JPH0448266A - 抗原又は抗体の濃度測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、液体試料中の抗原又は抗体の濃度測定方法に
関する。

〔従来の技術〕

従来、液体試料中の抗原又は抗体の濃度を測定する代表
的な方法としては、レーザーネフェロメトリー、ラテッ
クス比濁法、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノ
アッセイ等が知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、前記の抗原又は抗体の濃度測定方法のうち、レ
ーザーネフェロメトリー及びラテックス比濁法は、試料
液中に血球等の他の共存物質が存在して光の吸収、散乱
が起こる場合には正確な測定を行うことができず、測定
の感度、精度とも大幅に低下するという問題かある。そ
のため、測定用の試料の調製には、そのような共存物質
を予め除去する必要かあった。また、微粒子表面の凹凸
によって光散乱の状態が変わるため測定結果が影響を受
けるという欠点もあった。

また、エンザイムイムノアッセイでは酵素活性の安定性
という困難な要求があること、そしてラジオイムノアッ
セイでは放射性物質を用いる危険性が伴うという問題か
あった。

そこで、本発明の課題は、共存物質が試料液中に共存し
ていても何らそれらに影響されず、したがって、従来の
免疫測定においては分離する必要かあった血球等の共存
物質を分離せずに、その存在のままで抗原又は抗体の濃
度を測定することができる方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者は、かかる課題を解決するものとして、抗原又
は抗体と、抗体又は抗原を固定化した磁気微粒子とを抗
原−抗体反応させて得られる凝集塊の初期磁化特性が、
試料液中の抗体又は抗原の濃度と相関関係かあることを
見出した。

本発明は、かかる発見に基づいて、抗原又は抗体を含有
する液体試料に、該抗原又は抗体と特異的に結合する抗
体又は抗原を固定化した磁気微粒子を懸濁して抗原抗体
反応を起こさせて磁気微粒子を凝集させた後、得られた
凝集塊に磁場を印加して該凝集塊の初期磁化特性を測定
する工程を有する、液体試料中の抗原又は抗体の濃度測
定方法を提供するものである。

抗原・抗体固定化磁気微粒子微粒子 この方法において、抗原又は抗体の固定化に用いる磁気
微粒子の材料は、特に限定されず、例えば、ＦｅＪａ、
　　７　　Ｆｅ２０ｓ、　Ｃｏ　　７−Ｆｅ２０ｓ、（
ＮｉＣｕＺｎ）０・Ｆｅ２０ｓ、　　（ＣｕＺｎ）（Ｉ
Ｆｅ２０ｓ、　（Ｍｎ−Ｚｎ）０　・Ｆｅ２Ｏ３，（Ｎ
ｉＺｎ）Ｏ・Ｆｅ２０ｓ、ＳｒＯ・６Ｆｅ２０２．　Ｂ
ａＯ・６Ｆｅ２０ｓ、　５１０２て被覆したＦｅ２０４
（粒径約２００人）　［Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　ｖｏｌ、２．　ｐ、２〜１０　（
１９８０）参照］、各種の高分子材料（ナイロン、ポリ
アクリルアミド、タンパク質等）とフェライトとの複合
微粒子、磁性金属微粒子等を挙げることができる。

磁気微粒子の粒径は、一般に、５０〜５００人の範囲で
よい。

上記の材料及び粒径を有するものの中でも特に好ましい
ものとして、ＳｉＯ□で被覆した粒径約２００人のＦｅ
ｉｇｎ粒子、及び粒径２００〜３００人のｒ　−Ｆｅ２
ｅｓ粒子を挙げることかできる。さらに、このようフｊ
好ましい磁気微粒子として、走磁性細菌から得られる磁
鉄鉱（Ｆｅ３０ｔ）からなる微粒子（粒径約５００人）
が挙げられる。前記走磁性細菌は、例えば特開昭６２−
６１５９９号に開示された方法および採取器により淡水
又は海水から容易に採取することかてきる。

この濃度測定方法に用いられる抗原又は抗体を固定化し
た磁気微粒子は、上記の磁気微粒子に所要の抗原又は抗
体を固定化することにより製造することかできる。抗原
又は抗体の磁気微粒子への固定化は、抗原又は抗体の固
定化技術として公知の方法により行うことができ、例え
ば、シランカップリング剤、ブドウ状球菌より得られる
プロティンＡを磁気微粒子に被膜させ、そして抗体を結
合させる方法等を用いて行う。

磁気微粒子に固定される抗体又は抗原の種類は、被測定
対象である特定の抗原又は抗体に対して抗体又は抗原の
関係にあるものであり、試料液中の抗原又は抗体に応じ
て選択される。かかる抗原又は抗体の例としては次のも
のを挙げることかできる。

抗原類：　ＩｇＧ、　ＩｇＡ、　ＩｇＭ、　ＩｇＬアル
ブミン、ＨＣＧ、　ＡＦＰ、カルジオライピン抗原、血
液型物質、コンカナバリンＡＳＤＮＴ、プロスタグラン
ジン、ＣＲＰ、　ＨＢｓ、ヒト成長ホルモン、ステロイ
ドホルモン、ＣＥＡ、　ＩｇＤ等。

抗体類：抗アルブミン抗体、抗ＣＲ抗体、抗ＩｇＧ抗体
、抗１ｇＡ抗体、抗１ｇＭ抗体、抗１ｇＢ抗体、抗Ｉｇ
Ｇ抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ＤＮＴ抗体、抗プロスタグラ
ンジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗ＣＲＰ抗体
、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ステロイ
ドホルモン抗体、およびこれらを含む血清、並びにモノ
クローナル抗体。

抗原抗体反応 上記の抗原又は抗体を固定化した磁気微粒子を試料液に
懸濁する方法は、特に限定されない。

定量の試料液に、一定濃度で磁気微粒子を含む懸濁液を
添加してもよいし、あるいはその逆でもよい。磁気微粒
子の懸濁液に用いられる分散媒は、通常、水性媒体か一
般的である。

抗原又は抗体を固定化した磁気微粒子を、例えば、特開
昭６３−９０７６６号公報に開示の懸濁液、即ち、抗原
又は抗体が固定化されている粒径５０〜５００人の磁気
微粒子か、該磁気微粒子１ｍｇ当り５ｍ７以上の、界面
活性剤濃度０６１重量％以上の等張塩水溶液中に分散し
てなる懸濁液として予め調製しておき、試料液に添加す
ることもできる。かかる懸濁液は、安定性が高く保存性
が良好であるので便利である。等張塩水溶液としては、
例えば、０．９％ＮａＣ１溶液、０．０２５Ｍ　ｔ、よ
糖水溶液を使用することができ、また、これに添加する
界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ　ｓｏ、−ＣＯＯＨ，
Ｃｏｏ−などの基を有する界面活性剤等が挙げられる。

等張塩水溶液中の界面活性剤濃度は、０．１重量％以上
であることが必要で、好ましくは、０．１〜１．０重量
％である。

この方法において、試料液に磁気微粒子を分散させるに
は、例えば超音波を利用することができる。試料の懸濁
液中への分散処理により試料液中に存在した抗体又は抗
原は磁気微粒子上に固定化されている抗原又は抗体に結
合し、抗原−抗体−磁気微粒子からなる三元結合体を生
成する。これらの結合体は、抗原−抗体反応の進行によ
り隣接する結合体同士で凝集し、凝集塊を生成する。

このとき、特開昭６３−９０７６６号公報に記載のよう
に試料液に磁界を適用してもよく、これにより凝集塊の
生成を促進することができる。

初期磁化特性の測定 本発明の方法において、凝集塊の初期磁化特性の測定は
地磁気の影響を極力避けうる装置によって行うことが求
められ、好ましい磁力計としては、例えば、振動試料型
磁力計（ＶＳＭ）を使用することができる。

前記の抗原−抗体反応により得られる凝集塊の粒度は、
試料液中の抗原又は抗体の濃度と相関関係がある。即ち
、試料中の抗原又は抗体の濃度が高いほど生成する凝集
塊の粒度が大きくなる。こうして得られた凝集塊の分散
液に一定方向の磁場を印加すると各凝集塊は磁場の方向
に配向させられるが、凝集塊の粒度が小さいほど配向が
速いため磁化曲線の上昇する傾きが鋭くなる。一方、凝
集塊の粒度が大きいほど磁化曲線の傾きは小さくなる。

したがって、既知の抗原又は抗体の濃度に対する初期磁
化特性の変化を、例えば検量線として求め、これに基づ
いて未知の抗原又は抗体の濃度を測定することができる
。

〔実施例〕

実施例１ （１）粒径１５０人の酸化鉄からなる磁気微粒子に抗ヒ
ト１ｇＧを固定化したものを、Ｔｗｅｅｎ　８０を０．
６％含む生理食塩水に濃度１■／イて分散させ、磁気微
粒子懸濁液を調製した。

（２）次に、抗原であるヒトＩｇＧを、それぞれ、０．
１．１０．１００又は１０００μｇ／ｍｌ含む５種の試
料水溶液各０．１艷に、前記の磁気微粒子分散液０．１
ｙｄを添加した。これらの懸濁液に電磁石を用いて周波
数２Ｈｚの交番磁場２００Ｇ程度を５分間印加し、抗原
−抗体反応を完全に行わせ、凝集塊を生成させた。

次に、試料液をアクリル樹脂製の直径７ｍｍ、厚さ５ｍ
ｍ、内容量４０μｌの円柱状容器、サンプルボルダ−に
移し、振動試料型磁力計（理研電子■製。

ＢＨＶ−３）で、初期磁化曲線を求めたところ図１に示
す結果か得られた。

実施例２ 実施例１の（］）で示した方法によって濃度１０ｍｇ／
ｍｌの磁気微粒子懸濁液を調製した。次に、実施例１の
（２）と同様にして抗原−抗体反応を完全に行わせて凝
集塊を生成させ、測定を行った。

そして、磁場２０００ｅにおける磁化を各抗原濃度ごと
に求めたところ、図２に示す結果か得られた。

実施例３ ヒトｒｇＧを種々の既知濃度で含む５種の試料水溶液各
０．１−に、前記の実施例１の（１）で調製した磁気微
粒子分散液０．１ｍ７１’を添加した。実施例１と同様
にして抗原−抗体反応を完全に行わせ、凝集塊を生成さ
せた。

次に、試料液を前記サンプルホルダーに移し、振動試料
型磁力計（理研電子■製、　　ＢＨＶ〜３）で、磁場２
０００ｅにおける磁化を各抗原濃度ごとに求めたところ
、図３に示す検量線が得られた。

〔発明の効果〕

本発明の抗原又は抗体の濃度測定方法は、血球等の共存
物質の存在下においても何ら影響されずに抗原抗体反応
による磁気微粒子の粒度を短時間で測定できる、酵素を
使用しないためその安定性が問題とならず、また放射性
物質を使用しないので安全性が高い等の点で有利である
。

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例１で測定された各抗原濃度の試料につい
ての初期磁化曲線を示し、図２は、同じ＜　２０００ｅ
における抗原濃度と磁化変化率の関係を示す。 図３は、実施例２で得られた磁場２０００ｅにおける抗
原濃度と磁化変化率の関係を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗原又は抗体を含有する液体試料に、前記抗原又
   は抗体と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した磁
   気微粒子を懸濁して抗原抗体反応を起こさせて磁気微粒
   子を凝集させた後、得られた凝集塊を含む系に磁場を印
   加して該凝集塊の初期磁化特性を測定する工程を有する
   、液体試料中の抗原又は抗体の濃度測定方法。
2. （２）抗原抗体反応の際に反応系に磁場を印加する請求
   項（１）の方法。