JPH0236236B2 - - Google Patents
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- JPH0236236B2 JPH0236236B2 JP55030465A JP3046580A JPH0236236B2 JP H0236236 B2 JPH0236236 B2 JP H0236236B2 JP 55030465 A JP55030465 A JP 55030465A JP 3046580 A JP3046580 A JP 3046580A JP H0236236 B2 JPH0236236 B2 JP H0236236B2
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- Japan
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- polysaccharide
- capsular polysaccharide
- polysaccharides
- column
- hydrolyzate
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、肺炎球菌の莢膜性多糖類の精製法に
関する。
関する。
多価の肺炎球菌多糖類ワクチンは、多くのタイ
プのストレプトコツカス・ニウモニエ
（Streptococcus pneumoniae）莢膜性多糖類か
らなる。通常これらの多糖類は普通の発酵で生成
せしめられる。肺炎球菌多糖類は、技術的に公知
の方法、例えばライジング（lysing）、遠心分離、
アルコール分離及び硫酸アンモニウム沈殿によ
り、他の発酵生成物から分離される。これらの工
程に続いて、凍結乾燥及び各肺炎球菌種に独特な
他の工程が行なわれる。肺炎球菌多糖類の免疫原
性は多糖類の分子量に直接比例するようであるか
ら（即ち高分子量が高免疫原性に等しいから）、
肺炎球菌莢膜性多糖類は、元々の状態の構造を有
してできるだけ最も大きい重合体として保持され
ることが望ましい。この結果、ワクチンを投与す
る対象の免疫応答がより効果的になるであろう。
プのストレプトコツカス・ニウモニエ
（Streptococcus pneumoniae）莢膜性多糖類か
らなる。通常これらの多糖類は普通の発酵で生成
せしめられる。肺炎球菌多糖類は、技術的に公知
の方法、例えばライジング（lysing）、遠心分離、
アルコール分離及び硫酸アンモニウム沈殿によ
り、他の発酵生成物から分離される。これらの工
程に続いて、凍結乾燥及び各肺炎球菌種に独特な
他の工程が行なわれる。肺炎球菌多糖類の免疫原
性は多糖類の分子量に直接比例するようであるか
ら（即ち高分子量が高免疫原性に等しいから）、
肺炎球菌莢膜性多糖類は、元々の状態の構造を有
してできるだけ最も大きい重合体として保持され
ることが望ましい。この結果、ワクチンを投与す
る対象の免疫応答がより効果的になるであろう。
食品及び薬剤省生化学局（Bureau of
Biologics of the Food and Drug
Administration）は、ワクチンに用いるすべて
の種類の肺炎球菌多糖類重合体の見かけ上の大き
さに対して基準を設定した。この基準によると、
現在のワクチンのすべての多糖類はセフアローズ
（Sepharose ）4Bの場合（多糖類の種類に依
存して）0.15〜0.35の範囲以下のKd値を有さなけ
ればならない。ここにKd値とは
Ｖ（溶出）−Ｖ（空隙）／Ｖ（床）−Ｖ（空隙）として
定義されるものであ る。タイプ―19肺炎球菌（ATCCに寄託されてお
り且つ自由に入手しうるもので、登録番号は第
6319号）の場合、Kdの限界値は0.25であり、こ
れは約500000の分子量に相当する。
Biologics of the Food and Drug
Administration）は、ワクチンに用いるすべて
の種類の肺炎球菌多糖類重合体の見かけ上の大き
さに対して基準を設定した。この基準によると、
現在のワクチンのすべての多糖類はセフアローズ
（Sepharose ）4Bの場合（多糖類の種類に依
存して）0.15〜0.35の範囲以下のKd値を有さなけ
ればならない。ここにKd値とは
Ｖ（溶出）−Ｖ（空隙）／Ｖ（床）−Ｖ（空隙）として
定義されるものであ る。タイプ―19肺炎球菌（ATCCに寄託されてお
り且つ自由に入手しうるもので、登録番号は第
6319号）の場合、Kdの限界値は0.25であり、こ
れは約500000の分子量に相当する。
肺炎球菌莢膜性多糖類の多くは、分子が多糖類
の精製工程を通して完全に保持されるというよう
に十分安定である。タイプ―19は例外であつて凍
結乾燥において不安定である。このタイプ―19の
分子は、Ｌ―マンノース、Ｄ―グルコース、２―
アセトアミド―２―デオキシ―Ｄ―マンノース及
びホスフエノートからなり、解重合して許容しう
るKd基準以下の分子量を有する分子を生成する
傾向がある。この場合、ホスフエート残基の存在
が観測される多糖類の不安定性と関係があるとい
う提案もある。
の精製工程を通して完全に保持されるというよう
に十分安定である。タイプ―19は例外であつて凍
結乾燥において不安定である。このタイプ―19の
分子は、Ｌ―マンノース、Ｄ―グルコース、２―
アセトアミド―２―デオキシ―Ｄ―マンノース及
びホスフエノートからなり、解重合して許容しう
るKd基準以下の分子量を有する分子を生成する
傾向がある。この場合、ホスフエート残基の存在
が観測される多糖類の不安定性と関係があるとい
う提案もある。
今回、凍結乾燥工程に先立つて、両性物質例え
ばグリシン、アラニン、リジン、バリン及び他の
アミノ酸；アルブミン、ゼラチン、ペプトン、カ
ゼイン及び蛋白質加水分解物及び蛋白質をタイプ
―19莢膜性肺炎球菌多糖類に0.01〜25.0％（Ｖ／
Ｖ）、好適には0.1〜2.0％（Ｖ／Ｖ）の濃度で添
加すると、凍結乾燥中にその好ましくない分解が
起こらず、従つて生化学局の設定した基準に適合
する多糖類が得られるということが発見された。
更に、上述の添加剤は、それ自体が均質化に役立
つて多糖類の溶解度を向上させ、その結果後にワ
クチンに用いるのにより有用な凍結乾燥生成物を
与える。
ばグリシン、アラニン、リジン、バリン及び他の
アミノ酸；アルブミン、ゼラチン、ペプトン、カ
ゼイン及び蛋白質加水分解物及び蛋白質をタイプ
―19莢膜性肺炎球菌多糖類に0.01〜25.0％（Ｖ／
Ｖ）、好適には0.1〜2.0％（Ｖ／Ｖ）の濃度で添
加すると、凍結乾燥中にその好ましくない分解が
起こらず、従つて生化学局の設定した基準に適合
する多糖類が得られるということが発見された。
更に、上述の添加剤は、それ自体が均質化に役立
つて多糖類の溶解度を向上させ、その結果後にワ
クチンに用いるのにより有用な凍結乾燥生成物を
与える。
第１図は両性安定剤を含まないタイプ―19多糖
類の溶出曲線を示す。第２図はグリシン安定剤を
含む肺炎球菌タイプ―19多糖類の溶出曲線を示
す。第３図はアラニン安定剤を含む肺炎球菌タイ
プ―19多糖類の溶出曲線を示す。第４図はアルブ
ミン安定剤を含む肺炎球菌タイプ―19多糖類の溶
出曲線を示す。
類の溶出曲線を示す。第２図はグリシン安定剤を
含む肺炎球菌タイプ―19多糖類の溶出曲線を示
す。第３図はアラニン安定剤を含む肺炎球菌タイ
プ―19多糖類の溶出曲線を示す。第４図はアルブ
ミン安定剤を含む肺炎球菌タイプ―19多糖類の溶
出曲線を示す。
多糖類の保護機構は不明確である。しかしなが
ら多糖類が残存する自己消化性酵素
（autolyticenzymes）によつて酵素的に分解され
るならば、両性物質のそれとイオン的相互作用が
立体化学的に酵素の活性点への接近を阻害してい
るということで説明できよう。例えば両性物質の
正荷電は多糖類のホスホジエステル結合に含まれ
る燐に引きつけられる。従つて両性物質の存在は
ホスホジエステラーゼが活性点で働くのを阻害す
るかも知れない。
ら多糖類が残存する自己消化性酵素
（autolyticenzymes）によつて酵素的に分解され
るならば、両性物質のそれとイオン的相互作用が
立体化学的に酵素の活性点への接近を阻害してい
るということで説明できよう。例えば両性物質の
正荷電は多糖類のホスホジエステル結合に含まれ
る燐に引きつけられる。従つて両性物質の存在は
ホスホジエステラーゼが活性点で働くのを阻害す
るかも知れない。
分子が凍結乾燥の際の（水分子が除去される際
の）ストレスで開裂するほど切れ易い結合を含む
から分解するのであれば、両性物質が切れ易い結
合と相互作用して凍結乾燥時の作用力に耐えさせ
ているということも考えられよう。
の）ストレスで開裂するほど切れ易い結合を含む
から分解するのであれば、両性物質が切れ易い結
合と相互作用して凍結乾燥時の作用力に耐えさせ
ているということも考えられよう。
本発明の目的は、肺炎球菌タイプ―19莢膜性多
糖類を不純物質から精製するために必要とされる
工程中、肺炎球菌タイプ―19莢膜性多糖類の本来
の形態を保持せしめることである。
糖類を不純物質から精製するために必要とされる
工程中、肺炎球菌タイプ―19莢膜性多糖類の本来
の形態を保持せしめることである。
本発明の特別な目的は、莢膜性多糖類が肺炎球
菌タイプ―19に由来する精製工程において、莢膜
性多糖類の本来の形態を保持せしめることであ
る。
菌タイプ―19に由来する精製工程において、莢膜
性多糖類の本来の形態を保持せしめることであ
る。
本発明の更なる目的は、凍結乾燥の工程中、肺
炎球菌タイプ―19莢膜性多糖類を安定化させるこ
とである。
炎球菌タイプ―19莢膜性多糖類を安定化させるこ
とである。
上述の提案以上に、他の保護作用機構も可能で
ある。
ある。
ある具体例では、乾燥した肺炎球菌莢膜性多糖
類―グリシン粉末を、2.5mg／mlの多糖類濃度ま
で0.2M酢酸アンモニウム中に溶解する。この１
mlをカラムにかけ、前述の如くKdを決定する。
0.25以下のKdは、分子が解重合されておらず且
つ多糖類は生化学局によるワクチンに使用するた
めに許容されうるということを示している。
類―グリシン粉末を、2.5mg／mlの多糖類濃度ま
で0.2M酢酸アンモニウム中に溶解する。この１
mlをカラムにかけ、前述の如くKdを決定する。
0.25以下のKdは、分子が解重合されておらず且
つ多糖類は生化学局によるワクチンに使用するた
めに許容されうるということを示している。
肺炎球菌タイプ―19多糖類分子の、例えばグリ
シンとの混合による安定化ということで意味づけ
が行なわれる本発明の重要性は、添付するグラフ
によつて示される。第図はKd0.30を有する保
護されていない多糖類の許容できない画分の溶出
曲線を示す。第図は、0.03の許容しうるKdを
有する0.1グリシンで処理した肺炎球菌タイプ―
19多糖類の許容しうる画分の溶出曲線を示す。第
図は0.2％DL―アラニンで処理した及び0.1の
Kdを有する肺炎球菌タイプ―19多糖類の許容し
うる画分の溶出曲線を示す。第図は0.2％の人
間の血漿アルブミンで処理した及び0.2のKdを有
するタイプ―19多糖類の許容しうる画分の溶出曲
線を示す。グラフには示してないけれど他のアミ
ノ酸及び蛋白質も多糖類の分解に対する保護に同
様の効果を示した。
シンとの混合による安定化ということで意味づけ
が行なわれる本発明の重要性は、添付するグラフ
によつて示される。第図はKd0.30を有する保
護されていない多糖類の許容できない画分の溶出
曲線を示す。第図は、0.03の許容しうるKdを
有する0.1グリシンで処理した肺炎球菌タイプ―
19多糖類の許容しうる画分の溶出曲線を示す。第
図は0.2％DL―アラニンで処理した及び0.1の
Kdを有する肺炎球菌タイプ―19多糖類の許容し
うる画分の溶出曲線を示す。第図は0.2％の人
間の血漿アルブミンで処理した及び0.2のKdを有
するタイプ―19多糖類の許容しうる画分の溶出曲
線を示す。グラフには示してないけれど他のアミ
ノ酸及び蛋白質も多糖類の分解に対する保護に同
様の効果を示した。
この保護の機構は明らかにされていない。肺炎
球菌タイプ―19多糖類の解重合又は分解からの保
護に関して最も可能性のある二つの説明は、それ
が酵素によつて分解される、或いはホスホジエス
テル結合のような切れ易い結合が凍結乾燥中に切
断する又は加水分解を受けるという機構である。
しかしながら、今や両性物質が肺炎球菌タイプ―
19多糖類を保護しうるということが知られた。更
に保護用は、グリシン又はアルブミンでわかるよ
うに、安定剤の大きさに無関係のようである。ま
たイオン的な相互作用は、多糖類、二糖類及び多
糖類のような中性化合物が保護効果を示さないこ
とから、必要のように見える。
球菌タイプ―19多糖類の解重合又は分解からの保
護に関して最も可能性のある二つの説明は、それ
が酵素によつて分解される、或いはホスホジエス
テル結合のような切れ易い結合が凍結乾燥中に切
断する又は加水分解を受けるという機構である。
しかしながら、今や両性物質が肺炎球菌タイプ―
19多糖類を保護しうるということが知られた。更
に保護用は、グリシン又はアルブミンでわかるよ
うに、安定剤の大きさに無関係のようである。ま
たイオン的な相互作用は、多糖類、二糖類及び多
糖類のような中性化合物が保護効果を示さないこ
とから、必要のように見える。
本発明は第一に概略的に及び次いでその特別な
適用例で説明される。本発明によれば、セフアロ
ーズ 〔フアーマシア（Pharmacia）製、
Piscataway、N.J.；有効分離分子量範囲３×105
〜３×106M.W.を有するアガローズの商品名〕を
0.2M酢酸アンモニウムで予備処理することによ
つて洗浄し、脱気し及び公知の方法に従つてクロ
マトグラフイーカラムに充填した。空隙容量Vo
及び床（bed）容量Viは、ブルー・デキストラン
（Blue Dextran）2.5mg及びグルコース1.0mgを
0.2M酢酸アンモニウム1.0mlに溶解し、これをカ
ラムに適用することによつて決定される。溶出マ
ーカーを備えたギルソン画分捕集器（Gilson
fraction collector）を用い、試験管当り2.0mlを
集めた。カラムの溶出物を屈折率で監視し
〔Pharmacia Refractive Index Moniton〕、こ
れを自動的に記録した。最初のピークはその最高
値においてブルー・デキストラン及び空隙容量
（Vo）を表わし、及び第二のピークはその最高値
において床容量（Vi）を表わす。溶出容量（Ve）
は、肺炎球菌多糖類2.5mgを0.2M酢酸アンモニウ
ム1.0mlに溶解し及びそれをカラムに適用するこ
とによつて決定される。
適用例で説明される。本発明によれば、セフアロ
ーズ 〔フアーマシア（Pharmacia）製、
Piscataway、N.J.；有効分離分子量範囲３×105
〜３×106M.W.を有するアガローズの商品名〕を
0.2M酢酸アンモニウムで予備処理することによ
つて洗浄し、脱気し及び公知の方法に従つてクロ
マトグラフイーカラムに充填した。空隙容量Vo
及び床（bed）容量Viは、ブルー・デキストラン
（Blue Dextran）2.5mg及びグルコース1.0mgを
0.2M酢酸アンモニウム1.0mlに溶解し、これをカ
ラムに適用することによつて決定される。溶出マ
ーカーを備えたギルソン画分捕集器（Gilson
fraction collector）を用い、試験管当り2.0mlを
集めた。カラムの溶出物を屈折率で監視し
〔Pharmacia Refractive Index Moniton〕、こ
れを自動的に記録した。最初のピークはその最高
値においてブルー・デキストラン及び空隙容量
（Vo）を表わし、及び第二のピークはその最高値
において床容量（Vi）を表わす。溶出容量（Ve）
は、肺炎球菌多糖類2.5mgを0.2M酢酸アンモニウ
ム1.0mlに溶解し及びそれをカラムに適用するこ
とによつて決定される。
第一のピークのアペクス（apex）に捕集され
る溶出液の容量はVeである。式Kd＝Ve−Vo／Vi−Voを 用いることにより、分配係数が決定される。
る溶出液の容量はVeである。式Kd＝Ve−Vo／Vi−Voを 用いることにより、分配係数が決定される。
タイプ―19肺炎球菌莢膜性多糖類は、本発明の
実施によつて分離する場合タイプ―19肺炎球菌莢
膜性多糖類の凍結乾燥前に両性物質（例えばグリ
シン）が0.01〜25％（Ｖ／Ｖ）、好ましくは0.1〜
2.0％（Ｖ／Ｖ）の濃度で添加される。
実施によつて分離する場合タイプ―19肺炎球菌莢
膜性多糖類の凍結乾燥前に両性物質（例えばグリ
シン）が0.01〜25％（Ｖ／Ｖ）、好ましくは0.1〜
2.0％（Ｖ／Ｖ）の濃度で添加される。
乾燥した肺炎球菌莢膜性多糖類及び保護物質の
粉末は2.5mg／mlの多糖類濃度まで0.2Mの酢酸ア
ンモニウムに溶解せしめられる。この１mlをカラ
ムに適用してKdを前述のように決定する。
粉末は2.5mg／mlの多糖類濃度まで0.2Mの酢酸ア
ンモニウムに溶解せしめられる。この１mlをカラ
ムに適用してKdを前述のように決定する。
0.25以下のKdは、分子が約500000M.W.以下に
解重合されておらず及びそのようなKd値の多糖
類が生化学局の基準によりワクチンに用いるため
に許容できるということを示す。
解重合されておらず及びそのようなKd値の多糖
類が生化学局の基準によりワクチンに用いるため
に許容できるということを示す。
次の実施例は本発明を更に良く説明するが、こ
れは本発明の例示であつて、これを限定する意図
を有さない。本発明は特に特許請求の範囲によつ
て限定されるだけである。本発明は、本発明の精
神を離れずして他の形に具現化することはでき
ず、多くのそのような具体例は同業者が直ぐに認
識しうるであろう。実施例において凍結乾燥原料
として使用した肺炎球菌多糖類は、例えば欧州特
許第24493号明細書および米国特許第4242501号明
細書に記載された方法により製造される。
れは本発明の例示であつて、これを限定する意図
を有さない。本発明は特に特許請求の範囲によつ
て限定されるだけである。本発明は、本発明の精
神を離れずして他の形に具現化することはでき
ず、多くのそのような具体例は同業者が直ぐに認
識しうるであろう。実施例において凍結乾燥原料
として使用した肺炎球菌多糖類は、例えば欧州特
許第24493号明細書および米国特許第4242501号明
細書に記載された方法により製造される。
実施例 １
本発明に従い、ビーズの破裂を防ぐために注意
深く撹拌しながら、セフアローズ 4Bゲル（フ
アーマシア）を0.2M酢酸アンモニウムは懸濁さ
せた。ゲルが沈殿した後、微細物が傾斜し、すべ
ての微細物が除去されるまでこの方法を繰返し
た。沈降したゲルを約３倍容量の緩衝液で希釈
し、吸引フラスコに移した。真空にし、フラスコ
を断続的に１時間伴振とうすることによつてゲル
懸濁液を脱気した。この懸濁液を注意深く1.5×
90cmのフアーマシア製カラムに供し、空気泡を防
止した。次いでゲルの約1/2インチが重力によつ
て沈降するまでカラムの底部出口端を閉じ、次い
で出口を開放した。カラムを約87cmの高さまで充
填した。充填後、カラム出口をフアーマシア製屈
折率監視計に連結し、屈折率（RI）を自動的に
記録した。次いで溶出液をギルソン画分捕集器ま
でもつていき、試験管当り2.0mlの溶出液を集め
た。空隙容量Vo及び床容量Viは、ブルー・デキ
ストラン（Pharmacia）2.5mg及びデキストロー
ズ1.0mgを0.2M酢酸アンモニウム1.0mlに溶解する
ことによつて決定した。１mlをカラムに供した。
この混合物をカラム中に通し、溶出液を屈折率で
監視し、自動的に記録した。第一のピークはその
最大値においてブルーデキストラン及び空隙容量
（Vo）を表わし、第二のピークのデキストローズ
はその最大値において床容量（Vi）を表わす。
全床容量（Vi）を決定する他の方法は、14C酢酸
ナトリウムを用いる方法である。即ちカラムに
0.4μCiの放射線活性を含有する酢酸ナトリウム
1.0mlを仕込む。次いで２mlの画分を集め、各各
の画分からの0.5ml部分を、シンチレーシヨン液
体10mlを含む別のシンチレーシヨン薬ビン中に移
す。この薬ピンの放射線活性を計数し、これを毎
分当りのカウント数として表示する。次いでカウ
ント数を各画分番号に対してプロツトする。全床
容量は、溶出図において14C酢酸ナトリウムピー
クの最大の位置まで捕集された溶出物の容量であ
る。溶出のプロフイルにおいて対称なピークはカ
ラムが許容しうることを示す。多糖類20ml部分を
標準的な方法によつて凍結乾燥した。乾燥多糖類
を2.5mg／mlの濃度で0.2M酢酸アンモニウムに添
加し、その1.0mlを予じ補正した4Bセフアローズ
を充填したフアーマシア製カラム（1.5×90cm）
に供した。12〜15ml／時の流速において及び溶出
プロフイルの望ましい高さを与えるのに適当なよ
うにフアーマシア製RI監視器を設定して、セフ
アローズ 4Bを充填したカラムに多糖類を流下
させ、RIを自動的に記録した。溶出物をギルソ
ン画分捕集器により2.0ml／試験管で集めた。
Vo、Vi、Ve及びKdはそれぞれ43ml、123ml、67
ml及び0.3であつた。第１図は、多糖類が部分的
に分解し、そのKdはタイプ―19多糖類に対する
生化学局の必要条件0.25に適合しない0.3のKdを
有した。
深く撹拌しながら、セフアローズ 4Bゲル（フ
アーマシア）を0.2M酢酸アンモニウムは懸濁さ
せた。ゲルが沈殿した後、微細物が傾斜し、すべ
ての微細物が除去されるまでこの方法を繰返し
た。沈降したゲルを約３倍容量の緩衝液で希釈
し、吸引フラスコに移した。真空にし、フラスコ
を断続的に１時間伴振とうすることによつてゲル
懸濁液を脱気した。この懸濁液を注意深く1.5×
90cmのフアーマシア製カラムに供し、空気泡を防
止した。次いでゲルの約1/2インチが重力によつ
て沈降するまでカラムの底部出口端を閉じ、次い
で出口を開放した。カラムを約87cmの高さまで充
填した。充填後、カラム出口をフアーマシア製屈
折率監視計に連結し、屈折率（RI）を自動的に
記録した。次いで溶出液をギルソン画分捕集器ま
でもつていき、試験管当り2.0mlの溶出液を集め
た。空隙容量Vo及び床容量Viは、ブルー・デキ
ストラン（Pharmacia）2.5mg及びデキストロー
ズ1.0mgを0.2M酢酸アンモニウム1.0mlに溶解する
ことによつて決定した。１mlをカラムに供した。
この混合物をカラム中に通し、溶出液を屈折率で
監視し、自動的に記録した。第一のピークはその
最大値においてブルーデキストラン及び空隙容量
（Vo）を表わし、第二のピークのデキストローズ
はその最大値において床容量（Vi）を表わす。
全床容量（Vi）を決定する他の方法は、14C酢酸
ナトリウムを用いる方法である。即ちカラムに
0.4μCiの放射線活性を含有する酢酸ナトリウム
1.0mlを仕込む。次いで２mlの画分を集め、各各
の画分からの0.5ml部分を、シンチレーシヨン液
体10mlを含む別のシンチレーシヨン薬ビン中に移
す。この薬ピンの放射線活性を計数し、これを毎
分当りのカウント数として表示する。次いでカウ
ント数を各画分番号に対してプロツトする。全床
容量は、溶出図において14C酢酸ナトリウムピー
クの最大の位置まで捕集された溶出物の容量であ
る。溶出のプロフイルにおいて対称なピークはカ
ラムが許容しうることを示す。多糖類20ml部分を
標準的な方法によつて凍結乾燥した。乾燥多糖類
を2.5mg／mlの濃度で0.2M酢酸アンモニウムに添
加し、その1.0mlを予じ補正した4Bセフアローズ
を充填したフアーマシア製カラム（1.5×90cm）
に供した。12〜15ml／時の流速において及び溶出
プロフイルの望ましい高さを与えるのに適当なよ
うにフアーマシア製RI監視器を設定して、セフ
アローズ 4Bを充填したカラムに多糖類を流下
させ、RIを自動的に記録した。溶出物をギルソ
ン画分捕集器により2.0ml／試験管で集めた。
Vo、Vi、Ve及びKdはそれぞれ43ml、123ml、67
ml及び0.3であつた。第１図は、多糖類が部分的
に分解し、そのKdはタイプ―19多糖類に対する
生化学局の必要条件0.25に適合しない0.3のKdを
有した。
溶出容量（Ve）は、肺炎球菌多糖類2.5mgを
0.2M酢酸アンモニウム1.0mlに溶解し、これをカ
ラムに適用することによつて決定した。第一の最
大ピークのアペツクスまでに捕集される溶出物の
容量はVeに相当する。式Kd＝Ve−Vo／Vi−Voに従い、 分配係数を決定した。
0.2M酢酸アンモニウム1.0mlに溶解し、これをカ
ラムに適用することによつて決定した。第一の最
大ピークのアペツクスまでに捕集される溶出物の
容量はVeに相当する。式Kd＝Ve−Vo／Vi−Voに従い、 分配係数を決定した。
安定化されてないときのKd0.3は、凍結乾燥前
にグリシンを0.1％の濃度で試料20mlに添加した
場合の安定化された肺炎球菌多糖類と対比でき
た。混合物を凍結乾燥し、粉末を2.5ml／多糖類
mlの濃度まで0.2M酢酸アンモニウムに溶解した。
この１mlを、予じめ補正した4Bセフアローズ
を充填したフアーマシア製カラム（1.5×90cm）
に供した。12〜15ml／時の流速において及び溶出
プロフイルの望ましい高さを与えるのに適当なよ
うにフアーマシア製RI監視器を設定して、多糖
類をカラム中に流下させ、RIを自動的に記録し
た。溶出物をギルソン画分捕集器により2.0ml／
試験管で集めた。Vo、Vi、Ve及びKdはそれぞ
れ43ml、123ml、45ml及び0.03であつた。第２図
はグリシンが多糖類の分解を防ぐという点で多糖
類に重大な保護効果を有することを示す。第２図
において一番高いピークはグリシンである。
にグリシンを0.1％の濃度で試料20mlに添加した
場合の安定化された肺炎球菌多糖類と対比でき
た。混合物を凍結乾燥し、粉末を2.5ml／多糖類
mlの濃度まで0.2M酢酸アンモニウムに溶解した。
この１mlを、予じめ補正した4Bセフアローズ
を充填したフアーマシア製カラム（1.5×90cm）
に供した。12〜15ml／時の流速において及び溶出
プロフイルの望ましい高さを与えるのに適当なよ
うにフアーマシア製RI監視器を設定して、多糖
類をカラム中に流下させ、RIを自動的に記録し
た。溶出物をギルソン画分捕集器により2.0ml／
試験管で集めた。Vo、Vi、Ve及びKdはそれぞ
れ43ml、123ml、45ml及び0.03であつた。第２図
はグリシンが多糖類の分解を防ぐという点で多糖
類に重大な保護効果を有することを示す。第２図
において一番高いピークはグリシンである。
実施例 ２
タイプ―19多糖類を上に概述したように精製し
た。凍結乾燥に先立つて、試料20mlにDL―アラ
ニンを0.2％の濃度で添加した。この混合物を凍
結乾燥し、粉末を2.5mg／多糖類mlの濃度まで
0.2M酢酸アンモニウムに溶解した。１mlを予じ
め補正したセフアローズ 4Bを充填したフアー
マシア製カラム（1.5×90cm）に供した。12〜15
ml／時の流速において及び溶出プロフイルの望ま
しい高さを与えるのに適当なようにRI監視器を
設定して、多糖類を充填したカラム中に流下さ
せ、RIを自動的に記録した。溶出物をギルソン
画分捕集器により2.0ml／試験管で捕集した。
Vo、Vi、Ve及びKdはそれぞれ40ml、118ml、43
ml及び0.1であつた。第３図は、DL―アラニンが
多糖類の分解を防ぐという点で多糖類に保護効果
を有することを示す。第３図において一番高いピ
ークはアラニンである。
た。凍結乾燥に先立つて、試料20mlにDL―アラ
ニンを0.2％の濃度で添加した。この混合物を凍
結乾燥し、粉末を2.5mg／多糖類mlの濃度まで
0.2M酢酸アンモニウムに溶解した。１mlを予じ
め補正したセフアローズ 4Bを充填したフアー
マシア製カラム（1.5×90cm）に供した。12〜15
ml／時の流速において及び溶出プロフイルの望ま
しい高さを与えるのに適当なようにRI監視器を
設定して、多糖類を充填したカラム中に流下さ
せ、RIを自動的に記録した。溶出物をギルソン
画分捕集器により2.0ml／試験管で捕集した。
Vo、Vi、Ve及びKdはそれぞれ40ml、118ml、43
ml及び0.1であつた。第３図は、DL―アラニンが
多糖類の分解を防ぐという点で多糖類に保護効果
を有することを示す。第３図において一番高いピ
ークはアラニンである。
実施例 ３
タイプ―19多糖類を実施例１に概述したように
精製した。凍結乾燥に先立つて、多糖類の試料20
mlに正常の人間の血漿アルブミンを0.2％の濃度
で添加した。この混合物を凍結乾燥し、粉末を
2.5ml／多糖類の濃度まで0.2M酢酸アンモニウム
に溶解した。この１mlを予じめ捕正したセフアロ
ーズ 4Bを充填したフアーマシア製カラム（1.5
×90cm）に供した。12〜15ml／時の流速において
及び溶出プロフイルの望ましい高さを与えるのに
適当なようにRI監視器を設定して、多糖類を充
填したカラム中に流下させ、RIを自動的に記録
した。溶出物をギルソン画分捕集器により2.0
ml／試験管で集めた。Vo、Vi、Ve及びKdはそ
れぞれ43ml、123ml、59ml及び0.2を示した。第４
図は正常の人間の血漿アルブミンが多糖類の分解
を防ぐという点で多糖類に対し保護効果を有する
ことを示す。第４図において一番高いピークはア
ルブミンである。
精製した。凍結乾燥に先立つて、多糖類の試料20
mlに正常の人間の血漿アルブミンを0.2％の濃度
で添加した。この混合物を凍結乾燥し、粉末を
2.5ml／多糖類の濃度まで0.2M酢酸アンモニウム
に溶解した。この１mlを予じめ捕正したセフアロ
ーズ 4Bを充填したフアーマシア製カラム（1.5
×90cm）に供した。12〜15ml／時の流速において
及び溶出プロフイルの望ましい高さを与えるのに
適当なようにRI監視器を設定して、多糖類を充
填したカラム中に流下させ、RIを自動的に記録
した。溶出物をギルソン画分捕集器により2.0
ml／試験管で集めた。Vo、Vi、Ve及びKdはそ
れぞれ43ml、123ml、59ml及び0.2を示した。第４
図は正常の人間の血漿アルブミンが多糖類の分解
を防ぐという点で多糖類に対し保護効果を有する
ことを示す。第４図において一番高いピークはア
ルブミンである。
対し保護効果を有することを示す。
上記実施例は本発明の例示であつて、これを限
定するものではない。概略的に分類した両性物質
が莢膜性多糖類の分子全体を保護するのに役立つ
ということは、同業者にとつて明らかであろう。
例えば従来凍結乾燥工程で切れ易いことがわかつ
ている多糖類が両性物質の添加によつて保護され
るであろうということが発見された。特に同業者
は、他のアミノ酸が本発明の精神から離れずして
凍結乾燥中の莢膜性多糖類の保護を行ないえない
ということを認識しよう。他の蛋白質及び蛋白質
加水分解物も本発明の精神から離れずして凍結乾
燥中の莢膜性多糖類の保護を行ないえないことも
発見された。更に、数種からの及び数種の有機体
からの莢膜性多糖類が、他の凍結乾燥精製法にお
いて、本発明の精神から離れずしてアミノ酸及び
蛋白質及び蛋白質加水分解物によつて保護されは
しないということも同業者にとつて明らかであろ
う。
定するものではない。概略的に分類した両性物質
が莢膜性多糖類の分子全体を保護するのに役立つ
ということは、同業者にとつて明らかであろう。
例えば従来凍結乾燥工程で切れ易いことがわかつ
ている多糖類が両性物質の添加によつて保護され
るであろうということが発見された。特に同業者
は、他のアミノ酸が本発明の精神から離れずして
凍結乾燥中の莢膜性多糖類の保護を行ないえない
ということを認識しよう。他の蛋白質及び蛋白質
加水分解物も本発明の精神から離れずして凍結乾
燥中の莢膜性多糖類の保護を行ないえないことも
発見された。更に、数種からの及び数種の有機体
からの莢膜性多糖類が、他の凍結乾燥精製法にお
いて、本発明の精神から離れずしてアミノ酸及び
蛋白質及び蛋白質加水分解物によつて保護されは
しないということも同業者にとつて明らかであろ
う。
第１図は両性安定剤を含まないタイプ―19多糖
類の溶出曲線を示し、第２図はグリシン安定剤を
含む肺炎球菌タイプ―19多糖類の溶出曲線を示
し、第３図はアラニン安定剤を含む肺炎球菌タイ
プ―19多糖類の溶出曲線を示し、及び第４図はア
ルブミン安定剤を含む肺炎球菌タイプ―19多糖類
の溶出曲線を示す。
類の溶出曲線を示し、第２図はグリシン安定剤を
含む肺炎球菌タイプ―19多糖類の溶出曲線を示
し、第３図はアラニン安定剤を含む肺炎球菌タイ
プ―19多糖類の溶出曲線を示し、及び第４図はア
ルブミン安定剤を含む肺炎球菌タイプ―19多糖類
の溶出曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 莢膜性多糖類を発酵で生成せしめ且つ発酵か
ら回収しそして凍結乾燥することにより莢膜性多
糖類を精製する際に、効果的な安定化量の両性物
質を添加することによつて凍結乾燥中菌莢膜性多
糖類を安定化させることを特徴とする該多糖類の
精製法。 ２ 該莢膜性多糖類が肺炎球菌莢膜性多糖類であ
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 該莢膜性多糖類がタイプ―19の肺炎球菌莢膜
性多糖類である特許請求の範囲第２項記載の方
法。 ４ 該両性物質がアミノ酸である特許請求の範囲
第１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５ 該アミノ酸がリジン、アラニン、バリン、グ
リシンおよびそれらの組合せから選ばれる特許請
求の範囲第４項記載の方法。 ６ 該両性物質が蛋白質又は蛋白質の加水分解物
である特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記
載の方法。 ７ 該両性物質がアルブミン、カゼイン、ゼラチ
ン、アルブミン加水分解物、カゼイン加水分解
物、ペプトン加水分解物、ゼラチン加水分解物お
よびそれらの組合せから選らばれる特許請求の範
囲第６項記載の方法。 ８ 該両性物質が0.01〜25％ｖ／ｖの濃度で凍結
乾燥前の混合物に添加される特許請求の範囲第１
〜７項のいずれかに記載の方法。 ９ 該両性物質が0.1〜２％ｖ／ｖの濃度で凍結
乾燥前の混合物に添加される特許請求の範囲第８
項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/021,861 US4221906A (en) | 1979-03-19 | 1979-03-19 | Stabilization of pneumococcal polysaccharides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS55159799A JPS55159799A (en) | 1980-12-12 |
| JPH0236236B2 true JPH0236236B2 (ja) | 1990-08-16 |
Family
ID=21806554
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3046580A Granted JPS55159799A (en) | 1979-03-19 | 1980-03-12 | Purification of capsule forming polysaccharide |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4221906A (ja) |
| EP (1) | EP0017322B1 (ja) |
| JP (1) | JPS55159799A (ja) |
| AR (1) | AR220822A1 (ja) |
| AT (1) | ATE2114T1 (ja) |
| CA (1) | CA1135643A (ja) |
| DE (1) | DE3061466D1 (ja) |
| ES (1) | ES489694A0 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2510606A1 (fr) * | 1981-07-30 | 1983-02-04 | Berri Balzac | Procede d'obtention de polyosides capsulaires, polyosides capsulaires ainsi obtenus et leur application a la preparation de vaccins |
| BE889979A (fr) * | 1981-08-14 | 1982-02-15 | Smith Kline Rit | Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation |
| US4542123A (en) * | 1982-01-11 | 1985-09-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Composition and method for increasing brain tyrosine levels |
| US4600583A (en) * | 1982-09-07 | 1986-07-15 | Tetra Consultants Inc. | Pharmaceutical compositions |
| DE3601922A1 (de) * | 1986-01-23 | 1987-07-30 | Behringwerke Ag | Stabilisiertes virus-antigen, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung |
| FR2619122B1 (fr) * | 1987-08-03 | 1990-03-09 | Pasteur Institut | Procede d'obtention de polyosides capsulaires de staphylocoques, polyosides obtenus, applications de ces polyosides et souches pour la mise en oeuvre du procede |
| CA2059692C (en) * | 1991-01-28 | 2004-11-16 | Peter J. Kniskern | Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine |
| CA2059693C (en) * | 1991-01-28 | 2003-08-19 | Peter J. Kniskern | Polysaccharide antigens from streptococcus pneumoniae |
| CN101663327B (zh) | 2007-03-23 | 2014-05-07 | 惠氏公司 | 产生肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)荚膜多糖的缩短的纯化方法 |
| ES2749952T3 (es) | 2008-12-18 | 2020-03-24 | Wyeth Llc | Procedimiento de control del peso molecular de polisacáridos de Streptococcus pneumoniae usando carbono |
| BRPI0922981A8 (pt) * | 2008-12-18 | 2019-11-26 | Wyeth Llc | método para o controle do peso molecular polissacarídeo para o sorotipo 19a de streptococcus pneumoniae |
| EP3436061A4 (en) | 2016-03-31 | 2019-12-04 | Liffey Biotech Limited | Saccharide-polypeptide-conjugate compositions and methods of use thereof |
| WO2019070994A1 (en) | 2017-10-04 | 2019-04-11 | Liffey Biotech Limited | SACCHARIDE-POLYPEPTIDE CONJUGATE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2528972A (en) * | 1947-05-15 | 1950-11-07 | Western Reserve University | Prophylactic toxoid compound and method of making same |
| US3436311A (en) * | 1966-02-28 | 1969-04-01 | Pillsbury Co | Fungal polysaccharide composition and method for making same |
| US4043952A (en) * | 1975-05-09 | 1977-08-23 | National Starch And Chemical Corporation | Surface treatment process for improving dispersibility of an absorbent composition, and product thereof |
| US4090919A (en) * | 1976-01-29 | 1978-05-23 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Water-insoluble tannin preparation for immobilization of proteins |
-
1979
- 1979-03-19 US US06/021,861 patent/US4221906A/en not_active Expired - Lifetime
-
1980
- 1980-01-17 CA CA000343904A patent/CA1135643A/en not_active Expired
- 1980-02-15 AT AT80300443T patent/ATE2114T1/de not_active IP Right Cessation
- 1980-02-15 DE DE8080300443T patent/DE3061466D1/de not_active Expired
- 1980-02-15 EP EP80300443A patent/EP0017322B1/en not_active Expired
- 1980-03-12 JP JP3046580A patent/JPS55159799A/ja active Granted
- 1980-03-12 AR AR280285A patent/AR220822A1/es active
- 1980-03-18 ES ES489694A patent/ES489694A0/es active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1135643A (en) | 1982-11-16 |
| AR220822A1 (es) | 1980-11-28 |
| EP0017322B1 (en) | 1982-12-29 |
| US4221906A (en) | 1980-09-09 |
| ES8102805A1 (es) | 1981-02-16 |
| EP0017322A1 (en) | 1980-10-15 |
| ES489694A0 (es) | 1981-02-16 |
| DE3061466D1 (en) | 1983-02-03 |
| JPS55159799A (en) | 1980-12-12 |
| ATE2114T1 (de) | 1983-01-15 |
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