JPH02501796A - 組換えアルツハイマーアミロイドタンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アルツハイマー病の診断および治療に関する。 さらに詳しくは１本発明は、アルツハイマー病に関連するアミロイドタンパク沈 着物に関係した物質を１診断用に使用することに関する。 アルツハイマー病の人口統計学は９次第に良く理解されるようになってきている 。６５歳以上の合衆国人口の５％以上および８５歳以上の合衆国人口の１５％以 」二が、この病気に罹患し疾患によるものであると考えられており、熟練した看 護施設で死亡する人々の約６５％がこの病気に罹患している。 治療が現在のところ実験段階であるという問題点を論駁するには１診断もまた信 頼できない。簡単な診断検査方法は存在しない。診断は２表れた総体的症状につ いてのそれに変わる説明に関する否定的結果に基づく一連の評価によってなされ る。疾患の存在が、脳の検死解剖により死後正確に評価され得ると仮定して、現 在の結果は、生きている個体に対する現在の診断方法が約２０％の割合で偽陽性 を与えることを示している。 アルツハイマー病の存在を診断する簡単な検定方法を得ることは、患者に対して 適切な治療を行い、かつ治療法を開発する上で非常に役立つ。以下に記載された 発明は、この診断へのアブ−ロチを提供する。 アルツハイマー病の存在に関連する生化学的現象および代謝現象についていくつ かの事実が知られている。アルツハイマー病の患者の脳には、神経原繊維のもつ れ（ＮＦＴ）およびアミロイド沈着物という２つの形態学的変化および組織病理 学的変化が見られる。ニューロン内の神経原繊維のもつれは他の成人病にも同様 に存在するが、ニューロン間の空間（神経炎プラーク）および周りの微小血管（ 脈管プラーク）の両方におけるアミロイド沈着物の存在はアルツハイマー病の特 徴であるようにである。これらのうちで、神経炎プラークは。 これらのプラークの大部分を構成しているタンパクは、一部端製され、配列が決 定されている。死亡したアルツハイマー病患者のプラークが豊富な大脳は、約４ ．２ｋｄの「ファ」ポリペプチド、すなわちアミロイドプラークコアタンパク（ ＡＰＣＰ）　、ここでは、　「β−アミロイドコアタンパクＪと呼ばれるものを 抽出するための供給源として使用されている。このペプチドは、　Ｇｌｅｎｎｅ ｒ、　Ｇ、らによりＢ−タンパクと命名された（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ（１９８４）１２０：８８５−８９０〕ｏ　アミノ末 端のアミノ酸配列が決定されている［Ｇｌｅｎｎｅｒ、　Ｇ、ら。 Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｎ＋＋＋＋ｕｎ（１９８４Ｈ２ ２：１１３１−１１３５；Ｍａｓｔｅｒｓ。 Ｃ，シ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳＡ（１９８５）８ ２：４２４５−４２５９３　。上記２つのグループによって報告されたアミノ酸 配列は、　Ｇｌｅｎｎｅｒらがアルツハイマー病の脳脈管アミロイドについて１ １位のグルタミンを報告しているのに対し、　Ｍａｓｔｅｒらが１１位のグルタ ミン酸を報告しているのに対し、　Ｍａｓｔｅｒらが１１位のグルタミン酸を報 告していることを除けば同一である。また、前者の著者らが、脳脈管アミロイド は独特のアハノ末端を有していると報告しいてるのに対し、後者の著者らは、ア ミロイドタンパクコア中に見られる形態が「不完全な」アミノ末端を有している 。すなわちこの供給源から単離されたペプチドが。 アミノ末端から３個、７個、または８個のアミノ酸を欠いているようであると報 告している。両方のグループとも、同じペプチドが、ダウン症候群の成人個体の アミロイドプラークコアおよび脈管アミロイドに見られることを示しており、１ １位におけるグルタミン酸を報告している。 β−アミロイドコアタンパクに関する他の研究は、　Ｒｏｈｅｒ。 より実施された。この研究では、タンパクの完全なアミノ酸組成が示され、かつ それが既知のタンパクの組成と一致しないことが確認された。しかしながら、得 られた組成は、明らかに、　Ａ１１ｓｏｐ、　Ｄ、ら［Ｂｒａｉｎ　Ｒｅ５（１ ９８３）２５９：３４８−３５２）の組成と一致しておらず、　Ｇｌｅｎｎｅｒ またはＭａｓｔｅｒｓ　（前出）により公表された組成とも一致していなかった 。 Ｗｏｎｇ、　Ｃ０％Ｉ１．ら　［Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩ ＳＡ（１９８５）８２二８７２９−８７３２）は、　Ｍａｓｔｅｒｓ（前出）に より報告されたβ−アミロイドコアタンパクにおける最初の１０個のアミノ酸と 相同の合成ペプチドが、マウスの抗体を増加させることができること、およびこ れらの抗体が、アミロイドを含んだ脳脈管のみならず、神経炎プラークをも着色 するために使用され得ることを示した。 これらの結果は、アミノ酸８〜１７に対応する合成ペプチドに般に、アルツハイ マー病患者の大脳の様々な個所に見られるプラークタンパク、免疫反応性におい て類似しているようである。多くの通常用いられる変性剤（例えば、界面活性剤 およびカオトロピック剤）への可溶化が不可能であることにより示されるように 、プラークタンパクの非常に不溶性である［Ｍａｓｔｅｒｓ　（前出）　Ａ１１ ｓｏｐ、　Ｄ。ら（前出）〕。 他のアミロイドタンパクとの類似性から、β−アミロイドコアタンパクは、末梢 循環系またはリンパ系における前駆体から形成され得ると考えられる。アミロイ ドタンパクに対する前駆体タンパクの性質が知られている疾患と関連のあるアミ ロイド沈着物の６つの既知例がある。−次アミロイドーシスについては、源は免 疫グロブリンＬ鎮であり；二次アミロイド−シスについては、前駆体はアミロイ ドタンパクであり：家族性のアミロイド多発性神経障害および老人性の心臓性ア ミロイド−シスについては、プレアルブミンまたはその変異体であり：甲状腺の 髄様癌については、プロカルシトニン断片であり：そして、遺伝性脳出血につい ては、ｒ−）しあり、甲状腺癌のアミロイドに対する前駆体としてのプロカルシ トニン断片に関して、さらに少なくとも多数の参考文献がある。あるいは、また さらに、β−アミロイドコアタンパクに対するこのような前駆体は、脳中で生成 されることもあ大きいタンパクの骨格内にβ−アミロイドコアタンパク配列を含 むタンパクの存在することが報告されている（Ｋａｎｇ。 Ｊ、ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５ニア３３−７３６）　。このタンパク は、β−アミロイドコアタンパクのインビボでの前駆体である。このタンパクは 、ヒト胎児の脳組織のｃＤＮＡライブラリーから単離されたｃＤＮＡクローンの 配列から推定されており、６９５個のアミノ酸残基からなる。β−アミロイドコ アタンパクのアミノ末端は５９７位で始まっている。上記シリーズの類推により 。 このような前駆体またはその断片は、アルツハイマー病患者において、この病気 に罹患していない人に対して弁別可能なレベルで、血清中を循環しうる。あるい は、またさらに、このような差は、脳を髄液においても検出されうる。 インビボにおけるβ−アミロイドコアタンパクの生産をもたらす代替メカニズム は、β−アミロイドコアタンパクの第１アミノ酸（Ａｓｐ）をコードする配列に 対して、タンパク合成の開始アミノ酸であるメチオニンのコドンが、ゲノム中で は直前に存在するという観察事項により示唆される。インビボで頻繁に起こって いるように、細胞の翻訳装置がこのメチオニンを開始メチオニンとして選択し、 ついでアミノペプチダーゼがこのメチオニンを酵素的に除去することにより、β −アミロイドコアタンパクのアミノ末端を有するタンパクが生木発明のある一般 的な目的は、β−アミロイド関連タンパクのＤＮＡ配列と、タンパク組成物とを 提供することである。 該ＤＮＡ配列およびタンパク組成物は、アルツハイマー病の改善されたスクリー ニング、診断、特徴付け、およびアルツハイマー病の病因論に関する研究に用い ることができる。 特に９本発明は、ヒト被検者におけるアルツハイマー病の予後および診断に有用 なりＮＡ配列を提供する。該ＩＩＮＡ配列は。 第１図および第２図のＤＮＡ配列と、これらＤＮＡ配列の副断片とを包含する。 ただし、このような副断片はβ−アミロイドコアタンパクをコードする２８個の アミノ末端アミノ酸残基からなる断片を含まない。 本発明のこの局面における好ましい実施態様では１次のようなりＮＡ配列が提供 される二つまり、第１図に示す配列の副断片がバクテリオファージλＡＰ［：Ｐ １６８　ｉ４のβ−アミロイド関連遺伝子産物の１６８ｂｐ挿入断片に相当する ようなりＮＡ配列である。 本発明の他の局面では、上記のＤＮＡ配列の発現により得られる組換え体β−ア ミロイド関連タンパクが提供される。 本発明のさらに他の局面は、被検者のアルツハイマー病に罹患（１，やすい遺伝 的素質を診断する方法に関する。該診断方法は次の工程を包含する：アルツハイ マー病に罹患しやすい　、素質に関連するので、上記のＤＮＡにおける１つまた はそれ以上の変化を同定すること、および被検者の遺伝子断片を、このような変 化の有無について検定すること。 関連する予後の検査では、被検者のアルツハイマー病に罹患しやすい遺伝的素質 を診断する方法が提供される。該診断方法は次の工程を包含する＝アルツハイマ ー病に罹患しやすい素質に関連するので、第１図、第２図、または第４図のＤＮ Ａ配列における１つまたはそれ以上の制限部位変化を同定すること、および被検 者の遺伝子断片を、このような制限部位変化の有無について検定すること。 さらに他の実施態様では、被検者のアルツハイマー病を診断する方法が提供され る。該診断方法は次の工程を特徴する請求項８のタンパク免疫原性領域を含むペ プチドを調製すること、該ペプチドに対して特異的な抗体を誘発すること。 および該抗体を用いて、アルツハイマー病に罹患している疑いのある被検者にお けるβ−アミロイド関連タンパクの有無を検出すること。 本発明のさらに他の実施態様は２次の配列を有するポリペプチドの、アルツハイ マー病の治療に有用な組成物の製造における使用に関する： Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｒ３　ＡｌａＭｅｔ　ｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔ ｒｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｃ ｙｓＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌ ｙ　Ｇｕｙ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ＡｓｎＰｈｅ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｕｙ　Ｓｅｒ 　Ａｌａ１ｅ 本発明のこれらの目的および特徴上池の目的および特徴とは２本発明の以下の詳 細な説明を添付の図面乏共に読めば。 より充分に明らかとなる。 第１図はλＡＰＣＰ］６８ｉ４と呼ばれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す。 該塩基配列はβ−アミロイド関連タンパクのアミノ酸１−７５１をコードする。 １．６８　ｂ　ｐ挿入物には下線力杯ｊされている。このクローンは該１６８ｂ ｐ挿入物によってＫａｎｇらの配列と区別される。 第２図はＭａｓｔｅｒらが報告したβ−アミロイドコアタンパクにおける最初の １８個のアミノ酸をコードするゲノミッククローンのＤＮＡ配列を示す。該ＤＮ Ａ配列はまた。これらのアミノ酸の直前に存在するメチオニンのコドンをコード する。このメチオニンコドンは開始コドンとして使用し得る可能性がある； 第３図は２５Ｍ２Ｗ４と呼ばれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す。該塩基配 列の３゛末端分はβ−アミロイドコアタンパクにおける最初の４個のアミノ酸を コードする。該塩基配列はまた。これらのアミノ酸の直前に存在する上記のよう なメチオニンのコドンをコードする： 第４図は２５Ｍ２Ｗ３と呼ばれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す。該塩基配 列は９７個のアミノ酸をコードする；これらのうち最初の２６個は、　Ｍａｓｔ ｅｒｓらが報告したβ−アミロイドコアタンパクのＧＬＩＩ３からＡｌａ、、ま での領域に対応している；第５図は２５Ｍ２Ｗ４と２５Ｍ２Ｗ３とから推定され るβ−アミロイド関連タンパクに関する塩基配列およびそれに対応するアミノ酸 配列を示す： 第６図はλＳＭＷ９　β−アミロイドクローンのヌクレオチド配列およびそれか ら推定されるアミノ酸を示す；第７図は２５Ｍ２Ｗ３および２５Ｍ２Ｗ９の配列 の比較を示す；第８図はλＡＰＣＰ１６８ｉ４のｍＤＮＡとＫａｎｇらが報告し たｍＤＮＡとのノーザンプロットによる検出を示す。これらのノーザンプロット は、ヒト脳およびヒト培養細胞から単離されたＲＮＡを用いて作製され、各々の 種に特異的なオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせたものである。 第９図は細菌中でβ−アミロイド関連タンパクを生産するための細菌発現ベクタ ーの構築手順の概略を示す；第１０図は、λＡＰＣＰ１６８ｉ４によりコードさ れたタンパクを発現させるための組換え体ワクシニアウィルス発現ベクターの構 築手順の概略を示す； 第１１図はλＡＰＣＰ１６８ｉ４によりコードされたたく発現させるための補乳 動物細胞発現ベクターの構築手順の概略を示す；第１２図は第５図に示すβ−ア ミロイド関連タンパクを生産するための発現ベクターの構築を示す。この場合、 β−アミロイドコアタンパク配列のすぐ上流側の部分をコードするメチオニンを 開始メチオニンとして使用する；第１３図はλＡＰｔｌ：Ｐ１６８ｉ４１６８ｂ ｐ挿入物によりコードされるペプチドと、その構成要素の多くが塩基性プロテア ーゼに対する抑制活性を示すような上位に分類されるタンパクとの関連性を示す ；そして 第１４図は１合成トリプトファンオペロンプロモーターおよびオペレーター調製 配列の構造と、プラスミドｐＴＲＰ２３３の制限部位地図とを示す。 （以下余白） 発明の詳細な説明 ここで用いられているように、　「β−アミロイドコアタンパク」は、　Ｍａｓ ｔｅｒｓ、　Ｃ，Ｌ、ら［Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（ １９８５）　８２　：　４２４５−４２４９　（ここでは、ｒＭａｓｔｅｒｓら 」と呼ぶ）〕により報告されたタンパクを意味する。このおよそ４ｋＤタンパク は、アミノ末端において、配列分析により、少し異なるアミノ末端を有する４つ のペプチドの混合物として定義される。３つの小さいペプチドのアミノ末端は、 最も大きいペプチドのアミノ末端により完全にコードされる。最も長い形態の最 初の２８個のアミノ酸は次のアミノ酸である：Ａｓｐ　＋　−Ａ　ｌａ　２−Ｇ 　ｌｕ　、−Ｐｈｅ　＊−Ａｒｇ　、−Ｈ１ｓｓ−Ａｓｐｔ−３ｅｒ　ｓ−Ｇ　 Ｉｙ　５−Ｔｙｒ＋ｇ−Ｇ１ｕ＋＋−Ｖａｌ＋２）１ｉｓ＋３ＨＩ８＋４−Ｇｌ ｎ＋５−ＬｙＳ＋５−ＬｅｌＪ＋ｔ−％’ａｌｌＢ−Ｐｈｅ＋ｓ　Ｐｈｅ２ｏ− Ａｌａｚ＋−Ｇｌｕ２２−ＡＳｐｚｓ−シミ１２ｓ−Ｇ１ｙ２ｓ−Ｓｅｒｚｓ　 ５ｅｒ２ｔ−Ａｌａ２ｓ　ｏ分子の残りの部分は、配列分析によっては定義され ていない。 「β−アミロイド関連タンパク」または「β−アミロイド関連ペプチド」は、そ れらの配列内に、上で定義されたβ−アミロイドコアタンパク配列を含むタンパ ク、または必ずしも上で定義されたβ−アミロイドコアタンパク配列を含まない ようなタンパクの断片を含むタンパクとして、ここでは定義される。−例として 、この用語は、６９５アミノ酸タンパクのアミノ酸５９７において、その構造内 に、β−アミワイドコア３６（ここでは、　「Ｋａｎｇら」と呼ぶ）により報告 されたタンパクを意味するために使用される。別の例として、この用語は、７５ １アミノ酸タンパクのアミノ酸６５３において、その構造内に、β−アミロイド コアタンパクを含む、第１図に示された。λＡＰＣＰ１６８ｉ４によりコードさ れるタンパクを意味する。 「免疫原性β−アミロイドコアペプチド」または「免疫原性β−アミロイド関連 ペプチド」は、アミノ酸配列がβ−アミロイドコアタンパクまたはβ−アミロイ ド関連タンパクのいくつかの領域のアミノ酸配列と一致しているペプチド、およ び免疫された動物において抗体応答を引き起こし得るペプチドを意味する。 「アルツハイマー病に罹患しやすい遺伝的素質」とは、アルツハイマー病に罹患 している個体、またはアルツハイマー病を発現する運命にあるが正常なわけでは ない（罹患していない）個体のゲノムに見られる同定可能な遺伝子の変異または 変化を意味する。 β−アミロイドコアタンパクまたはβ−アミロイド関連タンパクの配列に対応す るＤＮＡは９診断におけるプローブとして有用である。β−アミロイド関連タン パク配列と、隣接する非コードセグメントを有するβ−アミロイドコアタンパク 配列との一部分をコードする配列を含むいくつかのＤＮＡがここに開示されてい る。従って、これらの［ｌＮＡ配列は、全体としてまたは部分的に、完全なプロ ーブとしであるいは断片として９診断に有用である。 特に本発明は、第１図に示すヌクレオチド配列および対応する推定アミノ酸配列 を有するβ−アミロイド関連タンパクをコードするＤＮＡ配列を包含する。この ＤＮＡ配列は、β−アミロイド関連コアタンパクを含む約８２．６１０ダルトン のタンパクをコードする。 第１図に示す本発明のβ−アミロイドタンパクｃＤＮＡ配列は。 バクテリオファージλＡＰＣＰ１６８ｉ４から単離することができる。 このヒトフィブロブラストｃＤＮＡクローンは、　ＳＶ４０形質転換フィブロプ ラス）　（ＳＶ８０）細胞から標準的技術を用いてλｇｔｌ。 に調製されたｃＤＮＡライブラリーから得られた［Ｔｏｄａｒｏ、　Ｇ、Ｊ。 ブラリーは、標識オリゴヌクレオチドの混合物でスクリーニングされたβ−アミ ロイド関連配列を含む２つの独特なファージが得られた。これらのβ−アミロイ ド関連配列は、プラスミドベクターにサブクローン化され、配列分析により、１ ６８ｂｐ挿入物が存在すること以外は、　Ｋａｎｇらのβ−アミロイド関連タン パクをコードする配列と、共線状の配列であることが見出された。１６８ｂｐ挿 入物は、　Ｋａｎｇらの配列のＶａ１２ｍｓに対するコドンを中断しており、λ ＡＰＣＰ１６８ｉ４タンパクからこのアミノ酸が失われた。１６８ｂｐ挿入物は 、中断されたＶａＬａａｓコドンから得られた３つの塩基対と共に、第１図にお いて下線を付した５７個の新しいアミノ酸をコードする。この挿入個所の下流の 、第１図のコドン６５３には、　Ｍａｓｔｅｒｓらにより報告されたβ−アミロ イドコアタンパクのアミノ末端アスパラギン酸が存在する。λＡＰＣＰ１６８ｉ ４クローンは、　１９８７年７月１日付で、受託番号第４０３４７号としてＡＴ ＣＣに寄託された。 特に有用なものとして、　Ｋａｎｇらのβ−アミロイド関連タンパク配列の対応 する「接合部」をコードする配列順序と同様。 λＡＰＣＰ１６８ｉ４に見られる５７アミノ酸挿入物をコードする配列がある。 例えば、ある好ましい実施態様は、上で同定されたタンパクの残基２８９〜３４ ５に対応するアミノ酸配列を有するβ−アミロイド関連タンパクをコードするＤ ＮＡ配列を包含する。従って、この実施態様は１次のアミノ酸配列を有するβ− アミロイド関連タンパクを包含する： Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　ＡｌａＭＢＴ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔ ｒｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｃ ｙｓ本発明のβ−アミロイド関連タンパクは、この特定のペプチド（そのあらゆ る断片を含む）によって他の報告されている形態のものと区別される。 他の好ましい実施態様では、本発明は、第１図に示すβ−アミロイド関連配列の アミノ酸残基２８４−Ｖａｔ□、３−（２８９−３４５）−３４９に対応するＤ ＮＡ配列および推定アミノ酸配列を有するβ−アミロイド関連タンパクを開示す る（ここで、は、残基２８９〜・３４５の欠失を表す記号である）。この特定領 域に広がるオリゴペプチドは、　Ｋａｎ３らにより報告されたβ−アミロイド関 連タンパク遺伝的変異体と９本発明のβ−アミロイド関連タンパクとを区別する タンパク特異的診断試薬を生成するのに有用である。従って、この実施態様は９ 次のアミノ酸配列を有するβ−アミロイド関連タンパクを包含する：このペプチ ドの配列内に含まれる。より小さいペプチドも使用されうる。 １６８ｂｐ挿入物に特異的なオリゴヌクレオチドやＫａｎｇらにより報告された β−アミロイド関連タンパクのこの領域の接合部に特異的なオリゴヌクレオチド は２合成を行い、これら２つの異なるタンパクのｍＲＮＡ発現レベルを比較する ために使用することができる。−例として、オリゴ＃　２７３４と呼ばれる。 １６８ｂｐ挿入物に特異的なオリゴヌクレオチド：（以下余白） およびオリゴ＃２７３３と呼ばれる。「接合部」領域に特異的なオリゴヌクレオ チド は、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡ自動合成機を用いて、ホ スファ−アミダイト法により合成された。 「接合部」オリゴは、挿入物のどちら側でも１５ｂｐを補足するものであり、公 表されたβ−アミロイド関連タンパク配列と、λＡＰＣＰ１６８ｉ４配列とを、 当該技術分野で公知の特定のハイブリダイゼーション条件により区別するために 使用される。 この条件下では、　１５ｂｐの完全マツチは不安定であり、他方３０ｂｐの完全 マツチは安定である。これらのオリゴヌクレオチドは、特定の配列の発現レベル を測定する方法として、様々な源からｃＤＮＡライブラリーまたはｍＲＮＡをス クリーニングするために使用される。 以下に記載される別の例は、神経炎プラークにおけるアルツハイマー病に特徴的 なβ−アミロイドタンパク配列の最初の１８個（ｍｅｔを含めば、１９個）のア ミノ酸をコードするゲノ：　１１５７−１１７４）により報告されたゲノムライ ブラリーからλシャロン４Ａで得られたものであり、第２図に示すように。 部分的に配列決定されている。この図から明らかなように。 ゲノミッククローンの配列決定された部分は、　５７ｂｐセグメントを含み、以 前に報告されたβ−アミロイドコアタンパクのアミノ酸１〜１８と、直前のメチ オニンとをコードする。アミノ酸１８コドンの下流において、ゲノム配列は、β −アミロイドコアタンパクの報告されたアミノ酸配列から予期されるものと比べ ると、コドン配列が分散している。第４図の配列によりコードされるタンパクを 参照し、また当該技術分野で周知の知識を用いて、この領域に隣接する配列を調 べると、この分散はイントロン配列であるようである。２３Ｍ２と呼ばれるこの クローンは、　１９８６年１１月１３日付けでＡＴＣＣに寄託された。 ゲノミッククローンに由来する旧ｎｄＩＩＩ／Ｒｓａ　Ｉプローブ（第２図参照 ）は、正常なヒト（この個体は、心筋梗塞で死亡した５５歳の男性であった）の 脳の側頭部および頭頂部皮質組織からλｇｔｌｏに構成されたｃＤＮＡライブラ リーから、標準的手順に従って、　ｃＤＮＡ断片を単離するためのプローブとし て使用された。単離された３つのｃＤＮＡクローンは９通常の方法で配列決定さ れ、β−アミロイド関連タンパクをコードする領域を同定するための３つの可能 性のある読み枠の各々におけるアミノ酸配列と合っていた。２５Ｍ２Ｗ４と呼ば れるクローンの１つは、３′末末端列を含む。この３′末末端列は、クローンの 完全塩基配列を示す第３図から明らかなように、β−アミロイドコアタンパクの ５”末端におけるアミノ酸Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅをコードする。Ａｓ ｐｌコドンの直前には、メチオニンコドンが存在する２５Ｍ２Ｗ３と呼ばれる第 ２のクローンは、５°領域セグメントと、β−アミロイド関連タンパクの残りの 部分をコードするさらに９５個のコドンとを含む。β−アミロイドコアタンパク のアミノ酸３および４をコードする。２５Ｍ２Ｗ４クローンの３′末端（Ｅｃｏ ＲＩ制限部位）と６ｂｐが重複する２５Ｍ２Ｗ４および２５Ｍ２Ｗ３においてコ ードされる１００アミノ酸タンパク（Ｍｅｔを含む）のＤＮＡ配列を第５図に示 す。メチオニンはおそらくインビボでプロセッシングされ、従ってこの図に示さ れたβ−アミロイド関連タンパクが、９９アミノ酸配列であろうということは当 然理解される。 第３のｃＤＮＡクローンは、β−アミロイド関連タンパクの一部をコードする。 このクローンは、第５図のアミノ酸３〜４４０部分における１５個のヌクレオチ ド差および４個のアミノ酸差により示される領域において、２５Ｍ２Ｗ３とは異 なる。λＳＭ２％ｌｉ９と呼ばれるこのクローンのＤＮＡ配列および推定アミノ 酸配列を第６図に挙げる。２５Ｍ２Ｗ３との比較を第７図に挙げる。 本発明はさらに、第２図、第３図、第４図、および第６図に示すＤＮＡ配列と、 これらの割断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を包含する。これらの図に 示されたようなβ−アミロイドコアタンパクの推定配列をコードするこれらの配 列の断片には、示された配列の縮重形態が含まれる。本発明はまた。第２図、第 ３図、第４図、および第６図のＤＮＡからこれらの図に示されているように推定 されるアミノ酸配列を有するペプチドを包含する。 例えば、ある実施態様には、　（第４図に示された）２５Ｍ２Ｗ３のｃＤＮＡ挿 入物中の９７アミノ酸ペプチドをコードするコドンを５゛方向へ延長し、そのア ミノ末端に、β−アミロイドコアタンパクアミノ末端におけるさらに２個のアミ ノ酸と、必要に応じてアミノ末端メチオニンとを含めることにより得られた。 ９９または１００アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するβ−アミロイド 関連タンパクが含まれる。従って、この実施態様には９次のアミノ酸配列を有す るβ−アミロイドタンパクが含まれる： Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＬｙｓＧｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　ｌｉｅ　Ｇ ｌｙ　Ｌｅｕ　ＭＥＴ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ａ ｌａＡｓｎ０ しかしながら、第１図に与えられている配列のアミノ酸６５２により示されるよ うに、または第２図の塩基対２３８〜２４０゜あるいは第３図の塩基対１２１４ 〜１２１６のように、　ＭｅｔがＤＮＡにおいてコードされるけれども、このメ チオニンは、翻訳装置により開始メチオニンとして用いられるならば、　Ｍａｓ ｔｅｒｓらの結果と一貫性があるので、酵素的プロセッシングにより除去される ようである。 コードＤＮＡに対する別の配列には、上記の対応するコドンおよびアミノ酸位置 の代わりに、アミノ酸３〜４４について第６図に示されたＤＮＡおよび推定アミ ノ酸配列が含まれる。 さらに他の実施態様には９次のようなタンパクおよびそれらのコード配列が含ま れる。すなわち、上記タンパクの断片。 特にＭａｓｔｅｒｓらの不完全なＮ末端タンパクに対応し、１〜３位、１〜７位 、または１〜８位のコドンまたはアミノ酸を欠くものである。 ２５Ｍ２Ｗ４　、　２５Ｍ２Ｗ３　、　２５Ｍ２Ｗ９　、およびλＡＰＣＰ１６ ８ｉ４クローンは、メリーランド州ロック・ローンのアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクションに寄託されており、これらのＡＴＣＣ番号は、それぞれ第 ４０２９９号、第４０３００号、第４０３０４号。 および第４０３４７号である。 Ｃ，タンパクの生産 上記の４つのｃＤＮＡクローンは、コード配列の構築を可能にする。これらのコ ード配列を発現させることにより、完全なβ−アミロイド関連タンパク、すなわ ちβ−アミロイドコアタンパクについて報告されたアミノ末端配列を含む１００ 個のアミノ酸からなるβ−アミロイド関連タンパク、および他の所望のタンパク が得られる。これらの配列は、タンパクを生産するのに適切な発現ベクターに挿 入することができる。第１図のＤＮＡ副配列を構築する方法と、この配列を細菌 発現ベクターに挿入する方法の詳細は、実施例２に与えられている。 簡単に言えば、　ｐＡＰｃＰ１１８−３と呼ばれる３、ｃｏｌｉ発現ベクターは 、第１図に記載されたアミノ酸残基６５５〜７５１からなる融合タンパクを発現 させるために構築された。ｐＡＰｃＰ１１８−３の構築は２次の３つの断片を連 結することにより達成された＝（１）（ｐＢＲ３２２複製機能、アンピシリン耐 性遺伝子、トリプトファンプロモーターおよびオペレーター、リポソーム結合部 位。 β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子の７個のアミノ末端コドンと、後に続く６個の トレオニン残基とをコードするＤＮＡ、および転写終結シグナルからなる）プラ スミド骨格：（２）第１図の配列のアミノ酸残基６５５〜７２８をコードするＥ ｃｏＲＩ−Ｈａｅｌｌ断片；および（３）第１図の配列のアミノ酸残基７２９〜 ７５１と。 後に続く終止コドンとをコードする合成断片。 得られたベクターを用いて、　Ｂ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０を形質転換させた。融 合タンパクの発現は、トリプトファン濃度を低下させ。 次いで３−β−インドールアクリル酸を添加することにより誘発された。得られ たタンパクは従来の精製技術を用いて精製することができ、得られた精製物質は 診断検定用の抗体を生産するのに使用することができる。 第１図に記載されたβ−アミロイド関連タンパクの完全なコード配列は、寄託さ れたλＡＰＣＰ１６８ｉ４クローンに由来する２つの断片にサブクローン化され 、ｐｓｃｌｌ　（すなわち、ワタシニアウイルス発現ベクター）に挿入された。 得られたベクター（すなわち、　ｐＦＬ４Ｔ４ＢＶ）の構築は第１０図に示され ている。 簡単に言えば、第１図に示すタンパクのアミノ酸残基６５５〜７５１に及ぶ約１ ．０６キロベース（ｋｂ＞のＥｃｏＲＩ断片を、　ＥｃｏＲＩ−消化プラスミド ｐＧＥＭ−３”に（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ社から入手可能）クローン化 することにより、　ｐ４ＢＩと呼ばれる中間ベクターを作成した。その後、　ｐ ４Ｂ１を旧ｎｄＩＩＩで消化し、β−アミロイド関連配列の３′側非コ一ド配列 の多くを除去した。得られたベクターｐ４ＢΔＲ１をＥｃｏＲＩで消化し、仔つ シ腸アルカリホスファターゼで処理した後、λＡＰＣＰ１６８ｉ４に由来する２ ０８８ｂｐ　Ｅｃ。 旧断片に連結することにより、　ｐ４７４Ｂを形成した。このプラスミドを、　 ＳｍａｌおよびＸｍｎ１で消化し、第１図に示す完全タンパクをコードする配列 に広がる２６７８ｂｐ断片を生成させた。 このＳｍａｌ−Ｘｍｎｌ断片によりコードされる遺伝子は、　Ｃｏｃｈｒａｎ。 Ｍ、Ａ、ら［Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８２：　１９−２３　（１ ９８５）］により報告された真核生物の一時的発現系を用いて、　ＣＶ−１サル 腎臓細胞中でβ−アミロイド関連タンパクを引き続いて発現させるために、良く 知られたワクニシアウイルスベクターｐｓｃ１１に挿入された。より一般的には 、このベクターは、その配列がワタニシアウイルスゲノムに挿入された後、動物 におけるインビボでのタンパクおよび抗体の生産に使用される（以下の「抗体の 生産１０項を参゛照さ才′１、六−い）１、同様に、こ１、二に記載さね、にβ −６，了ミロイド：１了タンパクよ人−はβ−アミｏイド関連夕゛・′バクを発 現さセるために、畦乳袖物ベクターを使用ず、かこ２・ができ七”）。例λ、ば 。プラス”ミドｐｈＧＩＩ−ＳＶ　（１０）　＜１９８７年４月１５ＥＩＩ−公 開され、か−（＞　、、Ｈｌ、−Ｂ；：　参照文献、！、１：　ｌ、τ組込まれ ）ニー欧州特許出願第２１７．８２２号に記載されたプラスミド）は、　ｐｌＪ ［ｉｌ！プラスミド骨格、　ｈＭｔ−１［ａ遺伝子プ（ｙｉ千・−り・および調 節要素、Ｓシー４Ｑ　ＤＮＡプロモーターおよびエンハンザ−要素、ぞし、“− Ｃｈ　Ｇ　Ｈ遺伝子の１−・ド部分および３′側調節配列を含む。とのプラスｔ 　！−’は＋　Ｂａｍ旧およびＳｍａ　Ｉで消化し、Ｂ州旧　リンカ−で処理す ることにより、ヒト成長ホルモンタンパクのコード配列を削除して、３”側部ニ トード配列および調節要素をブノスミド骨格に結合さ１Ｊることができる。 この約５．１００ｂｐの口Ｎへ片を、ゲル精製し、　ＢａｍＨＩ　リンカ−に連 結する。Ｂａｍ旧で消化し、　ＤＮＡ断片を再精製シフ、次いで連結することに より、　ｐＭＴｓＶ４０　ｐｏｌｙＡ　Ｂａｍと呼ばれるプラスミドが得られる 。このプラスミドはり乳動物細胞発現ベクターを有する構造要素および調節要素 を含む。ｐＭＴｓＶ４０　ｐｏｌｙＡ　ＢａｍをＢａｍ１ｌ　Ｉで消化し、　［ ）ＮＡポリメラーゼＩおよび４つのｄＮＴＰ全部の存在下で修復した後９　この ベクターは、プラスミドｐ４Ｔ４Ｂの〜２，６７８ｂｐ　Ｓｍａｌ−Ｘｍｒ＋１ 制限断片を挿入するのに利用し得る。得られたベクターは９次いで実施例４に記 載されたようなＣＨＤ細胞における効率的なタンパク発現に使用し得る。 さらに、第３図に示された２５Ｍ２Ｗ３クローンに存在する配列と組合わせて、 λＳＭ？！ＩＡ４クローンの配列情報は、第５図に記載さね六−クンバクをコー ドす−る１乳動物細胞発現ベクターを構葉１゛るのに使用。 Ｌ記のダンバク生産の場合、形質転換細胞は、下記のよう（、ニ調製された抗β 　丁ミロイド抗体を用いで、得らイ１．たβ−〕′〜ミロイド関連タンパクの生 産に゛ついでスクリーグーングされろ。 （以Ｆ余白） Ｄ、弧」慕λ逼暫 β−アミロイドコアタンパクやβ−アミロイド関連タンパクに対して特異的な抗 体は公知の方法で調製される。合成ペプチドを使う例を挙げれば、一般に、タン パクの配列は、好ましい免疫原性領域を同定するために、主として極性および／ または荷電を有するアミノ酸残基を持った少なくとも約１０個のアミノ酸長の領 域について分析される。 別の例では、第１図に示すＤＮＡ配列は、λＡＰＣＰ１６８ｉ４中に挿入された 配列に特異的なオリゴペプチドや、　Ｈａｎｇらが報告したβ−アミロイド関連 タンパクに対応するこの挿入物の接合部分を設計するのに用いることができる。 例えば、　Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ −Ｔｈｒ−Ａｌａのような挿入された接合部分を構成するオリゴペプチドは、動 物を免疫し、　Ｋａｎｇらが報告したタンパクにおけるこの領域に対して特異的 な抗血清を生産するのに使用することができる。λＡＰＣＰ１６８ｉ４の配列の 知識を持たずにＫａｎｇの配列を調べても、当該技術分野で公知の方法により、 このペプチドを価値のある試薬として同定するのに必要な情報は提供されない。 さらに他の例としては。 １６８ｂｐの挿入領域中に存在する配列を表現するのに設計されたオリゴペプチ ドを同様に用いて、　ＡＰＣＰ１６８ｉ４タンパクにおけるこの独特な領域に対 する抗血清を生成させることができる。従って、抗原性について好ましいと同定 された領域は。 通常のペプチド合成法で合成され、キーホールリンベットヘモシアニンのような 適切な担体タンパクに共有結合で結合されている。 抗体は１通常の方法で、ウサギなどのペプチド／タンパク接合体に対し２て生成 される。免疫された動物内の抗体の存在は標準法で検出される。例えば、マイク ロタイタープレートに固定した免疫合成ペプチドに対する免疫反応性の試験と。 これに続＜　ＥＬＩＳＡ法を行う方法がある。 他の抗体製造法は、細菌を用いて製造した。実施例２０β−アミロイド関連融合 タンパクを免疫原として用いる方法である。このタンパクの免疫原性は、細菌を 用いて製造したこの融合タンパクに対する抗血清の免疫反応性によって示される 。 さらに他の抗体製造法は、宿主動物に、β−アミロイド関連タンパクをコードす る生きた組換え体ワクシニアウィルスを接種することによる方法であり、このよ うな組換え体ウィルスは、野生型ワクシニアウィルスと、ここに記載の、　ｐＦ Ｌ４Ｔ４ＢＶのようなｐｓｃ１１由来のベクターとのあいだの組換えを伴なう確 立された方法で調製される。これらの抗体はさらに、以下に述べる診断検定法に 用いることができる。 例えば、λＡＰＣＰ１６８ｉ４の５７アミノ酸挿入物のようなβ−アミロイド関 連タンパクの各種領域に由来するペプチドに特異的な抗体のパネルは、以下に述 べるように、アルツハイマー病の診断検定法に適する抗体を同定するために、ア ルツハイマー病の患者の血清もしくは脳を髄液中に存在するβ−アミロイド関連 タンパクの免疫反応性についてさらに分析される。 Ｅ、参ｍ灰よブコ５１汰 β−アミロイド関連タンパクについて第３図、第４図、および第６図に記載した ＤＮＡ配列は、死亡時にアルツハイマー病の徴候を全く示しておらず、見かけは 正常な高齢の女性に由来するものである。他のβ−アミロイド関連タンパクとし て第１図に示したλＡＰＣＰ１６８ｉ４の配列は、培養された線維芽細胞由来の ものである。これらの配列は、アルツハイマー病の個体内に見出され、それ故、 この病気に罹患しやすい素質に関連があると考えられるゲノム配列の変異を同定 する基準を提供する。 １−土復抹　アルツハイマー・病に罹患しやすい個体の遺伝的素質を決定する検 定法が用いられる。これらの検査では。 本発明のＤＮＡ配列を用いて患者のＤＮＡ試料を比較研究し、β−アミロイド遺 伝子を有する染色体の領域の多型性を明確にする。代りにまたは同時に本発明の ＤＮＡ配列は、核酸のハイブリダイゼーションに用いて、変化を明確にすること ができる。 なお、この変化には、β−アミロイド関連タンパクをコードするＤＮＡまたはＲ ＮＡにおける付加、欠失、変異もしくは置換が含まれる。 アルツハイマー病に関係のあるβ−アミロイド関連タンパク配列の変化は９判別 プローブ結合法で検定することができる。当該技術分野で公知の適切なハイブリ ダイゼーション条件下では、オリゴヌクレオチドプローブは、完全に相補的な配 列には結合するが、非常に近い関係にあるが変化した配列には結合しない。 ある検定法では、被検体から調製した核酸試料を、規定のハイブリダイゼーショ ン条件下で、各プローブとハイブリダイズさせ２次いで特定のオリゴヌクレオチ ドに対する結合性について試験する。変化、従ってアルツハイマー病に罹患しや すい素質は、一方のプローブとは結合するが他方のプローブとは結合しないこと によって確認される。プローブ結合法は、他の遺伝病にも利用されており、　Ｃ ｏｎｎｅｒ　Ｂ、Ｊ、ら、紅匹勤工Ａｃａｄ　５ｃｉ（ＵＳＡ）　８０：２７８ −２８２　（１９８３）に記載されている。 あるいは、上記のゲノム配列またはｃＤＮＡ配列由来のプローブを、アルツハイ マー病に罹患しやすい遺伝的な素質と関連がある制限断片長の多型性を同定する のに利用することができる。最初にプローブは、正常人および患者のゲノム消化 試料の両方から得た制限部位断片の長さの同定に用いられる。 アルツハイマー病と関連がある制限断片における長さの変化が、標準法によって 遺伝子スクリーニング法に利用される。 すなわち、被検体のゲノム物質を関連のある制限酵素で消化し９次いで、サザン プロット法による断片のパターンを標識プローブで決定する。 ２、菫版抜　他の種々の臨床アミロイド−シスにおいて。 アミロイド発生ペプチドは、正常に発現される遺伝子産物の変異体である。これ らのペプチドは、異常タンパク分解プロセッシングか、または最初のアミノ酸配 列を変化させる遺伝子損傷によって変化したものである。家族性アミロイド多発 性神経障害（ＦＡＰ　）のようなアミロイド−シスが知られているが、この疾患 では、正常な前駆体とアミロイドジェニック変異体との混合物が血液中に共存し ている。アルツハイマー病における。異常遺伝子産物を発現する異常組織の分布 、または遺伝子の発現レベル、遺伝子の配列もしくは遺伝子のプロセッシングな どの他の何らかの変化は、アミロイド沈着の病因学の見地から重要である。 本発明の物質を利用する第１の診断検査法は、正常な個体に対するアルツハイマ ー病の個体のβ−アミロイドコアタンパクもしくはβ−アミロイド関連タンパク の増減を検定する直接抗体検定法である。この方法では、上記のようにして得ら れた抗体は、アルツハイマー病であることが知られている個体から得たタンパク との特異的な免疫反応性についてスクリーニングされる。免疫反応性血清タンパ クの存在は、固相ＥＬＩＳＡ法のような標準免疫検定法によって測定される。 β−アミロイドコアタンパクもしくはβ−アミロイド関連タンパクの存在を検定 される人体試料には９例えば血清もしくは脳を髄液がある。例えば、アミロイド −シスを伴う遺伝的脳出血症、つまりアミロイドがγトレース前駆体から発生す る疾患では、この前駆体は、免疫検定法を用いて脳を髄液中に検出することがで きる。この病気の患者では、この前駆体のレベルが減少しているので、この前駆 体はアミロイド沈着物の形成中に消費されているという結論になる。この前駆体 は脳で作られるので、脳を髄液は適切な試料である。 他の診断検査法では、β−アミロイド関連タンパクをコードするＤＮＡは、適当 なｏ＋ＲＮＡとハイブリダイズする能力によって、適当な標的細胞内のβ−アミ ロイド関連タンパクをコードするｍＲＮＡの合成の増減を検出するためのプロー ブとして直接的に有用である。この方法の効用を示す例を以下の実施例５に示す 。 第３の診断検定法によれば、精製された組換え体アミロイドタンパクもしくは合 成ペプチドを固体担体に結合させた標準ＥＬＩＳＡ法を用いて、患者の血清中の アミロイドタンパクに対する抗体を検出することができる。 （以下余白） Ｆ７拍丼法２ また１、′の発明は、゛アルツハイマー病の改良治療法を（に供するものである 。ひとつの治療法が、λＡＰＣＰ１６８ｉ４中の１−６８　ｈｐの挿入物がコー ドする。タンパクの配列によって示唆されている。タンパクデータベースをサー チするコンピュータプログラムを使うよろな当該技術分野でよく知られている方 法を用いて、あるタンパクの他のクンバクに対するタンパク類似性を比較した結 果、前記の１６８ｂｐ挿入物がコードするタンパクは、クニツク（Ｋｕｎｉｔ、 ｚ）塩基性プロテアーゼインヒビターと１７で知られている一群のクンバクと高 度に相同性であることが分かった。前記の挿入タンパクセグメントの９前記タン パク群の３タンパクに対する類似性のレベルを第１３図に示す。この図においで 記号（：）は、比較された二つの配列が同一であることを示り１．記号（。）は ９類供の化学特牲をもったアミノ酸の置換を示す。−文字アミノ酸コードでＥＶ Ｃ３・・・ＧＳＡ　１と記載された挿入部の配列は。前記群のすべてのタンパク （この内３種だけが例示されている）に対し７で、その全長にわたって高度に類 似しアいることを示し２でいる。比較結果を示したのは次のものである。（１） ヒトトリプシンインヒビター二トリブシン、プラスミンおよびリゾソーム顆粒球 性エラスターゼを阻害する分泌血漿タンパク〔ワヒター、イー・とホッホストラ ッザー、ケー（Ｗａｃｈｔｅｒ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｈｏｃｂｓｔｒａｓｓｅｒ、 　Ｋ、）Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｈｅｗ、３６ ２巻、　１３５１．−１３５５頁、　１９８１年；モリイ、エムとトラビス、ジ エイ（Ｍｏｒｉｉ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｔｖａｖｉｓ。 、Ｌ）　Ｂｉｏｍ　ＣｈｅｌＩＨｏｐｐｅ、−５ｅｙｆｉｅｒ、　３６６巻、　 １９−ｚｘＨ，１９８５年〕　；（２）　）すプシン、キ干トリフ′シン、エラ スタ　、、、（ｇ類および）“〉スミ７を阻害するウシトリプシンイン！、ビタ ー〔ホンホスドラ−ｌサー、クーとワヒター、・イー、　Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌ ｅｒ’ｓＺ　ＰｈｙｓｉｏｉＣｈｅｔｓ、　３６４巻、　１６７９−１６１３７ 頁、　１９８３年−土ツホストラッサー。 クーらＨｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、３６４ 巻、　１６８９−１６９６Ｌ　１９８３年〕　；および（３）トリプシン、カリ クレイン、キモ［・リブシンおよびブ・ラスミンを阻害するウニ゛／匍清塩基性 ブｒＪテア−ゼインヒビター（およびその前駆物質）〔アンダー・ソン。 、ｌ−スと４ングストン、ア・仁　ビー’＋　（Ａｒｔｄｅｒｓｏｒｉ　、　Ｓ −ａｎｄＫｉｎＢｔｏｎ、Ｉｆ　、　ｌ、）　、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ、Ａｃａｄ　 ５ｃｉ（ＬＩＳＡ）、ＳＯＳ、６８３８６８４２頁、ｌり８３年）　、　１６８ １）Ｐ　（Ｄ挿入タンパク配列に対ｊる関連性のＥ記のレベルＣ，基づいて、λ ＡＰＣＰ１６８ｉ４タンパクのこの領域は、生体内でプロテア−１；［’剤’」 しての機能を有すると解釈される。この解釈にｊ７ばられ工・、＜はないが、　 １６８ｂｐの挿入タンパクもしくはくの断片の配列ｉ、１′７５づいたプロテア −・ゼ阻害剤は、アルツハイマー病の治療荊とＬ２て有用゛こあることを示唆し ７でいる。、−のプロテアーゼ阻害剤もしくは他のプ「トテアー・・ゼ阻害剤は ９ペプチドまたは非ペプチドで、神経炎のブラ・−りの形成を阻止するような機 構によってアルツハイマー病の治療もＬ　（は予防に使用できる。投与法にはこ れらペプチドの鼻からの投与がある（血液脳関門は、鼻腔のすぐ移るでは一層開 いていることが知られている）、鼻からの投与は、プロテアーゼ阻害剤のペプチ ドに９賦形剤と、０７１〜ｌＯ％（ｗ／ｉＪ）　６度のフシジン酸誘導体もしく はポリオキシエチレンエーテルのような有効量のアジュ、バントとを配合するこ とによって行うことができる。安定剤もしくは殺菌剤を任意に添加し、′７：、 もよい。ペプチドの景は、その効力と生体利用性によって変わるが、０６１〜・ ２５％（ｅｖ／ｗ　）の範囲である。投午は多少頻繁になるが、異の両側に１日 当り１・−４回１０へ一１００／／１の溶液をスプレーし、て行ってもよい。他 の投与形態としては、阻害剤の製Ｔ学的Ｉ：′、可能な賦形剤溶液（阻害剤の濃 度は０．１−２５％ｈ／ｗ　）　）があり、この場合、阻害剤は、血液流、を柱 または直接脳て注射（７て投与される。阻害剤が非ペプチドの場合は、経日投Ｊ ≠イー行うご七ができる。 Ｇ８方法−と、原−扛 細胞の形質転換２ベクター・の構築、メンセンジャ・〜ＲＮＡの抽出、Ｃ旺Ａ５ イブラリイの作製などｒ用いられる方法の１．Ｊとんどは、当該技術分野で広く 実用されている方法であり）　；Ｅたほとんどの当業者ζ”）：、特定の榮件と 方法が説明さ、ｆ’ｔＴいる標準の原材料を熟知している。しかり２便宜−１８ 、以下のバラグラフでガ・イドラインを述べる。 狛−主カー制御配刀。 原核系と真核早の両者が、β−ニアミロイド−１７配列とβ−７ミ■４１’間連 配列・〈“発現するのＧ、−用いられるが、勿論、原核系１−１１中が、りｌ】 ・−＝、）ｙゲ処理を行うのに最も便利゛ｒ・Ｃ・）る。 １ｆｆｌ　核７１．）物、＝　＋−，−ｉ：’　ａＪ：　、仁−１−２す（ｌ′ ！。ｃ、ｏｌｉ　）の各秤菌株・ｉ’：　ｔｒｆｆｉ’ｔ”ｚｊ　’Ｑカ、＠　 ｊｌ　工＜　ｔｚ　”　’、６’。イＬ！１　（１’）　？（ｋ　？、−Ｊｇ　 ８０）々宋Ａ、　（Ｊ、川−’Ｆ@＠　Ｚｌ　ａ　７Ｍ　ＣＩ’Ｘｌ：　ｊ？Ｂ 位、選択可能な標識および宿ネに迫台する種に由来する制御配列を有するプラス ミドベクターが用いられる。例えば、イ＝−。コリは、ボリバ・−ら（Ｒｏｌｉ ｖａｒ　ｅ；　ａｌ　）　（Ｇｅｎｅ、２巻。 ９５Ｊ　１９７７年）Ｌ″、よって得られた。イー・−。コリの種由来のブラス ミＦであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いで、一般に形質転換される。　ｐＢＲ３ ２２はアンピシリンとテｌ＝ラサ・イクリン耐性の遺伝イを有４゛るので、所望 のベクターを構築する際に保持されるかまたは破壊され得る選択ｉ１Ｔち；、シ な多・重標識を（是供する。原核生物の制御配列は、任意にオ′ベレーターを有 する複製開始のブ１１７千−クと、リボゾーム結合部位の配列とを備えでいると 本願では定義する。通常用いられる原核生物の制御配列は。 次のような通常用いられるプロ（−ター・を持っでいる。ずなわちβ−ラクタマ ー・ゼ（ベニシリナー＋゛）とラフ！−・ス（１バ）プロ’ｆ：　＝ター系〔チ ャンら（ＣＩ＋ａｎｇ　ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９８巻、　１ ０５６頁、　１９１１年〕；トリブトフ１ン（ｔｒｐ）プロモーター系〔ゲデル ら（Ｇｏｅｄｃｌｅｌ　ｅｔ、　ａｍ　）　、　Ｎｕｃｉｅｉｃ　Ａｃ１ｃｆｆ ｓ　Ｒｓｓ　＋１″ｉ巻、　４０５７頁、　１９８０年〕　；およびλ誘導Ｐ、 ブロモ−・・クーとトＸ遺伝子リボゾーム結合部位〔シマタｂら（Ｓｈｉｍａｔ ａｋｅ　ｅｔ、　ａり　。 Ｎａｔｕｒｅ、２９２　Ｓ、　１２８　Ｒ，ｔ９Ｂ１９日である。 細菌１．ｍ　ｊＪ１１ヌて、酵母のような真核徹４（二町も宿、：ｉ−とし７て 用いることがごきる。多数の他の株中９４Ｌび種が一般に入手できるが３実験室 株の゛リッカｒ、ｊミ４＝　ニア、　４＝しじジ′ｒ、　（５ａｃｃｈａｒｏ＋ ｐｙｃｓｓｃｅｒｃｖｉｓｉａｅ）　”Ｌ）まりパン用ｒ４　）ｌが最４＞　ｃ ＋、く使われる。例えば。 ゾ（１−チ、シフ、／「、”？−ル（Ｂｒｏａｃｈ、、−’−Ｒ，）　、　Ｍｅ ｔ、ｔｉ　Ｅｎｚ。 １０１巻、３０７頁、　１９８３年の２μの複製起点５または他の酵母に適合す る複製起点（例えば、ステインクコームら（Ｓｔｉｎｃｈｃｏａ＋ｂａｔ　ａｌ 　）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２Ｂ２巻、３９頁、　１９７９年；ツクンパー、ジー ら（Ｔｓｃｈｕａ＋ｐｅｒ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｇｅｎｅ、　１０巻、 １５７頁、　１９８０年；およびクラーク、エル、ら（Ｃ１ａｒｋｅ　Ｌ、　ｅ ｔ　ａｌ）　、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ。 １０１壱３００頁、　１９８３年参照〕を採用するベクターを用いることができ る。酵母ベクターの制御配列は、解糖酵素合成のプロモーターを有する〔ヘスら （ｌｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｊ　Ａｄｖ　ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ、７巻、１４ ９頁、　１９６８年；ハランドら（Ｈｏｌｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ）　。 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１７巻、　４９００頁、　１９７８年〕。当該技 術分野で知られているその他の利用できるプロモーターとしては、３−ホスホグ リセリン酸キナーゼのプロモーター〔ヒッツエマンら（Ｈｉｔｚｅ＋ｓａｎ　ｅ ｔ　ａｌ）　、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅ＋＊　、　２５５巻、　２０７３頁、　 １９８０年〕がある。増殖条件および／または遺伝的バックグランドで転写が制 御されるという追加の利点を有する他のプロモーター類としては、アルコールデ ヒドロゲナーゼ２．イソサイトクロームＣ（ｉｓｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ） 　、酸性ホスファターゼ。 窒素代謝に関連する分解酵素、α−因子系、およびマルトースとガラクトースの 利用に関する酵素のプロモーター領域がある。またターミネータ−の配列は、コ ーディング配列の３′末端にあるのが望ましいと信じられている。このようなタ ーミネータ−は、酵母由来の遺伝子内でコーディング配列に続（３′側非翻訳領 域に見られる。 また多細胞生物由来の真核宿主細胞の培養物中のポリペプチドをコードする遺伝 子を発現することも可能である〔例えばアクセルら（Ａｘｅｌ　ｅｔ　ａｌ）の 米国特許第４，３９９．２１６号参照〕。 これらの系は、さらに、イントロンをスプライスしてゲノムの断片を直接発現す るのに利用できるという利点もある。有用な宿主細胞系としては、　ＶＥＲＯ細 胞とＨｅ１ａ細胞、およびチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＯＯ）細胞がある 。これらの細胞の発現ベクターは、哺乳類細胞と適合する９次のようなプロモー ターと制御配列を有する０例えば２通常用いられる。 シミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）由来の初期プロモーターと後期プロモータ ー〔フィアースら（Ｐｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７３巻 、１１３頁、　１９７８年〕、またはポリオーマウィルス、アデノウィルス２． ウシ乳頭腫ウィルス、もしくはトリ肉腫ウィルス由来のプロモーターのような他 のウィルスプロモーターが挙げられる。制御可能のプロモーターｈｎｒｏ　（カ リン、エムら（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９ ９巻、　７９７−８０２頁、　１９８２年〕も使用できる。＠乳類細胞宿主系の 形質転換の一般的な態様についてはアクセルによって述べられている（前記文献 ）。 まだ“エンハンサ−”領域が２発現を最適化するのに重要であることは明らかで ある。これらの領域は、一般に、非コーディングＤＮＡ　領域中でプロモーター 領域の上流もしくは下流に見られる配列である。複製起点は、必要ならば、ウィ ルス源から得ることができる。しかし染色体への組込みは、真核細胞内のＤＮＡ 複製と共通の機構である。 並１転換 使用される宿主細胞によるが、その細胞に適切な標準法を用いて形質転換は行わ れる。塩化カルシウムを使うカルシウム処理法〔コーヘン、ニス・エヌ・（Ｃｏ ｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、）　、　ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ ）　、　６９巻、　２１１０頁、　１９７２年に記載〕、またはＲｂＣ１ｚ法〔 マニアティスら（Ｍａｎｔａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ）　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ ｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。 ２５４頁、　１９８２年およびハナハン、ディ、（Ｈａｎａｈａｎ、　ｏ、）　 、　ＪＭｏｌ　Ｂｉｏｌ、　１６６巻、　５５７−５８０頁、　１９８３年とに 記載〕は１強固な細胞壁バリヤーを有する原核細胞などの細胞に用いることがで きる。かような細胞壁のない哺乳類細胞に対しては、グラハムアンドパンデアニ ブ（Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。 ５２巻、５４６頁、　１９７８年のリン酸カリシウム沈澱法、および場合によっ ては、ウィグラー、エムら（Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ）によって改変 された方法（ウィグラ、エムらＣｅ１ｌ、　１６巻、　７７７−７８５頁、　１ ９７９年）を用いることができる。酵母への形質転換は、ベッグス、ジェイ、デ ４．　（Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、　Ｄ、）　、　Ｎａｔｕｒｅ。 ２７５巻、　１０４−１０９頁、　１９７８年またはヒネン、ニーら（Ｈｉｎｎ ｅｎ。 Ａ、　ａｔ　ａｌ）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　（Ｕ ＳＡ）　７５巻、　１９２９頁。 １９７８年の方法に従って実施される。 丘えＬ二■盪築 所望のコーディング配列と制御配列を有する適切なベクターの構築には、当該技 術分野でよく知られている標準の連結法と制限法を用いる０分離されたプラスミ ド、　ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドを切断し、調整し、所望の形 態に再連結する。 ベクターを形成するＤＮＡ配列は、多数の原料から入手することができる。バッ クボーンベクターと制限系は、構築物中バルクの配列を得るため用いられる入手 可能な“宿主°゛ベクター一般的に見られる。適切なコーディング配列を得るた めの最初の作業は２通常、適切な配列を、　ｃＤＮＡライブラリィまたはゲノム ＤＮＡライブラリィから回収することである。しかし、配列が一旦明らかになる と、生体外で個々のヌクレオシド誘導体から始まる全遺伝子配列を合成すること ができる。 かなり長い９例えば５００〜１０００ｂｐの遺伝子の全遺伝子配列は。 個々の重複している相補的オリゴヌクレオチドを合成し、デオキシリボヌクレオ チドトリホスフェートの存在下、　ＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖非重複部 分に充填することによって調製することができる。この方法を用いることによっ て。 公知の配列の数種の遺伝子を構築することが成功している〔例えばエツジ、エム ・ディ（Ｅｄｇｅ、　翫り、　）　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９２巻、７５６頁、 　１９８１年；ナンベアー、ケイ、ビーら（Ｎａｍｂａｉｒ。 Ｋ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ　）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２３巻、　１２９９頁、　 １９８４年；ジェイ。 アーネスト（Ｊａｙ　、　Ｅｒｎｅｓｔ）　、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅａ＋　、 　２５９巻、　６３１１頁、　１９８４年参照〕。 合成オリゴヌクレオチド類は、ホスホトリエステル法（エツジら、　Ｎａｔｕｒ ｅ　（上記文献）およびダックワースら（（Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈｅｔ　ａｌ）　 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９巻、　１６９１頁、　ｔ９ｓｉ年に 記載）〕またはホスホラミダイト法〔ビューケイジ、ニス、エル、とカルーザー ス、エム、エイチ（Ｂｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒ ｓ。 Ｍ、　Ｈ，）　、　Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔｓ、　２２巻、　１８５９頁、　１９８１ 年およびマチューチ、エム、ディ、（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｍ、Ｄ、　）とカ ルーザース、エム、エイチ、　Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｗ　Ｓｏｃ　１０３巻、　３１ ８５頁、　１９８１年に記載〕で調製されるかまたは、市販の自動オリゴヌクレ オチド合成装置を用いて調製することができる。アニーリング前の、または標識 をつけるための一本鎖のキナーゼ処理は、過剰の例えば、１ｎ請ｏ１の基質に対 して約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを、５抛Ｈトリス緩衝液ｐＨ７，６ 、１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、５　ｍＭ　ジチオトレイトール、１〜２ａ＋Ｍ　ＡＴ Ｐ、　１．７ｇｍｏｌ　γ３２Ｐ−ＡＴＰ　（２，９ｍｃｉ　／ＩＩＩｍｏｌｅ 　）　、　０．１　ｍＭスペルミジン、　０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下で用 いることによって達成される。 一旦、所望のベクターのコンポーネントがこのように得られたならば、標準の制 限法および連結法を用いて、コンポーネント切断および連結ができる。 部位特異的ＤＮＡ切断は、当該技術分野に広（知られている条件下で適切な制限 酵素（もしくは酵素群）で処理することによって実施されるが、その詳細は、こ れら市販の制限酵素のメーカーが具体的に述べている（例えば、　Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓの製品カタロク参照）。一般に、約１μｇのプラスミ ドもしくはＤＮＡ配列が、約２０μｌの緩衝溶液中で１単位の酵素よって切断さ れるが２本願の実施例では、特に、　ＤＮＡ基質を確実に完全消化するために、 過剰の制限酵素を用いる。 培養時間は約３７°Ｃで約１〜２時間であるが、変えることもできる。各培養後 、フェノール／クロロホルムで抽出９次いでエーテル抽出を行ってタンパクを除 去し９次いで核酸を、水性画分からエタノールで沈澱させることによって回収す る。 所望により２標準法を用いて、ポリアクリルアミドゲルもしくはアガロースゲル の電気泳動法によって、切断された断片のサイズ分離を、実施してもよい。一般 的なサイズ分離法の詳細は、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｅｅｏｌｏｇｙ 　、　６５巻、　４９９−５６０頁、　１９８０年に記載されている。 制限切断された断片は、４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェ−）　（ｄＮ ＴＰ）の存在下、イー、コリＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ）大きな断片で処 理して平滑末端とする。この時の培養時間は２０〜２５°Ｃで約１５〜２５分で 、５０ｏ＋Ｍ）リス緩衝液ｐＨ７，６、５０ｍＭ　ＮａＣ１，６１１Ｍ１’１ｇ ｃｈ　、　６ｄ　ＤＴＴおよび０．１〜１．ＯｍＭ　ｄＮＴＰ中で培養する。フ レノウ断片は、たとえ４個のｄＮＴＰが存在していても、５゛側−重鎖の突出部 をふさぎ。 突出する３゛側−重鎖を、チューバック（（ｈｅｗ　ｂａｃｋ　）する。 所望により、突出部の特性によって要求される制限内で９選択されたｄＮＴＰの ひとつだけもしくはい（つかを供給することによって選択的な修復を行うことが できる。フレノウで処理した後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、 エタノールで沈澱させる。適切な条件下、　ＳｌヌクレアーゼもしくはＢＡＬ〜 ３１で処理すると、すべての一本鎖部分が加水分解される。 連結反応は、１５〜５０μ！の体積中２次の標準条件と温度下で行う。例えば２ ０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ。 １０ｍＭ　ＤＴＴ　、　３３μｇ　／ｄ　ＢＳＡおよびｌＱａ＋Ｍ　５抛ＭＮａ Ｃ１（Ａ成分）と、これに４０　ｐ　ｔａ　ＡＴＰと０．０１〜０，０２ワイス （Ｗｅｉｓｓ　）単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて用い、０°Ｃで行う方法（ “付着端”連結法）、または前記Ａ成分とこれに１ｍＭＡＴＰと０．３〜０．６ ワイス単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて用い１４°Ｃで行う方法（“平滑末端 ”連結法）がある。分子間“付着端”連結反応は３３〜１００μｇ／Ｉｄ、総Ｄ ＮＡ　ｆｉ度（５〜１００　ｎＭ総末＠濃度）で通常行われる。分子間平滑末端 連結反応は１μｉ総末端濃度で行われる。 “ベクター断片”を用いるベクター構築法では、ベクター断片を２通常、細菌の アルカリ・ホスファターゼ（ＢＡＰ　）もしくは子ウシ腸アルカリホスファター ゼ（ＣＩＰ）で処理して。 ５”末端のリン酸塩を除去し、かつベクターの自己連結を防止する。消化は、１ ｇｇのベクター当り約１単位のＢＡＰもしくはＣＩＰを用い、約１０ｍＭのトリ ス−塩酸緩衝液、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中ｐＨ８で、６０℃にて約１時間行う、核酸 断片を回収するため。 調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた。代わり に、追加の制限酵素消化を行い、不要の断片を除くことによって二重消化を行っ たベクターでは、再連結反応を防止することができる。 配列の修飾を要する。　ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ由来のベクターの部分に 対しては、プライマーを用いた部位特異的変異誘発法が用いられる〔シラー、エ ム・ジエイとスミス、エム（Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｍｕ、　ａｎｄ　Ｓｎ＋ｉｔｈ、 　Ｍ、）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１０巻、　６４８７− ６５００頁、　１９８２年およびアデルマン、ジエイ・ピーら（Ａｄｅｌａ＋ａ ｎ　、　Ｊ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ）　、　ＤＮＡ　２巻、　１８３−１９３頁、 　１９８３年〕。この方法は、限られた不一致を除いて、変異させるべき一本鎖 ファージＤＮＡに相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行い、所 望の変異を示す。要約すれば９合成オリゴヌクレオチドを、プライマーとして用 いて、ファージに相補的な一本鎖を合成し、得られた部分的に二本鎖のまたは完 全な二本鎖ＤＮＡが、ファージを保持する宿主細菌に形質転換される。形質転換 された細菌の培養物を寒天上面に塗布し、ファージが寄生する単細胞からプラー クを形成させる。 理論的には、新しいプラークの５０％が、−重鎖として変異形態のファージを含 有し、５０％が元の配列をもっている。得られたプラークを、キナーゼ処理をし た合成プライマーとハイブリッドさせた後、完全に一致するものは結合するが１ 元のストランドとの不一致なものの結合は充分防止される洗浄温度で洗浄する。 次いでプローブとハイブリッドするプラークを採取し、培養してＤＮＡを回収す る。 構築嬰Ω１皿 以下に述べる構築物については、エム・カサダバン博士（叶９Ｍ。Ｃａ５ａｄａ ｂａｎ　）から入手したイー、コリ菌株ＭＣ１０６１（カサダバン、エムらＪ　 Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　１３８巻、　１７９−２０７頁、　１９８０年）または他の 適切な宿主を、連結混合物杏用いて最初に形質転換することによって、プラスミ ドを構築するための正しい連結を確認する。当該技術分野で知られているように 、アンピシリンテトラサイクリンなどの抗生物質の耐性、またはプラスミド構築 のモードによっては他の標識を用いて、満足すべき形質転換体を選択する。次い で得られた形質転換体由来のプラスミドを、クリユーウェル、ディ・ビイら（Ｃ ｌｅｗｅｌｌ　Ｄ。 Ｂ、ｅｔ　ａｌ　）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）、　 ６２巻、　１１５９頁、　１９６９年の方法、また、任意にクロラムフェニコー ル増幅法（クリユーウェル、ディ・ビイ、　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、　１１ ０巻、６６７頁。 １９７２年）を続けて用いて調製する。いくつかのミニＤＮＡの調製物が通常用 いられる。例えばホームズ、ディ・ニスら（Ｈｏｌｍｅｓ、　Ｄ、Ｓ、　ｅｔ　 ａｌ）　、　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、　１１４巻１９３〜１９７頁。 １９８１年およびバーンボイム、エイチ・シイら（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ。 Ｃ，ｅｔ　ａｌ）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７巻、　１５１ ３〜１５２３頁、　１９７９年のものがある。分離されたＤＮＡは、サンガー、 エフら（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ 　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、’　７４巻、　５４６３頁、　１９７７年とさらにメリ ックら（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ）　、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ ｓ　、９巻、３０９頁、　１９８１年に記載されたジデオキシヌクレオチド法、 またはマクサムら（Ｍａｘａｍ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　６５巻、４９９頁、　１９８０年の方法により、制限お よび／または配列決定して分析される。 この発明を下記実施例によってさらに説明する。これら実施例は、この発明の実 施態様を例示するためにのみ提供するものであり、この発明の範囲を限定するも のではない。 実１貫上 一アミロイドコア　ンパクと　−アミロイド　゛　ンパクコードする　゛ツムク ローンとｃＤＮＡクローンの＼シャロン４Ａλファージのヒトゲノムライブラリ ィを、Ｎ−末端配列の２８個のアミノ酸配列の最初の１３個のアミノ酸に相当す る。６重縮重体（ｓｉｘ−ｆｏｌｄ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　）　３８ｍｅｒプ ローブを用いてスクリーニングした。上記プローブを以下に示す。 上記配列図中、Ｉはイノシンを示す。上記プローブをヒトゲノムライブラリィの スクリーニングに用いたところ２強くハイブリッドするコロニーを得、これを１ ５Ｍ２と命名した。１５Ｍ２　ＯＮＡを分離し９部分的に配列を決定した。結果 を第２図に示す、配列を決定した部分は、ゲノムライブラリィから分離されたフ ァージの約１０〜２０ｋｂ挿入物のごく小さな断片である。 プローブを、はぼ２０１〜２９４の位置を示す旧ｎｄｍ／Ｒｓａｌ断片から構築 した。このゲノムプローブは、アルツハイマー病の形跡が全くない５５歳の弾性 の脳組織から、標準の方法を用いて、λｇｔｌｏ中に調製した。　ｃＤＮＡライ ブラリィをスクリーニングするのに用いた。λＳｌ’１２讐４．λ５Ｍ２Ｗ３お よびλ５Ｍ２Ｗ９と命名した３種のクローンを同定した。 １旌炎Ｉ 上記のゲノム配列とｃＤＮＡは、効率的な発現系内で組換え体タンパクを調製す るのに用いることができる。ゲノムＤＮＡは。 イントロンを処理できる哺乳類の細胞のような細胞に利用することができる。細 菌の細胞は、　ｃＤＮＡ配列の発現に利用することができる。 Ｊ二ニアｊし…Δ」」４這ノじ会ベク　６５５−７５１　の　と１！ｌＬ生 Ａ、プラスミドＡＰＣＰ１１８−３の ヒトβ−アミロイド関連タンパク（６５５−７５１）のイー、コリ発現ベクター を構築するには９次の３種のＤＮＡ断片の結合を必要とする。すなわち（１）プ ラスミドバックボーン〔複製機能、アンピシリン耐性遺伝子、トリプトファンの プロモーター／オペレータ、リポソーム結合部位、イー、コリ　β−ガラクトシ ダーゼのアミノ末端（７個のアミノ酸）とこれに続く６個のスレオニン残基をコ ードするＤＮＡ　、および転写終結シグナルからなる）；（２）第１図に示す、 アミノ酸６５５−７２８をコードするβ−アミロイド関連ＤＮＡの断片、；およ び（３）第１図に示すアミノ酸７２９−７５１をコードするβ−アミロイド関連 ＤＮＡの合成断片と終止コドンＵＡＡである。 上記プラスミドバックボーンは、　ｐＴＲＰ８３−１から誘導される。 プラスミドｐＴＲＰ８３−１は２次の方法で構築される細菌発現プラスミドであ る。 ｘ、合戦１−リブトファンオベロンγ旦ｊ−−およびオペレ二９−（７）ｇＦｌ ！１ｆｆｉお引λＩ染第１４図に示す１０種のオリゴデオキシヌクレオチドを、 ホスホトリエステル法で合成し精製した。１番と１０番を除く各オリゴデオキシ ヌクレオチドの５００ｐｍｏｌを、６０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８、１５ｍ Ｍ　ＤＴＴ、　１０＋＋＋Ｍ　ＭｇＣｈ、　２０μＣｉのＣｒ　−”Ｐ）　−Ａ ＴＰおよび２０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ／Ｌ　ＢｉｏｃｈｅＩＩｉ ｃａｌｓ社）を含有する２０μ！中で、３０分間、３７°Ｃでそれぞれ個別のリ ン酸化した０次いで６０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液ｐＨ８、１５１ＩＩＭＤＴＴ 　、　１０ｏ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｚ　、　１．５　ｍＭ　ＡＴＰおよび２０単位の追 加のポリヌクレオチドキナーゼを含有する１０μｌをさらに添加し。 ３０分間、３７°Ｃで培養した。この培養に続いて１００°Ｃで５分間培養した 。１番と１０番のオリゴデオキシヌクレオチドの５００ｐｍｏｌｅを、　ＡＴＰ を除いた上記緩衝液３０μ２で希釈した。 二本鎖対を構成する各オリゴデオキシヌクレオチド（例えば、第１４図に示す、 １番と２番および３番と４番などのオリゴデオキシヌクレオチド）の１６．７ｐ ｍｏｌｅを混合して９０°Ｃで２分間培養し、室温まで徐々に冷却した。次いで 多対を構築物内の他の対と結合させ、フェノール／クロロホルムで抽出し次いで エタノールで沈澱させた。得られたオリゴデオキシヌクレオチド対を、５ｍ１ｌ ）リス−塩酸緩衝液ｐＨ８、１０ｍＭ　ＭｇＣ１□、および２０＋ａＭ　ＤＴＴ を含有する３０μ！で再構成し、５０°Ｃで１０分間加熱し、室温まで冷却し、 　ＡＴＰを最終濃度０．５　ｍＭまで添加した。次に８００単位のＴ４ＤＮＡリ ガーゼを添加し、得られた混合物を１２．５℃で１２−１６時間培養した。 連結混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、　ＤＮＡをエタノールで沈澱 させた。得られた乾燥ＤＮＡを３０ａｌｌに再構成し、ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで ３７°Ｃにて１時間消化した。得られた混合物をフェノール／クロロホルムで抽 出し、エタノールで沈澱させ、レムリーら（Ｌａｅ＋＋＋ａ＋ｌｉ　ｅｔ　ａｌ ）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７巻、６８０頁、　１９７０年の方法により、８％ 　ポリアクリルアミドゲルの電気泳動法によって各種の二本鎖ＤＮＡセグメント を分離した。 得られたＤＮＡ断片を、潤滑ゲルオートラジオグラフィーによって可視化し、約 １００　ｂｐ長に相当するバンドを切り取り、−夜、前述のとおりに溶離した。 切断された合成りＮＡ断片を。 プラスミドＭ１３−ｍｐ８もしくはＭ１３−Ｉｌｌｐ９に連結し〔メリックとビ エイラ（Ｖｉｅｉｒａ）　、　Ｇｅｎｅ、　１９巻、　２５９−２６８頁、　１ ９８２年〕。 同様にＥｃｏＲＩとＰｓｔＩで消化し、ジデオキシヌクレオチド配列分析法に付 して、設計された配列を確認した。この設計された配列は、プロモーター（−３ ５と−１０の領域）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）のオペレーター領域お よびトリプトファンオペロンリーダーペプチドのりボゾーム結合領域を有する。 第１４図に示したのと類憤の配列が、イー、コリ内での非相同タンパクの発現に 有用であることが証明されている〔ハリウェル、アール、ニーとエムタージ、ニ ス（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ　。 Ｒ０＾、ａｎｄ　Ｅｍｔａｇｅ、　Ｓ、　）　、　Ｇｅｎｅ、９巻、　２７−４ ７頁、　１９８０年；イケハラ、エムら（Ｉｋｅｈａｒａ　、　Ｍ、　ｅｔ　ａ ｌ）　。 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（ＵＳＡ）　、　８１巻、　５９５６− ５９６０頁、１９８４年〕。 ２、人　ｔｒ　プロモーター　オペレー　−４るブースミドＴＲＰ２３３の プラスミドｐＫＫ２３３−２　（アマン、イーとブロシウス、ジエイ（Ａｍａｎ ｎ　、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｂｒｏｓｉｕｓ、　Ｊ、）　Ｇｅｎｅ、　４０巻、１８ ３頁、　１９８５年〕をＮｄｅ　ｌで完全に消化し２両末端を、５単位のイー、 コリポリメラーゼ１．つまりフレノウ断片（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈ ｅｉｍＩｎｃ、　）で平滑化し、４種のｄＮＴＰすべてを５Ｏｎ＋Ｍ添加した。 これヲ２５℃で２０分間培養した。フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノ ールで沈澱させた。Ｎｄｅ　Ｔで消化したＤＮＡを連結し。 イー、コリ内に形質転換した〔ナカムラ、ケイら（Ｎａｋａｍｕｒａ。 Ｋ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ、１巻、　２８９− ２９９頁、　１９８２年〕。 Ｎｄｅ　Ｉ部位を欠いたプラスミドが得られ、　ｐｋｋ−２３３−２−Ｎｄｅと 命名した。 ２０ｎｇのプラスミドｐｋｋ−２３３−２−ＮｄｅをＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで完 全に消化し９次に子ウシ腸ホスファターゼで処理した。ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌで 消化することによってＭ１３ＲＦから得られた合成ｔｒｐプロモーター／オペレ ーター配列の５０ｎｇを、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したｐｋｋ−２３３ −２−Ｎｄｅの１０ｎｇと混合し、　Ｔ４−ＤＮＡリガーゼで連結し１次いでイ ー、コリＪＡ２２１１ｐｐ７’ビｌａｃ　Ｉに形質転換した。１００ｂ、のＥｃ ｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ合成ｔｒｐプロモーター／オペレーターを含有するプラス ミドＤＮＡの存在によって、得られた形質転換体をスクリーニングしたが、正し いプラスミドが分離され、　ｐＴＲＰ２３３と命名した。 ｐＴＲＰ２３３をＥｃｏＲＩで消化し１両末端をフレノウで平滑化し。 連結してＥｃｏＲＩ制限部位を除去した。得られたプラスミドをＮｄｅ　Ｉと旧 ｎｄＩＩ［で消化し、Ｎｄｅ１部位とＥｃｏＲＩ部位との間に。 β−ｇａｌ　−（ｔｈｒ　）　’をコードするＮｄｅ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ　−Ｈ ｌｎｄｌ［［断片を挿入してプラスミドｐＴＲＰ８３−１を調製した。 次いで、プラスミドｐＴＲＰ８３−１をＥｃｏＲＩと旧ｎｄｌＩＩの制限エンド ヌクレアーゼで消化し、消化物を、０．６％アガロースゲル中で電気泳動に付し た〔マニアナイス、ティら（Ｍａｎｉａｔｉｓ。 Ｔ、ｅｔａｌ）前記文献１５７−１６０頁〕、プラスミドバックボーンを含有す る大きな断片を上記ゲルから溶出させた。次に。 １５Ｍ２Ｗ３由来のβ−アミロイド関連配列を含有するプラスミドｐＡＰｃＰ１ １３−３由来のＥｃｏＲＩ断片（第１図のアミノ酸６５５−７５１と３′−非翻 訳配列の５ｏｏｂｐとに相当する）を、ＨａｅＩ［制限エンドヌクレアーゼで消 化し、１２％ポリアクリルアミドゲル内で電気泳動した。はぼ２３０ｂｐのＥｃ ｏＲＩ　−Ｈａｅ　Ｉ［断片（アミノ酸６５５−７２８をコードするβ−アミロ イド関連配列を含有する）を溶出した。　７２８−７５１のアミノ酸をコードす る第１図のβ−アミロイド関連配列の残りの部分を、第９図に示す６種のオリゴ デオキシヌクレオチドを用いて調製した。１番と６番を除く各オリゴデオキシヌ クレオチドの５００　ｐｍｏｌｅずつを個別にリン酸化した。対を構成する各オ リゴデオキシヌクレオチド（例えば１番と２番、２番と３番など）の１６７ｐｍ ｏｌｅずつを混合し、９０℃で２分間培養し、室温まで徐々に冷却した。次いで 多対を他の対と結合させ、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈 澱させた。得られた対を、５ｏ＋Ｍ）−リス−塩酸緩衝液ｐＨ８，１０ｍＭ　Ｍ ｇＣｈ、　２０ｍＭ　ＤＴＴを含有する３０μ２で再構成し、５０℃で１０分間 加熱し、室温まで放冷した。ＡＴＰの最終濃度０．５　ｍＭまで添加し、８００ 単位の７４ＤＮＡ　リガーゼを添加し、得られた混合物を１２°Ｃで１２〜１６ 時間培養した。連結物を１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、　７９ｂ ｐのＨａｅ■−旧ｎｄＩＩ［合成断片を溶出した。 ｐＴＲＰ８３−１のＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄｌｌプラスミドバックボーン、はぼ２ ３０ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｈａｅ　ＩＩβ−アミロイドｃＤＮＡ断片および７９ ｂｐの合成Ｈａｅ　ｎ　−Ｈｉｎｄ　ｍβ−アミロイド断片を、１２°Ｃにて１ ２〜１６時間で連結した。イー、コリ菌株ＭＣ１０６１を、得られた連結混合物 で形質転換しくマニアナイス、ティら前記文献２５０−２５１頁）。 得られたアンピシリン耐性コロニーを、１００μｓ／ｄ！６Ｎ酸アンピシリンを 補充したしブロス１ｍｌ！中で一夜増殖させた。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶 解法（マニアナイスら、前記文献３６８−３６９頁）で調製した。プラスミドを 、ＥｃｏＲＩと）ｌｉｎｄＩＩＩで消化することによって正しい挿入物について スクリーニングした。はぼ３００ｂｐのＥｃｏＲｌ−ＨｌｎｄＩ［［断片を与え るプラスミドをｐＡＰｃＰ１１８−３と命名した。 （以下余白） Ｂ、−アミロイド　゛１人ポ１ペプチド（６５５−７５１）のプラスミドｐＡＰ ｃＰ１１Ｂ−３は、イー、コリ　トリプトファンプロモーター／オペレーターの 制御下で、１１０アミノ酸のβ−ガラクトシダーゼ−トレオニン−β−アミロイ ド関連融合タンパクを発現する。イー、コリ菌株−３１１０をプラスミドｐＡＰ ＣＰ１１８−３で形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロニーのひとつを、 Ｈ９最小塩類を含有する培地〔ミラー、ジエイ（Ｍｉ、１ｌｅｒ、　Ｊ、）　、 　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、 　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国、ニュー ヨーク州、コールドスプリングハーバ−）に、グルコース（０，４％）、チアミ ン（２μｇ　／　ｌｌ１１）　、　Ｍｇ５Ｏｎ　”　７ＨｚＯ（２００μｇ／ｄ ）、）リプトファン（４０ｄｇ／ｄ）、カザミノ酸（０，５％）およびアンピシ リン（１００μｇ／ｄ）を補充した培地内で、１２〜１６時間。 ３７℃で増殖させた。培養物を、還元させたトリプトファン（４μｓ／ｄ）を含 有する新しい培地で１００倍に希釈し１次に。 ３−β−インドールアクリル酸を２時間で最終濃度２５μｇ／ｄまで添加するこ とによって発現が誘導された。β−ｇｏｌ　−ｔｈｒ−β−アミロイド（６５５ −７５１）融合タンパクの発現は。 全細胞タンパクが１０〜２０％のレベルのときに起こり、このタンパクは、封入 小体の形態で存在し、封入小体は位相差顕微鏡（１０００倍）で可視化すること ができる。３−β−インドールアクリル酸を添加して６時間後に遠心分離して細 胞を収穫し、１０＋＊Ｍ）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７，５で洗浄し、得られた細胞 のベレットを一２０°Ｃで凍結した。 Ｃ１パ　リ゛告　の　−ａｌ　−ｔｈｒ　−−アミロイド　６５５−５００　ｄ の培養物から得た細胞のペレットを、４０ｄの、１０１トリス−塩酸緩衝液ｐＨ ７，５、０，６Ｍ　ＮａＣ１中に再懸濁させ。 ８■のりゾチームと、プロテアーゼ阻害剤のフェニルメチルスルホニルフルオラ イド（ＰＭＳＦ）とアボロチニン（それぞれ０．５　ａ＋Ｍと２５μｓ／ｄ）と ともに４°Ｃで１０分間培養した。２種類の洗浄剤、つまりデオキシコール酸ナ トリウム（１０％溶液４８０μりとＮＰ−４０（２０％溶液２４０μりの溶液を 加えて。 さらに４℃で１０分間培養した。細胞のベレットを音波処理して細胞を破砕して 、封入小体を遊離させた。ＲＮＡ５ｅ　（１０ｕ　ｇ／ｌｄ）とＤＮＡ５ｅ　（ １０ｄｇ　／ｌ１１）を添加し、混合物を３０分間室温で撹拌してＲＮＡとＤＮ Ａを消化した。封入小体（およびいくらかの細胞破片）を、１０分間５０００ｒ ｐｍ　（ＳＡ６００ロータ）で遠心分離して収集した。上澄み液を捨て、ベレッ トをタンパクゲル試料緩衝液中で、２０分間煮沸して、融合タンパクを可溶化し た。次に融合タンパクを、１２％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル中での電気泳 動で精製した（レムソー２ニー、ケイ。 Ｎａｔｕｒｅ、　２２７巻、６８０頁、　１９７０年）。各ゲルの端縁を除去し 。 クーマシーブルーで染色して１５キロダルトン（ｋＤ）の融合タンパクを可視化 した。融合タンパクを含有するゲルの領域を切取ることができるように、ゲルで タンパクを再配列した。 得られたポリアクリルアミドを、湿分を保持するために生理食塩水を加えて、針 の列（１６ゲージから２２ゲージ）を通して破砕した。ポリアクリルアミド／融 合タンパクの破砕物を。 ウサギの免疫化する直前に２アジユバント（ＲＩＢＩ　（ＲＡＳ　’）　）と混 合した。第１免疫化のため動物当り約１５０〜２００μｇの融合タンパクを投与 した。その後の免疫化には５０〜１００μｇの融合タンパクを用いる。 Ｄ、　−−ａｌ　−ｔｈｒ　−−アミ０４上６５５−ユ５ＬＩＵＡｎ久ｌバ叉灸 肌へＬ−Ｌ≦びじヨ」ンｙべ・プ　−ａＩｌｌｌｏｉｄ撫避ウエスク二つζをつ ｌ」う辷近 ３・−β−インドールアクリル酸で誘発された。イー、コリＷ３１１０　（ｐＡ ＰｃＰ１］、８−３）と同一３１１０　（ｐＴＲＰ８３−１）の培養物の細胞ベ レットを、レムリイのゲル試料緩衝液中で煮沸し、１２％ＳＯＳポリアクリルア ミドで電気泳動した。第２の形質転換された菌株は、β−ｇａｌ−ｔｈｒ−β− アミロイド（６５５−７５１）融合タンパクを除くすべてのタンパクを含有する 負の対照である。次にゲルをニトロセルロースに電気プロットし、免疫化された ウサギから収集したＡＰＣＰシンペップ抗血清とともに最初の培養を行い２次に ＩＺＳｌ−スタフィロコッカスタンパクＡとともに培養し、結合した抗体を同定 した〔ジョンソン。 ディ、ニーら（Ｊｏｈｎｓｏｎ　、　Ｄ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ　）　Ｇｅｎｅ　 Ａｎａｌ　Ｔｅｃｈ。 １巻、３頁、　１９８４年〕。これらのニトロセルロースフィルターからオート ラジオダラムが得られたが、このことは、抗ＡＰＣＰ３血清と融合タンパクとの 間の交差反応性を示している。シンペップＡＰＣＰ３は、第１図のアミノ酸７０ ５〜７１９からなり、これらアミノ酸は、融合タンパクのβ−アミロイド部分に 含まれる。また交差反応性は、他のβ−アミロイドシンペップ抗血清にも観察さ れた。 実隻貫主 きた　え　ワクチニアウィルス　いる　−アミロイド矢゛　ンパクに・　る　ク ローン　−　および　クロー之五山」す嘱り炎火 １、プラスミ上げに江殖コ閃１朶 多クローン性および単クローン性抗体を生成可能なプラスミドの構築法の概略を 第１０図に示す。プラスミドｐＧＥＭ−３”　（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｂｉｏｔｅｃ 社）をＥｃｏＲＩで消化し、マニアナイスらの方法によって子ウシ腸ホスファタ ーゼで処理した。λＡＰＣＰ１６８ｉ４由来の精製した１、０６ｋｂＥｃｏＲＴ 断片の５Ｏｎｇを、ＥｃｏＲＩで消化した。　ｐＧＥＭ−３”のＬｏｎｇと混合 し、　Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼを用いて、全体積２０μ！中で３０分間２５℃で培 養した。イー、コリ菌株ＭＣ１０６１をＣａＣ１，法によって形質転換を受容で きるようにし、上記の連結混合物で形質転換した。得られたアンピシリン耐性の コロニーを２１ｄのＬ−ａａ＋ｐブロス中で一夜増殖させ、このプロスから、プ ラスミドＤＮＡをトリトン−溶解法（マニアナイスら）で調製した。プラスミド をＢｉｎｄｌｌＩによって消化して正しい配向のものをスクリーニングした。　 １５０　ｂｐと３７００ｂｐのＨｉｎｄＩＩ［制限断片を有するプラスミドを選 択し、これをｐ４ＢＩと命名した。 得られたプラスミドｐ４ＢＩをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、　Ｔ４リガーゼで２５ °Ｃ３０分間処理して再連結して、コンビテン）−（受容能のある）ＭＣ１０６ １細胞を、上記の連結混合物で形質転換した。プラスミＦヲＥｃｏＲＩ消化によ って１３０　ｂｐ　）ｌｉｎｄＩＩ［断片のないものに対してスクリーニングし た。単−ＥｃｏＲ１部位を有するプラスミドを選択してこれをｐ４ＢΔＲＩと命 名した。ＬｏｎＨのプラスミドｐ４ＢΔＲＩｅＥｃｏＲＩで消化し、子ウシ腸ア ルカリホスファターゼで処理し、λＡＰＣＰ１６８ｉ４由来の精製した約〜２ｋ ｂのＥｃｏＲ１断片の１００　ｎｇと連結した。得られた連結混合物を用いてコ ンピテントＭＣ１０６１細胞を形質転換した。得られたアンピシリン耐性コロニ ーをＬ−ａｍｐプロス中で一夜増殖させて、プラスミドＤＮＡを調製した。プラ スミドを、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ［ｌで消化することによって正しい配向のも のについてスクリーニングした。　１．５　ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片と約〜１．５ ｋｂのＢａｍＨＩ　Ｈｉｎｄ　ｍ断片とを有するプラスミドを選択し、これをｐ ４Ｔ４Ｂと命名した。 プラスミドｐ４７４ＢをＳ＋ａａ　ＩとＸｍｎ　Ｉで消化し、得られた約〜２． ７　ｋｂ断片を０．８％　アガロースゲルから溶出させ、エタノールで沈澱させ 、減圧乾燥し、　ｄ）１．０の中に再懸濁した。 ５μｇのワクシニアウィルス発現ベクターｐｓｃ１１　［チャクラパーティら（ Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　 ５巻。 ３４０３−３４０９頁、　１９８５年〕を、　Ｓｍａ　Ｉで完全に消化し９次に 子ウシ腸ホスファターゼで処理した。ｐ４Ｔ４Ｂ由来の精製した約〜２．７　ｋ ｂのＳｍａ　Ｉ　−Ｘｍｎ　Ｉ断片５００ｎｇを、Ｓｍａｉで消化したｐｓｃ１ １５０ｎｇと混合し、　Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼとともに全体積２０μ！で１６時 間１５°Ｃで一夜培養した。イー、コリ菌株ＭＣ１０６１を上記連結混合物で形 質転換した。得られたアンピシリン耐性コロニーを一夜増殖させ、プラスミドＤ ＮＡを迅速煮沸法（マニアテイスら）によって分離した。プラスミドを、Ｅｃｏ ＲＩでの消化によって挿入物と正しい配向とについてスクリーニングした。約〜 ２５００ｂｐと約〜６００　ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を有するプラスミドを選択し 、　ｐＦＬ４Ｔ４ＢＶと命名した。 完全長のβ−アミロイド関連タンパクに対する単クローン性および多クローン性 の抗体を、イエルマ、ティ、ら（Ｙｉｌｍａ。 ７、）　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、６巻、　３２９−３３７頁、　１９８７年に記載 の新規の方法を用いて生成させた。簡潔に述べれば、この方法は、工程の免疫化 または選抜の段階のどちらにおいても、精製抗原（タンパク）を必要とせずに、 特定のタンパクに対する抗体を産生ずることを可能にする。この方法は１分離し た遺伝子を保持するように遺伝子的に加工できるワタシニアウイルスクローン化 ベクター〔スミスら（Ｓｆ！１ｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｎａｔｕｒｅ。 ３０２巻、　４９０−４９５頁、　１９８３年〕を利用する。したがって、伝染 性組換え体ワタシニアウイルスを使ってマウスを免疫化することができる。感染 させて２週間後に、マウスを殺し、コーラ−とミルスタイン（Ｘｏｈｌｅｒ　ａ ｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）によって開発された典型的な方法（Ｎａｔｕｒｅ、 　２５６巻、４９５頁、　１９７３年）と同様にして、単クローン性抗体を産生 させるために、マウスの肺臓細胞を骨髄腫細胞と融合させる０代わりに９通常行 うようにして、伝染性ワタシニアウイルス組換え体でウサギを免疫化し、多クロ ーン性抗血清を生成させるεとができる。 １０μｇのプラスミドｐ４Ｔ４ＢＶを用いて、標準方法〔マケットら（Ｍａｃｋ ｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　、　４９巻、　８５７−８６４ 頁、　１９８４年〕に従って、野生型ワタシニアウィルスに感染したＣＶ−１サ ル腎臓細胞をトラスフェクトさせる。ＴＫ−組換え体を、２５μｇ／ｉのブロモ デオキシウリジン（ＢＵｄＲ）の存在下ＴＫ−細胞上でのプラーク検定法で分離 する。青色発生を伴うプラーク検定を行うため、　ｐｓｃ１１ワタシニアウイル ス共発現ベクターの場合のように、１ミリリットル当り３００μｇのＸ−Ｇａ１ をアガロースオーバーレイ中に置いた。３７°Ｃで４〜６時間経過後プラークが 可視化した。プラークを２〜３回続けて精製する。 組換え体ウィルスから得たＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼ分析法と、λＡＰ ＣＰ１６８ｉ４由来の３２Ｐ−二ックトランスレーションを付した２０９１ｂｐ のＥｃｏＲＩ断片とのＤＮＡハイブリダイゼーション法とによって試験して、予 想していた構造を確認する。 λＡＰＣＰ１６８ｉ４の完全β−アミロイド関連ｃＤＮＡ配列を有する組換え体 ウィルスを分離し、高力価（Ｉ　Ｘ　１０”ｐＦｕ／　ｄ　）に増幅させる。こ れらの組換え体ウィルスは、ウサギおよびマウスを免疫化し９次いで公知の方法 を用いて完全長のβ−アミロイド関連タンパクに対する。それぞれ多クローン性 抗体および単クローン性抗体を産生ずるのに用いられる６種々の抗血清を、β− アミロイド関連タンパクウィルス組換え体に感染させた５ｓｓ−メチオニン標識 ＣＶ−１細胞から正しい大きさのタンパクを特異的に免疫沈澱させる性能、また は放射能で標識したアミノ酸にさらさなかった類似の細胞のウェスタープロット 上の変性タンパクを検出する性能とによってスクリーニングする。 尖丘冊土 一アミロイド　゛　ンバク　１−７５１　の立前ヱ皇登里 β−アミロイド関連タンパクを哺乳類細胞内で容易に発現させるために、プラス ミドは、該タンパクのコーディングセグメントが、ヒトメタロチオネインｎ　（ ｈＭＴ　ｎ）遺伝子由来の強力に調節されたプロモーターに融合するように構築 される。この方法は２段階で行われる。第一に、　ｐｈＧＨ−ＳＶＱωをＢａｗ ｌ　１とＳｅａ　Ｉの制限酵素で消化することによって１発現ベクターｐＭＴ　 ＳＶ４０ポリＡ　ＢａｇをｐｈＧＨ−ＳＶ　ＯＬＣクターから誘導し９次いでＤ ＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ断片）とともに培養して平滑末端の分子を得る。 次いで平滑末端を、ＢａｍＨＩリンカ−に連結し、Ｂａ５ａｌで切断し、再連結 して再環化させる。この段階で、　ｍＲＮＡの３°非翻訳領域と、推定上の３” 末端の転写停止シグナルおよびプロセッシングシグナルをコードするゲノム配列 との大部分を除いて、　ｐｈＧＨ−５Ｖ　Ｇωからヒト成長ホルモンのゲノム配 列のすべてを除去する。＠乳類細胞の発現構築物を得るために、　ｐＭＴｓＶ４ ０ポリＡ　ＢａｇをＢａｍＨＩで消化し９次に四種すべてのヌクレオチド三リン 酸およびＤＮＡポリメラーゼＩとともに培養して平滑末端を得る。次にこの断片 を（前述の）の９４Ｔ４Ｂ由来の精製した２６７８ｂｐの５ＩＩＩａ　Ｉ　−Ｘ ｍｎ　Ｉ断片と連結する。得られた組換え体骨子を、形質転換によってＭＣ１０ ６１に導入する。 チャイニーズハムスタ・・−卯巣（ＣＨＯ）−ＫＮ細胞を、Ｆ１２培地とＤＭＥ 培地の１＝１混合物と１０％のうシ胎児血清とからなる培地で培養した。コンビ チ□ｙｌ−細胞を、組立て体発現ベクターとｐＳＵ２　：　ＮｌミＯとで共形質 転換する〔サザー　ン、ビーら（Ｓｏｕｔｈｅｒｒｎ、Ｐ、、ｅｔ、ａｌ）　、 Ｊ、）ｌｏｌ　Ａｐｐｌ。　Ｇｅｎｅｔ、１巻、３２７．−３４１夏、　１９８ ２年〕、ｐＳＶ２　：　ＮＥＯは、ネオマ・イシンアナログＧ４１８に対する、 耐性を与える機能遺伝子をもっている。形質転換時に。 リン酸、リルシウム−１）ＮＡ共沈澱法（グラハム、エフ。エルとパン、デア、 ニブ、″ｆ、イ、ジェイ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２巻、　４５６−４６７頁、 　１９７３年に記載）と同様に、　５００　ｎｇにｐＳＶ２　：　ＮＥＯと５β ｇの組換え体ベクターとを、　ＣＨＯ細胞の６０＋ｓ皿Ｇ、二塗布した。ザザー ンらが記載ｉ、７たよ’）　！’抗住物質Ｇ４１８内で細胞増殖させるＪ′：と Ｇ、Ｔよって、安定にトランスフェクトされたＣＩＯ細胞のプールが得られる。 上記Ｃ１１０細胞は９発現ベクターＤＮＡを含有し、θ−アミロイド関連ｍＲＮ ｉｈ同タンパクを発現１する性能を有する１、 実−施Ｊｌｌ′ｉＪ−炙 ６β−・−アーミーローイ上関一連−りンバタ−５（いη７Ｆ＞：、、、Ｊ、、 、−、Ｏｉ培、−養啼−乳類則聰−内、ηＱ発現 β−アミＹ、スイド関連タンパクの産生を１・−・ドする哺乳類細胞発現ベクタ ーは、第１２図ｊ、こ示ずよ・）に９次のようにして構築することができる。笥 １０図の１４ＢΔＲ１・（フタ−をＢｃｏＲＩによる消化によって、直線状にす る。そのベクターを下記配列を有する２つのオリゴヌクレオチドと混合し、　Ｔ ４ＤＮＡ　リガーゼを用いて連結する。 ５’　−ＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧ−３’３°−ＧＧＣＣ ＣＴＧＧＴＡＣＣＴＡＣＧＴＣＴＴＡＡ−５’これらのオリゴヌクレオチドは、 １５Ｍ２Ｗ４のＭｅｔ−Ａη１−Ａｌａ　Ｄトンを再構築し、またそれらの前に ＥｃｏＲＩとＳｍａ　Ｉの部位が先行し、後に他のＥｃｏＲＩ部位が続くウコン ビテントイー。コリ菌株のＤ旧細胞を該混合物で形質転換し、アンピシリン耐性 の細菌を、　Ｌ−Ａ＋ｓｐプレート上で増殖させて選択した。正しい配向でＥｅ ｏＲＩ部位に挿入されたオリゴヌクレオチドの対を含有する形質転換体を、標準 スクリーニング法で選択し２　ｐΔＷ４／Ｗ３と命名した。プラスミドＤＮＡｐ ΔＷ４／す３を５ｗン）ＩとＸ＋ｎｎ　Ｉで消化し、第５図に記載のβ−アミロ イド関連タンパクをコードする配列を取出し、正しい断片をゲル精製法で分離す る。 次いで、Ｂａｏ＋ＨＩで直線状にし、前記実施例４で述べたようにして平滑末端 にし７た哺乳類細胞発現ベクターｐＭＴｓＶ４０ポリＡ　Ｂａｍに上記断片を挿 入する。得られたベクターのｐＭＴ−ＡＰＣＰ（６５２，７５１）は、β−アミ ロイド関連タンパク（６５２−７５１）の産生に利用できる。 実鶴−曳 りニア１−］−ワΔ、上舅漣り７．ンノ遣久−兄種ｑ遺旦約変異藤Φ識別検定迭 この章では、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、β〜アミＹ１イ１′関連？ ・パンバクトｌＲＮＡ１の遺伝的変異体をさ、刑する能力１．？：：・ついで述 べる。。 アルツハイニと一症の診断検定法は２　β−アミロイド関連り゛／バクの−、ノ の近縁の遺伝変異体士人倶よぞれらのｍＲＮＡを識別ξ１１．ζ―れらタンパク もｊ７．＜はｍＲＮＡの発現の相対的レベルを定量する形態をとる。第８図１１ ！２診断検定法の標準を桿供するたＶ帛、゛本父。明の配列炎用いた一例を示す 。 伶糊ｔｇｉ檎静ｂ　！、、、　＜　＆；を細１１１叩；Ｈｐｓａ　□と−２・パ 二／ティスらが述べてい２・グア゛＝ｙ７ン　ヂＡ゛・ンアネ＝−ｔ／ＣｓＣ１ 法！γよ５．て、　（細胞質ＲＮＡもしくは全縮ｆ　ＲＮ　Ａ　それぞれ４−− 一）いて）核を除去４′るかもしく　）、、、＠除去辻ずに１、培養中のヒトか イ１抱もしくはヒト脳＋＋Ｉｋ　（“パルツバ・・１“マー症の脳まｌ：・は正 常の脳）から調製した。 ；１　Ｂ　６）　ｔｈ、’、’、、　に　イア　番号を４＝ｆ　１３た試料は次 ｔｖ　、！：　ｒ；りである直１）１Ｍ１１％　−＋、’、１２１ｉ胞（＾ＴＣ Ｃ旬ｃｔｉη久））、すなわち神経芽細胞腫と線維ｌ・す旧１？Ｖ’、　ｘ！’ 、、’、　０．、”Ｒｅｉ　＋８者物由庫ノ全”ＮＡ；、　（２）ＭＲ（：５細 胞（ＡＴＣ（：’　ＣＣ目７１）、Ｊ’　ｆ、’Ｃｈ−５正常線器芽細胞由来の 全１７ＮＡ　；　（３）Ｈｅｔ、ａｌ胞（Ａ１゛ｃｃ″ＣＣ１，，２，２）ずな わら上皮細胞由来の全ＲＮＡ　；　（４）ＭＲＣ５細胞由来の絹■ζ譬ＲＮＡ　 ；　（５）Ｈｅ１．、ａｌｌ！胞由来のｍ胞ｌＲＮＡ　；（６）■−６０細剛（ ＡＴＣＣ”ＣＣ！、２４ｒ））　、すなわち前骨髄球白血病細胞由来の全針ＩＡ 　；（７）ｔ？、−テ（・、シーｙ）３ノイル−ボルフ１ζ・−・ルー１３−ア セテ・−川〜で祷り’ｆ’、　ｆ−、−’７’細胞のマ・クロア　ｙ　−ジ・・ ・・、の分化を誘発さゼ・た［ＩＬ’　６０　円１＋＞ｕ山’；ｆ　（ｆｉ　、 ｖ↑ＲＮＡ　慎ａ）ｊｌ−常、・：ｆ小脳の試料山ｓＪノ全ＲＮＬ（ワ）、’ｊ ’、！、’Ｅ　ｕ；　）Ｉｃ　ｊｊｌ　頭Ｊ”：　ＩＦ’Ｊ　Ｂｋ才ｊ由１１（ （ハ２７ＲＮＡ　；００）”７７ｉ戸ソハイ゛H−病個 ４１、　＋Ｑ＞　１ｉｆＴ　１ａｉｎ　、ａ、、：　３ｉｉ、、　由、：、Ｎｉ （＋：’７）　、、＞　ＲＮ　、ｌ′ｌ　；　；’Ｆ；　ＪA−、び（ＩＩ）　 ’、、＋ｌ’Ｅ　常な庚Ｘ　ＴＶＩ皮質山来（７Ｊ）全ＲＮＡである。ＲＮＡを 、オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィによって分画し、ホルムアルデヒド アガロースゲルで電気泳動さセ゛、二Ｉ・ロセルロースにプロット転移させる（ すべてマニアナイスらの前記文献に記載）。フィルターを焼き。 標準的な手順に従って、指示プローブと予備ハイブリダイゼー・ショニ／および ハイフ゛リダイゼ・−ジョンさせた。 指示ブト１−グは次のとおりである：（１）接合ブロー・ブ１本発明の詳細な説 明で既に述べた。カングらの配列に対し、て特異的な３０塩基のオリゴヌクレオ チド＃２７３３　；　（２）挿入ブーコープ。 すでに説明した。第１図に示すβ・−′アミロイド関連配列に対して特異的な６ ０塩基のオリゴヌクレオチド＃２７３４　；および（３）プラスミドｐＨＦＢＡ −１から分離し、た１８００ｂｐのヒトアクチンｃＤＮへ挿入物〔ポンチ、ビイ ら（Ｐｏｎｔｅ、　Ｐ、　ｅｔ、　ａｌ　）　、　Ｎｕｅ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ　 、　１２巻、　１６Ｂ？−１６９６頁。１９８４年〕である。メリゴヌクレオチ ドブロー・ブ１．Ｊ、。メーカ・・−の指示にしたがって末端転移酵素とともに 培養することによって［”ｐ　］−ｄＣＴＰで末端ｌコ標識をつけた。アクチン 挿入物は、ニックトランスレーション法によって（”ｐ　）−ＣＴＰで放射能標 識を付けた。ハイブリダイゼーシシ＝／後、オリゴヌクレオチドとハイブリッド したフィルターを１　ｘｓ、ｓ、ｃ、ｓｓ℃で洗浄した。アクチンとハイブリッ ドしたフィルタを０．ｉ　ｘＳＳＣ５５’ｃで洗浄した１、次にフィルタをＸ線 フィルムに感光さゼー２図に示したオー・トラジオグう・Ｊ、を作製し、た３、 挿入プローブは、全試験試料中で、第１図ｒ、パ示ずβ−アミロイドｒＡ連クり バクＩｌｌ　ｉ州＾を検出する。接白グロ−ブは、　１ｅＬａとＭＲＣ５の細胞 以外のすべての細胞で、カングらが記載したβ−アミロイド関連ｍＲＮＡを検出 する。アクチンプローブは、全細胞中の豊富なＲＮＡとハイブリッドすると考え られている対照である。 １旅■Ｉ Ｌニヱｊユイ」ｙ団Ｖユ２宸〜Ω影１−３４Ｆ■Ｌｑ鞭■！ｑ１１Ａ、１立入ま 上且匹■荏」Ω盪築 高発現遺伝子を得るため、イー、コリの好ましいコドンを選択し利用して、３対 のオリゴデオキシリボヌクレオチド（第９Ｄ図に示す）から、β−アミロイド関 連クンバク（２８９−３４５）を発現する合成遺伝子を、実施例２の教示にした がって組立て９次にヒドロキシルアミン切断部位（Ａｓｎ−Ｇｌｙ）を。 ２８９番のアミノ酸（Ｇｌｕ　）の前に挿入して、融合タンパクから該ポリペプ チドを切り離せるようにした。発現ベクターｐｉＲＰ８３−１を制限エンドヌク レアーゼＥｃｏＲＩと旧ｎｄｎｌで消化し。 得られた直線状プラスミドを０．６％アガロースゲルで精製した。５０μｇのプ ラスミドＤＮＡと２００μｇの合成遺伝子ＤＮＡをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い て連結し、イー、コリＭＣ１０６１をその連結物で形質転換した。アンピシリン 耐性のコロニーを１００μｇ／ｉのアンピシリン含有のしブロス中で一夜培養し 、アルカリ性プラスミド調製物を得た。得られたプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ 制限エンドヌクレアーゼで消化して、約３５０　ｂｐの断片が放出されることか ら、該遺伝子がベクター内に挿入されていることを確認した。合成遺伝子挿入を 受入れたプラスミドをｐＡＰＣＰ１２５−２と命名した。 プロモーター／オペレーターの制御下で、７４アミノ酸のβ−ガラクトシダーゼ −トレオニン−β−アミロイド関連融合タンパクを発現するように設計されてい る。イー、コリ菌株Ｗ３１１０をプラスミドｐＡＰｃＰ１２５−２で形質転換し 、得られたアンピシリン耐性のコロニーのひとつを実施例２に記載したのと同様 に増殖させた。３−β−インドールアクリル酸を最終濃度２５μｇ／ｉまで添加 することによって発現が誘発される。誘発してから５時間後、細胞のｌｌ！ｉ！ 分を培養物から取出し、遠心分離して収集し９次に１００μｌのレムリのタンパ ク試料緩衝液中で煮沸し２次いで標準法にて１６％５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲルで電気泳動を行う。封入小体形成の確認は位相差顕微鏡（１０００倍）で行 う。発現のレベルは、ゲルをクーマシーブルーで染色し、デンシトメーターで走 査してタンパクバンドの強度を定量することによって測定する。タンパクの精製 に用いる細胞を遠心分離で収集し、１０ｗ＋Ｍ）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７，５で 洗浄し、得られた細胞ペレットは必要な時まで一２０℃で凍結させる。 Ｃ，にｌ■ユυｒ−β−アミロイド　゛タンパクエ銘釘冬臣と至葺盟 融合タンパクを、　ＰＭＳＦとアプロチニンなしで、β−ｇａｌ　−ｔｈｒ−β −アミロイド関連（６５５−７５１）融合タンパクについて記載された（実施例 ２）のと同様にして精製した。２Ｍ尿素〜４Ｍ　尿素による一連の洗浄によって 他のタンパクを除き、封入小体内に認められる融合タンパクをさらにｅＡ縮した 。さらに精製が望ましい場合は、融合タンパクを６〜８Ｍ尿素中で可溶化し９次 いでゲル濾過クロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィーを行う、精 製を要しない場合は、融合タンパクをヒドロキシルアミンとともに、６Ｍ　塩酸 グアニジン中に可溶化し、モックスらが、　（Ｍｏｋｅｓ　ｅｔ　ａｌ）　。 Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　２６巻、　５２３９−５２４４頁、　１９８７年に記載の 条件下で。 ＡｓｎとＧｌｙ残基の間を切断して、そのアミノ末端にＧｌｙ残基を有するβ− アミロイド関連タンパク（２８９−３４５）を放出させる。上記の切断されたペ プチドを、逆相高圧液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィもしく はゲル濾過クロマトグラフィで精製した。次に、精製したβ−アミロイド関連タ ンパクを、還元し、タンとカイザー（Ｔａ’ｎ　ａｎｄ　Ｋａｉｓｅｒ）のＪ　 Ｏｒｇ　Ｃｈｅｗ、　４１巻、　２７８７頁、　１９７６年とＢｉｏｃｈｅ＋５ ｉｓｔｒｙ　１６巻。 １５３１−１５４１頁、　１９７７年に記載の方法で再酸化して、６個のＣｙｓ 残基間のジスルフィド結合を再形成した。６個のＣｙｓ残基を有し、イー、コリ 中に産生ずるウシ膵臓トリプシン阻害剤（アプロチニン）の再酸化もこれらの方 法で実施された〔フオン、ビルケンーバーグマンら（Ｖｏｎ　Ｗｉｌｃｋｅｎ− Ｂｅｒｇｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ）　。 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、５巻、　３２１９−３２２５頁、　１９８６年〕。 この発明を実施し、使用する好ましい実施態様を記載したが２種々の変更と改変 は、この発明から逸脱せずに行うことができることは明らかである。 下記培養物を、特許手続上、米国、メリーランド州、ロックビルに所在するアメ リカン　タイプカルチャーコレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　ＡＴＣＣ）に寄託した。バタテリ オファージλＳＭ２　、λ針２四およびλＡＰＣＰ１６８ｉ４は、微生物の寄託 の国際的承認に関するブタベスト条約に規定する条件下で寄託した（ブタベスト 条約）。 χｓＭ２　４０２７９　Ｉ９？４Ｈ＠１３６寄託された菌株を入手できるからと いって、特許法にしたがって政府の認可に基づいて付与された権利に違反してこ の発明を実施することを認可するものではない。 （以下余白） 入Ｔ’Ｇ　ＣＴＧ　ＣＣｃご ＋１ＥＴ　Ｌｅ＋ｉ　ｌ”ｒ。 ｌＧ１−３ ＦＩＧ、ｌ−４ ＦＩＧ、　２ ！＜　豐り、＋　？＜ ＦＩＧ、　５ 二にｘ８：８シ ｈｂ　１−４ｕり 国際調査報告 −一曙一一ハ両−■−ＰＣＴ／ｌｌｓ　８７１０２９５３国際調査報告 ＵＳ　８７０２９５３ Ｓ＾　１９６５４

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト被検者におけるアルツハイマー病の予後および診断に有用なＤＮＡ配列 であって，第１図および第２図のＤＮＡ配列と，これらＤＮＡ配列の副断片とを 包含するＤＮＡ配列であるが，ただしこのような副断片がβ−アミロイドコアタ ンパクをコードする２８個のアミノ末端アミノ酸残基からなる断片を含まない， ＤＮＡ配列。
2. ２．請求項１に記載のＤＮＡであって，前記副断片はバクテリオファージλＡＰ ＣＰ１６８ｉ４のβ−アミロイド関連遺伝子産物の１６８ｂｐ挿入断片に相当す る。
3. ３．請求項１に記載のＤＮＡであって，前記副断片は天然に存在する制限部位に 対応する。
4. ４．請求項３に記載のＤＮＡであって，前記副断片は第４図に示すＤＮＡ配列の ＥｃｏＲＩ制限断片を包含する。
5. ５．請求項１に記載の組換え体ＤＮＡ配列であって，β−アミロイド関連タンパ クをコードするＤＮＡ配列は，該β−アミロイドタンパクに通常付随しているタ ンパクをコードするＤＮＡを含まない。
6. ６．請求項５に記載のＤＭＡであって，前記β−アミロイド関連タンパクは次の アミノ酸配列を有する： 【配列があります】
7. ７．請求項５に記載のＤＮＡであって，前記β−アミロイドタンパクは第５図に 示すアミノ酸配列を有し，該アミノ酸配列はアミノ酸０（Ｍｅｔ），１〜３，１ 〜７，または１〜８が随意に欠失している。
8. ８．請求項５，６，または７のＤＮＡの発現により得られる組換え体β−アミロ イド関連タンパク。
9. ９．被検者のアルツハイマー病に罹患しやすい遺伝的素質を診断する方法であっ て，アルツハイマー病に罹患しやすい素質に関連するので，請求項１または２の ＤＮＡにおける１つまたはそれ以上の変化を同定すること，および被検者の遺伝 子断片を，このような変化の有無について検定すること， を包含する診断方法。
10. １０．被検者のアルツハイマー病に罹患しやすい遺伝的素質を診断する方法であ って，アルツハイマー病に罹患しやすい素質に関連するので，請求項１．２，３ ，または４のＤＮＡにおける１つまたはそれ以上の制限部位変化を同定すること ，および 被検者の遺伝子断片を，このような制限部位変化の有無について検定すること， を包含する診断方法。
11. １１．被検者のアルツハイマー病を診断する方法であって，請求項８のタンパク の免疫原性領域を含むペプチドを調製すること， 該ペプチドに対して特異的な抗体を誘発すること，および該抗体を用いて，アル ツハイマー病に罹患している疑いのある被検者におけるβ−アミロイド関連タン パクの有無を検出すること， を包含する診断方法。
12. １２．次の配列を有するポリペプチドの，アルツハイマー病の治療に有用な組成 物の製造における使用：【配列があります】
13. １３．アルツハイマー病の治療に用いる組成物であって，次の配列を有するポリ ペプチドを活性成分として，少なくとも１種の薬学的に容認される賦形剤と混合 した状態で含有する，組成物： 【配列があります】