JPH0262234B2

JPH0262234B2 -

Info

Publication number: JPH0262234B2
Application number: JP55188780A
Authority: JP
Inventors: Masao Tsuji; Yoshihiro Ichihara
Original assignee: Kuraray Co Ltd
Current assignee: Kuraray Co Ltd
Priority date: 1980-12-29
Filing date: 1980-12-29
Publication date: 1990-12-25
Also published as: JPS578781A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアルスロバクター属に属し、コール酸
塩を基質として3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケ
ト−5β−コラン酸及び／又はその塩を生産する
突然変異菌株に関する。本発明者らは先に、高濃度のコール酸塩を唯一
の炭素源とする培地で生育可能なアルスロバクタ
ー属に属する新規な微生物が、高濃度コール酸塩
を基質として7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト
−5β−コラン酸及び／又はその塩、3α，7α−ジ
ヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及び／又
はその塩並びに7α，12α−ジヒドロキシ−３−ケ
ト−5β−コラン酸及び／又はその塩を主要な代
謝産物として生産することを見出し、この微生物
をアルスロバクターCA−35（Arthrobacter CA
−35）菌株（微工研菌寄第5145号）と命名した
（特願昭54−124866号参照）。本発明者らはコール酸塩を基質として3α，7β
−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及
び／又はその塩を選択的に蓄積する微生物を得る
ため鋭意研究を重ねた結果、上記のアルスロバク
ターCA−35菌株に通常の突然変異処理、例えば、
紫外線、Ｘ線、γ線などの照射、Ｎ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、４−ニ
トロキノリン−Ｎ−オキサイド、アクリフラビ
ン、エチルメタンスルホネートなどの突然変異誘
起剤との接触などを施すことにより、コール酸塩
を基質として3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト
−5β−コラン酸及び／又はその塩を極めて選択
的に生産する突然変異菌株を分離することに成功
し、本発明に到達した。このような突然変異菌株として次の菌株を挙げ
ることができる。 (1) アルスロバクターCA−35−A589−29−32
（Arthrobacter CA−35−A589−29−32）菌株
（微工研菌寄第5522号） (2) アルスロバクターCA−35−A589−47
（Arthrobacter CA−35−A589−47）菌株（微
工研菌寄第5523号） (3) アルスロバクターCA−35−A849
（Arthrobacter CA−35−A849）菌株（微工研
菌寄第5524号） (4) アルスロバクターCA−35−Ａ−1071−15
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1071−15）菌株
（微工研菌寄第5525号） (5) アルスロバクターCA−35−Ａ−1448
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1448）菌株（微
工研菌寄第5526号） (6) アルスロバクターCA−35−Ａ−1475
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1475）菌株（微
工研菌寄第5527号） (7) アルスロバクターCA−35−Ａ−1766−15
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1766−15）菌株
（微工研菌寄第5528号） (8) アルスロバクターCA−35−Ｍ−965−３
（Arthrobacter CA−35−Ｍ−965−３）菌株
（微工研菌寄第5529号） (9) アルスロバクターCA−35−Ｙ−37−12
（Arthrobacter CA−35−Ｙ−37−12）菌株
（微工研菌寄第5530号）これらの突然変異菌株のうち、等にアルスロバ
クターCA−35−A589−29−32菌株及びアルスロ
バクターCA−35−A589−47菌株がコール酸塩か
ら高い変換率かつ高い選択率で3α，7α−ジヒド
ロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及び／又はそ
の塩を生産する能力を有する。なお、これらの突然変異菌株のうち、アルスロ
バクターCA−35−A589−29−32菌株、アルスロ
バクターCA−35−A589−47菌株、アルスロバク
ターCA−35−A849菌株、アルスロバクターCA
−35−Ａ−1071−15菌株、アルスロバクターCA
−35−Ａ−1448菌株、アルスロバクターCA−35
−Ａ−1475菌株、アルスロバクターCA−35−Ａ
−1766−15菌株及びアルスロバクターCA−35−
Ｍ−965−３菌株はアルスロバクターCA−35菌株
をＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジンと接触させることにより、またアルスロバ
クターCA−35−Ｙ−37−12菌株はアルスロバク
ターCA−35菌株に紫外線を照射することにより
各々得られた。これら突然変異菌株の具体的な取
得方法を後述の実施例に示す。上記の新株のアルスロバクターCA−35菌株及
びその突然変異菌株のそれぞれの菌学的性質をア
ルスロバクター・シンプレツクスIAM1660菌株
の菌学的性質と対比して列挙すると次表のとおり
である。なお、アルスロバクターCA−35菌株は
岡山県倉敷市の土壌より分離し採集した。

【表】

【表】コール酸ナトリウム塩に対する態度アルスロバクターCA−35菌株は唯一の炭素源
としてコール酸ナトリウム塩を約20〜500ｇ／
の高濃度で含む培地で生育可能であり、しかもコ
ール酸ナトリウム塩を基質として7α−ヒドロキ
シ３，12−ジケト−5β−コラン酸及び／又はそ
のナトリウム塩、3α，7α−ジヒドロキシ−12−
ケト−5β−コラン酸及び又はそのナトリウム塩
並びに7α−12α−ジヒドロキシ−３−ケト−5β−
コラン酸及び／又はそのナトリウム塩を主要な代
謝産物として生産することができる。一方、前記
のアルスロバクターCA−35菌株の突然変異菌株
は唯一の炭素源としてコール酸ナトリウム塩を含
む培地では生育困難か又は全く生育しない。ま
た、アルスロバクター・シンプレツクス
IAM1660菌株は唯一の炭素源としてコール酸ナ
トリウム塩を10ｇ／含む培地で生育困難であ
る。上記の菌学的性質を有するアルスロバクター
CA−35菌株の分類学上の位置をバージーズ・マ
ニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリ
オロジー第７版及び第８版により検索した。アル
スロバクターCA−35菌株は特に色素生産性、糖
の資化性及びコール酸ナトリウム塩に対する態度
において明らかにアルスロバクター・シンプレツ
クスIAM1660菌株と異なる。アルスロバクター
CA−35菌株は黄色〜クリーム色の色素を生産す
るが、アルスロバクター属に属する菌で色素生産
菌としてはアルスロバクター・オキシダンス、ア
ルスロバクター・オーレツクス及びアルスロバク
ター・ウレアフアシエンスが存在する。しかし、
アルスロバクター・オキシダンス及びアルスロバ
クター・オーレツセンスは通常グラム染色が陰性
であること及びデンプンの加水分解性を有してい
ることより、アルスロバクターCA−35菌株とは
異なる。また、アルスロバクター・ウレアフアシ
エンスは通常グラム染色が陰性であること及び硝
酸塩の還元性を有していないことより、アルスロ
バクターCA−35菌株とは異なる。従つて、アル
スロバクターCA−35菌株はアルスロバクター属
に属するいずれの標準種の菌とも異なつているこ
とより、アルスロバクター属に属する新菌種を構
成する微生物であると判断した。また、一般に突
然変異菌株はその親株と同じ種に属するものと考
えられており、前記のアルスロバクターCA−35
菌株の突然変異菌株はいずれもその親株と同じ新
菌種に属するものと判定した。本発明に係る突然変異菌株は上記の菌株に限ら
れるものではなく、微生物の突然変異菌株でアル
スロバクター属に属し、コール酸塩を基質として
3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン
酸及び又はその塩を生産するものであればいずれ
でもよい。本発明に係る突然変異菌株による3α，7α−ジ
ヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及び／又
はその塩の生産は、本発明に係る突然変異菌株を
コール酸塩を含む培地に培養することにより行な
われる。コール酸塩は具体的にはコール酸のナト
リウム、カリウムなどのアルカリ金属の塩又はカ
ルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属
の塩であるが、好ましくはコール酸のアルカリ金
属塩である。コール酸塩はそのまま所定濃度の水
溶液に調整してそれを基質として用いてもよい
し、或いは水に予めコール酸と塩を形成し得る所
定量のアルカリ金属化合物又はアルカリ土類金属
化合物を溶かしたのち、その水溶液にコール酸を
加えて所定濃度に調整したコール酸塩を基質とし
て用いてもよい。コール酸塩の濃度は通常約１〜
500ｇ／の範囲でよいが、生産される3α，7α−
ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及び／
又はその塩の収量、培養条件及び操作性などの経
済的観点から約10〜500ｇ／の範囲が好ましく、
さらに20〜300ｇ／の範囲がより好ましい。培
養方法は原則的には一般微生物の培養で採用され
る方法と同じであるが、通常は液体培地による振
盪培養法又は通気撹拌培養法が用いられる。培地
としては本発明に係る突然変異菌株が資化利用で
きる栄養源を含有するものであればよい。炭素源
としてはアラビノースなどのペントース類；グル
コース、マンノース、フラクトース、ガラストー
スなどのヘキソース類；マルトースなどの二糖
類；澱粉分解物、糖アルコール類、グリセリンな
どの多価アルコール類；又はポリペプトン、ペプ
トン、肉エキス、麦芽エキス、コーンステイープ
リカー、酵母エキス、各種アミノ酸などが用いら
れる。また蓄素源としては、例えば硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム
などが用いられる。また、この他に燐酸水素２カ
リウム、燐酸２水素カリウム、硫酸マグネシウム
などの無機塩が添加される。培養条件に特徴はな
いが、通常25〜35℃で６時間〜５日間振盪培養又
は通気撹拌培養を行なう。このようにして培養液中に蓄積された3α，7α
−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及
び／又はその塩を分離・採取するには、まず培養
液中の菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心分離
などにより分離除去し、得られた培養濾液又は上
清に例えば塩酸を加える。このようにして培養濾
液又は上清を酸性とすることにより3α，7α−ジ
ヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸をはじめ
とするコール酸塩の変換物が沈澱する。ここで、
沈澱する3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β
−コラン酸以外のコール酸塩の変換物として7α
−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−コラン酸、
7α，12α−ジヒドロキシ−３−ケト−5β−コラン
酸などがある。なお、この際、未変換のコール酸
塩はコール酸として沈澱する。沈澱物を除去した
液に例えば酢酸エチルを加えて残存する上記のコ
ール酸塩の変換物並びに未変換のコール酸及び／
又はその塩を抽出し、しかるのち酢酸エチルを溜
去することによりほぼ完全に3α，7α−ジヒドロ
キシ−12−ケト−5β−コラン酸をはじめとする
コール酸塩の変換物を採取し、未変換のコール酸
及び／又はその塩を回収することができる。この
ようにして得られたコール酸塩の変換物並びに未
変換のコール酸及び／又はその塩を例えばメチル
エステルに変換後、シリカゲルカラムに吸着さ
せ、クロロホルム、クロロホルム／エタノールの
99／１容量比の混合液及びクロロホルム／エタノ
ールの97／３容量比の混合液により順次溶出させ
る。すなわち、クロロホルムにより7α−ヒドロ
キシ−３，12−ジケト−5β−コラン酸メチルエ
ステルを溶出させ、クロロホルム／エタノールの
99／１容量比の混合液によりまず7α，12α−ジヒ
ドロキシ−３−ケト−5β−コラン酸メチルエス
テルを溶出させ、ついで目的とする3α，7α−ジ
ヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸のメチル
エステルを溶出させる。さらに、クロロホルム／
エタノールの97／３容量比の混合液によりコール
酸メチルエステルを溶出させる。得られた3α，
7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸メ
チルエステルは常法により加水分解することによ
り3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラ
ン酸とすることができる。本発明に係る突然変異菌株により得られる3α，
7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸は
フアン・ミンロン還元反応に供することにより胆
石溶解剤として有用なケノデオキシコール酸
（CDCA）に容易に変換できる。以下実施例及び応用例によつて本発明をさらに
詳細に説明する。参考例アルスロバクターCA−35菌株（微工研菌寄第
5145号）を次に示す方法で培養した。コール酸
100ｇ、硝酸アンモニウム2.0ｇ、燐酸２水素カリ
ウム2.0ｇ、燐酸水素２カリウム5.0ｇ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.2ｇ、酵母エキス0.1ｇ及び
水酸化ナトリウム10ｇに蒸留水を加えて容量を１
に調整し、これを培地とした。この培地を500
ml容坂口フラスコに100ml宛10本に分注し、120℃
で15分間、蒸気殺菌を行なつた。予め上記の培地
と同じ培地で試験管振盪機にて２日間増殖させた
種菌を上記の500ml容坂口フラスコあたり10ml宛
添加し、２日間振盪培養した。培養後、これらの
培養液を集め、遠心分離機で菌体を除去後、得ら
れた培養上清に塩酸を添加して該上清を塩酸酸性
にするとコール酸塩の変換物及び未変換コール酸
が沈澱した。この沈澱物を採取し、残りの溶液を
酢酸エチル１で抽出し、ロータリー・エバポレ
ーターで酢酸エチルを溜去後、得られた残存物を
先の沈澱物と合わせることにより、85ｇのコール
酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物を得た。
この混合物の極く一部を取り、これにメタノール
を加えて１％溶液とし、この溶液10μをミクロ
ボンダパツクＣ−18カラムを備えた高速液体クロ
マトグラフイー（米国ウオーターズ社製、HLC
−GPC−244型）に注入した。移動相としてPH2.5
に調整した水／メタノールの30／70容量比の混合
液を流速１ml／分で流し、検出を屈折率方式で行
なつたところ第１図のクロマトグラムが得られ
た。このクロマトグラムにおけるピークＡ、ピー
クＢ、ピークＣ及びピークＤは標準品のピークと
照合することにより各々7α−ヒドロキシ−３，
12−ジケト−5β−コラン酸、3α，7α−ジヒドロ
キシ−12−ケト−5β−コラン酸、7α，12α−ジヒ
ドロキシ−３−ケト−5β−コラン酸及びコール
酸のものと一致した。また、これらのピークＡ、
ピークＢ及びピークＣの各々の部分に相当する化
合物を分取し、マススペクトル、赤外線吸収スペ
クトル及びNMRスペクトルにより化合物の構造
確認を行なつたところ、それぞれ上記の7α−ヒ
ドロキシ−３，12−ジケト−5β−コラン酸、3α，
7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及
び7α，12α−ジヒドロキシ−３−ケト−5β−コラ
ン酸であつた。なお、ピークＡ、ピークＢ及びピ
ークＣの各々の部分に相当する化合物の赤外線吸
収スペクトル（Ａ，Ｂ及びＣ）はメチルエステル
化後の化合物についてのものであり、それらを標
準品の赤外線吸収スペクトル（A′，B′及びC′）
と対比してそれぞれ第２図、第３図及び第４図に
表示する。さらに、分取したクロマトグラムのピ
ークＡ、ピークＢ及びピークＣの部分に相当する
化合物をメチルエステル化したのち融点を測定す
ると次表に示すとおりであつた。

【表】第１図のクロマトグラムの面積比から得られた
コール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸の残
存量を算出すると次表に示すとおりである。

【表】実施例１アルスロバクターCA−35−Ｍ−965−３菌株
（微工研菌寄第5529号）の取得培地１（組成：水酸化ナトリウム0.5％、コール
酸5.0％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.5％、塩化
ナトリウム0.5％及び寒天1.5％）のスラントに生
育させたアルスロバクターCA−35菌株の１白金
耳を、予め試験管（内径21mm、長さ200mm）内に
準備した培地２（組成：水酸化ナトリウム１％、
コール酸10％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２
水素カリウム0.2％、燐酸１水素カリウム0.5％、
硫酸マグネシウム・７水和物0.02％及び酵母エキ
ス0.01％）の10mlに植菌し、30℃で24時間振盪培
養した。この培養液の0.3mlを予め試験管（内径
21mm、長さ200mm）に準備した培地３（組成：水酸
化ナトリウム0.05％、コール酸0.5％、グルコー
ス0.5％、硝酸アンモニウム0.2％、燐酸２水素カ
リウム0.2％、燐酸１水素カリウム0.5％、硫酸マ
グネシウム・７水和物0.02％及び酵母エキス0.01
％）の10mlに加え、30℃で15〜16時間振盪培養し
た。ついで、この対数増殖期にある菌体を0.45μ
のメンブランフイルターで無菌的に濾過集菌し、
0.1M燐酸塩緩衝液（PH7.0）2.0mlで洗滌後、同じ
緩衝液25mlに懸濁させた。この菌懸濁液４mlを試
験管（内径21ml、長さ200mm）に入れ、これに終
濃度が50μｇ／mlになるようにＮ−メチル−N′−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加し、30℃
で45分間振盪することによつて突然変異処理を行
なつた。なお、この処理条件下でのアルスロバク
ターCA−35菌株の死滅率は約80％であつた。突
然変異処理を施した菌体を0.45μのメンブランフ
イルターで無菌的に濾過集菌し、0.1M燐酸塩緩
衝液（PH7.0）20mlで洗滌後、同じ緩衝液25mlに
懸濁させた。得られた菌懸濁液を滅菌した生理食
塩水で希釈し、それを培地４（組成：水酸化ナト
リウム0.1％、コール酸1.0％、硝酸アンモニウム
0.2％、燐酸２水素カリウム0.2％、燐酸１水素カ
リウム0.5％、硫酸マグネシウム・７水和物0.02
％、酵母エキス0.01％及び寒天1.5％）の寒天平
板上に300〜500個のコロニーを出現させるように
塗布したのち、30℃で４日間培養した。出現した
コロニー中の極小コロニーを単離し、培地５（組
成：ペプトン0.5％、酵母エキス0.5％、塩化ナト
リウム0.5％及び寒天1.5％）の寒天平板上で30℃
で24時間培養した。ここに出現したコロニーを培
地４の寒天平板上にレプリカし、30℃で20時間培
養した。この培地４で生育しないコロニーに対応
する上記の培地５のコロニーを培地６（組成：水
酸化ナトリウム0.1％、コール酸1.0％、ペプトン
0.5％、酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5％及
び寒天1.5％）のスラントにそれぞれ移し、30℃
で24時間培養した。このスラントから１白金耳の
菌体を予め試験管（内径21mm、長さ200mm）内に
準備した培地７（組成：水酸化ナトリウム0.5％、
コール酸5.0％、グルコース0.5％、硝酸アンモニ
ウム0.2％、燐酸２水素カリウム0.2％、燐酸１水
素カリウム0.5％、硫酸マグネシウム・７水和物
0.02％及び酵母エキス0.01％）の10mlに植菌し、
30℃で３日間振盪培養した。得られたそれぞれの
培養液中の生産物を薄層クロマトグラフイーで検
定し、目的とする3α，7α−ジヒドロキシ−12−
ケト−5β−コラン酸及び／又はその塩を選択的
に蓄積する１菌株を見出し、これをアルスロバク
ターCA−35−Ｍ−965−３菌株と命名した。以後、この突然変異菌株の取得方法を総括して
単にNTG処理と称する。実施例２アルスロバクターCA−35−A849菌株（微工研
菌寄第5524号）の取得実施例１で得られたアルスロバクターCA−35
−Ｍ−965−３菌株を親株とし、これにNTG処理
を施すことにより3α，7α−ジヒドロキシ−12−
ケト−5β−コラン酸及び／又はその塩を選択的
に蓄積する３菌株を見出し、これらをそれぞれア
ルスロバクターCA−35−A589菌株、アルスロバ
クターCA−35−A849菌株及びアルスロバクター
CA−35−Ａ−1071菌株と命名した。実施例３及び４アルスロバクターCA−35−A589−29−32菌株
（微工研菌寄第5522号）及びアルスロバクター
CA−35−A589−47菌株（微工研菌寄第5523
号）の取得実施例２で得られたアルスロバクターCA−35
−A589菌株のコロニーから２個の優良菌株を単
離し、これらをそれぞれアルスロバクターCA−
35−A589−29−32菌株及びアルスロバクターCA
−35−A589−47菌株と命名した。実施例５アルスロバクターCA−35−Ａ−1071−15菌株
（微工研菌寄第5525号）の取得実施例２で得られたアルスロバクターCA−35
−Ａ−1071菌株のコロニーから１個の優良菌株を
単離し、これをアルスロバクターCA−35−Ａ−
1071−15菌株と命名した。実施例６アルスロバクターCA−35−Ａ−1448菌株（微
工研菌寄第5526号）の取得実施例２で得られたアルスロバクターCA−35
−A849菌株を親株とし、これにNTG処理を施す
ことにより3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−
5β−コラン酸及び／又はその塩を選択的に蓄積
する複数個の菌株を見出し、それらの中の最も優
良な菌株をアルスロバクターCA−35−Ａ−1448
菌株と命名した。実施例７アルスロバクターCA−35−Ａ−1475菌株（微
工研菌寄第5527号）の取得実施例６で得られたアルスロバクターCA−35
−Ａ−1448菌株を親株とし、これにNTG処理を
施すことにより3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケ
ト−5β−コラン酸及び／又はその塩を選択的に
蓄積する複数個の菌株を見出し、それらの中の最
も優良な菌株をアルスロバクターCA−35−Ａ−
1475菌株と命名した。実施例８アルスロバクターCA−35−Ａ−1766−15菌株
（微工研菌寄第5528号）の取得実施例２で得られたアルスロバクターCA−35
−Ａ−1071菌株を親株とし、これにNTG処理を
施すことにより3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケ
ト−5β−コラン酸及び／又はその塩を選択的に
蓄積する複数個の菌株を見出し、それらの中の最
も優良な菌株をアルスロバクターCA−35−Ａ−
1766菌株と命名した。得られたアルスロバクター
CA−35−Ａ−1766菌株のコロニーから１個の優
良菌株を単離し、これをアルスロバクターCA−
35−Ａ−1766−15菌株と命名した。実施例９アルスロバクターCA−35−Ｙ−37−12菌株
（微工研菌寄第5530号）の取得培地１のスラントに生育させたアルスロバクタ
ーCA−35菌株の１白金耳を、予め試験管（内径
21mm、長さ200mm）内に準備した10mlの培地２に
植菌し、30℃で20時間振盪培養した。この培養液
を無菌的に遠心分離（５℃、10000r.p.m.，５分
間）することにより集菌し、これを滅菌水10mlに
懸濁させた。得られた菌懸濁液を、15Wの紫外線
灯（波長2537Å）をつり下げた無菌箱内でその灯
下約27cmのところに設置した内径7.5cmのシヤー
レ内に入れ、10分間紫外線を照射させることによ
り突然変異処理を行なつた。なお、この処理条件
下でのアルスロバクターCA−35菌株の死滅率は
約99.9％であつた。突然変異処理を施した菌体を
0.45μのメンブランフイルターで無菌的に濾過集
菌し、0.1M燐酸塩緩衝液（PH7.0）20mlで洗滌
後、同じ緩衝液25mlに懸濁させた。得られた菌懸
濁液を滅菌した生理食塩水で希釈し、それを前述
のNTG処理におけると同様に培地４〜７を用い
て培養を繰返すことにより、3α，7α−ジヒドロ
キシ−12−ケト−5β−コラン酸及び／又はその
塩を選択的に蓄積する１菌株を見出し、これをア
ルスロバクターCA−35−Ｙ−37−12菌株と命名
した。応用例１アルスロバクターCA−35−A589−29−32菌株
（微工研菌寄第5522号）の培養アルスロバクターCA−35−A589−29−32菌株
を次に示す方法で培養した。コール酸100ｇ、硝
酸アンモニウム2.0ｇ、燐酸２水素カリウム2.0
ｇ、燐酸水素２カリウム5.0ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.2ｇ、酵母エキス0.1ｇ及び水酸化
ナトリウム10ｇに水道水を加えて容量を800mlに
調整した。この溶液を120℃で15分間、蒸気殺菌
した。また別途に、グルコース５ｇを200mlの水
道水に溶解し、この溶液を110℃で30分間、蒸気
殺菌し、冷却後、上記の溶液に加えて容量を１
に調整し、これを培地とした。次いで、この培地
を500ml容坂口フラスコに100ml宛10本に無菌的に
分注した。予め上記の培地と同じ培地で試験管振
盪機にて14時間増殖させた種菌の培養液を上記の
500ml容坂口フラスコあたり２ml宛添加し、３日
間振盪培養した。培養後、これらの培養液を集
め、遠心分離機で菌体を除去後、得られた培養上
清に塩酸を添加して該上清を塩酸酸性するとコー
ル酸塩の変換物及び未変換コール酸が沈澱した。
この沈澱物を採取し、残りの溶液を酢酸エチル１
で抽出し、ロータリー・エバボレーターで酢酸
エチルを溜去後、得られた残存物を先の沈澱物と
合わせることにより、99.3ｇのコール酸塩変換物
及び未変換コール酸の混合物を得た。この混合物
の極く一部を取り、これにメタノールを加えて２
％溶液とし、この溶液10μをミクロボンダパツ
クＣ−18カラムを備えた高速液体クロマトグラフ
イー（米国ウオーターズ社製、HLC−GPC−244
型）に注入した。移動相としてPH4.0に調整した
水／メタノールの30／70容量比の混合液を流速１
ml／分で流し、検出を屈折率方式で行なつたとこ
ろ第５図のクロマトグラムが得られた。このクロ
マトグラムにおけるピークＢ及びピークＤは標準
品のピークと照合することにより各々3α，7α−
ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラン酸及びコ
ール酸のものと一致した。また、ピークＢの部分
に相当する化合物を分取し、参考例と同様にして
そのマススペクトル、赤外線吸収スペクトル及び
NMRスペクトルによる化合物の構造確認を行な
つたところ、上記の3α，7α−ジヒドロキシ−12
−ケト−5β−コラン酸であつた。第５図のクロマトグラムの面積比から、得られ
た3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β−コラ
ン酸の収量及び未変換コール酸の残存量を算出す
ると次表に示すとおりである。

【表】応用例２アルスロバクターCA−35−A589−47菌株（微
工研菌寄第5523号）の培養応用例１においてアルスロバクターCA−35−
A589−29−32菌株の代りにアルスロバクターCA
−35−A589−47菌株を用い、コール酸及び水酸
化ナトリウムの濃度を各々50ｇ／、５ｇ／に
変え、かつ培養時間を35時間に短縮させた以外は
応用例１と同じ方法により培養し処理することに
より、コール酸塩変換物及び未変換コール酸の混
合物49.31ｇを得た。この混合物から応用例１と
同じ方法により第６図のクロマトグラムが得られ
た。このクロマトグラムにおけるピークＡ、ピー
クＢ、ピークＣ及びピークＤは標準品のピークと
照合することにより各々7α−ヒドロキシ−３，
12−ジケト−5β−コラン酸、3α，7α−ジヒドロ
キシ−12−ケト−5β−コラン酸、7α，12α−ジヒ
ドロキシ−３−ケト−5β−コラン酸及びコール
酸のものと一致した。なお、ピークＡ、ピーク
Ｂ、ピークＣ及びピークＤの各々の部分に相当す
る化合物を分取し、これらの化合物を薄層クロマ
トグラフイーを用いて調べたところ、ピークＢ、
ピークＣ及びピークＤの部分に相当する化合物は
単一化合物であつたが、ピークＡの部分に相当す
る化合物は7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−
5β−コラン酸と他の未同定物質との混合物であ
つた。第６図のクロマトグラムの面積比から、得られ
たコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸の
残存量を算出すると次表に示すとおりである。

【表】応用例３アルスロバクターCA−35−A849−47菌株（微
工研菌寄第5524号）の培養応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−A849菌株を用いる以外は応用例２と同じ方法
により培養し処理することにより、コール酸塩変
換物及び未変換コール酸の混合物49.34ｇを得た。
この混合物から応用例１と同じ方法により第７図
のクロマトグラムが得られた。このクロマトグラ
ムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及びピ
ークＤは標準品のピークと照合することにより
各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−コ
ラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β
−コラン酸、7α，12α−ジヒドロキシ−３−ケト
−5β−コラン酸及びコール酸のものと一致した。
なお、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及びピーク
Ｄの各々の部分に相当する化合物を分取し、これ
らの化合物を薄層クロマトグラフイーを用いて調
べたところ、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及び
ピークＤの部分に相当する化合物はいずれも単一
化合物であつた。第７図のクロマトグラムの面積から、得られた
コール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸の残
存量を算出すると次表に示すとおりである。

【表】応用例４アルスロバクターCA−35−Ａ−1071−15菌株
（微工研菌寄第5525号）の培養応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ａ−1071−15菌株を用いる以外は応用例２と同
じ方法により培養し処理することにより、コール
酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物49.31ｇ
を得た。この混合物から応用例１と同じ方法によ
り第８図のクロマトグラムが得られた。このクロ
マトグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピーク
Ｃ及びピークＤは標準品のピークと照合すること
により各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−
5β−コラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケ
ト−5β−コラン酸、7α，12α−ジヒドロキシ−３
−ケト−5β−コラン酸及びコール酸のものと一
致した。なお、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及
びピークＤの各々の部分に相当する化合物を分取
し、これらの化合物を薄層クロマトグラフイーを
用いて調べたところ、ピークＢ、ピークＣ及びピ
ークＤの部分に相当する化合物は単一化合物であ
つたが、ピークＡの部分に相当する化合物は7α
−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−コラン酸
と他の未同定物質との混合物であつた。第８図のクロマトグラムの面積比から、得られ
たコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸の
残存量を算出すると次表に示すとおりである。

【表】応用例５アルスロバクターCA−35−Ａ−1448菌株（微
工研菌寄第5526号）の培養応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ａ−1448菌株を用いる以外は応用例２と同じ方
法により培養し処理することにより、コール酸塩
変換物及び未変換コール酸の混合物49.30ｇを得
た。この混合物から応用例１と同じ方法により第
９図のクロマトグラムが得られた。このクロマト
グラムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及
びピークＤは標準品のピークと照合することによ
り各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−
コラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−
5β−コラン酸、7α，12α−ジヒドロキシ−３−ケ
ト−5β−コラン酸及びコール酸のものと一致し
た。なお、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ及びピ
ークＤの各々の部分に相当する化合物を分取し、
これらの化合物を薄層クロマトグラフイーを用い
て調べたところ、ピークＢ、ピークＣ及びピーク
Ｄの部分に相当する化合物は単一化合物であつた
が、ピークＡの部分に相当する化合物は7α−ヒ
ドロキシ−３，12−ジケト−5β−コラン酸と他
の未同定物質との混合物であつた。第９図のクロマトグラムの面積比から、得られ
たコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸の
残存量を算出すると次表に示すとおりである。

【表】応用例６アルスロバクターCA−35−Ａ−1475菌株（微
工研菌寄第5527号）の培養応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ａ−1475菌株を用いる以外は応用例２と同じ方
法により培養し処理することにより、コール酸塩
変換物及び未変換コール酸の混合物49.35ｇを得
た。この混合物から応用例１と同じ方法により第
１０図のクロマトグラムが得られた。このクロマ
トグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピーク
Ｃ、及びピークＤは標準品のピークと照合するこ
とにより各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト
−5β−コラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−
ケト−5β−コラン酸、7α，12α−ジヒドロキシ−
３−ケト−5β−コラン酸及びコール酸のものと
一致した。なお、ピークＡ、ピークＢ、ピークＣ
及びピークＤの各々の部分に相当する化合物を分
取し、これらの化合物を薄層クロマトグラフイー
を用いて調べたところ、ピークＡ、ピークＢ、ピ
ークＣ及びピークＤの各々の部分に相当する化合
物を分取し、これらの化合物を薄層クロマトグラ
フイーを用いて調べたところ、ピークＡ、ピーク
Ｂ、ピークＣ及びピークＤの部分に相当する化合
物はいずれも単一化合物であつた。第１０図のクロマトグラムの面積比から、得ら
れたコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸
の残存量を算出すると次表に示すとおりである。

【表】応用例７アルスロバクターCA−35−Ａ−1766−15菌株
（微工研菌寄第5528号）の培養応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ａ−1766−15菌株を用いる以外は応用例２と同
じ方法により培養し処理することにより、コール
酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物49.27ｇ
を得た。この混合物から応用例１と同じ方法によ
り第１１図のクロマトグラムが得られた。このク
ロマトグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、及び
ピークＤは標準品のピークと照合することにより
各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−コ
ラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β
−コラン酸及びコール酸のものと一致した。な
お、ピークＡ、ピークＢ及びピークＤの各々の部
分に相当する化合物を分取し、これらの化合物を
薄層クロマトグラフイーを用いて調べたところ、
ピークＡ、ピークＢ及びピークＤの部分に相当す
る化合物はいずれも単一化合物であつた。第１１図のクロマトグラムの面積比から、得ら
れたコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸
の残存量を算出すると次表に示すとおりである。

【表】応用例８アルスロバクターCA−35−Ｍ−965−３菌株
（微工研菌寄第5529号）の培養応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ｍ−965−３菌株を用いる以外は応用例２と同
じ方法により培養し処理することにより、コール
酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物49.36ｇ
を得た。この混合物から応用例１と同じ方法によ
り第１２図のクロマトグラムが得られた。このク
ロマトグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、及び
ピークＤは標準品のピークと照合することにより
各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−5β−コ
ラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12−ケト−5β
−コラン酸及びコール酸のものと一致した。な
お、ピークＡ、ピークＢ及びピークＤの各々の部
分に相当する化合物を分取し、これらの化合物を
薄層クロマトグラフイーを用いて調べたところ、
ピークＢ及びピークＤの部分に相当する化合物は
単一化合物であつたが、ピークＡの部分に相当す
る化合物は7α−ヒドロキシ−３，12−ジケト−
5β−コラン酸と他の未同定物質との混合物であ
つた。第１２図のクロマトグラムの面積比から、得ら
れたコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸
の残存量を算出すると次表に示すとおりである。

【表】応用例９アルスロバクターCA−35−Ｙ−37−12菌株
（微工研菌寄第5530号）の培養応用例２においてアルスロバクターCA−35−
A589−47菌株の代りにアルスロバクターCA−35
−Ｙ−37−12菌株を用いる以外は応用例２と同じ
方法により培養し、処理することにより、コール
酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物49.33ｇ
を得た。この混合物から応用例１と同じ方法によ
り第１３図のクロマトグラムが得られた。このク
ロマトグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピー
クＣ、及びピークＤは標準品のピークと照合する
ことにより各々7α−ヒドロキシ−３，12−ジケ
ト−5β−コラン酸、3α，7α−ジヒドロキシ−12
−ケト−5β−コラン酸、7α，12α−ジヒドロキシ
−３−ケト−5β−コラン酸及びコール酸のもの
と一致した。なお、ピークＡ、ピークＢ、ピーク
Ｃ及びピークＤの各々の部分に相当する化合物を
分取し、これらの化合物を薄層クロマトグラフイ
ーを用いて調べたところ、ピークＡ、ピークＢ、
ピークＣ及びピークＤの部分に相当する化合物は
いずれも単一化合物であつた。第１３図のクロマトグラムの面積比から、得ら
れたコール酸塩変換物の収量及び未変換コール酸
の残存量を算出すると次表に示すとおりである。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図は参考例で得られたコール酸塩変換物及
び未変換コール酸の液体クロマトグラムを表わ
し、第２〜４図はそれぞれ第１図のクロマトグラ
ムのピークＡ、ピークＢ及びピークＣの各々の部
分に相当する化合物をメチルエステル化したもの
の赤外線吸収スペクトル（Ａ，Ｂ及びＣ）を標準
品の赤外線吸収スペクトル（A′，B′及びC′）と
対比して表示したものである。第５〜１３図はそ
れぞれ応用例１〜９で得られたコール酸塩変換物
及び未変換コール酸の液体クロマトグラムを表わ
す。

Claims

【特許請求の範囲】１アルスロバクターCA−35−A589−29−32
（Arthrobacter CA−35−A589−29−32）菌株
（微工研菌寄第5522号）、アルスロバクターCA−35−A589−47
（Arthrobacter CA−35−A589−47）菌株（微工
研菌寄第5523号）、アルスロバクターCA−35−A849
（Arthrobacter CA−35−A849）菌株（微工研菌
寄第5524号）、アルスロバクターCA−35−Ａ−1071−15
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1071−15）菌株
（微工研菌寄第5525号）、アルスロバクターCA−35−Ａ−1448
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1448）菌株（微工
研菌寄第5526号）、アルスロバクターCA−35−Ａ−1475
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1475）菌株（微工
研菌寄第5527号）、アルスロバクターCA−35−Ａ−1766−15
（Arthrobacter CA−35−Ａ−1766−15）菌株
（微工研菌寄第5528号）、アルスロバクターCA−35−Ｍ−965−３
（Arthrobacter CA−35−Ｍ−965−３）菌株
（微工研菌寄第5529号）およびアルスロバクターCA−35−Ｙ−37−12
（Arthrobacter CA−35−Ｙ−37−12）菌株（微
工研菌寄第5530号）からなる群から選ばれる突然
変異株。