JPH0223877A - エイコサペンタエン酸含有脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はエイコサペンタエン酸（以下ＥＰＡという）含
有脂質及びエイコサペンタエン酸の発酵法による製造方
法に関する。

〔従来の技術〕

ＥＰＡに代表される多価不飽和脂肪酸は、生体膜の構成
成分として重要な役割を担っている。またこれまでに知
られているＥＰＡの薬理作用には、以下のものが知られ
ている。■血小板凝集抑制作用（血栓溶解作用）■血液
中の中性脂肪低下作用■血液中のＶＬＤＬ−コレステロ
ール、ＬＤＬ−コレステロール低下作用、ＨＤＬ−コレ
ステロール増加作用（抗動脈硬化作用）■血液粘度低下
作用■血圧降下作用■抗炎症作用■抗腫瘍作用。さらに
、プロスタグランジン−族の生成に際し基質となり、ヒ
トを含む高等は乳動物の体内で必須的な機能を発揮する
。特にＥＰＡはタイプ３のプロスタグランジンの生成の
際の基質として重要であって、血小板の凝集抑制作用が
あり、血栓症の治療及び予防剤としての応用が検討され
ている。さらにＥＰＡは、血漿コレステロールレベルの
低下に寄与する多価不飽和脂肪酸の中でも特にその活性
が高く、通常の植物油に含まれるリノール酸などよりも
ｉチかに有効である。また魚類等の必須栄養素としても
知られている。

このように、ＥＰＡがその血栓防止作用あるいは脂質低
下作用に基づく健康食品あるいは医薬品としての可能性
がデンマークのダイヤ−ベルブ（八ｍ、Ｊ、ｃ１ｉｎ、
Ｎｕｔｒ、、２８，９５８．１９７５）の疫学調査によ
り明らかにされているが、その化学構造から明らかなよ
うに化学合成することは、極めて困難である。このよう
なことから我が国においてもＥＰＡを多く含有するイワ
シ、サバ、サンマ等の青背魚の摂食が推奨されるように
なってきた。

今日、健康食品として市販されているＥＰＡは、そのほ
とんどが点数法によって得られた魚油の分別物であって
、そのＥＰＡ含量は１０〜３０％程度である。点数法に
よって抽出される魚油は構成脂肪酸として多種類の脂肪
酸を含む混合グリセリドであって、各成分を単離精製す
ることが困難であるばかりでなく、ＥＰＡはすべてシス
形の二重結合を５個有する炭素数２０の直鎖の多価不飽
和脂肪酸である為に、極めて酸化され易い不安定な脂肪
酸であり、魚油からＥＰＡを濃縮する場合には酸素・光
・熱等を避けて行なう必要がある。さらに、これら魚油
ＥＰＡの分別に使用された各種の有機溶剤は通常減圧下
に除去されるが、その完全除去は技術的及びコスト的に
問題点が多い。

医薬品としてのＥＰＡは、様々な方法によって抽出され
た魚油を酵素的にもしくはアルカリ条件下で処理して遊
離脂肪酸まで加水分解するか又は該遊離酸をメチルもし
くはエチルエステルに変じた後、これらを低温分別結晶
法、尿素付加法、減圧蒸留法又は、逆相クロマト法等に
より更に精製してＥｐＡ濃度を９０％以上としたものが
多い。

しかし、これらの方法を用いて得られたＥＰＡ濃縮物は
、工程中に各種の有機溶剤が使用されたりまたは、２０
０℃近い高熱を加えられたりするため、有機溶剤の残留
やＥＰＡの重合、異性化あるいは酸化等による変質の懸
念をはらんでいる。更に、魚油等をＥＰＡの原料として
用いた場合、心臓疾患の原因の一つとして疑われている
トコセン酸等の除去が困難であるため、健康食品、医薬
品等に利用する上で問題点を残している。

一方、最近、不完全な精製・濃縮では、魚臭が残るなど
の欠点を有した魚油からの抽出法を改善することを目的
として、クロレラ、単細胞藻類モノダス、ユーグレナあ
るいはけい藻等微生物を用いたＥＰＡの生産方法が散見
される様になり、微生物を利用したＥＰＡ生産が注目さ
れてきている。

最近では、ゲラ−マンとシュレンク（Ｊ、Ｌ、Ｇｅｌｌ
ｅｒｍａｎａｎｄ　Ｈ，５ｃｈｌｅｎｋ、ＢＢＡ、５７
３２３．１９７９）及び、山田等（昭和６１年度日本醗
酵工学会大会、１９８６）の発表で、ＥＰＡを産生ずる
かび（糸状菌）についての報告がなされた。これら微生
物によるＥＰＡ生産は、その脂肪酸組成から、分離精製
が比較的容易なこと、また培養制御により、ＥＰＡ生産
をコントロールしやすい等の長所がある。しかしながら
バクテリア等に比較して、培養時間が長＜（７日〜１ケ
月程度）、生産性の向上が大きな問題点として残ってい
る。

〔本発明の解決しようとする問題点〕

以上述べて来た様に、健康食品または、医薬品として考
えられているＥＰＡの、魚油からの抽出生産、あるいは
、藻類やかび等の培養による生産には、いくつかの問題
点が有る。これらのことから、本発明の目的は、精製が
容易で純度の高いものが得られ、かつ培養時間が短く培
養制御が容易な、バクテリアを利用したＥＰＡ含有脂質
の醗酵生産方法を見出す事にある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は、ＥＰＡ産生能を有するバクテリアを広く
海洋に求めて鋭意研究を行った結果、シュードモナス（
Ｐｓｅｕｄｏｓ＋ｏｎａｓ）属、アルテロモナス属又は
シーワネラ属に属するバクテリアがＥＰＡを生産するこ
とを見出し、この知見に基いて本発明を完成した。

従って、本発明は、シュードモナス属、アルテロモナス
属又はシーワネラ属に属し、エイコサペンタエン酸含有
脂質を生産することができる微生物を培養することによ
ってエイコサペンタエン酸含有脂質を生成蓄積せしめ、
所望によりさらにエイコサペンタエン酸を単離すること
を特徴とするエイコサペンタエン酸含有脂質又はエイコ
サペンタエン酸の製造方法、及びエイコサペンタエン酸
含有脂質を生産することができるシュードモナス属、ア
ルテロモナス属又はシーワネラ属に属する微生物を提供
するものである。

〔具体的な説明〕

（１）微生物 本発明において使用する微生物はシュードモナス属、ア
ルテロモナス属、又はシーワネラ属に属し、ＥＰＡ又は
これを含有する脂質を生産することができるものであれ
ばよく、このような微生物は自然界から新たに分離し、
又は保存菌から選択することができる。

シュードモナスに属する微生物の例として、シュードモ
ナス・ビュートリファシェンス−＄とｎ＋ｏｎａｓ　　
匹江１匹江旦）を挙げることができ、新菌株として本発
明者等が分離したシュードモナス・ピユートリファシェ
ンスＳＣＲＣ−−２１８１、ＳＣＲＣ−−２２０１゜Ｓ
ＣＲＣ−−２２７１、ＳＣＲＣ−−２３４１、ＳＣＲＣ
−−２４５１、ＳＣＲＣ−２６４２、ＳＣＲＣ−−２７
９２、ＳＣＲＣ−−２８７８、ＳＣＲＣ−−３０１１。

ＳＣＲＣ−−３０２２を挙げることができる。

アルテロモナスに属する微生物の例として、アルテロモ
ナス・ピユートリファシェンス（Ａｌｔｅｒｏ−ｍｏｎ
ａｓ　　　ｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）を挙げる事が出来
、新菌株として本発明者等が分離した、アルテロモナス
・ピユートリファシェンスＳＣＲＣ−−２８７１、及び
アルテロモナス・ビュートリファシェンス・サブスピー
シズ・サガミファシェンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　
　匹旦ｅ−ｆａｃｉｅｎｓ　　５ｕｂｓｐｅｃｉｅｓ　
　ｓａ　ａｍｉｆａｃｉｅｎｓ）ＳＣＲＣ−１１６２、
アルテロモナス・ピユートリファシェンス（Ａ１ｔｅｒ
ｏａ＋ｏｎａｓ　　ｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ　　ＳＣＲ
Ｃ−−２８７１等を挙げる事ができる。一方、この種に
属する保存菌として例えばアルテロモナス・ピユートリ
ファシェンスＩＡＭ−１５１０及ヒアルテロモナス・ピ
ユートリファシェンスＴＡＭ　−１２４２５を挙げる事
が出来、これらの保存株はそれぞれの寄託番号のもとに
ＩＡＭから自由に人手する事が出来る。

アルテロモナスに属する微生物の例として、さらにアル
テロモナス・ハネダイ（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ７を挙
げる事が出来る。この種に属する保存菌として例えばア
ルテロモナス・ハネダイ　ＩＡＭ−１２６４１を挙げる
事が出来、この保存菌はその寄託番号のもとにＩＡＭか
ら自由に入手する事が出来る。

アルテロモナスに属する微生物の例として、さらにＥＰ
Ａ産生能を持つ微生物として、本発明者等が新たに分離
し、アルテロモナス・ルーメンサス圓旦肛聾並且　１ｕ
ｍｅｎｓａｓ）と同定・命名したＳＣＲＣ−−６４４４
、及びアルテロモナス・キシロ−サス（八ｌｔｅｒｏｍ
ｏｎａｓ　　７と同定・命名したＳＣＲＣ−２５１７を
挙げる事が出来る。

シーワネラに属する微生物の例として、シーワネラ・ピ
ユートリファシェンス　（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ匹江妊
匹凡Ｕ）を挙げる事が出来、新菌株として本発明者等が
分離した、シーワネラ・ピユートリファシェンスＳＣＲ
Ｃ−−２８７４を挙げる事が出来る。

またこの種に属する保存菌株としてシーワネラ・ビュー
トリファシェンスＩＡＭ−１５１０、シーワネラ・ピユ
ートリファシェンスＩＡＭ　−１２４２５等がＥＰＡ産
生能を持っている。

前記の新菌株は次のようにして分離した。次の第１表に
示す組成の培地を調製した。

第１表 肉エキス　　　　　　　１％ ペプトン　　　　　　　１％ ＮａＣ１Ｏ，５％ 寒天　　　　１．５％ 水道水　　　　　　　　ｐＨ７，０ この寒天平板培地に各地の海洋より採取した海洋性生物
体サンプルを滅菌した生理食塩水で適度に希釈したもの
を接種し、２５℃で１〜２日間培養した。この寒天平板
培地に出現したコロニーを同じ培地組成の斜面培地に釣
菌した。

このようにして各地の海洋より採取した海洋性生物体サ
ンプルから多数の菌株を分離した。次に、表の培地より
寒天をぬいたものを試験管に５ｄずつ分注し、同様に滅
菌した。それぞれの菌株をこの培地で２５℃、１〜２日
間培養した。得られた培養液より、後記の方法によりＥ
ＰＡ産生能を検定した。このようにして、ＥＰＡを顕著
に生産する下記の株を得た。これらの菌株の分離源は次
表の通りであった。

ＳＣＲＣ−−３０１１，ＳＣＲＣ−−３０２２ＳＣＲＣ
−２５１７ 三陸海岸 豊後水湾 これらの菌株はそれぞれ次の第３表に示す菌学的性質を
有する。

上記の菌学的性質に基き、これらの菌株を、バージイズ
・マニュアル・オプ・ディターミナティブ・バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｌｔｙ）
第８版、１９７４年〔参照文献１）ｉマニュアル・オブ
・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏｇｙ）第３版、１９８０年〔参照文献２〕　
；バージイズ・マニュアル・オプ・システマティク・バ
クテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆ　ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
第１巻、３５２頁、１９８４年〔参照文献３〕　；並び
にジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏ
−ｂｉｏｌｏｇｙ）ＬｉＬ３０５７　３０７４（１９８
３）　（参照文献４〕に従って次のように同定した。

ＳＣＲＣ−−２１８１、ＳＣＲＣ−−２２０１、ＳＣＲ
Ｃ−−２２７１、ＳＣＲＣ−−２３４１、ＳＣＲＣ−−
２４５１、ＳＣＲＣ−−２６４２、ＳＣＲＣ−−２７９
２。

ＳＣＲＣ−−２８７８、ＳＣＲＣ−−３０１１、及びＳ
ＣＲＣ−−３０２２は、いずれも、好気性で運動性及び
１本の極鞭毛を有し、またカタラーゼ、オキシダーゼ活
性を有するダラム陰性の桿菌であることから、参照文献
１及び２に従えばシュードモナス属に属する。シュード
モナス属の種としてシュードモナス・ピユートリファシ
ェンスが知られており、前記性質が文献記載のそれとほ
ぼ一致するので、前記１０株はシュードモナス・ピユー
トリファシェンスであると同定される。なお、糖からの
酸およびガスの生成テストの項目の中には必ずしも、文
献記載のそれと一致しない項目があるが、これらは分類
学上さほど重要な項目ではなく、同一種でも一般的によ
く変化するものであり、これらの記載に必ずしも規定さ
れるものではない。

なお、参照文献４には、シュードモナス・ピユートリフ
ァシェンスはＤＮＡのＧ＋Ｃ含量による分類からアルテ
ロモナス（Ａｌｔｅｒｏｔｓｏｎａｓ）属に近いことよ
り、アルテロモナス・ピユートリファシェンスＤ工ｔｅ
ｒｏｍｏｎａｓ　　ｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）　として
記載されている。またこのことは、前記参照文献３に於
いても記載されている。

さらに近年システマティック・アンド・アプライド・マ
イクロバイオロジー（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ａｎｄＡ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　　６．１
７１　１８２（１９８５）（参照文献５）に於いて、新
たにシーワネラ（Ｓｈｅｅｖａｎｅｌｌａ）属が提唱さ
れ、上記菌種をシーワネラ・ピユートリファシェンス（
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　　ｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）　
　とすることが提唱されている。

ＳＣＲＣ−−２８７１は、好気性で運動性及び１本の極
鞭毛を有し、またカタラーゼ、オキシダーゼ活性を有す
るダラム陰性のかん菌であり、かつＤＮＡのＧ＋Ｃ含量
が４７．１％である事から、前記文献１゜２．３、及び
４に従って、アルテロモナス属に属する。アルテロモナ
ス属の種としてアルテロモナス・ピユートリファシェン
スが知られて居り、前記性質が文献記載のそれとほぼ一
致するので、この菌株はアルテロモナス・ピユートリフ
ァシェンスであると同定される。

ＳＣＲＣ−−２８７４は、好気性で運動性及び１本の極
鞭毛を有し、またカタラーゼ、オキシダーゼ活性を有す
るダラム陰性のかん菌であり、前記の表に示す菌学的性
質を示すことから、前記文献ｌ、及び２の分ｌ！Ｊ［基
準に従えばシュードモナス・ビュートリファシェンスに
属する。しかしながら、シュードモナス・ピユートリフ
ァシェンスは前記参照文献４においては、ＤＮＡのＧ＋
Ｃ含量による分類からアルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍ
ｏｎａｓ）属に近いことより、アルテロモナス・ビュー
トリファシェンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　　ｕｔｒ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）として記載されており、またこのこ
とは前記文献３にも記載されている。さらに、前記文献
５においては、５　Ｓ　ｒＲＮＡの塩基配列により新た
にシーワネラ　（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属を提唱し、
上記菌種をシーワネラ・ピユートリファシェンス（Ｓｈ
ｅｓｖａｎｅｌｌａ　　匹旦虹展江用）とすることを提
唱している。以上の事から、この菌株はシーワネラ属に
属しシーワネラ・ピユートリファシェンスであると同定
される。

ＳＣＲＣ−−１１６２は下記の特徴を有する。

■　ダラム陰性 ■　運動性を持つ ■　非胞子形成の好気性かん菌 ■　Ｏ−Ｆテスト陰性 ■　カタラーゼ、オキシダーゼ陽性 ■　硝酸塩還元能を持つ ■　硫化水素産生能を持つ ■　ゼラチン・ＤＮＡ分解能を持つ ■　グルコースからの酸産生（＋）、ガス産生［相］　
キノン型；ユビキノン７と８、メナキノン、メチルメナ
キノン ■　周毛性鞭毛を持つ ＠　　Ｎａ”要求性 このような諸性質を有する本菌株ＳＣＲＣ−−１１６２
株の分類学的な位置は、前記の参照文献１．２，３、及
び４に従えば次の様に同定される。上記■から［相］ま
での項目により、アルテロモナス・ビュートリファシェ
ンス］土ｔｅｒｏｍｏｎａｓ　　ｕｔｒｅｆａｃｉｅｎ
ｓ）に類縁の菌株であると考えられる。しかしながら、
電子顕微鏡レベルでの形態から、周毛体の鞭毛を持ち、
またオルニチン分解能を持たず、Ｎａ”要求性であるこ
とから、本菌株をアルテロモナス・ピユートリファシェ
ンス・サブスピーシズ・サガミファシエンス（Ａｌｔｅ
ｒｏｍｏｎａｓ　　ｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓｓｕｂｓｐ
ｅｃｉｅｓ　　ｓａ　ａｎ＋１ｆａｃｉｅｎｓ−と同定
、命名した。

ＳＣＲ−６４４４及びＳＣＲ−２５１７は下記の主たる
性質を有する。

■　ダラム陰性 ■　運動性を持つ ■　非胞子形成の好気性かん菌 ■　Ｏ−Ｆテスト陰性 ■　カタラーゼ、オキシダーゼ陽性 ■　ウレアーゼ陰性 ■　ゼラチン、ＤＮＡ分解能を持つ ■　グルコースからの酸産生（＋）、ガス産生■　Ｎａ
（Ｊ！または海水要求性 ＠ｌ　　Ｇ＋Ｃ含量：　ＳＣＲＣ−−６４４４；　４１
．４％、ＳＣＲＣ−−２５１７、４１，１％、 このような諸性質を有する本菌株ＳＣＲＣ−−６４４４
及びＳＣＲＣ−−２５１７株の分類学的な位置は、前記
文献１２．３、及び４の分類基準に従えば次の様に同定
される。上記■から［相］までの項目により、アルテロ
モナス・ビュートリファシェンス姐ｕ肛竺坦岨ｕｔｒｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）またはアルテロモナス・オーランティ
ア（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　　ａｕｒａｎｔｉａ）に
類縁の菌株であると考えられる。しかしながら、ＳＣＲ
Ｃ−−６４４４は、硝酸塩還元能及びＤ−マンノース利
用能を持ち、またオルニチン分解能を持たないことから
、従来のどの種にも属さず、本菌株をアルテロモナス・
ルーメンサス（＾ｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　　ｌｕｍｅｎ
ｓａｓ）と同定・命名した。

一方ＳＣＲＣ−−２５１７は、硝酸塩還元能及びＤ−マ
ンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース利用能を
持ち、またオルニチン分解能及び硫化水素性能を持たず
、さらに電子顕微鏡レベルでの形態から両極毛の鞭毛を
持つ事から、従来のどの種にも属さず、本菌株をアルテ
ロモナス・キシロ−サス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　　
ｘ幻詮旦隻Ω−と同定・命名した。

以上記載した本発明の新菌株の内下記の株が工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託され、さらにブタペプト条
約に基（国際寄託に移管された。

シュードモナス・ピユートリファシェンス（Ｐｓｅｕｄ
ｏｓｏｎａｓ　　ｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＳＣＲＣ
−２８７８昭和６１年１２月２６日・寄託 微工研菌寄第９１１４号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９１１４）昭
和６２年１２月１７日国際寄託に移管微工研条寄第１６
２３号（ＦＵＲ−ＢＰ　−１６２３）アルテロモナス・
ピユートリファシェンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　　
ｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＳＣＲＣ−２８７１昭和６
２年１月２８日寄託 微工研菌寄第９１５８号（ＦＥＲＭ　Ｐｉ１５Ｂ）昭和
６２年１２月１７日国際寄託に移管微工研条寄第１６２
４号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１６２４）シーワネラ・ピユー
トリファシェンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ　　　ｕｔｒ
ｅｆａｃｉｅｎｃｅ　ＳＣＲＣ−−２８７４昭和６２年
１月２８日寄託 微工研菌寄第９１５９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９１５９）昭
和６２年１２月１７日国際寄託に移管微工研条寄第１６
２５号（ＦＥＲＭ　ＢＰ、１６２５）アルテロモナス・
ピユートリファシェンス・サブスピーシズ・サガミファ
シエンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｕｔｒｅｆａｃｉｅ
ｎｓ　　５ｕｂｓｐｅｃｉｅａ　　ｓａ　ａ＋ｗｉｆａ
ｃｉｅｎｓ）ＳＣＲＣ−１１６２ 昭和６２年２月２０日寄託 微工研菌寄第９２１０号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９２１０）昭
和６２年１２月１７日国際寄託に移管微工研条寄第１６
２６号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１６２６）アルテロモナス・
ルーメンサスＡ１ｔｅｒｏ＋ｗｏｎａｓＩｕｍｅｎｓａ
ｓ）　ＳＣＲＣ−−６４４４昭和６２年ｉｏ月２０日寄
託 微工研菌寄第９６６７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９６６７）ア
ルテロモナス・キシロ−サス（Ａ　１　ｔｅｒｏｍｏｎ
ａｓ■ハｕ旦ＳＣＲＣ−２５１７ 昭和６２年１０月２０日寄託 微工研菌寄第９６６８号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９６６８）以
上、自然界から分離した菌株について詳細に記載したが
、これらの菌に差異を生じさせて一層生産性の高い菌株
を得ることもできる。

この発明の菌株は、常法に従って保存することができ、
例えば寒天スラント培地上で、又は凍結乾燥法により保
存することができる。寒天スラント培地としてシュード
モナス属細菌の保存に常用されている培地、例えば菌の
分離に関して前記した培地を使用することができる。ま
た、凍結乾燥保存も常法に従って行うことができる。

（２）ＥＰＡの製造方法 前期の微生物を培養して本発明のＥＰＡを製造しようと
する場合、基礎栄養培地として、この発明の微生物が増
殖し得るものであればいずれを使用してもよい。この培
地は、窒素源として例えば酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス等の１種類又は複数種類を含有する。また、この培
地には必要に応じて炭素源として各種の糖類を加えるこ
とができる。この培地には、塩化ナトリウム、もしくは
天然海水や人工海水を加えることが好ましい。

培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いて行っても
よいが、目的とするＥＰＡを多量に得るためには、液体
培地を用い、静置培養もしくは振とう培養、通気・攪拌
培養等により好気的条件下で培養を行うのが好ましい。

培養温度は菌が生育し、ＥＰＡが生産される温度範囲内
であればいずれの温度でも良く、好ましくは５〜３０”
Ｃであり、より好ましくは１５〜２５℃である。ｐＨは
６〜９、好ましくは７〜８の範囲である。培養時間は採
取し得る量のＥＰＡ含有脂質が生産される時間を選べば
良く好ましくは８〜４８時間である。

次に得られた培養物から本発明のＥＰＡが採取される。

精製法として通常の脂質精製法を用いることが出来る。

例えば、培養液から遠心分離、濾過等の常用の集菌手段
によって菌体を集める。次に、この菌体を所望により水
、食塩水、又は緩衝液、例えばリン酸緩衝液等により洗
浄した後、これらの液中に再懸濁する。この懸濁液を、
脂質の抽出のために常用されている溶剤、例えばクロロ
ホルム／メタノール混合物により抽出し、相分離してク
ロロホルム相を得る。次に、このクロロホルム相を蒸発
除去することによりＥＰＡ含有脂質を含む材料が得られ
る。常法によりこれをけん化することにより遊離のＥＰ
Ａ、又はその塩を得ることができる。

かくして、本発明によれば上記のバクテリアを使用して
発酵生産することにより、精製が容易でかつ短時間で多
量にＥＰＡ含有脂質及びＥＰＡを得ることができる。

次に本発明のＥＰＡ含有脂質の製造方法の具体的な例を
実施例に示す。

肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｊ！　０
．５％を含有し、ｐＨ７，０に調整した培地２０１を１
２１℃、１５分間加熱殺菌した後、シュードモナス・ピ
ユートリファシェンスＳＣＲＣ−−２８７１３（漱工研
菌寄第９１１４号）を接種し、２５℃で２４時間好気的
に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約１５０ｇ　（乾燥重量で１６．５　ｇ　）の菌体を得
た。

菌体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、１１に懸
濁した。この菌体懸濁液をＩＩ！のクロロホルムメタノ
ール溶液（２：　１　ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した後
、遠心分離し、クロロホルム相を得た。

さらに水相及び菌体をクロロホルム６００　ｍＺで振と
う抽出した後遠心分離し、クロロホルム相を得た。

クロロホルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂質画分
は、１．１６ｇ　（乾燥菌体当り７．０３％）であった
。この脂質画分にはＥＰＡが含まれる。この画分を０．
３　Ｎ　ＮａＯＨを含有する９５％エタノール中で８０
℃にて１時間けん化し、ＥＰＡのナトリウム塩を含む生
成物を得た。これを６ＮＨ（Ｊにより中和し、遊離のＥ
ＰＡを含む生成物を得た。次に、ジアゾメタン等により
メチルエステル化した後、ガスクロマトグラフにて分析
してその含有率を測定したところ、０．１１４ｇ　（脂
質画分の９．８％、乾燥菌体の０．６９％）のＥＰＡが
含まれていることがわかった。

肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、Ｎａ（Ｊ！　Ｑ
、５％を含有し、ｐＨ７，０に調整した培地２０１を１
２１℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・
ビュートリファシェンスＳＣＲＣ−−２８７１（微工研
菌寄第９１５８号）を接種し、２５℃で２４時間好気的
に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約１３５ｇ　（乾燥重量で１５．０　ｇ　）の菌体を得
た。

菌体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、１１に懸
濁した。この菌体懸濁液を１１のクロロホルム−メタノ
ール溶液（２：　１　　ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した
後、遠心分離し、クロロホルム相を得た。

更に水相及び菌体をクロロホルム６００−で振とう抽出
したのち遠心分離し、クロロホルム相を得た。

クロロホルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂質画分
は、１．０５ｇ　（乾燥菌体当たり７．００％）であっ
た。この脂質画分にはＥＰＡが含まれる。この両分を０
．３　Ｎ　−ＮａＯＨを含有する９５％エタノール中で
８０℃にて１時間鹸化し、ＥＰＡのナトリウム塩を含む
生成物を得た。これを６Ｎ−ＨＣ７！により中和し、遊
離のＥＰＡを含む生成物を得た。次に、この生成物の一
部をジアゾメタンによりメチルエステル化した後、ガス
クロマトグラフにて分析してその含有率を測定した所全
生成物中に０．１１１ｇ（脂質画分の１０．６％、乾燥
菌体の０．７４％）のＥＰＡが含まれていることが分か
った。

前記遊、％ｌｔ　Ｅ　Ｐ　Ａを含有する生成物をシリカ
ゲルクロマトグラフィー〔溶出剤：ｎ−ヘキサン／エチ
ルエーテル（９：１））により精製してＥＰＡのみを含
む両分を得、これを蒸発乾燥することにより０．１０　
ｇのＥＰＡを得た。

肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｊ！０．
５％を含有し、ｐＨ７，０に調整した培地２０１を１２
１℃、１５分間加熱殺菌したのち、シーワネラ・ビュー
トリファシェンスＳＣＲＣ−−２８７４（微工研菌寄第
９１５９号）を接種し、２５℃で２４時間好気的に培養
した。培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量約２０
０ｇ（乾燥重量で２２．５　ｇ　）の菌体を得た。

菌体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、１１に懸
濁した。この菌体懸濁液を１１のクロロホルム−メタノ
ール溶液（２：　１　　ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した
後、遠心分離し、クロロホルム相を得た。

更に水相及び菌体をクロロホルム６００−で振とう抽出
したのち遠心分離し、クロロホルム相を得た。

クロロホルム抽出画分を？ａ縮乾固して得られた脂質画
分は、１．７８ｇ　（乾燥菌体当り７．９１％）であっ
た。この脂質画分にはＥＰＡが含まれる。この両分を０
．３　Ｎ　−ＮａＯＨを含有する９５％エタノール中で
８０℃にて１時間鹸化し、ＥＰＡのナトリウム塩を含む
生成物を得た。これを６Ｎ−）１ｃＪ！により中和し、
遊離のＥＰＡを含む生成物を得た。次に、この生成物の
一部をジアゾメタンによりメチルエステル化した後、ガ
スクロマトグラフにて分析してその含有率を測定した所
全生成物中に０．２４１　ｇ（脂質画分の１３．５％、
乾燥菌体の１．０７％）のＥＰＡが含まれていることが
分かった。

前記遊離ＥＰＡを含む生成物をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィー〔溶出剤：ｎ−ヘキサン／エチルエーテル
（９：　１）　）により精製してＥＰＡのみを含む両分
を得、これを蒸発乾燥することにより０．２２ｇのＥＰ
Ａを得た。

肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ　０．
５％を含有し、ＰＨ７，０に調整した培地３０１を１２
１℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・ピ
ユートリファシェンス・サブスピーシズ・サガミファシ
エンスＳＣＲＣ−−１１６２（微工研菌寄第９２１０号
）を接種し、２５℃で２４時間好気的に培養した。

培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量約２０５ｇ（
乾燥重量で２５．６　ｇ　）の菌体を得た。菌体を０．
８５％の食塩水で１回洗浄した後、１．５１に懸濁した
。この菌体懸濁液を１．５１のクロロホルム−メタノー
ル溶液（２：　１　ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した後、
遠心分離し、クロロホルム相を得た。更に水相及び菌体
をクロロホルム９００ｒｎ！で振とう抽出したのち、遠
心分離し、クロロホルム相を得た。

クロロホルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂質両分
は２．１３ｇ　（乾燥菌体当たり８．３２％）であった
、この両分を０．３　Ｎ　−ＮａＯＨを含有する９５％
エタノール中で８０℃にて１時間鹸化し、これを６Ｎ−
Ｈ（Ｊにより中和し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得た
。

次に、ジアゾメタンによりメチルエステル化した後、ガ
スクロマトグラフにて分析して、測定した所０．２０５
ｇ　（脂質画分の９．６％、乾燥菌体の０．８０％）の
ＥＰＡが含まれていることが分かった。

このＥＰＡを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラム
を用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロ
マトグラフィーを行なうことにより精製されたＥＰＡ　
Ｏ，１８５ｇを得た。

産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、Ｎａ（４０，５
％を含有し、ｐＨ７，０に調整した培地２０／を１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・ハネ
ダイ　ＩＡＭ−１２６４１を接種し、１５℃で２４時間
好気的に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採取し
湿重量約１５０ｇ　（乾燥重量で１４．９ｇ）の菌体を
得た。菌体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、１
１に懸濁した。この菌体懸濁液を１／のクロロホルム−
メタノール溶液（２：　１　　ｖ／ｖ）で良く振とう抽
出した後、遠心分離し、クロロホルム相を得た。更に水
相及び菌体をクロロホルム６００−で振とう抽出したの
ち遠心分離し、クロロホルム相を得た。クロロホルム抽
出画分を濃縮乾固して得られた脂質画分は、１．１８ｇ
　（乾燥菌体当たり７．９２％）であった。この両分を
０．３　Ｎ　−ＮａＯＨを含有する９５％エタノール中
で８０℃にて１時間鹸化し、これを６Ｎ−Ｈ（Ｊにより
中和し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得た。次にジアゾ
メタンによりメチルエステル化した後、ガスクロマトグ
ラフにて分析して、測定した所０．１４５　ｇ　（脂質
画分の１２．３％、乾燥菌体の０．９７％）のＥＰＡが
含まれていることが分かった。このＥＰＡを含む遊離脂
肪酸混合物をシリカゲルカラムを用い、メタノールを溶
出液としてカラム逆相分配クロマトグラフィーを行なう
ことにより精製されたＥＰＡ　０．１２６ｇを得た。

肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣ７！　０
．５％を含有し、ｐＨ７，０に調整した培地１０１を１
２１℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・
ルーメンサス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　　ｌｕｍｅｎ
ｓａｓ）　ＳＣＲＣ−６４４４（微工研苗寄第９６６７
号）を接種し、２５℃で２４時間好気的に培養した。培
養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量約１６０ｇ　（
乾燥重量で２０．４ｇ）の菌体を得た。菌体を０．８５
％の食塩水で１回洗浄した後、０．５１の同食塩水に懸
濁した。この菌体懸濁液を０．５１のクロロホルム−メ
タノール溶液（２：　１　　ｖ／ｖ）で良く振とう抽出
した後、遠心分離し、クロロホルム相を得た。更に水相
及び菌体をクロロホルム３００−で振とう抽出したのち
、遠心分離し、クロロホルム相を得た。クロロホルム抽
出画分を濃縮乾固して得られた脂質画分は１．０５ｇ　
（乾燥菌体当たり５．１３％）であった。この両分を０
．３　Ｎ−ＮａＯＨを含有する９５％エタノール中で８
０℃にて１時間鹸化し、これを６Ｎ−ＨＣｌにより中和
し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得た。

次に、ジアゾメタンによりメチルエステル化した後、ガ
スクロマトグラフにて分析して、測定した所０．１９８
　ｇ　（脂質画分の１８．９％、乾燥菌体の０．９７％
）のＥＰＡが含まれていることが分かった。

このＥＰＡを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラム
を用い、メタノールを？容出液としてカラム逆相分配ク
ロマトグラフィーを行なうことにより精製されたＥＰＡ
　０．１７７ｇを得た。

肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣ１０，５
％を含有し、ｐＨ７，０に調整した培地１０１を１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・キシ
ロ−サス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ　　ｄｓｃＲｃ−２
５１７（微工研菌寄第９６６８号）を接種し、２５℃で
２４時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機で菌体
を採取し湿重量約１４５ｇ　（乾燥重量で１９．６　ｇ
　）の菌体を得た。菌体を０．８５％の食塩水で１回洗
浄した後、０．５１の同食塩水に懸濁した。この菌体懸
濁液を０．５１のクロロホルム−メタノール溶液（２：
　１　　ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心分離し
、クロロホルム相を得た。更に水相及び菌体をクロロホ
ルム３００−で振とう抽出したのち、遠心分離し、クロ
ロホルム相を得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾固し
て得られた脂質画分は１．０１ｇ（乾燥菌体当たり５．
１５％）であった。この画分を０．３　Ｎ　−ＮａＯＨ
を含有する９５％エタノール中で８０℃にて１時間鹸化
し、これを６Ｎ−Ｈ（Ｊにより中和し、遊離のＥＰＡを
含む生成物を得た。

次に、ジアゾメタンによりメチルエステル化した後、ガ
スクロマトグラフにて分析して、測定した所０．１７３
ｇ　（脂質画分の１７．１％、乾燥菌体の０．８８％）
のＥＰＡが含まれていることが分かった。

このＥＰＡを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラム
を用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロ
マトグラフィーを行なうことにより精製されたＥＰＡ　
０．１５９ｇを得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ア
   ルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属又はシーワ
   ネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属に属し、エイコサペン
   タエン酸含有脂質を生産することができる微生物を培養
   することによってエイコサペンタエン酸含有脂質を生成
   蓄積せしめ、所望によりさらにエイコサペンタエン酸を
   単離することを特徴とするエイコサペンタエン酸含有脂
   質又はエイコサペンタエン酸の製造方法。 ２、エイコサペンタエン酸含有脂質を生産することがで
   きるシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ア
   ルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属又はシーワ
   ネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属に属する微生物。 ３、前記シュードモナス属微生物がシュードモナス・ピ
   ュートリファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕ
   ｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）ＳＣＲＣ−２１８１、ＳＣＲＣ
   −２２０１、ＳＣＲＣ−２２７１、ＳＣＲＣ−２３４１
   、ＳＣＲＣ−２４５１、ＳＣＲＣ−２６４２、ＳＣＲＣ
   −２７９２、ＳＣＲＣ−２８７８、ＳＣＲＣ−３０１１
   又はＳＣＲＣ−３０２２である特許請求の範囲第２項に
   記載の微生物。 ４、前記アルテロモナス属微生物がアルテロモナス・ピ
   ュートリファシエンス（￥Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ￥　
   ￥ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ￥）ＳＣＲＣ−２８７１、
   アルテロモナス・ピュートリファシエンス・サブスピー
   シズ・サガミファシエンス（￥Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ
   ￥　￥ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ￥　ｓｕｂｓｐｅｃｉ
   ｅｓ　￥ｓａｇａｍｉｆａｃｉｅｎｓ￥）ＳＣＲＣ−１
   １６２、アルテロモナス・ルーメンサス（￥Ａｌｔｅｒ
   ｏｍｏｎａｓ￥　￥ｌｕｍｅｎｓａｓ￥）ＳＣＲＣ−６
   ４４４、又はアルテロモナス・キシローサス（￥Ａｌｔ
   ｅｒｏｍｏｎａｓ￥　￥ｘｙｌｏｓｕｓ￥）ＳＣＲＣ−
   ２５１７である特許請求の範囲第２項に記載の微生物。 ５、前記シーワネラ属微生物がシーワネラ・ピュートリ
   ファシエンス（￥Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ￥　￥ｐｕｔｒ
   ｅｆａｃｉｅｎｓ￥）ＳＣＲＣ−２８７４である特許請
   求の範囲第２項に記載の微生物。