JPH02274A - 新規な２５−ヒドロキシビタミンｄ↓３誘導体およびその製造法およびそれを用いた定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、新規な２５−ヒドロキシビタミンＤ３アミノ
酸誘導体を合成し、それをハプテンとして担体蛋白質と
結合させて免疫することにより得た抗体またはビタミン
Ｄバインディングプロティン（ＤＢＰ）と、ヨードの放
射性同位元素で標識された新規なヨードの放射性同位元
素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体を用いて、
被験液中の活性型である２５−ヒドロキシビタミンＤｓ
Ｗｔを定量することを目的として確立した発明であり、
合成化学、免疫化学および放射化学の分野に係る。

〈従来の技術〉 従来、２５−ヒドロキシビタミンＤ、の定量法として、
コンペティティブプロテインパインディフグアッセイ法
（ＣＰＢＡ法）とラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）
が知られており、これらの方、ＣＰＢＡ法において用い
られるビタミンＤバインディングプロティンは、一般に
はビタミンＤ欠乏飼料飼育ラットの血漿を用いることが
知られており（ビタミン第５５巻、１２号（１２月）１
９８１、第５９５頁〜６０５頁）、また、ＲＩＡ法にお
いて用いられる抗体を作製するためのハプテンとしては
、側鎖末端にカルボニル基をもつもの等が知られている
（特開昭５８−９２６５６号公報、特開昭５５−４７６
５３号公報、特開昭５９−１４８７７５号公報）。

いづれの定量法においても、標識化合物としては、２５
−ヒドロキシビタミンＤ、のトリチウム〔３Ｈ〕標識化
合物を用いる点で共通している。

〈発明が解決しようとする問題点〉 被験液中の２５−ヒドロキシビタミンＤ、の定量におい
て、前述の従来用いられているトリチウム〔３旧標識化
合物は、放射エネルギーが′ＰやＩｔｓ　　ｌと比較し
て極めて低く、そのためにトリチウム〔３Ｈ〕標識化合
物を用いた定量法は、液体シンチレーションカウンター
等による検出装置を必要とするため、高価であり且つ測
定操作が煩雑であった。そのため高感度でより簡便な測
定法が望まれていた。

く問題点を解決するための手段〉 本発明者らは、前述の問題点を鑑み鋭意研究の結果、高
放射線エネルギーを有し、汎用性において優れている放
射性ヨードで標識された２５−ヒドロキシビタミンＤ、
誘導体を開発した。従来、単位時間当たりの放射エネル
ギーの低いβ線放出核種であるトリチウム〔３Ｈ〕によ
る種々のビタミンＤ、標識化合物が存在した。しかし、
トリチウム〔３Ｈ〕と同様にラジオイムノアッセイに汎
用される放射エネルギーの高いγ線放出核種のヨード（
ｌｕｌｌ）で標識されたビタミンＤ、誘導体は、ビタミ
ンＤの特徴でもある共役トリエン構造の不安定さゆえ、
ラジカル反応を誘発し自己分解を起こすと考えられ、現
在まで報告されていない。

しかるに、本発明者らが開発したヨード（ＩＩｓ　　１
〕で標識された２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体は
Ｔ線による構造的分解を起こすことな（安定であり、ラ
ジオイムノアッセイに利用しうるちのであることを見出
した。

一般に低分子化合物の放射性ヨード標識法としては、直
接標識法（クロラミン−Ｔ法）と間接標識法（ポルトン
−ハンター試薬等による方法）がある（Ａｍｅｒｓｈａ
ｓ＋；アマシャームノートＩＮｏｖ。

１９８１）、Ｌかし、ビタミンＤ類は酸、酸素、酸化剤
、熱、光に対して非常に不安定であるため、緩和な反応
条件で進行する間接標識法を用いることが最も好ましい
０間接標識法を実施するに当り、まず、側鎖末端にアミ
ノ基を有する新規な２５−ヒドロキシビタミンＤ、アミ
ノ酸誘導体を合成した。さらに、該誘導体をハプテンと
して担体蛋白質と結合せしめ、これを動物に接種して抗
体を得た。また同誘導体にヨードの放射性同位元素標識
を行った。さらに、得られた抗体とヨードの放射性同位
元素標識化合物を用いてラジオイムノアッセイの測定系
を確立するに到り、被験液中の２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ３の定量に際して、８亥測定系を用いるアッセイ法
が高感度かつ簡便な掻めて有用性に冨む定量法であるこ
とを見出した。

また、従来行われているＤＢＰを用いたＣＰＢＡ法によ
っても本発明のヨード放射性同位元素標識化合物を用い
て高感度に２５−ヒドロキシビタミンＤ３を定量測定で
きることを見い出した。

即ち本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので
あって、式（１） 〔式中、Ｒ１は炭素数１〜１０のアルキレン基を示す〕
で表される新規な２５−ヒドロキシビタミンＤ、アミノ
酸誘導体および、式（ＩＩ）〔式中、Ｒ１は炭素数１〜
１０のアルキレン基、Ｒ２はアミノ保護基を示す〕で表
される２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体を、塩基存
在の不活性溶媒中でアミノ保護基を脱離せしめることを
特徴とする、式（１）で表される新規な２５−ヒドロキ
シビタミンＤ、アミノ酸誘導体の製造法であ〔式中、Ｒ
１は炭素数１〜１ｏのアルキレン基、Ｒ１はヨードの放
射性同位元素を有する残基を示す〕で表されるヨードの
放射性同位元素標識２５ヒドロキシビタミンＤ、誘導体
である。また、被験液に式（Ｉｆｆ）で表されるヨード
の放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘
導体と２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗体とを反応せし
めて生成する該ヨードの放射性同位元素標識２５−ヒド
ロキシビタミンＤ、誘導体−２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ、抗体結合体と、未反応線ヨードの放射性同位元素標
１ｉｉ２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体とを分離し
、次いで分離したいずれか一方の放射性同位元素である
標識ヨードの量を定量することを特徴とする該被験液中
の２５−ヒドロキシビタミンＤ、の定量法である。また
、式（Ｉ［ｌ）で表されるヨードの放射性同位元素標識
２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体とビタミンＤバイ
ンディングプロティン（以下、ＤＢＰと略すことがある
）とを反応せしめて生成する該ヨードの放射性同位元素
標ｒａ２５−ヒドロキシビタミンＤ３誘導体−ＤＢＰ結
合体と、未反応線ヨードの放射性同位元素標識２５−ヒ
ドロキシビタミンＤ、誘導体とを分離し、次いで分離し
たいずれか一方の放射性同位元素である標識ヨードの量
を定量することを特徴とする該被験液中の２５−ヒドロ
キシビタミンＤ、の定量法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

まず、式（１）で表される２５−ヒドロキシビタミンＤ
、アミノ酸誘導体は、アミノ酸を２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ、の３位炭素のβ水酸基を介して共有結合せしめ
て得られるもので、式〔■〕のＲ６は炭素数１〜１０の
アルキレン基である。

また、この式（１）で表される２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ、アミノ酸誘導体は、後述の２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ、抗体作製時のハプテンの誘導体としても用いら
れ、ハプテンのＦＡＲ体として担体蛋白質と結合させる
際の架橋基の鎖長は、炭素数にして１〜１０個が好まし
く、特に好ましくは２〜６個が挙げられることから、Ｒ
，は直鎖状炭素数２〜６個からなるアルキレン基である
ことが特に好ましい。

式（１）で示す２５−ヒドロキシビタミンＤ。

アミノ酸誘導体は、２５−ヒドロキシビタミンＤ。

にアミノ基が保護されたアミノ酸を反応せしめ、式（Ｉ
ｔ）で表される２５−ヒドロキシビタミンＤ３誘導体を
得、該誘導体（ｎ）からアミノ保護基を脱離せしめるこ
とにより得られる。

まずアミノ基を保護するために使用する原料アミノ酸と
しては、下記の式（ＩＶ） ＨＯＯＣＲ１ＮＨｔ　　　　　（ＴＶ）（式中Ｒ，は前
記と同し基を示す）で表されるものであり、Ｒ１で示さ
れるアルキレン基は炭素数ｎ＝１．グリシン、ｎ＝２．
β−アラニン、ｎ＝３、Ｔ−アミノ−ｎ−酪酸、β−ア
ミノ−１ｓｏ　−酪酸、ｎ−４，Ｄおよび／またはＬ体
のオリリジン、ｎ＝５．ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、
ｌ’１−＝６．７−アミツニナント酸、さらにｎ＝１０
．１１−アミノウンデシル酸であって、アミノ酸中の炭
素構造は好ましくは直鎖状であり、炭素数２〜６個のア
ルキレン基を有するものが好ましく、本発明の技術思想
からすれば、δ−アミノ−レブリン酸、グリシルグリシ
ンやδ−アミノ酸であるＤおよび／またはＬ体のリジン
等を用いることもできる。さらに、側鎖中に水酸基を有
するアミノ酸、例えば４−アミノ−３−ヒドロキシブチ
リックアシド等でも水酸基を保護することによって同様
に用いることができる。

また、アミノ酸のアミノ保護基としては、アミノ保護基
の脱離操作に際して、苛酷な脱離条件を要する場合には
ビタミンＤ類自体が分解されることもあり得ることから
、弱塩基条件下で緩和に短時間で脱離できるものであれ
ばよく、例えば、９−フルオレニルメチルカルボニル基
〔以下、Ｆｍ０Ｃと略すことがある）、９−（２−スル
ホ）フルオレニルメチルカルボニル基、１，１−ジメチ
ル−２−シアノエチルオキシカルボニル基、５−ペンズ
イソキサゾリルメチルオキシカルボニル鰭等が挙げられ
るが、特に好ましくは容易にアミノ酸のアミノ基を保護
することができる９−フルオレニルメチルオキシカルボ
ニル基が、アミノ基の保護基として良い。アミノ基を保
護したアミノ酸を得るに当たっては、上述のアミノ保護
基を有する活性誘導体として、例えばＦｍｏ　ｃをもつ
活性エステルである、Ｎ−サクシニイミディルー９−フ
ルオレニルメチルオキシカルボキシレートが挙げられ、
その他にも、９−フルオレニルメチルクロロホルメート
を用いることができる。またアミノ基の保護を行うに際
しては、該活性誘導体と目的のアミノ酸を公知の方法（
Ｌ、Ａ、Ｃａｒｐｉｎｏ　ａｎｄ　Ｇ。

Ｙ、Ｈａｎ　Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、　、Ｌ１１７．３
４０４　（１９７２）　）にて反応せしめＦｍｏ　ｃ−
アミノ酸を得ればよい。

さらにアミノ基を保護したアミノ酸としてＦｍ０Ｃ−ア
ミノ酸を用いて式（Ｉ［）の２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ、アミノ酸誘導体を得るための方法を例にとると、Ｆ
ｍｏｃ−アミノ酸を２５−ヒドロキシビタミンＤ、０３
位炭素のβ水酸基を介して共有結合せしめるに当り、２
５−ヒドロキシビタミンＤ３　１当量に対してＦｍｏｃ
−アミノ酸またはその酸無水物、酸ハライドまたは活性
エステル等の通常使用されるカルボキシル基反応性誘導
体を１当量用いることにより式（ｎ）で表される化合物
が得られる。より好ましくは、Ｆｍｏ　ｃアミノ酸１当
量と”他の酸゛ｌ当量からなる混合酸無水物を、不活性
ガス霊気下、塩基存在の無水溶媒中で反応せしめる。該
混合酸無水物を用いて２５−ヒドロキシビタミンＤ、と
反応せしめるのは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３の炭
素２５位の水酸基にＦｍｏ　ｃ−アミノ酸が結合した副
生成物を生成させないためであり、該混合酸無水物を調
製するに当り”他の酸”としては、吉草酸、ピバリン酸
、イソブチロキシカルボニルが用いられ、特にピバリン
酸が好ましい。２５−ヒドロキシビタミンＤ、とＦｍｏ
　ｃ−アミノ酸との反応において、無水溶媒としてはテ
トラヒドロフラン、ジオキサン等の無水有機溶媒が好ま
しい、また、塩基としては、特にジメチルアミノピリジ
ン（ＤＭＡＰ）およびピペリジノビリジン（ＰＰＹ）が
好ましい。これは、立体障害のある２級アルコール、３
級アルコールのエステル化に有用である。

不活性ガスとしては、アルゴンおよび窒素ガスが好まし
い。また、反応に当たり、反応温度はＯ〜２０゛Ｃ１反
応時間は１〜３時間が好ましい、このようにして得られ
た式（ｎ）で表される２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘
導体は、必要に応じてカラムクロマトグラフィー、３Ｎ
クロマトグラフイ（ＴＬＣ）等の精製手段を用いて精製
してもよい。

さらに式（ｎ）で表される該２５一ヒドロキシビタミン
Ｄ、誘導体を、塩基存在の不活性溶媒中でアミノ保護基
の脱離操作（脱Ｆｍｏｃ化）により、式（Ｉ）で表され
る２５−ヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体とする
。この保護基の脱離操作を行うに当たり、用いられる塩
基としては、ピペリジン、モルホリン、エタノールアミ
ン等があり、特にモルホリンが好ましく、不活性溶媒と
しては、エタノール、メタノールが良く、特に無水エタ
ノール、無水メタノールが好ましい、また反応は不活性
ガス霊気下、遮光状態で行ない、反応温度はＯ〜２０°
Ｃ１反応時間は１〜３時間が好ましい、このようにして
得られた、式（１）で表される２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ３アミノ酸誘導体は、必要に応じてカラムクロマト
グラフィーＴＬＣ等の精製手段を用いて精製してもよい
。

次いで、式（ＩＩＩ）で表されるヨードの放射性同位元
素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体について述
べるｓＲｌについては上述の式（１）において説明した
Ｒ１と同意味を示し、Ｒ１はヨードの放射性同位元素を
有する残基であり、用いられるヨードの放射性同位元素
としては、ｌ！ＪやＩ３１！などが用いられるが、好ま
しくは半減期の比較的長いｌ！Ｊが良い、ヨード（１１
％　ｌ　）の放射性同位元素を有する残基としては、３
−（４−ヒドロキシ−３−ヨード〔１８５Ｂフエニル）
プロピオニル基、３−（３，５−ショート〔重１％１）
−４−ヒドロキシフェニル）プロピオニル基、２−（４
−ヒドロキシ−３−ヨード〔目ＳＩ〕フェニル）アセチ
ル基、２−（３，５−ショート〔”’Ｉ）−４−ヒドロ
キシフェニル）アセチル基、２−ヨード（Ｉｔｓ　ｌ　
）アセチル基、４−ヨード〔Ｉｔｓ　ｌ　）−ベンゾキ
シメチルカルボニル基、Ｎ置換−３−ヨード（Ｉｔｓ　
　１）チロシン残基などが挙げられる。特に３−（４−
ヒドロキシ−３−ヨード〔ＩｔＳ■〕フェニル）プロピ
オニル基および３−（３，５−ショート（１２％１）　
　　４−ヒドロキシフェニル）プロピオニル基が好まし
い。

ヨードの放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ、誘導体の製造においては、弐（１）で表される２５
−ヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導体に、間接標識
法（例えば、ポルトン−ハンター試薬による方法）によ
り放射性ヨードで標識せしめることにより、式（ＵＬ　
）で表されるヨードの放射性同位元素標識２５−ヒドロ
キシビタミンＤ３誘導体を得る。ここでいう間接標識法
とは、ヨードの放射性同位元素を有する残基を構成成分
とする後記の反応性誘導体（ＩＶ）と、２５−ヒドロキ
シビタミンＤ、アミノ酸誘導体を反応せしめ、放射性ヨ
ードを標識せしめた式（Ｉ［［）で表されるヨードの放
射性同位元素標！！＋２５−ヒドロキシビタミンＤ３誘
導体を得る方法である。

上記した反応性誘導体（ＩＶ）は、式 ％式％（） で表され、Ｒ，は前述と同じ意味を示し、Ｘは、サクシ
ニイミディルーＮ−オキシ基、フタルイミダイル−Ｎ−
オキシ基、５−ノルボルネン−２゜３−ジカルボキシイ
ミダイル−Ｎ−オキシ基またはマレイミディルーＮ−オ
キシ基を示し、Ｒ８が３−（４−ヒドロキシ−３−ヨー
ド（Ｌ！Ｓ（）フェニル）プロピオニル基であり、Ｘが
サクシニルゴミデイルーＮ−オキシ基である　Ｎ−サク
シニルイミディル３−（４−ヒドロキシ−３−ヨード（
１２５■）フェニル）プロピオネートは〔１１■〕ポル
トン−ハンター試薬として市販されており、筒便に使用
できる。

例えば、この（Ｉｔｓ　　Ｉ）ポルトン−ハンター試薬
を用いて、式（１）で表される２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ、アミノ酸誘導体に間接標識を行うために、ヨード
の放射性同位元素とアミノ基を介して共有結合せしめる
際は、反応に用いるヨード（１１５１３ポルトン−ハン
ター試薬数ｐ　ｍｏｌｅ〜数ｍ　ｍｏｌｅに対して、２
５−ヒドロキシビタミンＤ。

アミノ酸誘導体を５００〜２０００倍程度過剰に添加す
るのが好ましく、特に１０００倍で添加するのが好まし
い０通常、反応は０〜３０″Ｃ１１２〜７２時間行えば
よい。ここで、反応生成物であるヨード（＋１１１）の
放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導
体〔■〕は、ＲｒＡ法またはＣＰＢＡ法における利用率
を高めるために、ＴＬＣまたは高性能液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）などでより純度を高くすることが好
ましい。このようにして得られたヨード（１，ｓ　　１
）１１ｍ２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体は、エタ
ノール溶液中に一２０°Ｃ保存においてヨード（１２５
■）の半減期である２ケ月以上安定であり、ラジオイム
ノアッセイに充分使用しうるちのであった、この際、保
存温度はできるだけ低温が良く５°Ｃ〜−２０°Ｃ以下
、特に−２０″Ｃ以下が好ましい。溶媒はアルコール系
、エーテル系が好ましく保存の際は不活性ガスで置換す
ることが好ましい つぎに、ハブテンである２５−ヒドロキシビタミンＤ、
の抗体作製のために用いる、前述の如くに得られた式（
１）で表される２５−ヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸
誘導体を担体蛋白質と結合サセ、それを動物に接種する
ことにより２５−ヒドロキシビタミンＤ３抗体を作製し
得る。２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗体を得るにあた
り、まず抗体作製のために用いるハプテンの免疫原性抗
原を得るに必要な担体蛋白質としては、例えば、単純蛋
白質、ポリペプチド、糖蛋白などの複合蛋白質等が挙げ
られ、単純蛋白質としては牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
、ヒト血清アルブミン、ヒト血清グロブリンなどがあり
、ポリペプチドとしては、ポリリジン等で、糖蛋白とし
てはムコ蛋白質等が挙げられる。中でも単純蛋白質が好
ましく、特に牛血清アルブミン、ヒト血清アルブミンが
好ましい。２５−ヒドロキシビタミンＤ３アミノ酸誘導
体（１）と上述の担体蛋白質とを縮合剤、架橋剤の存在
下で共有結合せしめる。その際、縮合剤、架橋剤として
は、ジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）、酸無水物、グ
ルタルアルデヒドなどが用いられるが、中でも特にＤＣ
Ｃが好ましい、２５−ヒドロキシビタミンＤ、アミノ酸
誘導体と担体蛋白質との結合比率は、一般に多過ぎても
少な過ぎても得られる抗体の力価が低下するため、担体
蛋白質一分子当りにつき、２５−ヒドロキシビタミンＤ
、アミノ酸誘導体を１０〜４０個結合せしめるのが好ま
しい。

かくして得られる抗体作製のための上記の結合体は、動
物に接種して抗体を生産させることができる。動物に接
種するには、非経口的に投与する方法が採用され、例え
ば皮下または皮肉に注射することによって行われる。接
種する際には、例えば、上述の操作得られた２５−ヒド
ロキシビタミンＤ、アミノ酸誘導体−担体蛋白質の結合
抗原を緩衝液または生理食塩水に溶解し、同量のコンプ
リート・フロイント・アジュバント（ＣｏＢｌｅｔｅ　
ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ　　：　Ｃ，Ｆ、
　Ａ）を加え、充分乳化した後、用いる温血動物の皮下
、皮肉に投与し、１〜３週間毎に同一結合抗原を約１０
回はど投与して免疫せしめる。また必要により、結合抗
原を免疫担当中枢器官である肺臓に直接接種してもよい
、この間、一定期間毎に血中抗体価を測定しながら最高
時点で全採血しこれを静置し、凝固せしめて遠心分離し
、２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗体を含有する抗血清
を得る。また、この場合に用いる温血動物としては抗体
産生能のある動物であれば何れを用いてもよく、大量の
抗体を得るにはヤギ、ウシ等の大型動物を用いるのが好
ましい０通常はウサギ、ラットを用いるが、何ら限定さ
れるものではない、さらにこれらの被免疫動物から得ら
れた２５−ヒドロキシビタミンＤ。

抗体を含有する抗血清から２５−ヒドロキシビタミンＤ
、抗体を得るには、通常用いられる抗体の精製手段の方
法によって行なえばよく、例えば抗血清を硫安分画し、
次いでイオン交換クロマトグラフィーあるいはゲル濾過
によって精製・採取すればよい。

さらに２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗体を得る別法と
しては、上述の２５−ヒドロキシビタミンＤ、アミノ酸
誘導体−担体蛋白質の結合体抗原を接種した動物の目的
抗体産生肺臓細胞と株化された骨！！ｆｉｌｌ細胞とを
融合せしめて得られるハイプリドーマ（融合細胞）が産
生ずるモノクロナール抗体を製造する方法を用いてもよ
い。特に、哺乳動物としてマウスを用いる方法がよく利
用されている０例えばマウス（ＢａＩｌｂ／ｃ）を用い
、２５−ヒドロキシビタミンＤ、アミノ酸誘導体−担体
蛋白質の結合抗原を緩衝液または生理食塩水に溶解し、
同量のコンプリート・フロイント・アジュバントを加え
て混和懸濁した乳化液をマウスの皮下に投与し、その後
約１週間毎に複数回追加投与し、感作を行なう。その後
、最終感作の３〜５日後に細胞融合の作業を行う、これ
は最終感作３〜５日後の肺臓における抗体産生前駆細胞
を使用する細胞融合は、目的抗体の産生能を有するハイ
ブリドーマが最も得られやすいといわれているためであ
って、通常このような細胞が最も多くなる最終感作後３
日日頃の肺臓細胞が融合に用いられる。それ故、最終怒
作から３〜５日後に、２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗
体産生細胞である肺臓細胞を採取して、これを長期培養
可能な株化骨髄腫細胞と融合させる。長期培養可能な株
化細胞とは、インビトロまたはインビボの条件下で長期
間生育し増殖する免疫グロブリンまたはその類縁蛋白質
の産生細胞であればよく、通常は増殖が旺盛なＩＩ！ｌ
！ｉ細胞株が用いられる。好ましい代表例を挙げると骨
髄腫細胞株（ミエローマ細胞）であるＰ３−ＮＳＩ／１
−Ａｇ４−１、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１、ＳＰ２／Ｕ−
Ａｇ１４、ＭＰＣｌｌ−４５，６，ＴＧ、１．７等の細
胞株が挙げられるが、本発明においてはＰ３−Ｘ６３−
Ａｇ８Ｕ１が好適である。これらの細胞株は通常の細胞
培養培地で培養保存される。例えば培養は１０％ＦＣ３
添加ＲＰＭ１１６４０（商品名：ＲＰＭ１１６４０：フ
ローラボラトリー社製）にグルタミン、ピルビン酸、ペ
ニシリン、ストレプトマイシン等を加えた培地で行い、
保存には同じ培地にＳアザグアニンを添加した培養液が
用いられる。

細胞融合に際しては１回の融合に１〜３Ｘ１０’個のミ
エローマ細胞を使用すればよい。融合に用いられる抗体
産生細胞である肺臓細胞は、前記したような感作後のマ
ウスを解剖して肺臓をとり出し、細断した後、細胞用メ
ツシュ上でずりつぶし、肺臓細胞懸濁液を調製する。細
胞は洗浄等の処置をしてからミエローマ細胞との融合に
使うが、１回の融合には、通常１〜３Ｘ１０”個の細胞
が使用される。細胞融合は上記の如くして得られた肺臓
細胞とミエローマ細胞を混合して行われる。

混合の割合は、経験的にミエローマ細胞：肺臓細胞を１
：３〜１０の割合で行われる。細胞融合はハイプリドー
マ用培地で行われる。融合に際しては、通常の細胞融合
の方法、即ちセンダイウィルスやポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）等の融合促進剤を用いるのがよいことは言
うまでもないが、本発明においてはＰＥＧの使用が最適
である。このように融合促進剤を加えて融合した細胞を
前記したハイブリドーマ用培地へ分注し、培養を行う。

このようにしてマウス肺臓細胞とマウスミエローマ細胞
の融合が行われるが、融合細胞のみを選択するためにＨ
ＡＴ培地にて融合細胞を識別増殖させる。ＨＡＴ培地は
前記したハイブリドーマ用培地にヒボキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジンを添加した培地である。このよう
に選択したハイプリドーマは一般に細胞選択用プレート
の１穴当り２個以上のハイブリドーマが生育しており、
２種以上抗体が分泌される可能性があることや、他に抗
体を分泌できないハイブリドーマが混在していたりする
ので、同一の性質を有する細胞を得るために、個々のク
ローンを分離する必要がある。

即ち、クローン化（クローニング）を行うことが必要で
ある。クローン化の方法としては、限界希釈法や軟寒天
法が用いられるが、本発明においては限界希釈法が簡便
である。

このようにして得られた、高力価の２５−ヒドロキシビ
タミンＤ、抗体を分泌するハイブリドーマを保存するの
であれば、なるべく早い時期の内に凍結保存するのがよ
い。凍結保存は通常の方法にしたがい、例えば凍結用小
試験管やアンプルに細胞液を入れ、−８０°Ｃのフリー
ザー中で凍結させて、更に液体窒素中にて保存すればよ
い。さらに、ハイプリドーマ増殖法の一例としては、予
めプリスタン（ｐｒｉｓ　ｔａｎ＋　２＋　６＋　１０
＋　１４−　ｔｅｔｒａｍｅｔｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａ
ｎｅ　、アルドリッチ社製）を腹腔内投与したプリスタ
ン処理マウスの腹腔に、前記のハイブリドーマを投与し
、約１０日後腹水を採取することにより抗体の大量調製
を行うこともできる。また該ハイブリドーマをウシ胎児
血清含有ＲＰＭＩ培地やダルヘッコ変法イーグル培地等
にて培養してもよい。得られた抗体は通常用いられる精
製手段、例えば抗体を硫安分画し、次いでイオン交換ク
ロマトグラフィーあるいはゲル濾過やアフィニティーク
ロマトグラフィー等を行って、ＩｇＧ分画を行う。この
ようにして精製された２５−ヒドロキシビタミンＤ、モ
ノクロナール抗体を得ればよい。

また、２５−ヒドロキシビタミンＤ、モノクロナール抗
体産生細胞を、組織適合性抗原を同じくする動物や無胸
腺のヌードマウスの体内で！ＩＩ瘍として生育せしめ、
これから採取、精製してもよい。

さらに２５−ヒドロキシビタミンＤ３の定量に際し、２
５−ヒドロキシビタミンＤ、ポリクロナール抗体または
２５−ヒドロキシビタミンＤ３モノクロナール抗体（以
下、−括して２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗体と略す
ことがある）は、そのままの可溶性の状態で用いてもよ
く、または不溶性担体に固定化した固相体として用いて
もよい。

このような固相体としては、不溶性担体と２５−ヒドロ
キシビタミンＤ、抗体とを、多官能性試薬を用いて結合
せしめ、且つこの結合抗体が２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ、に対して抗体活性を保持していればよい。用いられ
る多官能性試薬としては、アミノ基、水酸基、カルボキ
シル基、チオール基等の官能基と反応し得る基を二つ以
上有する多官能性試薬であればよく、例えば、スクシン
アルデヒド、グルタルアルデヒド、アジボアルデヒド等
のアルデヒド化合物、マロン酸、コハク酸、グルタル酸
、アジピン酸等のジカルボン酸またはその反応性誘導体
、ヘキサメチレンジイソシアナート、２．４−トルエン
ジイソシアナート等のジイソシアナート化合物、ヘキサ
メチレンジイソチオシアナート等のジイソチオシアナー
ト化合物、マレイミド安息香酸、マレイミドフェニル酢
酸等のマレイミドカルボン酸またはその反応性誘導体、
Ｎ、Ｎ’　−エチレンビスマレイミド、Ｎ、Ｎ’０−フ
ェニレンジマレイミド等のシマレイミド化合物、ビスジ
アゾベンジジン、ジエチルマロンイミデート、ジメチル
アジピンイミデート、Ｎ。

Ｎｏ−ポリメチレンビスヨードアセトアミドや３（２°
−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオ７Ｍ、３−（２
°−ピリジルジチオ）プロピオン酸等のチオカルボン酸
化合物またはその反応性誘導体等が挙げられ、これらの
多官能性試薬は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３抗体の
アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等の官
能基との結合を考慮して選択すればよい。用いられる不
溶性担体としては、用いる抗体を結合させることができ
る多官能性試薬の官能基以外の他の官能基と反応し得る
基を導入せしめたものであればよく、例えばアルブミン
やゼラチン等の不溶化蛋白質、アガロース、セルロース
やデキストリン等のエピクロルヒドリン処理による不溶
化多ｔＪ！類や臭化シアン処理およびアミノ基導入を目
的として、これに対応するスペーサーが導入され、且つ
不溶化されたアクリロニトリル、アクリル酸、アクリル
酸エステル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エステル
、ビニルアルコール、酢酸ビニル、スチレン、アミノス
チレン、クロルスチレン、マレイン酸、フマル酸等の重
合体または共重合体等の不溶性合成高分子系担体やケイ
素やアルミニウム等の無機化合物にアミノ基等の官能基
導入の不溶性無機系担体が挙げられる。また用いる不溶
性担体は、単なる物理的な吸着作用により、２５−ヒド
ロキシビタミンＤ、抗体を結合し得るものであってもよ
い。これらの不溶性担体は、通常少なくとも濾過等の手
段により容易に単離できる粒径のものがよく、例えば径
１ｍｍ以上、好ましくは５ｍｍ以上のものがよく、ビー
ズ状のものが繁用される。

また、ビーズ状の代わりに、抗原抗体反応管の管底部の
形状と相位した紡錘形の形状のものとして用いてもよい
。

２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗体にスペーサー導入試
薬を用いて反応し得る基を導入するに当たっては、例え
ば、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポ
アルデヒド等のジアルデヒド化合物、ω−アミノ酪酸、
ω−アミノグルタミン酸の酸クロライド、スクシンイミ
ドエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル等の反応性誘
導体、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸等
のジカルボン酸化合物の反応性誘導体、ヘキサメチレン
ジアミン、デカメチレンジアミン等のジアミン化合物、
３−（２“−ピリジル−ジチオ）プロピオン酸、３−　
（２’　−ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸等
の反応性誘導体、Ｓ−アセチルメルカブトサクシニンク
・アンハイドライド、２−アミノエタンチオール等のチ
オール化合物等のスペーサー導入試薬の１個または２個
以上を用いて新たにアルデヒド基、カルボキシル基、ア
ミノ基、チオール基等の官能基を導入すればよい。

次いでこのような不溶性担体の反応し得る基に、２５−
ヒドロキシビタミンＤ３抗体を直接または多官能性試薬
を用いて結合せしめるのであるが、縮合においては、通
常ｐＨ６，０〜８．５の緩衝液または有機溶媒またはこ
れらの混合媒体中で０〜４０°Ｃにて各々を反応せしめ
ればよい。また別の固相体を製造する方法としては、用
いる不溶性担体の物理的な吸着能を利用して吸着固定化
せしめてもよい。さらにこの２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ３の抗体産生に用いた動物の血清に存在する通常の免
疫グロブリン画分を用いて他種の動物、特に大型哺乳動
物に免疫せしめて得られた第二抗体を用い、この第二抗
体を不溶性担体に固定化せしめ、次いでこれに２５−ヒ
ドロキシビタミンＤ。

抗体を抗原抗体反応により結合せしめて得られる２５−
ヒドロキシビタミンＤ３抗体活性がほとんど失活せしめ
ることのない固定化手段によって固相体を得てもよい。

さらにこのようにして得られた固相体は、洗浄、保存す
ればよい。

さらにまた上記の固相体を用いる代わりに２５ヒドロキ
シビタミンＤ、抗体を可溶性のままで用いて、被検液中
の２５−ヒドロキシビタミンＤ。

を定置する場合には、予め一定量の式（ＩＩＩ）で表さ
れるヨードの放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ、誘導体が加えられた被検液に、最適量の２５−
ヒドロキシビタミンＤ、抗体を添加することによって産
生される上記の標１ｎ２５ヒドロキシビタミンＤ、誘導
体および被検液中に存在する２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ３と２５ヒドロキシビタミンＤ、抗体との抗原抗体反
応結合体と未反応の標識２５−ヒドロキシビタミンＤ。

誘導体とを分離するために、２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ、抗体に対する特異的抗体が用いられる。

この特異的抗体は第二抗体とも呼ばれ、第二抗体は例え
ば２５−ヒドロキシビタミンＤ３の抗体産生に用いた動
物の血・清に存在する通常の免疫グロブリン画分を抗原
として用い、これを公知の免疫手段により他種の動物、
特に大型哺乳動物の皮下、または皮肉に注射して免疫し
、その抗血清から得ることができる。この第二抗体は必
要に応じて公知の精製手段により抗血清から抗体を得て
もよく、また抗血清の状態にて利用することが簡便であ
る。

さらに、上述の如く得られた２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ、抗体とヨードの放射性同位元素標識２５−ヒドロキ
シビタミンＤ３誘導体を用いた被験液中の２５−ヒドロ
キシビタミンＤ、の定量法を述べる。まず、２５−ヒド
ロキシビタミンＤ。

の含有量を測定しようとする被験液、例えばヒトの血清
において、まず血清中の２５−ヒドロキシビタミンＤ、
を抽出する。血清と同量の溶媒を加えて撹拌・静置後、
遠心分離にて抽出し、得られた上清液を分離し、カラム
クロマトグラフィーにて２５−ヒドロキシビタミンＤ、
を粗精製し、２５−ヒドロキシビタミンＤ、の溶出画分
を分取するやさらに好ましくは、これをＨＰＬＣカラム
にチャージし、溶出することにより精製するのがよい、
２５−ヒドロキシビタミンＤ、の溶出画分は、予めトリ
チウム〔３Ｈ〕の放射性同位元素標識２５−ヒドロキシ
ビタミンＤ、を用いて確認しておきその両分を集めて２
５−ヒドロキシビタミンＤ、を回収する。この２５−ヒ
ドロキシビタミンＤ３溶出画分を減圧乾燥し、アルゴン
ガスで置換し、さらにエタノールに溶解し、被験液とし
て測定に用いる。次いで、該被験液中の２５−ヒドロキ
シビタミンＤ３を定量する。まず、該被験液に一定適量
のヨードの放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ、誘導体を添加し、次いで最適量の２５−ヒドロキ
シビタミンＤ３抗体を加え、抗原抗体反応用溶媒、例え
ばリン酸緩衝液やベロナール緩衝液中４〜５℃程度にて
約１５時間〜７２時間インキエベートして抗体に対する
放射性ヨード標識ハプテンと定量すべき無標識ハプテン
との競争反応を惹起せしめる。その後、抗体に対する放
射性ヨード標識ハプテンと定置すべき無標識ハプテンと
の競争反応の結果、生成した抗原抗体結合体、特にヨー
ドの放射性同位元素標識２５ヒドロキシビタミンＤ、誘
導体−２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗体の結合体（Ｂ
）と、結合体形成に関与しないで残存する未反応のｉ離
体（Ｆ）、特に未反応遊離体であるヨードの放射性同位
元素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体のとを分
離するために、デキストラン−チャコール法（ＤＣ法）
により、濾過または遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５ｍ
１ｎ、）によりＢ−Ｆ分離を行ない各々の放射活性を測
定し、そのＢ／　（Ｂ＋Ｆ）あるいはＢ／Ｆの放射活性
を算出して、被検液中の２５−ヒドロキシビタミンＤ、
（Ｈ）の量を求める。すなわち、Ｈの量が増大すれば、
Ｂの放射活性は減少し、Ｆの放射活性は増大する。

したがって、未知量のＨが存在する条件下でＢとＦの放
射活性を測定すれば、あらかじめ既知量を用いて作製し
ておいた標準曲線から未知量のＨの量を測定できる。

また、Ｂ−Ｆ分離に当たって、用いる抗体が可溶性のま
まであり、第二抗体を用いる二抗体法を採用する場合に
は、競争反応後、第二抗体、さらに好ましくは第二抗体
を含有する抗血清、必要に応じてキャリアーとして２５
−ヒドロキシビタミンＤ、抗体作製に用いた同一種の動
物の正常血清を加えて、１〜１２時間インキュベートし
、その後抗原抗体反応によって生成した結合体を３００
ＱｒｐｍｌＯ〜３０分程度の遠心分離で沈殿せしめた沈
澱部分（Ｂ）とその上清部分（Ｆ）とを分別し、洗浄し
た沈澱物または上清のいづれか一方の放射活性を測定す
ればよい。

本測定によって、２ｐｇ／Ｔｅ５ｔ　〜２５６ｐｇ／Ｔ
ｅ５ｔまでの標準曲線が作製でき、この測定系において
、反応時間は５”Ｃ，１６時間または３７°Ｃ，１時間
で、迅速性を有し、反応後の処理操作は簡便であり、被
検液の希釈および添加回収試験も直線性をもっことから
、かなり高精度である。また、ヒト血清中の２５−ヒド
ロキシビタミンＤ３の濃度測定について、本発明の（目
５ｌ）ＲＩＡ法と従来の〔”　Ｈ）ＣＰＢＡ法との相関
関係を調べたところ、相関係数ｒ−０，９８０（ｙ＝０
．９２８Ｘ　　＋１．９０　ｎ・１８）の相関を示した
。

また、従来より用いられているＤＢＰを抗体の代わりに
使用しても、本発明中の２５−ヒドロキシビタミンＤ３
−ヨード（１！Ｓ　　Ｉｌ放射性同位元素標識誘導体と
反応し、１〜３２　ｐｇ／Ｔｅ５ｔの間で標識曲線が作
成できる。ＤＢＰは、ニワトリ、ラット、マウス、ウサ
ギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ヒトなどの動物の血清より得
られる。

次いで、本発明の実施例および参考例を挙げて具体的に
述べるが、本発明は何らこれらによって限定されるもの
ではない。

〔参考例１〕 血清中の２５−ヒドロキシビタミンＤｓの抽出・精製法 血清０．５ｍｆｆ１に対してアセトニトリル０．　５ｍ
１．を用いポルテックスミキサーにて撹拌後３０分静置
した。その後遠心骨Ｈ（３，ＯＯＯｒｐｍ、　１０ｎ＋
ｉｎ。

）し、得られた上清液０．８ｍｊ！を分取した。その上
清液０．８ｍｊ！をモツプパックＣ−１８カートリツジ
カラム（商品名、　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ　５Ｗａｔｅｒ
ｓ社製）にチャージし、含水アセトニトリルで溶出し、
粗精製した。その際モツプパックＣ−１８カートリツジ
カラムは常法に従いエタノールで活性化し、５０％アセ
トニトリルで平衡化したものを使用した０次に５０％ア
セトニトリル４ｍ！！、で洗浄し、次に６４％アセトニ
トリル４ｍｆで溶出（１α２５ヒドロキシビタミンＤ、
を含む両分）し、次に７３％アセトニトリル４ｍｆで溶
出（２５−ヒドロキシビタミンＤ３．２４．２５−ヒド
ロキシビタミンＤ３を含む両分）し、７３％アセトニト
リル溶出画分を減圧乾燥し、アルゴンガスで置換するこ
とにより２５−ヒドロキシビタミンＤ１画分を得た。さ
らに好ましくは、この粗精製の両分をｎ−ヘキサン−イ
ソプロパツール（９：　１）の混合溶媒２００ｍ！に溶
解し、ＨＰ　Ｌ　ＣのＺｏｒｂａｘ−ＳｒＬ　（Ｄｕｐ
ｏｎｔ社製＞　０．４６Ｘ２５ｃ、カラムにチャージし
て溶出することにより精製した。ここで、セソプパック
Ｃ−１８カートリンシカラムおよびＩ（ＰＬＣにおける
２５−ヒドロキシビタミンＤ３の溶出画分は、予めトリ
チウム〔３Ｈ］の標識２５ヒドロキシビタミンＤｓ　　
（２６，２７ｍｅｔｈｙ＋−’Ｈ〕を用いて確認した。

さらに、２５−ヒドロキシビタミンＤ、溶出画分（Ｒｔ
　＝　４〜５ｍ１ｎ、）を減圧乾燥し、アルゴンガスで
直換した。この溶出画分をエタノール２ｍｆｆ１に溶解
し、測定にはその２０μ！使用した。

本操作による２５−ヒドロキシビタミンＤ、の回収率は
９４．６±２．４％（ｎ−１８＞であった。

〔参考例２〕 ３−（Ｎ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミ
ノプロピオン酸の合成 Ｎ−サクシニイミディルー９−フルオレニルメチルオキ
シカルボキシレート（６７４ｍｇ、２ｍ　ｍｏｌｅ　）
をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）　　−ジメチルホルム
アミド（ＤＭＦ）−ＨｚＯ（１：　２　：　２）２５ｍ
２の混合溶媒に溶かし１、Ｔ−アミノ−ｎ　−プロピオ
ン酸（１７８ｍｇ、２ｍ　ｍｏｌｅ　）を加えて、室温
下、−晩反応せしめた。その後、反応液を減圧留去し、
残渣をシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−２００、７５
ｇ　−ＣＨＣＩｓ　　：メタノール−９：１）にて分離
・精製して、表題の目的物５３８．８ｍｇ（収率８６．
５％）を得た。

ＮＭＲ０δ（ＤＭＳＯ−ｄ６　） ２．５０−２．６０　（２Ｈ＋ｔ＋−ＣＬ−２）３．２
８Ｊ、３５　（２１１，ｍ、−ＣＨｚ−２）４．３３−
４．４４・（３１１，ａ＋、　Ｆｍｏｃ　　）７．３５
−８．０６　（８Ｈ，ｍ、　Ｆｍｏｃ　　）〔実施例１
〕 ２５−ヒドロキシビタミンＤ、−３β−０−（３’　−
（Ｎ−９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミ
ノ−プロピオン酸エステル〕の合成 参考例２で得られた３−（Ｎ−９−フルオレニルメチル
オキシカルボニル）アミノプロピン酸（１８，７ｍｇ、
０．０６ｍ　ｍｏｌｅ）を乾燥ＴＨＦ３ｍｊ２に溶解し
、ピバロイルクロライド（７，３８ｕ　ｊ！　　、ｄ　
、　０．９７９．０゜０６ｍ　ｍｏｌｅ）とジメチルア
ミノピリジン（ＤＭＡＰ：　７，３２ｍｇ、０．０６ｍ
　ｍｏｌｅ）を加え、アルゴン霊気、遮光下、−１５°
Ｃにて１５分間反応させた。それに２５−ヒドロキシビ
タミンＤ３（２４，０ｍｇ、０．０６＋ｗ　Ｉｇｏｌｅ
）のＴＨＦ１ｍｆ溶液を加え、０°Ｃで１時間、室温で
１時間反応後、はぼ２５−ヒドロキシビタミンＤ、が消
失した。この時点でメタノール０゜５ｍｌを加え反応を
停止した後、減圧留去した。

残渣を分取用Ｔ　Ｌ　Ｃ（Ａｒｔ５７１７　（Ｍｅｒｃ
ｋ社製）２０Ｘ　２０ｃｍ、展開溶媒、酢酸エチル−ヘ
キサン（１：２）〕にて分離精製して、表題の目的物３
０．１ｍｇ（収率７２．４％）を得た。

ＮＭＲ，δ（ＣＤＣ１３）　Ｉ）ｐＨ１Ｏ，５３７（３
８，Ｓ、　Ｃ１１３−１８）３．３０−３．６０　（２
１１，Ｉｌｌ、−Ｃ）ＩＩ−Ｎ−）４．１０−４．５０
　（３）１４．　Ｆｍｏｃ　　）４．８０−５．６０　
（４１１，ｍ、　Ｈ−１９Ｅ、Ｈ−３α、Ｈ−１９Ｚ、
−ＮＨ）５．９４−６．２９　（２Ｈ，ｌＩｌ、　Ｈ−
７，Ｈ−６）７．２０−７．８１　（８１１，ｍ、　Ｆ
ｍｏｃ　　）ＥＩＩＨ ＵＶ、λＭｄ　　ｎｍ　　　　３００．２　、２６６．
４　、２１４．４（実施例２〕 ２５−ヒドロキシビタミンＤ、−３β−０−（３゛−ア
ミノ−プロピオン酸エステル）の合実施例１で得られた
２５−ヒドロキシビタミンＤ、−３β−０−〔３°　−
（Ｎ−９’　−フルオレニルメチルオキシカルボニル）
アミノ−プロピオン酸エステル）　　（３０，１ｍｇ、
０．０４３ｍ　ｍｏｌｅ）をエタノール１ｍｌに溶解し
た。この溶液にモルホリン１０ｍ２を加え、アルゴン霊
気、遮光、室温下約１時間撹拌すると、反応は終了した
。この反応溶液を減圧ｆＡ１ｉ１Ｌ分取用Ｔ　Ｌ　Ｃ（
Ａｒｔ５７１７（Ｍｅｒｃｋ社製）１０　Ｘ２０ｃｎ、
展開溶媒、酢酸エチル−ＭｅＯＨ（１：４）〕にて分離
・精製し、表題の目的物８．３ｍｇ（収率４０．６％）
を得た。

ニンヒドリン呈色　陽性 ＮＭＲ，δ（ＣＤＣ１３）　Ｉ）１１１＋１０．５４　
　　　（３１１，ｓ、　ＣＨ＋−１８）２．３６−２．
５２　（２１１，ｍ、−Ｃｏ−Ｃ１ｌ□−）２．９０−
３．０５　（２１１，ｍ、−ＣＨｚ−Ｎ−）３．５０−
４．００　（２ｏ、ｂ、−Ｎｏ□）４．８６−５．０８
　（３８，ｎ＋、　Ｈ−１９Ｅ、Ｈ−３α、ｏ−ｔ９Ｚ
）５．９０−６．３０　（２１１，ｍ、　Ｉ（−７，Ｌ
６　）ｕｖ、　　λハｎ　ｍ　　　２６４．５［実施例
３］ ２５−ヒドロキシビタミンＤ３−３β−０−（３′　−
（ＢＳＡ−アミノ）−プロピオン酸エステル）および２
５−ヒドロキシビタミンＤ抗血清の作製 （１）２５−ヒドロキシビタミンＤ、−３β−０−（３
’　−（ＢＳＡ−アミノ）−プロピオン酸エステル）の
作製 実施例２で得られた２５−ヒドロキシビタミンＤ、−３
β−０−（３’　−アミノ−プロピオン酸エステル）　
　（１８，１ｍｇ＋３８．４３Ｘ１０−３Ｉ１ｍｏｌｅ
）をＴＨＦｌｍｌに溶解した。トリス緩衝液（０，１Ｍ
、　ｐＨ８，６）１０ｍｆｆ１にＢ　Ｓ　Ａ　（ｍＷ、
６５０００．５０ｍｇ、１１５０　Ｘ３８．４３×ｌＯ
弓ｍ　ｍｏｌｅ）を溶解し、ｏ”ｃに冷却後、■エチル
ー３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩（９，６ｍｇ、１．３　Ｘ３８．４３　ＸＩＯ−ｆ
ｆｍｍｏｌｅ）を添加した。この溶液を０°Ｃで３時間
反応後、この反応溶液にクロロホルム１０ｍ１を４回加
えて、未反応の２５−ヒドロキシビタミンＤ。

３β−０−（３°−アミノプロピオン酸エステル）を除
去した。水溶液層を凍結乾燥させ、表題の目的物の凍結
乾燥品４５ｍｇが得られ、Ｂ５Ａｌ分子当り２５−ヒド
ロキシビタミンＤ３−３β−〇（３°−アミノプロピオ
ン酸エステル）がその３°位のアミノ基を介して２２分
子結合したもので、これを略して表題化合物の式として
記載した。

（２）２５−ヒドロキシビタミンＤ３抗血清の作製（１
）で得られた凍結乾燥２５−ヒドロキシビタミンＤ、−
３β−〇−（３”−（ＢＳＡ−アミノ）プロピオン酸エ
ステル）（抗原）を、トリス緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ８
，６）に溶解し、これに同量のコンプリート・フロイン
ト・アジュバントを加え、充分に混和懸濁し、抗原がｌ
μｇ〜２００μｇ　／　ｍ　ｅとなるように調製した。

この乳化液を、２週間の間隔をおイテ、約１０回、５０
Ｔ〜５ｏｏＴ／匹をウサギの皮下に投与した。この間、
１０日毎に中途採血して、抗体力価を調べ、抗体力価が
最高になった時点で全採血をし、６０分間室温にてこれ
を静置し、凝固せしめた後、３０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離を行い、２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗体を
含有する抗血清を得、硫安分画し、ＩｇＧ画分を採取し
た。

（３）２５−ヒドロキシビタミンＤ３モノクロナール抗
体の作製 Ｂ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウス（雌、４週齢）に、（１
）で得られた凍結乾燥２５−ヒドロキシビタミンＤ３−
３β−０−（３’　−（ＢＳＡ−アミノ）−プロピオン
酸エステル）（抗原）を、ＰＨ７，２のリン酸緩衝液に
溶解したもの５０γをＣ，Ｆ、　Ａと共に皮下に投与し
、−週間後、５０γを再び皮下に投与し、最終感作とし
て二週間後、抗原単独で５０Ｔを腹腔に投与した。この
最終感作より３日後、マウスを解剖し、ＩＩＩＩＦＩを
とり出し細断し、さらに細胞用メツシュ上ですりつぶし
、肺臓細胞懸濁液を調製した。細胞融合はマウスのミエ
ローマ細胞Ｐ３−Ｘ−３−Ａｇ８Ｕ１を使用して、常法
に従って実施した。まず、３０％ＰＥＧ（分子１１００
０）水溶液を３７°Ｃにインキュベートし、次いで上記
の肺臓細胞とミエローマ細胞（両細胞の総数、４ＸＩＯ
７個、５：１）をＲＰＭＩのみの培地（５ｍｌ）のみに
懸濁し、両細胞を合わせてゆっくり混ぜ、１０分間１１
０００ｒｐで遠心し、上清を吸引除去した。再びＲＰＭ
Ｉ培地（１０ｍｌ）で細胞を洗浄し、遠心の後、上清を
吸引除去した。試験管をゆっ（りたたいて細胞ペレット
を混ぜ、これに１．ＯｍｆのＰＥＧ溶液をゆっくりと加
えてゆるやかに撹拌した。ゆるやかに振盪しつつ３７°
Ｃでインキュベーションを行った後、常用培地（１０ｍ
ｌりをゆっくり加えて融合反応を止め、再び細胞を懸濁
した。これを、５分間１１０００ｒｐで遠心し、沈澱し
た細胞ペレットを、試験管をゆっくりとたたいて分散さ
せた後、ＨＡＴ培地（５ｍｌにゆるやかに懸濁し、次い
でＨＡＴ培地（１ｍｆ）入りの容器に移し、生細胞を顕
鏡検査した。細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに
１穴当り２００　μ２づつ入れ、ＣＯ□インキュベータ
中で細胞を増殖させた。融合細胞をＨＡＴ培地で選択後
、限界希釈法に・よりクローニングした。得られたクロ
ーンＱｉ液を用いて、０．５ｍｌプリスタン処理Ｂａ１
ｂ／ｃマウス腹腔内にて増殖せしめ、これより腹水およ
び血清を採取し、常法によりＩｇＣ画分を回収し、さら
にプロティンＡ結合セファロースＣＬ−４Ｂのアフィニ
ティークロマトグラフィーにてＩｇＧ画分を精製し、こ
れをモノクロナル抗体として使用した。これより得られ
たＩｇＧのサブクラスはＩｇＧ１であった。

〔実施例４〕 モノヨード（＋２５１）の放射性同位元素標識ヒドロキ
シビタミンＤ、誘導体の製造；２５ヒドロキシビタミン
Ｄ３−３β−０−（３’（Ｎ−３−（４−ヒドロキシ−
３−ヨード〔Ｉ！Ｓ　Ｉ〕フェニル）プロピオニルコア
ミノ）プロピオン酸エステルの合成 実施例２で得られた２５−ヒドロキシビタミンンＤ３−
３β−ｏ−（３°　−アミノ−プロピオン酸エステル）
　　（１００ｎ　ｍｏｌｅ　、　１２７．８　ｔｔＱ、
　ＴＨＦ）のＴＨＦ溶液１３０μ２にヨード（１ｔｓ■
）ポルトン−ハンター試薬（ＮＥＮ、ＮＥＸ−１２０−
１０，２２００Ｃｉ／＋ｗ　＋ｍｏｌｅ、Ｔｏｔａｌ　
０．３３ｍＣｔ／１００　ｐ　Ｉ！Ｂｅｎｚｅｎｅ溶液
）　　（１００ｐ　ｍｏｌｅ／６６．６μｌ／２２０ｕ
Ｃ４）とＤＭＡＰ　（Ｉｎ　ｍｏｌｅ　／１　μｆｆ１
ＴＨＦ）を加え、アルゴン霊気、遮光、室温下２４時間
反応させた。

この反応ン夜をＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｚｏｒｂａｘ−３ＩＬ、
４．６ｍｍＸ２Ｓｃｍカラム、２０χイソプロパノ−ル
ーｎ−ヘキサン溶媒、流速１　ｍ　４２７ｓｉｎ、）に
て分離・精製した。表題の目的物のＲｔ、は８．５０−
９．５０　ｍｉｎ、であり、回収率は２０．０χであっ
た（原料であるヨード（１２ｓｔ）ポルトン−ハンター
試薬のＲｔ、は１４．０−１６．０　ｗｉｎ。

）。さらに、非放射性のモノヨード標識２５−ヒドロキ
シビタミンＤ、誘導体を作製し、本発明モノヨードの放
射性同位元素標１１１１ｉ２５−ヒドロキシビタミンＤ
、との同一性をＨＰＬＣ等により確認した。

〔実施例５〕 ショート（”’Ｉ）の放射性同位元素標識ヒドロキシビ
タミンＤ、誘導体の製造；２５ヒドロキシビタミンＤ、
−３β−０−（３′［Ｎ−３−（３，５−ショート〔１
２Ｓ■〕４−ヒドロキシフェニル）プロピオニルコアミ
ノ）プロピオン酸エステルの合成 実施例２で得られた２５−ヒドロキシビタミンＤ３−３
β−０−（３’　−アミノ−プロピオン酸エステル）　
　（２５ｎ　ｍｏｌｅ／６．９５２＃　ＩＩ　Ｔ　ＨＦ
　）のＴＨＦ溶液１２０μ！にヨード（ｔｔｓｌ）ポル
トン−ハンター試薬（ＮＥＮ、ＮＥＸ−１２０Ｈ−１０
゜４４００Ｃｉ／ｍ　ｎ＋ｏｌｅ、Ｔｏｔａｌ　０．３
３ｍＣ１／１００　ｐ　ＮＢｅｎｚｅｎｅを容ンｅｉ、
）　　　（２５ｐ　　ｍｏｌｅ／３３．３　　ｕ　　ｌ
／１１０μ　Ｃｉ）とＤＭＡＰ　（ｉｎ　ｍｏｌｅ／１
　μｊ！ＴＨＦ）を加え、アルゴン霊気、遮光、室温下
、２０時間反応させた。この反応液をＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｚ
ｏｒｂａｘ−５ＩＬ、４．６ｍｗＸ２Ｓｃｍ　　カラム
、２０χイソプロパノ−ルーｎ−ヘキサン溶媒。

流速１ｍｌ／ｎ＋ｉｎ、）にて分離・精製した。表題の
目的物のＲｔ、は８．９０−１０．１０ｍ１ｎ、であり
、回収率は９．９ｚであった（原料であるヨード〔Ｉ！
Ｓ　■〕ポルトンハンター試薬のＲｔ、は１４．５０−
１７．０Ｏｎ＋ｉｎ、　）　、さらに、非放射性のショ
ート標識２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体を作製し
、本発明ショートの放射性同位元素標識２５−ヒドロキ
シビタミンＤ、との同一性をＨＰＬＣ等により確認した
。

〔実施例６〕 ヨード（１２５１）放射性同位元素標識２５−ヒドロキ
シビタミン０２ｔ７％導体の評価（１）２５−ヒドロキ
シビタミンＤ３のラジオイムノアンセイによる標準曲線
の作製 ２５−ヒドロキシビタミンＤ３の標準エタノール溶液の
濃度２５６ｐｇ／２０μｌを調製し倍々希釈により１２
８μｇ／２０μｍ　、　６４ｐｇ／２０　ｔｔ　ｌ　、
　３２ｐｇ／２０μ１．１６ρｇ７２０μｌ　、　８ｐ
ｇ／２０μｍ、　４ｐｇ／２０μｌ　、　２ｐｇ／２０
μ２を鋼製した。各濃度につきチューブ３木にそれぞれ
２０μｌを分注した９次に抗酸化剤として、トコフェロ
ールを含有するヨード（１２５１）の放射性同位元素標
識２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体含有エタノール
溶液を各チューブに２０μＩ！（約１３，０ＯＯｃｐ＋
ｍ）ずつ分注した０次にｐＨ８，６０トリス緩衝液で希
釈（約ｔｓ、　ｏｏｏ倍）した抗２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ、ウサギ血清を各チューブに１ｍｊ２ずつ加え、
ポルデックスミキサ−で撹拌後、５°Ｃで一晩（約２０
〜２４時間）静置した。このインキュベーションの後、
この反応溶液にデキストランＴ７０と活性炭とを１対１
０の割合に混合して懸濁させたｐＨ８，６のグリシン緩
衝液を各チューブに３００μｌずつ分注し、ボルデ、ツ
クスミキサ−で撹拌後、５°Ｃで１時間インキュベーシ
ョンした。その後、３．００Ｏｒｐｍ？１０分間遠心分
離してＢ−Ｆ分離した後、上清液１ｍｌを分取してオー
トウェルγ−カウンターにて１分間測定してカウント数
を計測した。各チューブごと計測されたカウント数（Ｂ
）よりブランクとして２５−ヒドロキシビタミンＤ　ｓ
　１１０００ｐ／２０μｌを同様に操作して計測された
カウント数（ＢＬ）を引いた値を、２５−ヒドロキシビ
タミンＤ、濃度を０として同様に操作して計測された数
（Ｂｏ）からブランク（ＢＬ）を引いた値で除し、それ
に１００を刺した値をバウンド（結合）率として算出し
た。

かくして算出された結果により作製したヨード（＋ｚｓ
　１　）の放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ３誘導体の標準曲線を第１図に示しく２）放射性同
位元素トリチウム〔３Ｈ〕標識とヨード（１２５［）標
識の比較 トリチウム〔１Ｈ〕の放射性同位元素標識２５−ヒドロ
キシビタミンＤ、誘導体（２６，２７−ｍｅｔｈｙｌ−
３Ｈ）を用いて（１）ヨード（１２５り標識の場合と同
様に標゛準曲線を作製した。その結果を第２図に示した
。第２図中−・−・−はヨード（＋２５１）標識の場合
を示し、−ムーム−はトリチウム〔コＨ〕標識の場合を
示す。放射性同位元素としてヨード［Ｉｔ’ｌ］標識を
用いた場合の方が、トリチウム〔３Ｈ〕標識を用いた場
合の方よりも同等もしくはそれ以上の感度を示した。特
に低濃度（１０９ｇ／Ｔ）において顕著であった。

（３）放射性同位元素モノヨード（＋ｚｓ　　■）標識
とショート〔目Ｓ　　Ｉ）標識の比較 同様の方法で、放射性同位元素標識としてモノヨード（
Ｉｔｓｌ）標識を用いた場合とショート〔１１ＳＩ）標
識を用いた場合について比較し、その結果を第３図に示
し、第３図中−・−・−はモノヨード（＋ｚｓ　　Ｉ）
標識の場合を示し、−一一閣一はショート（”’Ｊ）標
識の場合を示す、用いたヨードの放射性同位元素標ｖｌ
ｉ２５−ヒドロキシビ放射性同位元素標識としてモノヨ
ード（１２Ｓ　　ｌ〕標識を用いた場合とショート（１
２５１）標識を用いた場合とではほとんど同等の感度を
示すが、特に、モノヨード（＋２５１１標識が好ましか
った。

（４）Ｒ、とじて用いられるメチレン基の側鎖の長さに
よる比較 式〔■〕におけるＲ、（−（ＣＨＩ）、−）について用
いられるメチレン基の側鎖の長さの比較としてｎ＝１、
ｎ＝２．ｎ＝３の場合を比較し、その結果を第４図に示
した。第４図中−ムームーはｎ＝１の場合を示し、−・
−・−はｎ＝２の場合を示し、−一一一一はｎ＝３の場
合を示す。好ましくはｎ＝１よりもｎ＝＝２とｎ＝３特
にｎ＝２が良好な結果を示した。

〔実施例７〕 ２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗体の代わりにＤＢＰを
用いたＣＰＢＡ法によるヨード（ｔｉｌ〕放射性同位元
素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ３誘導体の評価 （１１０Ｂ　Ｐの調整 ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｃａ１ｆ　Ｓｅｒｕｍ　：
　Ｆ　ＣＳ　）　３．３ｍ２をリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ’
？、　　４．　Ｏ，０１？ｌ　）で希釈し、ブルーセフ
ァロースカラム（商品名。

Ｂｌｕｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅカラム、ファルマシア社
製、φ２゜５　Ｘ７．５ｃ＋＋　）にチャージし、Ｂｅ
ｔ−ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ４０ｍｌを通し、脱アルブミ
ン処理を行なった。この溶出溶液を１フラクシヨン当た
り５　ｍ　Ｑ分取し、素通り画分中で２８０ｎｍの紫外
部吸収を有する７番目から１０番目のフラクション２０
ｍ１を得た。Ｆｅ２の代わりに恒温動物の血清を同様に
処理してもよい。

（２）抗体の代わりにＤＢＰを用いたＣＰＢＡ法による
ヨード（＋２５り放射性同位元素標識２５ヒドロキシビ
タミンＤ、誘導体の標準曲線の作製 ２５−ヒドロキシビタミンＤ、の標準エタノール溶液の
濃度り、０２ｐｇ／２０μＰを調整し、倍々希釈により
３２ｐｇ／２０　ａ　１．１６ｐｇ／２０　μｌ　、８
１１１１！／２（１μｔ、　４ｐｇ／２０ｔＩｊ！、２
ｐｇ／２０　ｔｔ　Ｌ　Ｌｐｇ／２０ｕ　Ｑを調整した
。各濃度につきチューブ２本にそれぞれ２０μ２を分注
した１次に抗酸化剤としてトコフェロールを含有するヨ
ード（ＩＩｓＩＩの放射性同位元素標識ビタミンＤ、誘
導体含有エタノール溶液を各チューブに２０ＩＩｊ２　
（約３０．ＯＯＱｃｐｍ　）ずつ分注した０次にｐＴ（
ａ、６０トリス緩衝液で希釈（（１）のＤＢＰフラクシ
ョン溶液を約５００〜１０００倍）したＤＢＰを各チュ
ーブに５００μ２ずつ加え、撹拌後、４°Ｃで１６時間
静置した。このインキュベーションの後、この反応溶液
にデキストランＴ７０と活性炭とを１対１０の割合に混
合して懸濁させたｐｉ−１１３，６のグリシン緩衝液を
各チューブに３００μｅずつ分注し、撹拌後、４°Ｃで
３０分間放置（１５分に１回撹拌する）した。その後、
４°Ｃ，３，ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離して１３
−Ｆ分離した後、上清液５００μ２を分取し、オートウ
ェルγカウンターにて１分間測定してカウント数を計測
した。各チューブごと計測されたカウント数（Ｂ）より
ブランクとして２５−ヒドロキシビタミンＤ、　１，０
２４ｐｇ／２０μ２を同様に操作して計測されたカウン
ト数（ＮＳＢ）を引いた値を、２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ、濃度を０として同様に操作して計測された数（Ｂ
、）からブランク（ＮＳＢ）を引いた値で除し、それに
１００を刺した値をバウンド（結合）率として算出した
。

かくして算出された結果により作製したヨード（１２ｉ
ｌ〕の放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ
、誘導体の標準曲線を第５図に示しく３）コード（１２
５１）の放射性同位元素＋Ｍ識２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ、誘導体の安定性実施例４または実施例５で得られ
たヨード［１″ｓＢの放射性同位元素標識２５−ヒドロ
キシビタミンＤ、誘導体を、−２０°Ｃ，アルゴンで置
換したバイアルビンによって５０％Ｈ，Ｏ−エタノール
溶液で保存し、その後経時的に（２）で示した要領で標
準曲線を作製した。第６図中、−０−０−は経時０日、
−へ一へ一は経時２１日後、−ローローは経時４９日後
の標準曲線を示す、その結果、２０°Ｃで保存の場合、
第６図に示す通り、７週まで２〜３２　ｐｇ／Ｔｅ５ｔ
の濃度範囲で標珈曲線に変化がなかった。このことは、
ヨード（＋ｚｓ　　Ｉ）の放射性同位元素標識２５−ヒ
ドロキシビタミンＤ。

誘導体がヨード（１２８Ｉ）を用いたラジオイムノアッ
セイにおいて十分使用しうる安定性を有することを示し
ている。

〈発明の効果〉 以上に述べた如く、本発明は高放射線エネルギーを有し
、汎用性において優れている放射性ヨードで標識された
２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体を提供できるもの
である。従来は、単位時間当たりの放射エネルギーの低
いβ線放出核種であるトリチウム〔３Ｈ］による種々の
ビタミンＤ３標識化合物が存在した。しかしトリチウム
（３１（〕と同様にラジオイムノアッセイに汎用される
放射エネルギーの高いＴ線放出核種のヨード（＋ｚｓ■
〕で標識されたビタミンＤ、誘導体は、ビタミンＤの特
徴でもある共役トリエン構造の不安定さゆえ、ラジカル
反応を誘発し自己分解を起こすと考えられ、現在まで報
告されていなかった。しかるに、本発明者により提供さ
れるヨード（＋２５　１）で標識された２５−ヒドロキ
シビタミンＤ、誘導体はγ線による構造的分解を起こす
ことなく非常に安定であり、ラジオイムノアッセイに利
用しうるちのであることを見出した。

一般にビタミンＤ、は、生体内において肝臓もしくは腎
臓によって代謝され、活性型のビタミンＤ、となる。こ
れらの活性型のビタミンＤ、（２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ１．１α、２５−ジヒドロキシビタミンＤ、）や、
１α−ヒドロキシビタミンＤ３．１α、２４−ジヒドロ
キシビタミンＤ、などの活性型ビタミンＤ、類は、臨床
的に骨粗鬆症、骨軟化症等の治療薬として用いられ、あ
るいはその開発が行われている。これらの薬物の臨床用
量は、その強い生理作用の為通常著しく少ない。一方、
薬理作用は薬物の血清中濃度、組織中濃度と相関を有し
ており、特にヒトにおける薬物の血清中濃度の測定は臨
床上極めて重要な意義を有する。これより、本発明は臨
床上、活性型ビタミンＤ、類を測定する上で高い利用価
値を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヨード（＋ｚｓｌ）の放射性同位元素標識２
５−ヒドロキシビタミンＤ３誘導体の標準曲線を示す。 第２図、はトリチウム〔３Ｈ〕の放射性同位元素標識２
５−ヒドロキシビタミンＤ。 誘導体とヨード（＋！　　■）の放射性同位元素標識２
５−ヒドロキシビタミンＤ３誘導体の標準曲線を示す。 第３図は、モノヨード（１２５１）の放射性同位元素標
識２５−ヒドロキシビタミンＤ、誘導体とショート［”
’Ｉ）の放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ、誘導体の標準曲線を示す。第４図は式（ＩＶ）にお
けるＲ＋（−（ＣＨり、−）についてｎ＝１．ｎ＝２．
ｎ＝３とした場合のそれぞれの標準曲線を示す。第５回
は、２５−ヒドロキシビタミンＤ、抗体の代わりにＤＢ
Ｐを用いたＣＰＢＡ法によるヨード（１２５１）放射性
同位元素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ。 誘導体の標準曲線を示す。第６図は、２５−ヒドロキシ
ビタミンＤ、抗体の代わりにＤＢＰを用いたＣＰＢＡ法
によるヨード（１２５７）放射性同位元素標識２５−ヒ
ドロキシビタミンＤ３に導体の安定性を示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１は炭素数１〜１０のアルキレン基を示す
   〕で表される新規な２５−ヒドロキシビタミンＤ＿３ア
   ミノ酸誘導体。
2. （２）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１は炭素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ＿
   ２はアミノ保護基を示す〕で表される２５−ヒドロキシ
   ビタミンＤ＿３誘導体を、塩基存在の不活性溶媒中でア
   ミノ保護基を脱離せしめることを特徴とする、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１は炭素数１〜１０のアルキレン基を示す
   〕で表される新規な２５−ヒドロキシビタミンＤ＿３ア
   ミノ酸誘導体の製造法。
3. （３）アミノ保護基が、９−フルオレニルメチルオキシ
   カルボニル基である特許請求の範囲第２項記載の製造法
   。
4. （４）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１は炭素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ＿
   ３はヨードの放射性同位元素を有する残基を示す〕で表
   されるヨードの放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビ
   タミンＤ＿３誘導体。
5. （５）ヨードの放射性同位元素が、＾１＾２＾５Ｉであ
   る特許請求の範囲第４項記載のヨードの放射性同位元素
   標識２５−ヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体。
6. （６）ヨードの放射性同位元素を有する残基が、３量（
   ４−ヒドロキシ−３−ヨード〔＾１＾２＾５Ｉ〕−フェ
   ニル）プロピオニル基又は３−（３，５−ジョード〔＾
   １＾２＾５Ｉ〕−４−ヒドロキシフェニル）プロピオニ
   ル基である特許請求の範囲第４項記載のヨードの放射性
   同位元素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体。
7. （７）被験液に、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１は炭素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ＿
   ３はヨードの放射性同位元素を有する残基を示す〕で表
   されるヨードの放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビ
   タミンＤ＿３誘導体と２５−ヒドロキシビタミンＤ＿３
   抗体とを反応せしめて生成する該ヨードの放射性同位元
   素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ＿３誘導体−２５−
   ヒドロキシビタミンＤ＿３抗体結合体と、未反応該ヨー
   ドの放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビタミンＤ＿
   ３誘導体とを分離し、次いで分離したいずれか一方の放
   射性同位元素である標識ヨードの量を定量することを特
   徴とする該被験液中の２５−ヒドロキシビタミンＤ＿３
   の定量法。（８）被験液に、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ＿１は炭素数１〜１０のアルキレン基、Ｒ＿
   ３はヨードの放射性同位元素を有する残基を示す〕で表
   されるヨードの放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビ
   タミンＤ＿３誘導体とビタミンＤバインディングプロテ
   イン（以下、ＤＢＰと略すことがある）とを反応せしめ
   て生成する該ヨードの放射性同位元素標識２５−ヒドロ
   キシビタミンＤ＿３誘導体−ＤＢＰ結合体と、未反応該
   ヨードの放射性同位元素標識２５−ヒドロキシビタミン
   Ｄ＿３誘導体とを分離し、次いで分離したいずれか一方
   の放射性同位元素である標識ヨードの量を定量すること
   を特徴とする該被験液中の２５−ヒドロキシビタミンＤ
   ＿３の定量法。