JPH0249583A - β―Ｄ―１，２―グルカナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、β−Ｄ−１．２−グルカナーゼの製造法に関
する。

（従来の技術） バイオマスの有効利用という観点から、最近。

セルラーゼが重要視されている。セルラーゼのうちトリ
コデルマ属により生産されるセルラーゼは。

ソフォロース（２−０−β−Ｄ　−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａ
ｎｏｓｙｌｎ−ｇｌｕｃｏｓｅ）から誘導されることが
知られている〔バイオケミカル　アンド　バイオフィジ
カルリサーチ　コミュニケーションズ；　、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃ０１ｎｌ１１．＋１＋
　３３８（１９５９）：ｌ　６　このソフォロースは、
２個のグルコースがβ−１，２結合で連結したタイプの
三糖であり２例えば、環状あるいは直鎖の（１→２）−
β−Ｄ−グルカンにβＤ−１，２−グルカナーゼを作用
させて得られる。

β−Ｄ−１．２−グルカナーゼとしては、アスペルギル
ス　フミガタス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｆｕｍｉ　
ａｔｕｓ）フザリウム　オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉ
ｕｍ　　７ペニシリウム　プレフェルディアナム（Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍ）　、ペ
ニシリウム　フニキュロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
　　ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ　）などの糸状菌由来のβ
−Ｄ−１．２−グルカナーゼ（カナデイアンジャーナル
　オブ　マイクロバイオロジー；　Ｃａｎ。

Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　７．３１２（１９６
１））が挙げられる。

このほか、サイトファーガ　アルベンジコーラ（偽１」
ユ互駐−ａｒｖｅｎｓｉｃｏｌａ　）　ＩＡＭ１２６４
８株のような細菌由来のβ−Ｄ−１．２−グルカナーゼ
も知られている（特開昭５９−１５４９８５号公報）。

（発明が解決しようとする問題点） 上記いずれのβ−Ｄ−１．２−グルカナーゼも（１→２
）−β−Ｄ−グルカンからソフォロースへの変換能が低
く、ソフォロースが高収率で得られない。

（発明の目的） 本発明の目的は、環状または直鎖状（１→２）β−Ｄ−
グルカンに作用しソフォロースを高収率で生成しうるβ
−Ｄ−１．２−グルカナーゼを生産する新規微生物を得
、それを用いたβ−Ｄ−１゜２−グルカナーゼの製造法
を提供することにある。

（問題点を解決するための手段および作用）本発明で使
用される新菌種アクレモニウムＳｐ１５は、アクレモニ
ウム属に属し、麦芽エキス寒天培地、バレイショ・ブド
ウ糖寒天培地またはツアペック寒天培地で培養したとき
、アクレモニウムキリエンスとは２分生子が卵形〜楕円
形である点において菌学的性質が異なる。この菌は、β
−０１，２−グルカナーゼを高率で生産する。

本発明のβ−Ｄ−１．２−グルカナーゼの製造法は、ア
クレモニウム属菌を培養し、培養物がらβ−Ｄ−１．２
−グルカナーゼを得る工程を包含し、そのことにより上
記目的が達成される。

上記新菌種アクレモニウムＳｐ１ｓのうち、特にアクレ
モニウムＳｐ１５　ＤＫ２０１５株（微工研菌寄第９０
１９号）がβ−Ｄ−１．２−グルカナーゼ生産能が高い
という理由で好適に利用される。この菌株は発明者らに
より大阪市域東区の土壌から分離・採取された新菌株で
あり、その菌学的性質を次に示す。

■学方比１ （１）各培地における生育状態 ■麦芽エキス寒天培地 生育は良好で２５°Ｃ１１０日間の培養で直径３０〜４
０ｍｍのコロニーになる。コロニー表面形かつ平坦で周
辺部は微細なのこぎり刃状である。コロニー表面は羊毛
状で白色の色状を呈する。コロニー裏面は淡黄色である
。

分生子は卵形〜楕円形であり着生状態は良好である。液
滴が見られる。子嚢果その他の有性胞子器官は形成され
ない。

■バレイショ・ブドウ糖寒天培地 生育は良好で２５°Ｃ２１０日間の培養で直径３０〜４
０鵬のコロニーになる。コロニーハ円形、平坦で１周辺
部は微細なのこぎり刃状である。コロニー表面は羊毛状
で白色の色状を呈する。コロニー裏面は淡黄色である。

分生子は卵形〜楕円形であり着生状態は良好である。液
滴が見られる。子嚢果その他の有性胞子器官は形成され
ない。

■ツアペック寒天培地 生育は良好で２５°Ｃ１１０日間の培養で直径２５〜３
５ｍｍのコロニーになる。コロニーハ円形、平坦で１周
辺部は微細なのこぎり刃状である。コロニー表面は羊毛
状で、白色の色状を呈する。コロニー裏面は黄色〜茶色
で数本の溝を形成する。茶色の拡散性色素を生成する。

分生子は、卵形〜楕円形であり着生状態は良好である。

液滴が見られる。

子嚢果その他の有性胞子器官は形成されない。

（２）生理学的性質 好気性菌であり１次の生理学的性質を有する。

（３）形態学的性質 各種培地上で子嚢果およびその他の有性生殖器官は確認
されず、塊状になったフィアロ型分生子の形成が観察さ
れる。厚膜胞子の形成も観察され、その多くは連鎖状で
ある。菌糸は多種の培地上で形成され、複雑に分枝し１
〜３μｍの菌糸幅で縦横に伸長する。分生子柄は単純分
枝をなす。分生子は透明かつ卵形〜楕円形でその大きさ
は、短径が１．０〜１．６μｍ、長径が２．３〜３．２
μｍである。厚膜胞子は透明でその大きさは、短径が３
．０〜１Ｏ８０μｍ、長径が３．５〜１２．０μｍであ
る。

１銖少Ｈ足 発明者らは１本発明の菌株（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　Ｓ
ｐ１５ＤＫ２０１５　）を、上記菌学的諸性質をもとに
　ザ　ジェネラ　オブ　ファンジャイ　スボルレイティ
ング　イン　ピュアカルチ＋　−（Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒ
ａ　ｏｆ　ＦｕｎｇｉＳｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ　ｉｎ　
Ｐｕｒｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　；　Ａ、　Ｒ，Ｇａｎｔｎ
ｅｒＶｅｒｌａｇ　ＫＧ、　Ｊ、　Ａ、　ｖｏｎ　Ａｒ
ｘ＋　１９７４）およびコンベンゾイウム　オブ　ソイ
ル　ファンジャイ（Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　５ｏ
ｉｌ　Ｆｕｎｇｉ　　；　　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ＋　　１９８０　　）により同定した。この菌株は
、上記のように、子嚢果その他の有性生殖器官を持たず
１分生子柄からは透明な分生子を生じ、かつ生じた分生
子がフィアロ型の性状であるところから、アインワース
（Ａｉｎｗｏｒｔｈ）の分類形式に従い、アクレモニウ
ム属に属する１菌種と同定された。しかも、コロニーが
白色で分生子が透明であり、かつ厚膜胞子を形成すると
いう点からアクレモニウム　キリエンス（Ａｃｒｅｍｏ
ｎｉｕｍ　　ｋｉｌｉｅｎｓｅ）に近似する。しかし。

アクレモニウム　キリエンスは上記３種の培地で培養し
たときに形成される分生子がいずれも円筒形であるのに
対して９本菌株は卵形〜楕円形であるため、この種には
属さないアクレモニウム（＾ｃｒｅｍｏｎ　ｉ　ｕｍ　
）属の新菌種であることが判明した。

暗１条作 上記菌株の培地は格別である必要はな（２通常の培地が
用いられる。炭素源としては、ブドウ糖。

グリセリン、麦芽糖、デンプン、デキストラン乳糖、シ
ヨ糖、糖蜜、粉飴などが用いられる。コーン、馬鈴薯、
甘藷などを用いることもできる。

窒素源としては酵母エキス、ペプトン、乾燥酵母。

大豆粉、コーンステイープリカー、アンモニア態窒素、
硝酸態窒素などが用いられる。無機塩類としては、　Ｋ
ｚＨＰＯ４＋　ＫＨｚＰＯ１＋　ＣａＣ１ｚ、　Ｍｇ５
Ｏａ、　ＮａＪＰＯ４（ＮＨ４）　ＪＰ０４などが用い
られる。本面にβ−Ｄ１．２−グルカナーゼを有利に生
産させるには。

環状または直鎖状（１→２）−β−Ｄ−グルカンを０．
５〜５重量％、好ましくは１重量％程度の割合で添加す
る。上記環状（１→２）−β−Ｄ−グルカンは９例えば
、特開昭５９−７１６８６号公報に記載のりゾビウム　
ファッセオリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　画且並旦）ＲＡ−
４株や特開昭５９−８２０９２号公報に記載のアグロバ
クテリウム　ラジオバクター（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｒａｄｔｏｂａｃｔｅｒ　）　Ａｌ−５株をグルコ
ースなどを含有する通常の培地で培養することにより生
産される。

直鎖状の（１→２）−β−Ｄ−グルカンは１例えば、　
Ａｍｅｍｕｒａら（ジャーナル　オブ　ジェネラルマイ
クロバイオロジー；　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌ　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏｇｙ　　１３１，３０１（１９８５））の方
法で、アセトバクター属の菌を通常の培地で培養するこ
とにより生産される。

β−Ｄ−１．２−グルカナーゼを生産する本面の培養ｐ
ｉは２．０〜１０．０．好ましくは４．５〜７．０．培
養温度は１５〜３０°Ｃ２好ましくは２０〜３０’Ｃで
ある。

好気的に液体培地で撹拌もしくは振盪しながら培養を行
う。固体培地上でも培養を行なえることはいうまでもな
い。例えば、２５°Ｃで２４時間液体培養を行うと９本
菌は充分に増殖し、β−Ｄ−１．２−グルカナーゼが菌
体外へ放出される。

上記方法で培養されたアクレモニウム属菌の培養物から
β−Ｄ−１．２−グルカナーゼが通常の方法により分離
される。例えば、培養物を遠心分離にかけて菌体を除き
、必要に応じて濃縮して粗酵素液を得る。

さらに９例えば、上記菌体を除いた粗酵素液に硫酸アン
モニウムを加えて塩析し、得られた固形分を透析にかけ
２次いで、透析内液をセファデックス力うム、焦点電気
泳動などで精製することにより精製酵素（β−Ｄ−１．
２−グルカナーゼ）が得られる。

−Ｄ−１２−グルカナーゼの ■作用および基質特異性：　（ｌ→２）−β−Ｄグルカ
ンに作用し、ソフォロースを生成する。

■至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは４．０〜４
．５である。安定ｐＨ範囲は４，５〜６．０であり、４
０°Ｃにて１時間保持したとき１００％安定に存在する
（同条件でｐＨを３．０としたときの残存活性は８０％
、　ｐＨを７〜８としたときの残存活性は７０％である
）。

■温度安定性；４０°Ｃ以下において１５分間安定に存
在する（５０°Ｃにおける残存活性は８０％、５５°Ｃ
では６５％、そして６０°Ｃでは２０％である）。

■分子量：　ＳＤＳ電気泳動法による分子量は３５．０
００である。

■等電点：９．６ Ｄ−１２−グルカナーゼの　　　　法 ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）に環状（１→２）β
−Ｄ−グルカンを濃度２．５■／ｍ！になるように溶解
する。この溶液０　、８　ｍｌに適当な濃度の酵素溶液
０．２−を加え、４０°Ｃで１時間反応させる。次いで
、ソモギ銅液１戚を添加して反応を中止させ還元力をソ
モギーネルソン法で定量する。既知濃度のソフォロース
を用いてあらかじめ検量線を作成し、これと比較してソ
フォロースの生成量を算出スる。４０°Ｃで１時間に１
μｍｏｌｅのソフォロースを生成する酵素量を１単位と
する。

上記方法で得られた精製β−Ｄ−１．２−グルカナーゼ
またはβ−Ｄ−１．２−グルカナーゼの粗酵素液を環状
または直鎖状（１→２）−β−Ｄグルカンに作用させる
とソフォロースが得られる。

例えば、環状（１→２）−β−Ｄ−グルカンを酢酸緩衝
液に溶解させ、β−Ｄ−Ｌ２−グルカナーゼを加えて４
０°Ｃで２２時間反応させると９反応液中にソフォロー
スが生成する。これを活性炭カラムなどで精製するとソ
フォロースが得られる。

ソフォロースの　′、 ソフォロースは、従来技術の項で述べたように。

セルラーゼの誘導基質として有効に利用されうる。

このほか、ソフォロースは９発明者らにより良質の甘味
を有することが発見されており、蔗糖の代わりに食品用
の甘味料として用いられうる。特に。

ソフォロースは摂取してもほとんどノンカロリーである
（動物はグルコースのβ−１，２結合を切断する酵素を
持たない）ため、ダイエツト食品用に好適に利用される
。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

実施炎上１皿朱Ω分離Ｙ 大阪市域東区の土壌から分離した菌株のうち。

表１に示す培地に生育しうる菌株を検索した。表１の培
地成分のうち環状（１→２）−β−Ｄ−グルカンはジャ
ーナル　オブ　ジェネラル　マイクロバイオロジー（Ｊ
、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１２８．１８
７３（１９８２）　）に記載の方法で調製し、精製を行
った。

（以下余白） 表１ 得た菌をそれぞれ同組成の液体培地にて３０°Ｃで２日
間培養した。培養液を濾紙にスポットし、ブタノール−
ピリジン−水（６：　４　：　３）を展開溶媒としてペ
ーパークロマトグラフィーを行った。

ソフォロースのスポットの特に大きい培養液に生育する
菌を取り出して平板培地で培養を行った。

この菌は本発明のアクレモニウムＳｐ１５　ＤＫ２０１
５株であることが、その生育状態、生理学的性質および
形態学的性質から確認された。

この菌を麦芽エキス寒天培地に１週間に１度の割合で植
え継ぎ、２ケ月を経過した菌について目視観察したとこ
ろ、菌の形態が変化していないことが確認された。

２　　　の　　および　　の 表２に示す培地を調製し、　５００ｍＩ！、の坂ロフラ
スコ１０本にこの培地を６０ｍ　ｌずつ分注し、滅菌を
行った。

表２ この滅菌培地１０本に実施例１で得られたアクレモニウ
ム５Ｔ１１５　ＤＫ２０１５株を一白金耳ずつ植菌し、
３０°Ｃにて４８時間振盪培養を行った。次に、それぞ
れの培地に滅菌した環状（１→２）−β−Ｄ−グルカン
を１％の濃度となるように添加し、さらに２４時間培養
を行った。

この培養物を遠心分離しく５０００ｒｐｍ　、　１０分
間）。

菌体を除去した。このようにして合計５００ｍ　ｌの粗
酵素液が得られた。この粗酵素液の酵素活性は１０Ｕ／
ｄであった。

上記粗酵素液に硫酸アンモニウムをその飽和濃度の約８
０％となるように加え、析出した固形分を濾取した。こ
れを２０＋ｎＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）　５０ｍ１ｌ
に溶解し、セルロースフィルムを用い同緩衝液に対して
透析処理を行った。透析内液をｓｐ−セファデックス充
填カラムにかけて吸着させた後、２０１酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ５，６）中、０〜０．５ＭのＮａＣ１濃度勾配法で溶
出を行った。溶出するフラクションを集めセファデック
スＧ−７５充填カラムでゲル濾過を行い　さらにＳＰ−
セファデックス充填カラムで精製を行った。これを焦点
電気泳動にかけ、β−Ｄ１．２−グルカナーゼ３■を得
た。このβ−Ｄ１．２−グルカナーゼの比活性は５０Ｕ
／■蛋白質であった。

３−Ｄ−１２−グルカナーゼを　い たソフォロースのｆｉ。１ ２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，６）　５０ｄに環状（１
→２）β−Ｄ−グルカン２ｇおよび実施例２で得られた
精製β−ｎ−１，２−グルカナーゼ１３５Ｕを加えた。

これを４０°Ｃにて２２時間保持した後、活性炭カラム
にかけて吸着させた。このカラムに１０％エタノール水
溶液を流して吸着物を溶離させた。溶離液からは精製ソ
フォロース９６０■が得られた。

環状（ｌ→２）−β−Ｄ−グルカンの代わりに直鎖状（
１→２）−β−Ｄ−グルカン（Ａｍｅｍｕｒａらの方法
により調製）３ｇを用いたこと以外は実施例３と同様に
操作したところ、精製ソフォロース１４００■が得られ
た。

ル較拠 アクレモニウム　クレソゲナム（ＡＴＣＣ１４６１５）
を実施例２と同様の方法で培養したところ２合計５００
戚のβ−ｎ−１，２−グルカナーゼの粗酵素液が得られ
た。その酵素活性は３Ｕ／ｍｌであった。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、新菌種アクレモニウムＳ
ｐ１５を利用して、β−Ｄ−１２−グルカナーゼを高率
で生産することが可能となる。β−Ｄ−１．２−グルカ
ナーゼは菌体外に放出されるため容易に採取・精製され
得る。得られたβＤ−１，２−グルカナーゼは環状また
は直鎖状（１→２）−β−Ｄ−グルカンに作用し、ソフ
ォロースを効果的に生成する。ソフォロースはセルラー
ゼの誘導基質として、さらに各種食品の甘味剤として利
用され得る。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アクレモニウム属に属し、β−Ｄ−１，２−グルカ
   ナーゼ生産能を有する菌を培養し、培養物からβ−Ｄ−
   １，２−グルカナーゼを得る工程を包含するβ−Ｄ−１
   ，２−グルカナーゼの製造法。 ２、前記アクレモニウム属菌がアクレモニウムＳｐ１５
   であり、 該アクレモニウムＳｐ１５が、麦芽エキス寒天培地、バ
   レイショ・ブドウ糖寒天培地またはツァペック寒天培地
   で培養したとき、アクレモニウムキリエンスとは、分生
   子が卵形〜楕円形である点において菌学的性質が異なる
   新菌種である、 特許請求の範囲第１項に記載の製造法。 ３、前記アクレモニウム属菌がアクレモニウムＳｐ１５
   ＤＫ２０１５株（微工研菌寄第９０１９号）である特許
   請求の範囲第２項に記載の製造法。 ４、前記β−Ｄ−１，２−グルカナーゼが（１→２）−
   β−Ｄ−グルカンに作用しソフォロースを生成する能力
   を有する特許請求の範囲第１項に記載の製造法。