JPH05292962A - 新規な枝切り酵素及びその製造法 - Google Patents
新規な枝切り酵素及びその製造法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【目的】本発明は新規な枝切り活性酵素、該酵素の製造
法及び該酵素を製造する微生物並びに当該酵素を用いた
各種糖液の製造法を提供する。 【構成】土壌中より新たにバチルス・エスピー ＡＰＣ
−９６０３を分離し、当該微生物を培養することにより
耐熱性を有し、酸性側に至適ｐＨを有し、更に広い基質
特異性を有する新規な枝切り活性酵素を生成せしめ、該
酵素を用いてグルコース、マルトースを製造する。
法及び該酵素を製造する微生物並びに当該酵素を用いた
各種糖液の製造法を提供する。 【構成】土壌中より新たにバチルス・エスピー ＡＰＣ
−９６０３を分離し、当該微生物を培養することにより
耐熱性を有し、酸性側に至適ｐＨを有し、更に広い基質
特異性を有する新規な枝切り活性酵素を生成せしめ、該
酵素を用いてグルコース、マルトースを製造する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なα−１，６−グル
コシダーゼ、該酵素を産生するバチルス属菌および該菌
株を培養し、培養物より当該酵素を製造する方法並びに
該酵素を用いたグルコース、マルトース等の製造法に関
する。更に詳細には、新たに土壌から分離されたバチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）・エスピー ＡＰＣ−９６０
３、新規な枝切り酵素及び該酵素の製造法並びに該酵素
を用いたグルコース、マルトースの製造法に関する。
コシダーゼ、該酵素を産生するバチルス属菌および該菌
株を培養し、培養物より当該酵素を製造する方法並びに
該酵素を用いたグルコース、マルトース等の製造法に関
する。更に詳細には、新たに土壌から分離されたバチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）・エスピー ＡＰＣ−９６０
３、新規な枝切り酵素及び該酵素の製造法並びに該酵素
を用いたグルコース、マルトースの製造法に関する。
【０００２】α−１，６−グルコシダーゼとは澱粉等の
α−１，６−グルコシド結合を切断し、直鎖アミロース
を生成する酵素であり、その基質特異性から主にイソア
ミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）或いはプルラナー
ゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）等に分類されている。特
にプルラナーゼはグルコース、マルトース、マルトトリ
オース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マ
ルトヘキサオース等のマルトオリゴ糖の生産にエンド型
アミラーゼ及びエキソ型アミラーゼと併用して糖化業界
において広く用いられている。
α−１，６−グルコシド結合を切断し、直鎖アミロース
を生成する酵素であり、その基質特異性から主にイソア
ミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６８）或いはプルラナー
ゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）等に分類されている。特
にプルラナーゼはグルコース、マルトース、マルトトリ
オース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マ
ルトヘキサオース等のマルトオリゴ糖の生産にエンド型
アミラーゼ及びエキソ型アミラーゼと併用して糖化業界
において広く用いられている。
【０００３】
【従来の技術】α−１，６−グルコシダーゼ生産菌とし
ては、古くは酵母に見い出されていたが、近年各種の細
菌においてその生産が報告されるようになった。例えば
アエロバクター・アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エシエリシア・インターメデ
イア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ
ａ）、シユードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）、ストレプ
トコツカス・ミテス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉ
ｔｉｓ）、サイトフアーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）属、
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属及び
フラボクロモゲネス（Ｆｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ
ｓ）属等である。
ては、古くは酵母に見い出されていたが、近年各種の細
菌においてその生産が報告されるようになった。例えば
アエロバクター・アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エシエリシア・インターメデ
イア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉ
ａ）、シユードモナス・アミロデラモサ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａ）、ストレプ
トコツカス・ミテス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉ
ｔｉｓ）、サイトフアーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）属、
ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属及び
フラボクロモゲネス（Ｆｌａｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ
ｓ）属等である。
【０００４】一方、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の
生産するα−１，６−グルコシダーゼとしてはバチルス
・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）ＩＦＯ
３００１、バチルス・フエルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｆｅｒｍｕｓ）ＩＦＯ ３３３０、バチルス・アシド
プルリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌ
ｕｌｙｔｉｃｕｓ）及びバチルス・セクトラマス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｅｃｔｏｒｒａｍｕｓ）等が知られて
いる。
生産するα−１，６−グルコシダーゼとしてはバチルス
・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）ＩＦＯ
３００１、バチルス・フエルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｆｅｒｍｕｓ）ＩＦＯ ３３３０、バチルス・アシド
プルリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌ
ｕｌｙｔｉｃｕｓ）及びバチルス・セクトラマス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｅｃｔｏｒｒａｍｕｓ）等が知られて
いる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来知られているα−
１，６−グルコシダーゼのほとんどは、至適pHが中性な
いし弱アルカリ性であり、酸性側で糖化を行う糖化業界
においてこれらのα−１，６−グルコシダーゼを使用す
ることは不利であった。
１，６−グルコシダーゼのほとんどは、至適pHが中性な
いし弱アルカリ性であり、酸性側で糖化を行う糖化業界
においてこれらのα−１，６−グルコシダーゼを使用す
ることは不利であった。
【０００６】一方、酸性側に至適ｐＨを有するα−１，
６−グルコシダーゼとしてシュードドモナス・アミロデ
ラモサ、バチルス・アシドプルリチカス及びバチルス・
セクトラマス等が生産する酵素が報告されているが、前
二者は耐熱性でなく工業的には不利であったり、培養時
間が細菌にしては長くかかりすぎ、そのため経済性の面
での問題点があった。これらの問題点を解決する新たな
生産株として後者のバチルス・セクトラマスが報告さ
れ、その菌株の生産するα−１，６−グルコシダーゼが
報告されている。しかしながら、更に工業的に有用な性
質を有する新規なα−１，６−グルコシダーゼの開発が
望まれていた。
６−グルコシダーゼとしてシュードドモナス・アミロデ
ラモサ、バチルス・アシドプルリチカス及びバチルス・
セクトラマス等が生産する酵素が報告されているが、前
二者は耐熱性でなく工業的には不利であったり、培養時
間が細菌にしては長くかかりすぎ、そのため経済性の面
での問題点があった。これらの問題点を解決する新たな
生産株として後者のバチルス・セクトラマスが報告さ
れ、その菌株の生産するα−１，６−グルコシダーゼが
報告されている。しかしながら、更に工業的に有用な性
質を有する新規なα−１，６−グルコシダーゼの開発が
望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは従来
の工業的に有用な性質、即ち 糖化反応の作用ｐＨ（酸性）に至適ｐＨを有する。 従来より耐熱性を有する。 に加え、より工業的に有用な性質を併せ持つ新規なα−
１，６−グルコシダーゼを著量生産する菌株を求め、広
く土壌を集めスクリーニングすることを試みた。
の工業的に有用な性質、即ち 糖化反応の作用ｐＨ（酸性）に至適ｐＨを有する。 従来より耐熱性を有する。 に加え、より工業的に有用な性質を併せ持つ新規なα−
１，６−グルコシダーゼを著量生産する菌株を求め、広
く土壌を集めスクリーニングすることを試みた。
【０００８】そして愛知県の土壌中より新たに分離し
た、バチルス属と同定された菌株が培養物中に多量にα
−１，６−グルコシダーゼを生産し、その生産される酵
素の性質を検討したところ、従来にない工業的に有用な
活性を有することを見いだし本発明を完成した。即ち、
本発明は以下の５発明よりなる。
た、バチルス属と同定された菌株が培養物中に多量にα
−１，６−グルコシダーゼを生産し、その生産される酵
素の性質を検討したところ、従来にない工業的に有用な
活性を有することを見いだし本発明を完成した。即ち、
本発明は以下の５発明よりなる。
【０００９】第１発明は、耐熱性を有し、酸性側に至適
ｐＨを有し、更に基質特異性が広い性質を有する新規な
枝切り酵素を提供する。
ｐＨを有し、更に基質特異性が広い性質を有する新規な
枝切り酵素を提供する。
【００１０】第２発明は新規な菌株、即ちバチルス・エ
スピー ＡＰＣ−９６０３を提供する。該菌株は第１発
明である新規な枝切り酵素を多量生産する能力を有す
る。
スピー ＡＰＣ−９６０３を提供する。該菌株は第１発
明である新規な枝切り酵素を多量生産する能力を有す
る。
【００１１】第３発明は第２発明のバチルス・エスピー
ＡＰＣ−９６０３を培養し、培養物から第１発明の酵
素を製造する方法を提供する。
ＡＰＣ−９６０３を培養し、培養物から第１発明の酵
素を製造する方法を提供する。
【００１２】第４発明は第１発明の枝切り酵素を用いて
グルコースを製造する方法を提供する。
グルコースを製造する方法を提供する。
【００１３】第５発明は第１発明の枝切り酵素を用いて
マルトースを製造する方法を提供する。
マルトースを製造する方法を提供する。
【００１４】（Ａ） 耐熱性を有し、酸性側に至適ｐＨ
を有し、更に基質特異性が広い性質を有する新規な枝切
り酵素を生産する微生物としては、例えば、愛知県の土
壌より新たに採取されたバチルス・エスピー ＡＰＣ−
９６０３が挙げられる。
を有し、更に基質特異性が広い性質を有する新規な枝切
り酵素を生産する微生物としては、例えば、愛知県の土
壌より新たに採取されたバチルス・エスピー ＡＰＣ−
９６０３が挙げられる。
【００１５】バチルス・エスピー ＡＰＣ−９６０３は
以下に述べるような菌学的性質を有する。尚、本菌株は
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２７
４６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７４６）として寄託されて
いる。
以下に述べるような菌学的性質を有する。尚、本菌株は
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２７
４６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２７４６）として寄託されて
いる。
【００１６】Ａ. 形態 （１）細胞の形 直桿状 （２）細胞の大きさ ０．５〜０．８×
３．０〜４．０μ （３）運動性 陽性 （４）胞子嚢 円形膨潤（１．０〜
１．５μ） （５）胞子の位置 菌端〜準端立 （６）コロニーの性状 半透明、光沢ある円
形凸状、菌苔はやや黄味 （７）グラム染色 可変（幼若細胞で陽
性、古い培養では不定）
３．０〜４．０μ （３）運動性 陽性 （４）胞子嚢 円形膨潤（１．０〜
１．５μ） （５）胞子の位置 菌端〜準端立 （６）コロニーの性状 半透明、光沢ある円
形凸状、菌苔はやや黄味 （７）グラム染色 可変（幼若細胞で陽
性、古い培養では不定）
【００１７】Ｂ. 生育状態及び生理学的性質 （１）普通ブイヨンでの生育 陰性 （２）好気的生育 陽性 （３）嫌気的生育 陰性 （４）生育温度 １３〜４５℃ （５）最適生育温度 ３３〜３８℃ （６）生育ｐＨ ４．０〜６．０ （７）最適生育ｐＨ ４．５〜５．５ （８）ＮａＣｌ中での生育範囲 ０〜５．０％ （９）硝酸塩の還元 陽性 （10）色素の生成 陰性 （11）クエン酸の利用 陰性 （12）プロピオン酸塩の利用 陰性 （13）カタラーゼ活性 陰性 （14）チロシンの分解 陰性 （15）デンプンの加水分解 陰性 （16）ＶＰ反応 陰性 （17）レシチナーゼ 陰性 （18）インドール 陰性 （19）エスクリンの分解 陽性 （20）リトマスミルク反応 不変（３０日） （21）ゼラチンの分解 陽性（弱） （22）カゼインの分解 陰性 （23）フェニルアラニン脱アミノ 陰性 （24）ＶＰブロスのｐＨ ５．０ （25）糖類の利用 グルコースから酸 陽性（遅延） マンニトールから酸 陽性 アラビノースから酸 陽性 キシロースから酸 陽性 シュクロースから酸 陽性（遅延） ラクトースから酸 陽性（遅延） トレハロースから酸 陽性 マニトールからガス 陰性
【００１８】上記の試験において、グラム染色、カタラ
ーゼ、形態などの検査は、指定の酵母エキス無機塩培
地、生育試験（ｐＨ、温度）はトリブチケースソイ寒天
（ＢＢＬ）、その他の生理試験はすべてｐＨを５．０±
０．１とし、１４日間培養した。
ーゼ、形態などの検査は、指定の酵母エキス無機塩培
地、生育試験（ｐＨ、温度）はトリブチケースソイ寒天
（ＢＢＬ）、その他の生理試験はすべてｐＨを５．０±
０．１とし、１４日間培養した。
【００１９】以上の菌学的性質をバージーのマニユアル
・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版及び
ザ・ジーナス・バチルス（”Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ” Ｒｕｔｈ， Ｂ． Ｇｏｒｄｏｎ，Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｎｏ． ４
２７，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓ
ｅｒｖｉｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．
Ｃ．（１９７３）の記載に従って菌株を同定した。
・オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版及び
ザ・ジーナス・バチルス（”Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ” Ｒｕｔｈ， Ｂ． Ｇｏｒｄｏｎ，Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｎｏ． ４
２７，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓ
ｅｒｖｉｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．
Ｃ．（１９７３）の記載に従って菌株を同定した。
【００２０】即ち、本菌株はグラム染色陽性、胞子を着
生すること、好気的に生育すること等からバチルス属に
属する菌株であることは明らかである。本菌株は、バチ
ラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕ
ｌａｎｓ）の菌学的性質に非常に類似しているが、カタ
ラーゼ陰性である点で異なっている。カタラーゼ陰性と
して知られるバチルス属としては、例えばバチルス・ラ
ーベ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ）、バチルス・
ポピリア（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）或
いはバチルス・レンチモルブス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌ
ｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）等であるが、本菌株はこれらと
は明らかに異なっている。よって、本発明者らは本菌株
をバチルス・エスピー ＡＰＣ−９６０３と命名した。
生すること、好気的に生育すること等からバチルス属に
属する菌株であることは明らかである。本菌株は、バチ
ラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕ
ｌａｎｓ）の菌学的性質に非常に類似しているが、カタ
ラーゼ陰性である点で異なっている。カタラーゼ陰性と
して知られるバチルス属としては、例えばバチルス・ラ
ーベ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ）、バチルス・
ポピリア（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）或
いはバチルス・レンチモルブス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌ
ｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ）等であるが、本菌株はこれらと
は明らかに異なっている。よって、本発明者らは本菌株
をバチルス・エスピー ＡＰＣ−９６０３と命名した。
【００２１】本菌株と公知の枝切り酵素生産菌であるバ
チルス・アシドプルリチカス及びバチルス・セクトラマ
スとを比較すると表１に示すとおり明確に区別すること
ができる。
チルス・アシドプルリチカス及びバチルス・セクトラマ
スとを比較すると表１に示すとおり明確に区別すること
ができる。
【００２２】
【表１】
【００２３】（Ｂ） 上記の第２発明である微生物を用
いて第１発明である新規な枝切り酵素を得るには培地に
当該微生物を接種し、常法に従って培養すればよい。
いて第１発明である新規な枝切り酵素を得るには培地に
当該微生物を接種し、常法に従って培養すればよい。
【００２４】まず、培地成分として適当な資化し得る窒
素源、炭素源等を適当量含有させればよい。例えば窒素
源としては、肉エキス、ペプトン、コーンスティープリ
カーなど、通常、微生物の培養に使用される有機窒素源
及び塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒
素源が使用される。又、炭素源としては、澱粉、液化澱
粉、デキストリン、マルトース、グルコース、シューク
ロースなどが使用される。そしてこれに補足する培地成
分としてリン酸塩、マグネシウム塩カルシウム塩、マン
ガン塩など各種金属塩が使用される。更に必要であれ
ば、無機、有機の微量栄養源を追加することもできる。
素源、炭素源等を適当量含有させればよい。例えば窒素
源としては、肉エキス、ペプトン、コーンスティープリ
カーなど、通常、微生物の培養に使用される有機窒素源
及び塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒
素源が使用される。又、炭素源としては、澱粉、液化澱
粉、デキストリン、マルトース、グルコース、シューク
ロースなどが使用される。そしてこれに補足する培地成
分としてリン酸塩、マグネシウム塩カルシウム塩、マン
ガン塩など各種金属塩が使用される。更に必要であれ
ば、無機、有機の微量栄養源を追加することもできる。
【００２５】培養の条件としては、前記のごとき培地の
ｐＨを４．０〜７．０に調整したものに本菌を接種し、
２０〜４５℃の温度で静置、振盪又は通気攪拌などの条
件で１〜２日間培養する。より好ましくは３０〜３７
℃、通気攪拌、４０〜４８時間培養する。
ｐＨを４．０〜７．０に調整したものに本菌を接種し、
２０〜４５℃の温度で静置、振盪又は通気攪拌などの条
件で１〜２日間培養する。より好ましくは３０〜３７
℃、通気攪拌、４０〜４８時間培養する。
【００２６】このようにして得られた培養物から目的と
する本願の第１発明である新規な枝切り酵素を採取、精
製するには一般的な酵素の採取、精製法が利用できる。
即ち、通常の遠心分離、濾過などのより培養液から菌体
を取り除くことによって粗酵素液を得ることができる。
この粗酵素液からは必要に応じて、塩析法、沈殿法、限
外濾過法、各種のクロマトグラフィー法を用いて精製酵
素として採取することも可能である。
する本願の第１発明である新規な枝切り酵素を採取、精
製するには一般的な酵素の採取、精製法が利用できる。
即ち、通常の遠心分離、濾過などのより培養液から菌体
を取り除くことによって粗酵素液を得ることができる。
この粗酵素液からは必要に応じて、塩析法、沈殿法、限
外濾過法、各種のクロマトグラフィー法を用いて精製酵
素として採取することも可能である。
【００２７】より具体的に記載すると、培養終了後、そ
の培養液から菌体を除去し、得られた上澄液を濃縮する
事によって高単位のα−１，６−グルコシダーゼ活性を
示す標品が得られた。さらに、この酵素標品は硫安分画
後、γ−サイクロデキストリン−セフアロース６Ｂにて
アフイニテイークロマトグラフイーを行い、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドにまで精製
した。
の培養液から菌体を除去し、得られた上澄液を濃縮する
事によって高単位のα−１，６−グルコシダーゼ活性を
示す標品が得られた。さらに、この酵素標品は硫安分画
後、γ−サイクロデキストリン−セフアロース６Ｂにて
アフイニテイークロマトグラフイーを行い、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドにまで精製
した。
【００２８】（Ｃ） このようにして得られた第１発明
である新規な枝切り酵素の酵素化学的性質を以下に詳述
する。
である新規な枝切り酵素の酵素化学的性質を以下に詳述
する。
【００２９】１ 作用：本酵素はα−１，６−グルコシ
ド結合に作用して直鎖アミロースを生成する。
ド結合に作用して直鎖アミロースを生成する。
【００３０】２ 基質特異性：本酵素のプルラン活性に
対するトウモロコシの溶性デンプン、トウモロコシのア
ミロペクチン、ポテトのアミロペクチン、カキのグリコ
ーゲンの相対活性は表２に示す通りである。１％濃度の
基質（ｐＨ５．０、１００ｍＭ マッキルバイン緩衝
液）に対する相対活性で示す。
対するトウモロコシの溶性デンプン、トウモロコシのア
ミロペクチン、ポテトのアミロペクチン、カキのグリコ
ーゲンの相対活性は表２に示す通りである。１％濃度の
基質（ｐＨ５．０、１００ｍＭ マッキルバイン緩衝
液）に対する相対活性で示す。
【００３１】
【表２】
【００３２】３ 至適ｐＨ：約５．２（１００ｍＭマッ
キルバイン緩衝液）を示す。（図１に示す）
キルバイン緩衝液）を示す。（図１に示す）
【００３３】４ ｐＨ安定性：４０℃、３０分処理（１
００ｍＭマッキルバイン緩衝液）においてｐＨ４．０〜
６．０まで安定である。（図２に示す）
００ｍＭマッキルバイン緩衝液）においてｐＨ４．０〜
６．０まで安定である。（図２に示す）
【００３４】５ 至適温度： 約６５℃付近（ｐＨ５．
０、３０分反応）を示す。（図３に示す）
０、３０分反応）を示す。（図３に示す）
【００３５】６ 温度安定性：７０℃、３０分処理にお
いて８０％安定である。（図４に示す）
いて８０％安定である。（図４に示す）
【００３６】７ 阻害剤の影響：ｐ−メルクリ安息香酸
（以下、ｐ−ＣＭＢという）及びＥＤＴＡで僅かに阻害
され、Ｎ−エチルマレイミド（以下、Ｎ−ＥＮＩとい
う）及びモノヨード酢酸（以下、ＭＩＡという）では阻
害されない。各種阻害剤による影響は、該阻害剤の終濃
度が１ｍＭで５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、４０
℃、３０分処理後の残存活性で表３に示す。
（以下、ｐ−ＣＭＢという）及びＥＤＴＡで僅かに阻害
され、Ｎ−エチルマレイミド（以下、Ｎ−ＥＮＩとい
う）及びモノヨード酢酸（以下、ＭＩＡという）では阻
害されない。各種阻害剤による影響は、該阻害剤の終濃
度が１ｍＭで５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０、４０
℃、３０分処理後の残存活性で表３に示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】８ 金属塩の影響：Ｍｇ2+、Ｃｏ2+、Ｃａ
2+、Ｎｉ2+、Ｂａ2+、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+及びＡｇ3+にはほ
とんど影響されず、Ｍｎ2+、Ｆｅ3+、Ｓｎ2+及びＣｄ2+
で僅かに阻害され、Ｈｇ2+で強く阻害される。各種金属
塩による影響は該金属塩の終濃度が、活性１４ｕ／ｍｌ
に対して１ｍＭで５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０、４０
℃、３０分処理後の残存活性で示す。
2+、Ｎｉ2+、Ｂａ2+、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+及びＡｇ3+にはほ
とんど影響されず、Ｍｎ2+、Ｆｅ3+、Ｓｎ2+及びＣｄ2+
で僅かに阻害され、Ｈｇ2+で強く阻害される。各種金属
塩による影響は該金属塩の終濃度が、活性１４ｕ／ｍｌ
に対して１ｍＭで５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．０、４０
℃、３０分処理後の残存活性で示す。
【００３９】
【表４】
【００４０】９ 分子量：約９８，０００（ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動法による）
リアクリルアミド電気泳動法による）
【００４１】１０ Ｃａの影響：５ｍＭ ＣａＣｌ2を
含む１％プルランを基質として活性を測定した。その結
果、活性に影響を与えない。酵素活性値 １４ｕ／ｍｌ
に対して５ｍＭ ＣａＣｌ2（ｐＨ５．０、５０ｍＭ
酢酸緩衝液）を３０分処理した後、活性を測定した。そ
の結果、温度安定性に影響を与えない。
含む１％プルランを基質として活性を測定した。その結
果、活性に影響を与えない。酵素活性値 １４ｕ／ｍｌ
に対して５ｍＭ ＣａＣｌ2（ｐＨ５．０、５０ｍＭ
酢酸緩衝液）を３０分処理した後、活性を測定した。そ
の結果、温度安定性に影響を与えない。
【００４２】１１ 等電点：約２．９
【００４３】第１発明の新規な枝切り酵素について、プ
ロモチーム：ノボ社製の枝切り酵素（以下、甲とする）
及びＤＢ−２５０：天野製薬製の枝切り酵素（以下、乙
とする）の性質と比較すると、下記の表５に示されるよ
うに明確に区別される。
ロモチーム：ノボ社製の枝切り酵素（以下、甲とする）
及びＤＢ−２５０：天野製薬製の枝切り酵素（以下、乙
とする）の性質と比較すると、下記の表５に示されるよ
うに明確に区別される。
【００４４】
【表５】
【００４５】本願第１発明と従来の枝切り酵素を比較す
ると以下のような相違点がある。即ち、
ると以下のような相違点がある。即ち、
【００４６】１ 生産菌株に関しては、本発明はバチル
ス エスピーＡＰＣ−９６０３である。それに対して、
甲はバチルス・アシドプルリテイクスであり、乙はバチ
ルス・セクトラマスである。
ス エスピーＡＰＣ−９６０３である。それに対して、
甲はバチルス・アシドプルリテイクスであり、乙はバチ
ルス・セクトラマスである。
【００４７】２ 基質特異性において、本発明はプルラ
ンばかりでなく比較的長鎖の糖類（溶性でんぷん、アミ
ロペクチン、グリコーゲン等）によくも作用する。それ
に対して、甲、乙共にプルランに対する基質特異性が非
常に高い。
ンばかりでなく比較的長鎖の糖類（溶性でんぷん、アミ
ロペクチン、グリコーゲン等）によくも作用する。それ
に対して、甲、乙共にプルランに対する基質特異性が非
常に高い。
【００４８】３ 至適温度に関しては、本発明は６５℃
であるが、甲は６０℃であり、乙は５５℃である。
であるが、甲は６０℃であり、乙は５５℃である。
【００４９】４ 温度安定性に関しては、本発明は７０
℃、３０分処理で８０％以上安定である。
℃、３０分処理で８０％以上安定である。
【００５０】５ 阻害剤の影響に関しては、本発明は各
種の阻害剤の影響を比較的受けにくい。それに対して、
甲及び乙はｐ−ＣＭＢによって強く阻害される。
種の阻害剤の影響を比較的受けにくい。それに対して、
甲及び乙はｐ−ＣＭＢによって強く阻害される。
【００５１】６ 金属塩の影響に関しては、本発明はＨ
ｇ2+以外には影響を受けない。それに対して、甲はＮｉ
2+、Ｆｅ3+、Ｃｕ2+、Ｈｇ2+、Ａｇ2+、Ｃｄ2+によって
強く阻害され、乙はＦｅ3+、Ｈｇ2+、Ａｇ2+によって阻
害される。
ｇ2+以外には影響を受けない。それに対して、甲はＮｉ
2+、Ｆｅ3+、Ｃｕ2+、Ｈｇ2+、Ａｇ2+、Ｃｄ2+によって
強く阻害され、乙はＦｅ3+、Ｈｇ2+、Ａｇ2+によって阻
害される。
【００５２】７ 等電点に関しては、本発明は約２．９
である。それに対して甲は約５．６、乙は約４．７であ
る。
である。それに対して甲は約５．６、乙は約４．７であ
る。
【００５３】以上のように、本発明の枝切り酵素は、甲
又は乙とは全く異なった酵素化学的性質を有している。
特にその耐熱性は従来と比較して高く、さらに基質特異
性に関しては、甲及び乙とは全く異なっているばかりで
なく、従来報告されたα−１，６−グルコシダーゼのい
ずれにもない性質を有している。
又は乙とは全く異なった酵素化学的性質を有している。
特にその耐熱性は従来と比較して高く、さらに基質特異
性に関しては、甲及び乙とは全く異なっているばかりで
なく、従来報告されたα−１，６−グルコシダーゼのい
ずれにもない性質を有している。
【００５４】つまり、酵素番号ＥＣ ３．２．１．６８
に分類されるα−１，６−グルコシダーゼ、即ちプルラ
ナーゼの基質特異性は、プルランに対して非常に特異的
であり、アミロペクチンや溶性澱粉に対する作用は弱
く、グリコーゲンに対する作用は更に弱いものである。
に分類されるα−１，６−グルコシダーゼ、即ちプルラ
ナーゼの基質特異性は、プルランに対して非常に特異的
であり、アミロペクチンや溶性澱粉に対する作用は弱
く、グリコーゲンに対する作用は更に弱いものである。
【００５５】また、酵素番号ＥＣ ３．２．１．４１に
分類されるα−１，６−グルコシダーゼ、即ちイソアミ
ラーゼの基質特異性はアミロペクチン、溶性澱粉、グリ
コーゲンには作用するが、プルランにはほとんど作用し
ないのである。
分類されるα−１，６−グルコシダーゼ、即ちイソアミ
ラーゼの基質特異性はアミロペクチン、溶性澱粉、グリ
コーゲンには作用するが、プルランにはほとんど作用し
ないのである。
【００５６】これらに対して、本願第１発明の枝切り酵
素は、プルランに作用するばかりでなく、アミロペクチ
ン、溶性澱粉、グリコーゲンにも広く作用しその基質特
異性は従来知られている、いわゆる枝切り酵素と比較し
て広い基質特異性を有している。つまり、本願第１発明
の新規な枝切り酵素は、比較的長鎖の糖類のα−１，６
結合にも作用する性質を有しているのである。よって、
本発明の第１発明である酵素は新規の枝切り酵素である
と言える。
素は、プルランに作用するばかりでなく、アミロペクチ
ン、溶性澱粉、グリコーゲンにも広く作用しその基質特
異性は従来知られている、いわゆる枝切り酵素と比較し
て広い基質特異性を有している。つまり、本願第１発明
の新規な枝切り酵素は、比較的長鎖の糖類のα−１，６
結合にも作用する性質を有しているのである。よって、
本発明の第１発明である酵素は新規の枝切り酵素である
と言える。
【００５７】（Ｄ） 本発明によって得られた枝切り酵
素は、例えばグルコアミラーゼを用いてデンプンよりブ
ドウ糖を製造する際に収率アツプの目的で添加したり、
β−アミラーゼと組み合わせてデンプンから高収率のマ
ルトースを製造する目的などに使用することができる。
素は、例えばグルコアミラーゼを用いてデンプンよりブ
ドウ糖を製造する際に収率アツプの目的で添加したり、
β−アミラーゼと組み合わせてデンプンから高収率のマ
ルトースを製造する目的などに使用することができる。
【００５８】グルコースの製造法を例示すると、澱粉を
α−アミラーゼで液化し、グルコアミラーゼでグルコー
スにまで糖化する。その際にでき得る限りその収率を向
上することが望まれている。そのために、分枝構造をな
しているα−１，６−グリコシド結合を積極的に切断す
ることによってその収率を高めることが可能であること
から、いわゆる枝切り酵素が併用されている。しかしな
がら、従来の枝切り酵素はその基質特異性が比較的短鎖
の糖類に限定されていたため、α−アミラーゼが作用
し、初期に生成した長鎖のα−１，６結合を有している
糖類に対しても枝切り作用を有する酵素であれば、更に
糖化の収率を向上させたり、糖化時間を短縮させること
が可能となる。
α−アミラーゼで液化し、グルコアミラーゼでグルコー
スにまで糖化する。その際にでき得る限りその収率を向
上することが望まれている。そのために、分枝構造をな
しているα−１，６−グリコシド結合を積極的に切断す
ることによってその収率を高めることが可能であること
から、いわゆる枝切り酵素が併用されている。しかしな
がら、従来の枝切り酵素はその基質特異性が比較的短鎖
の糖類に限定されていたため、α−アミラーゼが作用
し、初期に生成した長鎖のα−１，６結合を有している
糖類に対しても枝切り作用を有する酵素であれば、更に
糖化の収率を向上させたり、糖化時間を短縮させること
が可能となる。
【００５９】マルトースの製造法についても、β−アミ
ラーゼを用いる点を除き同様のことがいえる。
ラーゼを用いる点を除き同様のことがいえる。
【００６０】澱粉を糖化する条件としては、温度は５５
〜６５℃、好ましくは６０℃、ｐＨは４．０〜５．０、
好ましくは４．３〜４．７である。
〜６５℃、好ましくは６０℃、ｐＨは４．０〜５．０、
好ましくは４．３〜４．７である。
【００６１】糖化の条件によって変動するが、通常グル
コアミラーゼは２〜４単位、β−アミラーゼは２〜５単
位使用され、本発明の枝切り酵素は０．０５〜０．５単
位使用される。
コアミラーゼは２〜４単位、β−アミラーゼは２〜５単
位使用され、本発明の枝切り酵素は０．０５〜０．５単
位使用される。
【００６２】以下、本発明を実施例にて具体的に説明す
る。なお、実施例にて用いた本発明の酵素活性測定法は
次のとおりである。
る。なお、実施例にて用いた本発明の酵素活性測定法は
次のとおりである。
【００６３】１％プルラン溶液（ｐＨ５．０、１００ｍ
Ｍ マッキルバイン緩衝液）０．５ｍｌに酵素液０．５
ｍｌを加え、５０℃で３０分間反応する。生じた還元力
をＤＮＳ（３，５−ジニトロサリチル酸）法で定量す
る。１分間に１μｍｏｌのマルトトリオースに相当する
還元力を生ずるときを１単位とする。
Ｍ マッキルバイン緩衝液）０．５ｍｌに酵素液０．５
ｍｌを加え、５０℃で３０分間反応する。生じた還元力
をＤＮＳ（３，５−ジニトロサリチル酸）法で定量す
る。１分間に１μｍｏｌのマルトトリオースに相当する
還元力を生ずるときを１単位とする。
【００６４】
実施例１ 可溶性デンプン １．５ ％ ポリペプトン ０．５ ％ 酵母エキス ０．２５％ 硫酸アンモニウム ０．１ ％ リン酸二カリウム ０．１ ％ 硫酸マグネシウム ０．２５％ ｐＨ ５．０
【００６５】上記組成の培地にバチルス・エスピー Ａ
ＰＣ−９６０３を接種し、３７℃で７２時間坂口フラス
コで振盪培養した結果、 ｕ／ｍｌのプルラナーゼ
活性を培養液から得ることができた。この培養液９Ｌを
遠心分離して菌体を除去し、得られた上澄液を限外ろ過
膜で濃縮し、硫安９０％飽和で塩析を行い、遠心分離
後、沈殿を５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、
同液にて透析を行った。透析後、Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉａ
ｆｌｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰＭ−１０にて、１３０ｍ
ｌに濃縮した。
ＰＣ−９６０３を接種し、３７℃で７２時間坂口フラス
コで振盪培養した結果、 ｕ／ｍｌのプルラナーゼ
活性を培養液から得ることができた。この培養液９Ｌを
遠心分離して菌体を除去し、得られた上澄液を限外ろ過
膜で濃縮し、硫安９０％飽和で塩析を行い、遠心分離
後、沈殿を５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、
同液にて透析を行った。透析後、Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉａ
ｆｌｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰＭ−１０にて、１３０ｍ
ｌに濃縮した。
【００６６】濃縮後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）にて平衡化させた。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂカラムに供し、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムのリニアグラジュエントにて溶出した。溶出液を５０
ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて投石し、γ−サイ
クロデキストリン−セファロース６Ｂ（ファルマシア
製）に吸着させ、０．６％ γ−サイクロデキストリン
にて溶出した。溶出液をＡｍｉｃｏｎ Ｄｉａｆｌｏ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰＭ−１０で濃縮し、０．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で
平衡化させたトヨパール ＨＷ−５５Ｓに供し、ゲル濾
過を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、単一バ
ンドを示す精製酵素を得た。
０）にて平衡化させた。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂカラムに供し、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムのリニアグラジュエントにて溶出した。溶出液を５０
ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて投石し、γ−サイ
クロデキストリン−セファロース６Ｂ（ファルマシア
製）に吸着させ、０．６％ γ−サイクロデキストリン
にて溶出した。溶出液をＡｍｉｃｏｎ Ｄｉａｆｌｏ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰＭ−１０で濃縮し、０．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で
平衡化させたトヨパール ＨＷ−５５Ｓに供し、ゲル濾
過を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、単一バ
ンドを示す精製酵素を得た。
【００６７】実施例２ マルトース １．０ ％ ポリペプトン ０．５ ％ 酵母エキス ０．２５％ リン酸二カリウム ０．２ ％ 硫酸マグネシウム ０．１ ％ ｐＨ ５．０
【００６８】３０Ｌ容ジヤーフアーメンターに上記組成
の培地を仕込み、バチルス・エスピー ＡＰＣ−９６０
３を接種し、３７℃で４８時間通気攪拌培養した。培養
液から０．５ｕ／ｍｌのプルラナーゼ活性を得た。この
培養液を遠心分離して菌体を除き得られた上澄液を限外
ろ過膜で約１００倍に濃縮し、３８ｕ／ｍｌ（ｐＨ５．
０）の枝切り酵素の粗酵素液状標品を得た。これを硫安
分画した後、γ−サイクロデキストリン−セフアロース
６Ｂでアフイニテイークロマトグラフイーを行い２２５
ｕ／ｍｇ蛋白の精製酵素標品を得た。
の培地を仕込み、バチルス・エスピー ＡＰＣ−９６０
３を接種し、３７℃で４８時間通気攪拌培養した。培養
液から０．５ｕ／ｍｌのプルラナーゼ活性を得た。この
培養液を遠心分離して菌体を除き得られた上澄液を限外
ろ過膜で約１００倍に濃縮し、３８ｕ／ｍｌ（ｐＨ５．
０）の枝切り酵素の粗酵素液状標品を得た。これを硫安
分画した後、γ−サイクロデキストリン−セフアロース
６Ｂでアフイニテイークロマトグラフイーを行い２２５
ｕ／ｍｇ蛋白の精製酵素標品を得た。
【００６９】実施例３ ワキシースターチ ２．０ ％ 肉エキス ２．０ ％ リン酸二カリウム ０．２ ％ 硫酸マグネシウム ０．１ ％ ｐＨ ５．０
【００７０】１０００Ｌ容タンクに上記組成の培地を仕
込み、バチルス・エスピー ＡＰＣ−９６０３を接種
し、３７℃で４８時間通気攪拌培養した。培養液から
０．４ｕ／ｍｌのプルラナーゼ活性を得た。この培養液
を実施例２に示したと同様の操作を行い約１５０ｕ／ｍ
ｌの液状の枝切り粗酵素標品を約１Ｌ得た。
込み、バチルス・エスピー ＡＰＣ−９６０３を接種
し、３７℃で４８時間通気攪拌培養した。培養液から
０．４ｕ／ｍｌのプルラナーゼ活性を得た。この培養液
を実施例２に示したと同様の操作を行い約１５０ｕ／ｍ
ｌの液状の枝切り粗酵素標品を約１Ｌ得た。
【００７１】実施例４ 糖化用基質：液化デンプン（ＤＥ １１、ＢＸ３０） 糖化酵素 ：グルクザイムＮＬ−３（天野製薬製）
（２．５ｕ／ｇＤＳ） 本酵素 ：実施例３で得られた枝切り酵素（０．２５
〜０．４００ｕ／ｇＤＳ） 糖化条件 ：６０℃、ｐＨ４．５
（２．５ｕ／ｇＤＳ） 本酵素 ：実施例３で得られた枝切り酵素（０．２５
〜０．４００ｕ／ｇＤＳ） 糖化条件 ：６０℃、ｐＨ４．５
【００７２】上記の条件で糖化を行い各時間での単糖類
（Ｇ１）、２糖類（Ｇ２）、３糖類（Ｇ３）及び多糖類
（Ｇｎ）の含有率をＨＰＬＣで測定した。対照として本
酵素を添加しない糖化条件でも測定した。
（Ｇ１）、２糖類（Ｇ２）、３糖類（Ｇ３）及び多糖類
（Ｇｎ）の含有率をＨＰＬＣで測定した。対照として本
酵素を添加しない糖化条件でも測定した。
【００７３】参考例１ 実施例４と同一条件で本発明の枝切り酵素に変えて、プ
ロモチーム（甲）を使用して同様に操作して測定した。
実施例４と参考例１の結果を表６に示す。
ロモチーム（甲）を使用して同様に操作して測定した。
実施例４と参考例１の結果を表６に示す。
【００７４】
【表６】
【００７５】実施例５ 糖化用基質：液化デンプン（ＤＥ ４．６、ＢＸ２５） 糖化酵素 ：ビオザイムＭ５（天野製薬製）（４．０ｕ
／ｇＤＳ） 本酵素 ：実施例３で得られた枝切り酵素（０．２５
〜１．００ｕ／ｇＤＳ） 糖化条件 ：６３℃、ｐＨ５．５
／ｇＤＳ） 本酵素 ：実施例３で得られた枝切り酵素（０．２５
〜１．００ｕ／ｇＤＳ） 糖化条件 ：６３℃、ｐＨ５．５
【００７６】上記の条件で糖化を行い各時間での単糖類
（Ｇ１）、２糖類（Ｇ２）、３糖類（Ｇ３）及び多糖類
（Ｇｎ）の含有率をＨＰＬＣで測定した。対照として本
酵素を添加しない糖化条件でも測定した。
（Ｇ１）、２糖類（Ｇ２）、３糖類（Ｇ３）及び多糖類
（Ｇｎ）の含有率をＨＰＬＣで測定した。対照として本
酵素を添加しない糖化条件でも測定した。
【００７７】参考例２ 実施例５と同一条件で本発明の枝切り酵素に変えて、プ
ロモチーム（甲）を使用して同様に操作して測定した。
実施例４と参考例１の結果を表７に示す。
ロモチーム（甲）を使用して同様に操作して測定した。
実施例４と参考例１の結果を表７に示す。
【００７８】
【表７】
【００７９】
【発明の効果】本発明は新規な枝切り酵素、即ちイソア
ミラーゼ様活性とプルラナーゼ様活性を併せ持つ枝切り
酵素、該酵素を生産するバチルス 、該酵素の製造
法及び該酵素を用いた糖化方法を提供し、澱粉糖化業界
に貢献するものである。
ミラーゼ様活性とプルラナーゼ様活性を併せ持つ枝切り
酵素、該酵素を生産するバチルス 、該酵素の製造
法及び該酵素を用いた糖化方法を提供し、澱粉糖化業界
に貢献するものである。
【図１】本発明の新規な枝切り酵素の至適ｐＨを示すグ
ラフである。
ラフである。
【図２】本発明の新規な枝切り酵素のｐＨ安定性を示す
グラフである。
グラフである。
【図３】本発明の新規な枝切り酵素の至適温度を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図４】本発明の新規な枝切り酵素の温度安定性を示す
グラフである。
グラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１月２２日
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】
【表５】 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年３月１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】バチルス・エスピー ＡＰＣ−９６０３は
以下に述べるような菌学的性質を有する。尚、本菌株は
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−
４２０４として寄託されている。 ─────────────────────────────────────────────────────
以下に述べるような菌学的性質を有する。尚、本菌株は
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−
４２０４として寄託されている。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年４月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】まず、培地成分として適当な資化し得る窒
素源、炭素源等を適当量含有させればよい。例えば窒素
源としては、肉エキス、ペプトン、コーンスティープリ
カーなど、通常、微生物の培養に使用される有機窒素源
及び塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒
素源が使用される。又、炭素源としては、澱粉、液化澱
粉、デキストリン、マルトース、グルコース、シューク
ロースなどが使用される。そしてこれに補足する培地成
分としてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マ
ンガン塩など各種金属塩が使用される。更に必要であれ
ば、無機、有機の微量栄養源を追加することもできる。
素源、炭素源等を適当量含有させればよい。例えば窒素
源としては、肉エキス、ペプトン、コーンスティープリ
カーなど、通常、微生物の培養に使用される有機窒素源
及び塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒
素源が使用される。又、炭素源としては、澱粉、液化澱
粉、デキストリン、マルトース、グルコース、シューク
ロースなどが使用される。そしてこれに補足する培地成
分としてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マ
ンガン塩など各種金属塩が使用される。更に必要であれ
ば、無機、有機の微量栄養源を追加することもできる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】
【表５】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】１ 生産菌株に関しては、本発明はバチル
ス・エスピー ＡＰＣ−９６０３である。それに対し
て、甲はバチルス・アシドプルリテイクスであり、乙は
バチルス・セクトラマスである。
ス・エスピー ＡＰＣ−９６０３である。それに対し
て、甲はバチルス・アシドプルリテイクスであり、乙は
バチルス・セクトラマスである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６５】上記組成の培地にバチルス・エスピー Ａ
ＰＣ−９６０３を接種し、３７℃で７２時間坂口フラス
コで振盪培養した結果、０．９ｕ／ｍｌのプルラナーゼ
活性を培養液から得ることができた。この培養液９Ｌを
遠心分離して菌体を除去し、得られた上澄液を限外ろ過
膜で濃縮し、硫安９０％飽和で塩析を行い、遠心分離
後、沈澱を５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、
同液にて透析を行った。透析後、Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉａ
ｆｌｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰＭ−１０にて、１３０ｍ
ｌに濃縮した。
ＰＣ−９６０３を接種し、３７℃で７２時間坂口フラス
コで振盪培養した結果、０．９ｕ／ｍｌのプルラナーゼ
活性を培養液から得ることができた。この培養液９Ｌを
遠心分離して菌体を除去し、得られた上澄液を限外ろ過
膜で濃縮し、硫安９０％飽和で塩析を行い、遠心分離
後、沈澱を５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、
同液にて透析を行った。透析後、Ａｍｉｃｏｎ Ｄｉａ
ｆｌｏ ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰＭ−１０にて、１３０ｍ
ｌに濃縮した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６６】濃縮後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）にて平衡化させた。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂカラムに供し、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムのリニアグラジュエントにて溶出した。溶出液を５０
ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて透析し、γ−サイ
クロデキストリン−セファロース６Ｂ（ファルマシア
製）に吸着させ、０．６％ γ−サイクロデキストリン
にて溶出した。溶出液をＡｍｉｃｏｎ Ｄｉａｆｌｏ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰＭ−１０で濃縮し、０．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で
平衡化させたトヨパール ＨＷ−５５Ｓに供し、ゲル濾
過を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、単一バ
ンドを示す精製酵素を得た。
０）にて平衡化させた。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂカラムに供し、０〜０．５Ｍ塩化ナトリウ
ムのリニアグラジュエントにて溶出した。溶出液を５０
ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にて透析し、γ−サイ
クロデキストリン−セファロース６Ｂ（ファルマシア
製）に吸着させ、０．６％ γ−サイクロデキストリン
にて溶出した。溶出液をＡｍｉｃｏｎ Ｄｉａｆｌｏ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ＰＭ−１０で濃縮し、０．５Ｍ塩化
ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で
平衡化させたトヨパール ＨＷ−５５Ｓに供し、ゲル濾
過を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、単一バ
ンドを示す精製酵素を得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７９】
【発明の効果】本発明は新規な枝切り酵素、即ちイソア
ミラーゼ様活性とプルラナーゼ様活性を併せ持つ枝切り
酵素、該酵素を生産するバチルス・エスピー ＡＰＣ−
９６０３、該酵素の製造法及び該酵素を用いた糖化方法
を提供し、澱粉糖化業界に貢献するものである。
ミラーゼ様活性とプルラナーゼ様活性を併せ持つ枝切り
酵素、該酵素を生産するバチルス・エスピー ＡＰＣ−
９６０３、該酵素の製造法及び該酵素を用いた糖化方法
を提供し、澱粉糖化業界に貢献するものである。
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成５年３月１日
【旧寄託機関の名称】 工業技術院微生物工業技術研
究所
究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１２７４６
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術
研究所
研究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−４２０４
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 辻 廣二 愛知県西春日井郡西春町大字九之坪西城屋 敷51 天野製薬株式会社中央研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 少なくとも以下の酵素化学的性質を有す
る新規な枝切り酵素。 作用：α−１，６−グルコシド結合に作用して直鎖ア
ミロースを生成する。 基質特異性：プルランに作用し、溶性デンプン、アミ
ロペクチン、グリコーゲンにも作用する。 至適ｐＨ：約５．２ 至適温度：約６５℃付近 温度安定性：約８０％残存（７０℃、３０分） 分子量：約９８，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法） 等電点：約２．９ - 【請求項２】 バチルス属に属し、カタラーゼ産生能が
陰性で、請求項１記載の新規な枝切り酵素産生能を有す
ることを特徴とする微生物。 - 【請求項３】 請求項１記載の新規な枝切り酵素産生能
を有するバチルス属に属する菌株を培養し、培養物から
当該酵素を採取することを特徴とする新規な枝切り酵素
の製造法。 - 【請求項４】 澱粉又はその派生物に、少なくとも請求
項１記載の新規な枝切り酵素とグルコアミラーゼを作用
せしめ、得られるグルコース含有糖液を採取することを
特徴とするグルコース含有糖液の製造法。 - 【請求項５】 澱粉又はその派生物に、少なくとも請求
項１記載の新規な枝切り酵素とβ−アミラーゼを作用せ
しめ、得られるマルトース含有糖液を採取することを特
徴とするマルトース含有糖液の製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP07618192A JP3173849B2 (ja) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | 新規な枝切り酵素及びその製造法 |
| US08/022,163 US5387516A (en) | 1992-02-26 | 1993-02-25 | Heat stable debranching enzyme from a Bacillus microorganism |
| TW082101411A TW267188B (ja) | 1992-02-26 | 1993-02-26 | |
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| KR1019930002813A KR100261359B1 (ko) | 1992-02-26 | 1993-02-26 | 절지효소 및 이의 제조방법 |
| DE69322801T DE69322801T2 (de) | 1992-02-26 | 1993-02-26 | Enzym für Spaltung und Verfahren zu seiner Herstellung |
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|---|---|---|---|
| JP07618192A JP3173849B2 (ja) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | 新規な枝切り酵素及びその製造法 |
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|---|---|---|---|
| JP07618192A Expired - Fee Related JP3173849B2 (ja) | 1992-02-26 | 1992-02-26 | 新規な枝切り酵素及びその製造法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2662445A2 (en) | 2006-08-04 | 2013-11-13 | Amano Enzyme Inc. | Method for designing mutated enzyme, method for preparing the same and mutated enzyme |
| US9969996B2 (en) | 2006-08-04 | 2018-05-15 | Amano Enzyme Inc. | Method for making mutated pullulanase enzyme, mutated pullulanase enzyme, and microorganism expressing the same |
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|---|---|---|---|---|
| ATE183236T1 (de) * | 1992-12-28 | 1999-08-15 | Genencor Int | Pullulanase, mikroorganismen die sie produzieren, verfahren zur herstellung und ihre anwendung |
| DK1002062T3 (da) | 1997-07-02 | 2006-09-11 | Novozymes As | Stivelseomdannelsesfremgangsmåde ved anvendelse af varmestabile isoamylaser fra sulfolobus |
| AU2980199A (en) * | 1998-03-04 | 1999-09-20 | Genencor International, Inc. | Modified forms of pullulanase |
| KR20140020849A (ko) * | 2011-02-04 | 2014-02-19 | 아마노 엔자임 가부시키가이샤 | 말토트리오실 전이 효소의 신규 용도 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS529739B1 (ja) * | 1969-04-09 | 1977-03-18 | ||
| US3862005A (en) * | 1969-05-20 | 1975-01-21 | Hayashibara Co | Process for producing aldonic acids and starch sugars containing aldonic acids |
| JPS536232B2 (ja) * | 1974-01-11 | 1978-03-06 | ||
| US4011139A (en) * | 1974-11-26 | 1977-03-08 | Standard Brands Incorporated | Process for producing α-1,6 glucosidases using thermophilic microorganisms |
| CA1285896C (en) * | 1986-09-26 | 1991-07-09 | Kuniharu Nakai | .alpha.-1, 6-GLUCOSIDASE AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME |
| EP0405283A3 (en) * | 1989-06-26 | 1991-03-06 | Enzyme Bio-Systems Ltd. | Novel thermoduric and aciduric pullulanase enzyme and method for its production |
| JP6225036B2 (ja) | 2014-01-23 | 2017-11-01 | Ｉｈｉ運搬機械株式会社 | 連続アンローダの飛散防止カバー構造 |
-
1992
- 1992-02-26 JP JP07618192A patent/JP3173849B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-02-25 US US08/022,163 patent/US5387516A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-26 DE DE69322801T patent/DE69322801T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-26 TW TW082101411A patent/TW267188B/zh active
- 1993-02-26 EP EP93103057A patent/EP0558036B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-02-26 KR KR1019930002813A patent/KR100261359B1/ko not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2662445A2 (en) | 2006-08-04 | 2013-11-13 | Amano Enzyme Inc. | Method for designing mutated enzyme, method for preparing the same and mutated enzyme |
| US9969996B2 (en) | 2006-08-04 | 2018-05-15 | Amano Enzyme Inc. | Method for making mutated pullulanase enzyme, mutated pullulanase enzyme, and microorganism expressing the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0558036B1 (en) | 1998-12-30 |
| KR930018029A (ko) | 1993-09-21 |
| TW267188B (ja) | 1996-01-01 |
| EP0558036A1 (en) | 1993-09-01 |
| JP3173849B2 (ja) | 2001-06-04 |
| KR100261359B1 (ko) | 2000-07-01 |
| US5387516A (en) | 1995-02-07 |
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| DE69322801D1 (de) | 1999-02-11 |
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