JPH0761271B2 - 微生物を用いたエイコサペンタエン酸含有脂質の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、エイコサペンタエン酸（以下EPAという）含
有脂質の製造方法に関する。

（従来の技術） EPAに代表される多価不飽和脂肪酸は、生体膜の構成成
分として重要な役割を担っている。またこれまでに知ら
れているEPAの薬理作用には、以下のものが知られてい
る。血小板凝集抑制作用（血栓溶解作用）血液中の
中性脂肪低下作用血液中のVLDL−コレステロール、LD
L−コレステロール低下作用、HDL−コレステロール増加
作用（抗動脈硬化作用）血液粘度低下作用血圧降下
作用抗炎症作用抗腫瘍作用。さらに、プロスタグラ
ンジン一族の生成に際し基質となり、ヒトを含む高等ほ
乳動物の体内で必須的な機能を発揮する。特にEPAはタ
イプ３のプロスタグランジンの生成の際の基質として重
要であって、血小板の凝集抑制作用があり、血栓症の治
療及び予防剤としての応用が検討されている。さらにEP
Aは、血漿コレステロールレベルの低下に寄与する多価
不飽和脂肪酸の中でも特にその活性が高く、通常の植物
油に含まれるリノール酸などよりも遥かに有効である。
また魚類等の必須栄養素としても知られている。

このように、EPAがその血栓防止作用あるいは脂質低下
作用に基づく健康食品あるいは医薬品としての可能性が
デンマークのタイヤーベルグ（Am.J.Clin.Nutr.,28,95
8,1975）の疫学調査により明らかにされているが、その
化学構造から明らかなように化学合成することは、極め
て困難である。このようなことから我が国においてもEP
Aを多く含有するイワシ、サバ、サンマ等の青背魚の摂
取が推奨されるようになってきた。

今日、健康食品として市販されているEPAは、そのほと
んどが煮取法によって得られた魚油の分別物であって、
そのEPA含量は10〜30％程度である。煮取法によって抽
出される魚油は構成脂肪酸として多種類の脂肪酸を含む
混合グリセリドであって、各成分を単離精製することが
困難であるばかりでなく、EPAはすべてシス形の二重結
合を５個有する炭素数20の直鎖の多価不飽和脂肪酸であ
る為に、極めて酸化され易い不安定な脂肪酸であり、魚
油からEPAを濃縮する場合には酸素・光・熱等を避けて
行なう必要がある。さらに、これら魚油EPAの分別に使
用されたアセトン、メチルエチルケトン等各種の有機溶
剤は通常減圧下に除去されるが、その完全除去は技術的
及びコスト的に問題点が多い。

医薬品としてのEPAは、様々な方法によって抽出された
魚油を酵素的にもしくはアルカリ条件下で処理して遊離
脂肪酸まで加水分解するか又は該遊離酸をメチルもしく
はエチルエステルに変じた後、これらを低温分別結晶
法、尿素付加法、減圧蒸留法又は、逆相クロマト法等に
より更に精製してEPA濃度を90％以上としたものが多
い。しかし、これらの方法を用いて得られたEPA濃縮物
は、工程中に各種の有機溶剤が使用されたりまたは、20
0℃近い高熱を加えられたりするため、有機溶剤の残留
やEPAの重合、異性化あるいは酸化等による変質の懸念
をはらんでいる。更に、魚油等をEPAの原料として用い
た場合、心臓疾患の原因の一つとして疑われているドコ
セン酸等の除去が困難であるため、健康食品、医薬品等
に利用する上で問題点を残している。

一方、最近、不完全な精製・濃縮では、魚臭が残るなど
の欠点を有した魚油からの抽出法を改善することを目的
として、クロレラ、単細胞藻類モノダス、ユーグレナあ
るいはけい藻等微生物を用いたEPAの生産方法が散見さ
れる様になり、微生物を利用したEPA生産が注目されて
きている。最近では、ゲラーマンとシュレンク（J.L.Ge
llerman and H.Schlenk,BBA,573,23,1979）及び、山田
等（昭和61年度日本醗酵工学会大会、1986）の発表で、
EPAを産生するかび（糸状菌）についての報告がなされ
た。

これら微生物によるEPA生産は、その脂肪酸組成から、
分離精製が比較的容易なこと、また、培養制御により、
EPA生産をコントロールしやすい等の長所がある。しか
しながらこれらの糸状菌を用いた場合には、バクテリア
等に比較して、培養時間が長く（７日〜１ケ月程度）、
生産性の向上が大きな問題点として残っている。

（本発明が解決しようとする問題点） 以上述べて来た様に、健康食品または、医薬品として考
えられているEPAの、魚油からの抽出生産、あるいは、
藻類やかび等の培養による生産には、いくつかの問題点
が有る。これらのことから、本発明の目的は、精製が容
易で純度の高いものが得られ、かつ培養時間が短く培養
制御が容易な、バクテリアを利用したEPA含有脂質の醗
酵生産方法を見出す事にある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、EPA産生能を有するバクテリアを、広く
海洋に求めて鋭意研究した結果、パスツレラ（Pasteure
lla）属に属するバクテリアがEPAを生産することを見出
し、この知見に基づいて本発明を完成した。

従って、本発明は、パスツレラ属に属し、EPA含有脂質
を生産することが出来る微生物を培養する事によってEP
A含有脂質を生成蓄積せしめ、次いで該脂質を採取する
ことを特徴とする、エイコサペンタエン酸含有脂質の製
造方法を提供するものである。

（具体的な説明） （１）微生物 本発明において使用する微生物は、パスツレラ属に属
し、EPA又はこれを含有する脂質を生産する事が出来る
ものであればよく、このような微生物は自然界から新た
に分離する事が出来る。

パスツレラに属する微生物の例として、パスツレラ・ヘ
モリティカ（Pasteurella haemorytica）を挙げる事が
出来、新菌株として本発明者等が分離した、パスツレラ
・ヘモリティカSCRC−2288を挙げる事が出来る。

この新菌株は次のように分離した。

次の第一表に示す組成の培地を調整した。

この寒天平板培地に各地の海洋より採取した海洋性生物
体サンプルを滅菌した生理食塩水で適度に希釈したもの
を接種し、25℃で１〜２日間培養した。この寒天平板培
地に出現したコロニーを同じ培地組成の斜面培地に釣菌
した。

このようにして各地の海洋より採取した海洋性生物体サ
ンプルから多数の菌株を分離した。次に表の培地より寒
天を抜いたものを試験管に5mlずつ分注し、同様に滅菌
した。それぞれの菌株をこの培地で25℃、１〜２日間培
養した。得られた培養液より、後記の方法によりEPA産
性能を検定した。このようにして、EPAを顕著に生産す
る下記の菌株を北海道余市沖より採取した海洋性生物体
サンプルより得た。

この菌株は、次のような菌学的性質を有する。

観察項目 ａ）形態 １ 細胞の形 短かん菌 大きさ 0.6×1.2μｍ ２ 多形性の有無 無 ３ 運動性の有無 無 鞭毛の着生状態 一本・極鞭毛 ４ 胞子の有無 無 ５ グラム染色 陰性 ６ 抗酸性 陰性 ｂ）各培地に於ける生育状態 １ 肉汁寒天平板培養（25℃,2日間） イ）コロニー形状（直径） 1.5×1.5mm ロ）コロニーの形 円形 ハ）コロニー表面の形状 平滑 ニ）コロニーの隆起状態 台状 ホ）コロニーの周縁 全縁 ヘ）コロニーの色調 黄褐色 ト）コロニーの透明度 半透明 チ）コロニーの光沢 光沢 リ）可溶性色素の生成 無 ２ 肉汁寒天斜面培養（25℃,2日間） イ）生育の良否 良好 ロ）コロニーの光沢 光沢 ３ 肉汁液体培地（25℃,2日間） イ）表面の生育 無 ロ）濁度 濁る ハ）沈殿 粉状 ニ）ガス発生 無 ４ 肉汁ゼラチン（25℃,2日間） ゼラチン液化 液化 ５リトマスミルク 還元 ｃ）生理学的性質 １ 硫酸塩の還元 ＋ ２ 脱窒 − ３ MR − ４ VP − ５ インドール生成 − ６ 硫化水素の生成 ＋ ７ デンプンの加水分解 − ８ クエン酸利用 イ）Koser − ロ）Christensen − ９ 硝酸塩の利用 − 10 色素生成 イ）King Ａ 培地 − ロ）King Ｂ 培地 − 11 ウレアーゼ − 12 オキシダーゼ ＋ 13 カタラーゼ ＋ 14 生育の範囲 イ）pH ５〜９ ロ）温度 ５℃〜30℃ 15 酸素に対する態度 通性嫌気性 16 Ｏ−Ｆ テスト（グルコース） ＋（Ｆ） 17 糖類から酸及びガス生成 1.L−アラビノース − 2.D−キシロース ＋ 3.D−グルコース ＋ 4.D−マンノース − 5.D−フラクトース − 6.D−ガラクトース ＋ 7.麦芽糖 ＋ 8.ショ糖 ＋ 9.乳糖 − 10.トレハロース − 11.D−ソルビット − 12.D−マンニット ＋ 13.イノシット − 14.グリセリン − 15.デンプン − （ただしガスの生成 全項目−） ｄ）その他の諸性質 SS寒天培地での生育 − マッコンキー寒天培地での生育 − 6.5％NaCl耐塩性 ＋ DNase ＋ オルニチンの分解 − アルギニンの分解 − Na⁺要求性 − 以上のような諸性質から、本菌株SCRC−2288は下記の大
きな特徴を持つ。

グラム陰性 運動性を持たない 非胞子形成の通性嫌気性かん菌 Ｏ−Ｆテスト陽性（糖を醗酵する） カタラーゼ、オキシダーゼ陽性 硝酸塩還元能陽性 このような諸性質を有する本菌株SCRC−2288株の分類学
的な位置は、バージイズ・マニュアル・オブ・システマ
ティック・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Sys
tematic Bacteriology）第１巻、550ページ、1984年の
分類基準により、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteure
lla haemolytica）であると同定される。

なお、糖からの酸およびガスの生成テストの項目の中に
は必ずしも文献記載のそれと一致しない項目があるが、
これらは分類学上さほど重要な項目ではなく、同一種で
も一般的によく変化するものであり、これらの記載に必
ずしも規定されるものではない。

以上、自然界から分離した菌株について詳細に記載した
が、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性の高い菌
株を得ることも出来る。

この発明の菌株は、常法に従って保存することが出来、
例えば寒天スラント培地上で、または凍結乾燥法により
保存することが出来る。寒天スラント培地としては、パ
スツレラ属細菌の保存に常用されている培地、例えば菌
の分離に関して前記した培地を使用することが出来る。
また、凍結乾燥保存も常法に従って行なうことができ
る。

上記の菌株 パスツレラ・ヘモリティカSCRC−2288は工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第9425号
（FERM P−9425）として寄託されている。

（２）EPA含有脂質の製造方法 前記の微生物を培養してEPA含有脂質を製造しようとす
る場合、基礎栄養培地として、この発明の微生物が増殖
しうるものであればいずれを使用しても良い。

この培地は、窒素源として例えば酵母エキス、ペプト
ン、肉エキス等の１種類または複数種類を含有する。ま
たこの培地には必要に応じて炭素源として各種の糖類を
加えることが出来る。

培養は固体培地または液体培地のいずれを用いても良い
が、目的とするEPA含有脂質を多量に得る為には、液体
培地を用い、培養を行なうのが好ましい。培養温度は菌
が生育し、EPAが生産される温度範囲であればいずれの
温度でも良く、好ましくは５〜30℃であり、より好まし
くは15〜25℃である。pHは５〜９、好ましくは、７〜８
の範囲である。培養時間は採取し得る量のEPA含有脂質
が生産される時間を選べば良く、好ましくは８〜48時間
である。

次に得られた培養物からEPA含有脂質が採取される。精
製法として通常の脂質精製法を用いることが出来る。例
えば、培養液から遠心分離、ろ過等の常用の集菌手段に
よって菌体を集める。次に、この菌体を所望により水、
食塩水、又は緩衝液、例えばリン酸緩衝液等により洗浄
した後、これらの液中に再懸濁する。この懸濁液を、脂
質の抽出のために常用されている溶剤、例えばクロロホ
ルム／メタノール混合液により抽出し、相分離してクロ
ロホルム相を得る。次に、このクロロホルム相を蒸発除
去することによりEPA含有脂質を含む材料が得られる。
常法によりこれを鹸化することにより遊離のEPA又はそ
の塩を得る事が出来る。

かくして、本発明によれば上記のバクテリアを使用して
醗酵生産することにより、精製が容易でかつ短時間で多
量にEPA含有脂質及びEPAを得ることが出来る。

次に本発明のEPA含有脂質の製造方法の具体的な１例を
示す。

実施例１ パスツレラ・ヘモリティカ SCRC−2288からのEPA含有
脂質の生産 肉エキス1.0％，ペプトン1.0％,NaCl0.5％を含有し、pH
7.0に調整した培地20lを121℃、15分間加熱殺菌したの
ち、パスツレラ・ヘモリティカ SCRC−2288（微工研菌
寄第9425号）を接種し、25℃で24時間培養した。培養
後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量約195g（乾燥重量
で17.6g）の菌体を得た。菌体を0.85％の食塩水で１回
洗浄した後、１に懸濁した。この菌体懸濁液を１の
クロロホルム−メタノール溶液（2:1 v/v）で良く振と
う抽出した後、遠心分離し、クロロホルム相を得た。更
に水相及び菌体をクロロホルム600mlで振とう抽出した
のち、遠心分離し、クロロホルム相を得た。クロロホル
ム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂質画分は1.54g
（乾燥菌体当たり8.75％）であった。

この画分を0.3N−NaOHを含有する95％エタノール中で80
℃にて１時間鹸化し、これを6N−HClにより中和し、遊
離脂肪酸混合物を得た。

この遊離脂肪酸混合物をジアゾメタンによりメチルエス
テル化した後、ガスクロマトグラフにて分析し、測定し
た所0.166g（脂質画分の10.8％，乾燥菌体の0.94％）の
EPAが含まれていることが分かった。

このEPAを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラムを
用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロマ
トグラフィーを行なうことにより精製されたEPA0.152g
を得た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】パスツレラ（Pasteurella）属に属し、エ
   イコサペンタエン酸含有脂質を生産することができる微
   生物を培養することによって、エイコサペンタエン酸含
   有脂質を生成蓄積せしめ、次いで該脂質を採取すること
   を特徴とする、エイコサペンタエン酸含有脂質の製造方
   法。
2. 【請求項２】微生物がパスツレラ・ヘモリティカ（Past
   eurella haemolytica）である特許請求の範囲第１項に
   記載の製造方法。