素層−窒素としてＯ〜６００ｍｇ／ｄΩ）
３０μＱ添加した。それぞれ３７℃で５分間保温したの
ちＥＤＴＡ、ウレアーゼ濃度がそれぞれ５ｍＭ、 ０．
１ｕ／ｍｕになるように、ＥＤＴＡ、ウレアーゼ混液を
０．６社加え、分光光度計により３７℃での３４０ｎｍ
の１分間における吸収の減少から検体中の尿素を測定し
た。その？ｌｌ１１定結果を下に示す。
ｇＣＱ、、 ０．５ ｍＭＧＱＤＩＩ
５０ ｕ／ｍ ＱｉｃＤＩＩ
２ ｕ／ｍＱ以上を含有する０、１Ｍトリエタノ
ールアミン塩酸（ｐＨ７，５） ２．４ｍＱに１６０ｍ
Ｍアンモニアを含む様々な濃度に調整したクレアチニン
含有検体（尿素層−窒素としてＯ〜６００ｍｇ／ｄΩ）
３０μＱ添加した。それぞれ３７℃で５分間保温したの
ちＥＤＴＡ、ウレアーゼ濃度がそれぞれ５ｍＭ、 ０．
１ｕ／ｍｕになるように、ＥＤＴＡ、ウレアーゼ混液を
０．６社加え、分光光度計により３７℃での３４０ｎｍ
の１分間における吸収の減少から検体中の尿素を測定し
た。その？ｌｌ１１定結果を下に示す。
検体番号 １２３４５６７
実施例２
（Ｅ−ＫＧ １０ ｍＭＮＡＤｔｌ
０．１６ｍＭイソクエン酸 ５ ｍ
Ｍ ＡＤＰ ０．５ｍＭ ＭｇＣム ＩＩＩＩＭ ＧｐＤＨ１００ｕ／ｍ１ ｉｃＤＨ２ｕ／社 以」二を含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
２．４社に１６０ｍＭアンモニアを含む様々な濃度に
調整した尿素含有検体（尿素層−窒素として０〜１００
ＯＢ／ｄｊ’ ）３０μ看添加した。それぞれ３７°Ｃ
で５分間保温したのちＡＴＰ、ウレアーゼ濃度がそれぞ
れ２０ｍＭ、 ０．１ｕ／ｍｊ＋になるようにＡＴＰ
、ウレアーゼ混液を０．６〜ｌ加え分光光度計により２
５℃での３４０ ｎ ｍの１分間における吸収の減少か
ら検体中の尿素層−窒素を測定したｄｌす定結果を下に
示す。
０．１６ｍＭイソクエン酸 ５ ｍ
Ｍ ＡＤＰ ０．５ｍＭ ＭｇＣム ＩＩＩＩＭ ＧｐＤＨ１００ｕ／ｍ１ ｉｃＤＨ２ｕ／社 以」二を含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
２．４社に１６０ｍＭアンモニアを含む様々な濃度に
調整した尿素含有検体（尿素層−窒素として０〜１００
ＯＢ／ｄｊ’ ）３０μ看添加した。それぞれ３７°Ｃ
で５分間保温したのちＡＴＰ、ウレアーゼ濃度がそれぞ
れ２０ｍＭ、 ０．１ｕ／ｍｊ＋になるようにＡＴＰ
、ウレアーゼ混液を０．６〜ｌ加え分光光度計により２
５℃での３４０ ｎ ｍの１分間における吸収の減少か
ら検体中の尿素層−窒素を測定したｄｌす定結果を下に
示す。
検体番号 １ ２３４５６７８ ９’１ＯＩＩ測
定値 ７１８ ７１０ ７００ ６６５ ５９０
４９８ ４０３ ３０１ ２００ １００ ０実施例
３ α−ＫＧ ５ ＋ｎＭ ＮＡＤＰｔｌ ０．２ｍＭインクエ
ン酸 ５ ｍＭ ＭｇＣｆｚ ０．２ｍＭ ＧｆｌＤＩノ ２０ ｕ
／ｍＪｉｃＤＩＩ ２ ｕ／ｍ１以上
を含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）２．４
＋ｕｆに１６０ｍＭアンモニアを含む様々な濃度に調整
した尿素含有検体（尿素層−窒素として０〜ｌ ０００
＋ｎ Ｉζ／ｄ幻３０μＩ！−’ｔＡ加した。それぞ
れ３７℃で５分間保温したのちＩＥＤＴＡ、ウレアーゼ
濃度がそれぞれ１０ｍＭ、 ０．１ｕ／ｍＱになるよう
にＥＤＴＡ、ウレアーゼ混液を０．６ｍ１２加え分光光
度計により２５℃での３４０ｎｍの１分間における吸収
の減少から検体中の尿素層−窒素を測定した測定結果を
下に示す。
定値 ７１８ ７１０ ７００ ６６５ ５９０
４９８ ４０３ ３０１ ２００ １００ ０実施例
３ α−ＫＧ ５ ＋ｎＭ ＮＡＤＰｔｌ ０．２ｍＭインクエ
ン酸 ５ ｍＭ ＭｇＣｆｚ ０．２ｍＭ ＧｆｌＤＩノ ２０ ｕ
／ｍＪｉｃＤＩＩ ２ ｕ／ｍ１以上
を含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）２．４
＋ｕｆに１６０ｍＭアンモニアを含む様々な濃度に調整
した尿素含有検体（尿素層−窒素として０〜ｌ ０００
＋ｎ Ｉζ／ｄ幻３０μＩ！−’ｔＡ加した。それぞ
れ３７℃で５分間保温したのちＩＥＤＴＡ、ウレアーゼ
濃度がそれぞれ１０ｍＭ、 ０．１ｕ／ｍＱになるよう
にＥＤＴＡ、ウレアーゼ混液を０．６ｍ１２加え分光光
度計により２５℃での３４０ｎｍの１分間における吸収
の減少から検体中の尿素層−窒素を測定した測定結果を
下に示す。
検体番号 １ ２ ３ ４ ５ ６ ７
８ ９ １０ １１測定値 ７２０ ７０５
６９０ ６６０ ５８５ ５０２４０５ ２９８ ２
００ １００ ０検体中に存在している高濃度のアン
モニアの影響を全くうけず被検液中の尿素の定量が可能
となった・
８ ９ １０ １１測定値 ７２０ ７０５
６９０ ６６０ ５８５ ５０２４０５ ２９８ ２
００ １００ ０検体中に存在している高濃度のアン
モニアの影響を全くうけず被検液中の尿素の定量が可能
となった・
Claims (1)
- （１）検体にＧｌＤＨ、α−ＫＧ、ＮＡＤＨ（又はＮＡ
ＤＰＨ）、イソクエン酸、マグネシウムイオンまたはマ
ンガンイオンなどの金属イオン、およびｉＣＤＨを添加
混合し、検体中にすでに存在するアンモニアを消費せし
め、次いでＡＴＰ又は／及びキレート剤を添加し、ｉＣ
ＤＨ反応を停止し、これと同時もしくはしかる後ウレア
ーゼを添加して、生成するアンモニアを測定することを
特徴とする尿素の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17312485A JPS6234060A (ja) | 1985-08-08 | 1985-08-08 | 尿素の定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17312485A JPS6234060A (ja) | 1985-08-08 | 1985-08-08 | 尿素の定量方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6234060A true JPS6234060A (ja) | 1987-02-14 |
Family
ID=15954575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17312485A Pending JPS6234060A (ja) | 1985-08-08 | 1985-08-08 | 尿素の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6234060A (ja) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5921398A (ja) * | 1982-07-26 | 1984-02-03 | Oriental Yeast Co Ltd | 検体の前処理方法 |
| JPS5931700A (ja) * | 1982-08-14 | 1984-02-20 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
| JPS5931697A (ja) * | 1982-08-14 | 1984-02-20 | Oriental Yeast Co Ltd | 検体の前処理法 |
| JPS61247963A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-05 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
| JPH0675515A (ja) * | 1992-08-26 | 1994-03-18 | Dainippon Printing Co Ltd | 混成型ホログラムとその製造方法 |
-
1985
- 1985-08-08 JP JP17312485A patent/JPS6234060A/ja active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5921398A (ja) * | 1982-07-26 | 1984-02-03 | Oriental Yeast Co Ltd | 検体の前処理方法 |
| JPS5931700A (ja) * | 1982-08-14 | 1984-02-20 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
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| JPS61247963A (ja) * | 1985-04-26 | 1986-11-05 | Oriental Yeast Co Ltd | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量方法 |
| JPH0675515A (ja) * | 1992-08-26 | 1994-03-18 | Dainippon Printing Co Ltd | 混成型ホログラムとその製造方法 |
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