JPS6411279B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な酵素であるＤ−スレオニンア
ルドラーゼ及び、微生物を用いてこの酵素を製造
する方法に関する。 スレオニンアルドラーゼとは、スレオニンをグ
リシンとアセトアルデヒドに分解する酵素であ
り、これまでＬ−スレオニン及びＬ−アロスレオ
ニンに特異的に作用してこれをグリシンとアセト
アルデヒドに分解するＬ−スレオニンアルドラー
ゼ（E.C.4.1.2.5）は動、植物のほか細菌、酵母、
放線菌等の微生物にも存在することが知られてい
る。しかしながら、Ｄ−スレオニンをグリシンと
アセトアルデヒドに分解するＤ−スレオニンアル
ドラーゼの存在は全く知られていなかつた。 本発明者らは、食品添加物、飼料添加物等に潜
在市場の大きいＬ−スレオニンの製法としてDL
−スレオニンを光学分割する方法に着目し、Ｄ−
スレオニンを分解する酵素を広く検索した結果、
たまたまアリスロバクター属、シユードモナス属
およびアルカリゲネス属に属する特定の微生物が
Ｄ−スレオニンをグリシンとアセトアルデヒドに
分解する新規な酵素Ｄ−スレオニンアルドラーゼ
を産生することを見出し、これに基いて本発明を
完成した。 すなわち、本発明は、新規な酵素であるＤ−ス
レオニンアルドラーゼ、及びアリスロバクター
属、シユードモナス属、またはアルカリゲネス属
に属しＤ−スレオニンアルドラーゼを産生しうる
微生物を栄養培地に培養し、培養物からＤ−スレ
オニンアルドラーゼを採取することを特徴とする
Ｄ−スレオニンアルドラーゼの製造法に関するも
のである。 本発明において使用される微生物はアリスロバ
クター属、シユードモナス属、またはアルカリゲ
ネス属に属しＤ−スレオニンアルドラーゼ産生能
を有するものであり、例としてはアルカリゲネ
ス・ハエカリス（Alcaligenes faecalis）
IFO12669、シユードモナス（Pseudomonas）
DK−２微工研菌寄第6200号、およびアリスロバ
クター（Arthrobacter）DK−19微工研菌寄第
6201号を挙げることができる。 シユードモナスDK−２微工研菌寄第6200号お
よびアリスロバクターDK−19微工研菌寄第6201
号の菌学的性質を次に示す。 (a) 形態

【表】 (b) 各培地における生育状態

【表】 (c) 生理学的性質

【表】

【表】 以上の菌学的性質をもとに「バージエーズ・マ
ニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリ
オロジー 第８版（1974）」を参照して分類する
と、DK−２菌はグラム陰性の桿菌で極鞭毛を有
し、オキシダーゼ陽性、脱窒反応陽性であるとこ
ろからシユードモナス属に属するものと同定し
た。一方、DK−19菌はグラム染色性が弱い桿菌
で、多形性及び周毛を有し、糖類を資化できない
ことから、アリスロバクター属に属するものと同
定した。本発明の微生物は前述の各属に属しＤ−
スレオニンアルドラーゼ産生能を有すれば足り、
例えばＤ−スレオニンアルドラーゼとＬ−スレオ
ニンアルドラーゼを同時に菌体内に含有する菌株
が本発明の微生物に含まれるのはいうまでもな
く、この菌株を変異処理して得られたＬ−スレオ
ニンアルドラーゼ欠損株なども含まれる。 このような微生物を培養してＤ−スレオニンア
ルドラーゼを生成せしめるには特に困難はなく、
通常の細菌類の培養に準じて行なえばよい。すな
わち、培地について炭素源としてはグルコース、
グリセロール、糖蜜等の糖類あるいは酢酸、リン
ゴ酸等の有機酸など、窒素源としては硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、尿素など、有機栄養
源として酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コー
ンステイープリカーなど、そして無機イオンとし
てマグネシウム、鉄、マンガン、カリウム、リン
酸塩などを含むものを用いる。培地中にＤ−スレ
オニンを0.05〜0.5％程度添加すると酵素の産生
量が増加する場合もある。 培養方法も常法によればよく、例えば培地のPH
を４〜10として菌を接種後20〜60℃で１〜３日間
好気的に培養すればよい。 このようにして得られるＤ−スレオニンアルド
ラーゼは主に菌体内に生成蓄積される。そこで、
Ｄ−スレオニンアルドラーゼを酵素源として使用
する場合には、培養物あるいはそれから分離した
菌体をそのまゝあるいは乾燥して用いてもよい
が、Ｄ−スレオニンアルドラーゼをより精製した
形で使用する必要がある場合には、まず菌体を機
械的方法、酵素処理する方法、自己溶解法など公
知の方法によつて破壊して粗抽出液を得る。それ
から、この粗抽出液を硫安沈殿、アセトン又はエ
タノールなどによる溶媒沈殿、DEAE−セフアロ
ース、DEAE−セフアデツクス、リン酸カルシウ
ムゲル等の種々のイオン交換体や吸着剤を用いた
クロマトグラフイーなどを適宜組合せて精製する
ことによつて高純度の酵素標品を得ることができ
る。本酵素の活性発現には、補酵素としてピリド
キサール−5′−リン酸を必要とするため、反応時
には通常10^-3〜10^-5Mで存在させる。 本発明のＤ−スレオニンアルドラーゼの理化学
的性質は下記の実施例１及び２で得られた酵素標
品について測定したところ次の結果を示した。 ａ 作用および基質特異性 本酵素はＤ−スレオニンおよびＤ−アロスレ
オニンを分解してグリシンとアセトアルデヒド
を生成する。一方、Ｌ−スレオニンおよびＬ−
アロスレオニンにはまつたく作用しない。 ｂ 至適PH Ｄ−スレオニンを基質として各PHにおいて30
℃で10分間反応させ、生成したアルデヒドを定
量したところ、方酵素の至適PHは７〜９にあつ
た。尚、用いた緩衝液はPH４〜7.5までは0.1M
リン酸緩衝液、PH７〜９までは0.1Mトリス−
HCl緩衝液及びPH９〜11までは0.1M炭酸ソー
ダ緩衝液である。 ｃ PH安定性 酵素溶液を各PHにおいて30℃で１時間加温
後、溶液中の残存活性を測定したところ、本酵
素の安定PH範囲は６〜９で100％活性が残存し
ていた。尚、用いた緩衝液はPH４〜7.5までは
0.1Mリン酸緩衝液、PH７〜９までは0.1Mトリ
ス−HCl緩衝液及びPH９〜11までは0.1M炭酸
ソーダ緩衝液である。 ｄ 至適温度 Ｄ−スレオニンを基質としてPH8.0の0.1Mト
リス−塩酸緩衝液を用い、各温度で10分間反応
させ、生成したアセトアルデヒドを測定したと
ころ、本酵素の至適温度は40〜50℃にあつた。 ｅ 熱安定性 PH8.0の0.1Mトリス−塩酸緩衝液に溶解した
酵素溶液を各温度で１時間加熱後、溶液中の残
存活性を測定したところ、本酵素の安定温度は
40℃以下であつた。 ｆ 阻害、活性化および安定性 本酵素はメルカプトエタノール、亜硫酸ナト
リウム、亜硫酸水素ナトリウム、ジチオスレイ
トール、Mn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺によつて
活性化され安定化される。一方、Ag¹⁺、Cu²⁺、
Hg²⁺、Zn²⁺、Pd²⁺、ヒドロキシルアミン、ｐ
−クロルマーキユリー安息香酸によつて阻害さ
れる。 ｇ 補酵素 本酵素の活性発現には補酵素としてピリドキ
サール−5′−リン酸を必要とする。 ｈ 分子量 セフアデツクスＧ−200によるゲル濾過の結
果分子量は100000〜150000と測定された。 ｉ 失活の条件 本酵素はPH５以下、PH11以上、および温度70
℃以上では１時間に失活する。 ｊ 元素分析値 実施例１及び２で得られた各酵素の元素分析
値は近似した数値を示すが、その由来する属別
に記載する。 アリスロバクター属由来Ｃ；51.7％、Ｈ；
7.8％、Ｎ；15.7％、Ｏ；24.8％ シユードモナス属由来Ｃ；50.5％、Ｈ；7.1
％、Ｎ；14.8％、Ｏ；27.6％ アルカリゲネス属由来Ｃ；52.7％、Ｈ；8.1
％、Ｎ；16.4％、Ｏ；22.8％ 前記した酵素の力価の測定法は酵素含有液
0.1mlを100μmoleのＤ−スレオニンを含有する
PH8.0の0.1Mトリス−塩酸緩衝液0.9mlに加え、
30℃で10分間加温して生成したアセトアルデヒ
ドをPaz法〔Arch.Biochem.Biophys.、
Vol.109、p548（1965）〕によつて定量して求め
た。尚、１分間に1μmoleのＤ−スレオニンを
分解する酵素活性を1Uとした。 実施例で得られた酵素は以上のような理化学的
性質を有しているが、従来知られているスレオニ
ンアルドラーゼはすべてＬ−スレオニンを分解す
るものであつて本酵素のようにＤ−スレオニンを
分解するものは全く知られていないところから、
本酵素は明らかに全く新しい作用を有する新規酵
素である。 本酵素は、例えばDL−スレオニンを原料とし
てＬ−スレオニンを製造する方法に用いれば光学
分割工程を簡略化しうるが、そのほかＤ−スレオ
ニンの定量分析などにも有効である。 以下、実施例を示す。なお、％は全て重量％で
ある。 実施例 １ ポリペプトン0.5％、酵母エキス0.5％、
KH₂PO₄0.1％、MgSO₄0.05％、Ｌ−グルタミン
酸0.1％、およびＤ−スレオニン0.1％からなるPH
8.0の培地を調製し、５容の培養槽にその３
を投入して120℃で15分間加熱殺菌した。この培
地にアリスロバクターDK−19微工研菌寄第6201
号を接種し、PH7.5に保ちながら30℃で20時間通
気および撹拌をしつつ培養した。 培養終了後、培養液１から菌体を遠心分離
し、生理食塩水で１回洗滌後この湿菌体を0.1ｍ
Ｍピリドキサール−5′−リン酸及び10ｍＭメルカ
プトエタノールを含むPH7.5の0.1Mトリス−塩酸
緩衝液100ml中に懸濁した。この菌体懸濁液を
20KHzで10分間超音波処理して菌体を破壊してか
ら12000r.p.mで60分遠心して傾瀉し、105mlの粗
酵素抽出液を得た。 得られた粗酵素抽出液に硫安を加えて0.3〜0.5
飽和区分を分取し、この区分を上記緩衝液に対し
て１晩透析した。DEAE・セフアデツクスＡ−50
100mlを充填し、前記の緩衝液で予め平衝化して
おいたカラムに透析残液を通液して酵素を吸着さ
せた後、塩化ナトリウム溶液を0.1〜0.4Mまで濃
度を変えてカラムに通液し、溶出液の各フラクシ
ヨンのうちＤ−スレオニンアルドラーゼ活性区分
を集めた。この活性区分は塩化ナトリウムの濃度
が0.3Mの付近にあつた。集めた活性区分をセフ
アデツクスＧ−200 200mlを充填したカラムに通
液してゲル過を行ない、Ｄ−スレオニンアルド
ラーゼ活性区分を集め、メムブラムフイルターで
濃縮し、酵素濃縮液15mlを得た。この酵素液中の
タンパク含量は2.4mg／mlでＤ−スレオニンに対
する比活性は1.24U／mgであり、Ｄ−アロスレオ
ニンに対する比活性は3.33U／mgであつた。一
方、Ｌ−スレオニンおよびＬ−アロスレオニンに
対しては全く活性を示さなかつた。 実施例 ２ シユードモナスDK−２微工研菌寄第6200号お
よびアルカリゲネス・ハエカリスIFO12669を用
い、いずれも実施例１と同じ培地に同様に培養
し、培養液から酵素を分離したところシユードモ
ナスDK−２菌の場合には、タンパク濃度2.3mg／
mlの酵素液12mlが、アルカリゲネス・ハエカリス
菌の場合には、タンパク濃度2.1mg／mlの酵素液
11mlが得られた。この酵素活性を測定したとこ
ろ、前者はＤ−スレオニンに対する比活性が
1.01U／mgであり、Ｄ−アロスレオニンに対する
比活性が2.96U／mgであつた。一方、後者のそれ
はＤ−スレオニンに対する比活性が0.86U／mgで
あり、Ｄ−アロスレオニンに対する比活性が
2.95U／mgであつた。そして、いずれもＬ−スレ
オニンおよびＬ−アロスレオニンに対しては全く
活性を示さなかつた。 いずれの酵素も実施例１の酵素と同じNaCl濃
度で溶出され、かつ基質特異性、至適温度、温度
安定性、至適PH、PH安定性及び分子量等の理化学
的性質が類似しており、同一酵素と判断された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するＤ−スレオニン
   アルドラーゼ。 ａ 作用及び基質特異性；Ｄ−スレオニン及びＤ
   −アロスレオニンを分解してグリシンとアセト
   アルデヒドを生成する。一方、Ｌ−スレオニン
   及びＬ−アロスレオニンにはまつたく作用しな
   い。 ｂ 至適PH；PH７〜９にあつた。 ｃ PH安定性；30℃で１時間加温後ではPH６〜９
   の範囲でほぼ100％活性が残存していた。 ｄ 至適温度；PH8.0では40℃〜50℃にあつた。 ｅ 熱安定性；PH8.0で１時間加温後では40℃ま
   で安定であつた。 ｆ 阻害剤、安定剤及び活性化剤；Ag¹⁺、Cu²⁺、
   Hg²⁺、Zn²⁺、Pd²⁺、ヒドロキシルアミン、ｐ
   −クロルマーキユリー安息香酸によつて阻害さ
   れる。一方メルカプトエタノール、亜硫酸ナト
   リウム、亜硫酸水素ナトリウム、ジチオスレイ
   トール、Mn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺によつて
   安定化及び又は活性化される。 ｇ 補酵素；活性発現には補酵素としてピリドキ
   サール−5′−リン酸を必要とする。 ｈ 分子量；セフアデツクスＧ−200によるゲル
   過の結果分子量は100000〜150000と測定され
   た。 ｉ 失活の条件；PH５以下、PH11以上又は70℃以
   上に１時間放置すれば失活する。 ｊ 元素分析値； アリスロバクター属由来Ｃ；51.7％、Ｈ；
   7.8％、Ｎ；15.7％、Ｏ；24.8％ シユードモナス属由来Ｃ；50.5％、Ｈ；7.1
   ％、Ｎ；14.8％、Ｏ；27.6％ アルカリゲネス属由来Ｃ；52.7％、Ｈ；8.1
   ％、Ｎ；16.4％、Ｏ；22.8％ ２ アリスロバクター属、シユードモナス属、ま
   たはアルカリゲネス属に属し、Ｄ−スレオニンア
   ルドラーゼを産生しうる微生物を栄養培地に培養
   し、培養物からＤ−スレオニンアルドラーゼを採
   取することを特徴とするＤ−スレオニンアルドラ
   ーゼの製造法。