JPS5910198B2 - ７α−ヒドロキシ−３，１２−ジケト−５β−コラン酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はコール酸塩を高濃度で含む培地から微生物の代
謝産物として７α−ヒドロキシ−３・１２−ジケトー５
β−コラン酸及び／又はその塩を高収量でかつ短期間の
培養で得る方法に関し、さらに詳しくは高濃度コール酸
塩を基質として７α−ヒドロキシ−３・１２−ジケトー
５β−コラン酸及び／又はその塩を生産するアルスロバ
クター属又はプレビバクテリウム属に属する細菌を、コ
ール酸塩を高濃度で含む栄養培地に培養して上記のコラ
ン酸及び／又はその塩を生成せしめ、これを採取するこ
とを特徴とする７α−ヒドロキシー３・１２−ジケトー
５β−コラン酸及び／又はその塩の製造方法に関する。

従来、コール酸を基質として７α−ヒドロキシー３・１
２−ジケトー５β−コラン酸を微生物の代謝産物として
得る方法は知られており、例えば、早川らによるストレ
プトマイセス・ゲラチカス１１６４菌株を用いる方法〔
プロシーデイングス・オブ・ジャパン・アカデミー、第
３２巻第５１９〜５２２頁（１９５６年）〕がある。

しかし、この方法では基質としてのコール酸の濃度が低
《、１ ０ ｆｌ／ｌ以下の濃度のものが使用されてい
るにすぎない。

また、本発明者らの知見によれば、上記の方法で用いら
れる微生物は２ ０ ？／ｌ以上の高濃度のコール酸塩
を含む培地では生育不良となるか全《生育しないため、
この微生物の代謝産物として７α−ヒドロキシ−３・１
２−ジケトー５β−コラン酸及び／又はその塩を得よう
とする場合には必然的に低濃度のコール酸塩を基質とせ
ざるを得ない。

本発明者らは微生物の代謝産物として７α−ヒドロキシ
−３・１２−ジケトー５β−コラン酸を工業的に有利に
得るためその基質として高濃度のコール酸塩を要求する
微生物のスクリーニングを長期間行なってきた結果、ア
ルスロバクター属又はプレビバクテリウム属に属する特
定の細菌が高濃度コール酸塩を基質として７α−ヒドロ
キシ−３・１２−ジケトー５β−コラン酸及び／又はそ
の塩を高収量でしかも短期間の培養で代謝生産すること
を見出し、本発明を完成するに至った。

本発明者らが得た高濃度コール酸塩を基質として７α−
ヒドロキシ−３・１２−ジケトー５β−コラン酸及び／
又はその塩を生産する能力を有する細菌としては、アル
スロバクターＣＡ−３５（ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
Ｃ Ａ − ３ ５ ）菌株（工業技術院微生物工業
技術研究所、菌寄第５１４５号）及びプレビバクテリウ
ムＣ Ａ − ６ （ Ｂ ｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍＣＡ−６）菌株（工業技術院微生物工業技術研究所、
菌寄第５１４４号）があり、それぞれの菌学的性質ヲア
ルスロバクター・シンプレックスＩＡＭ１６６０菌株の
菌学的性質と対比して列挙すると次表のとおりである。

上記の表に示した菌学的性質に基づき、アルスロバクタ
ーＣＡ−３５菌株及びプレビバクテリウムＣＡ−６菌株
の同定を行なった。

アルスロバクターＣＡ−３５菌株はその形態、ダラム染
色などの顕微鏡的所見及び生埋学的性質などからパージ
エイズ・マニュアル・オブ・デイターミネイティブ・バ
クテリオロジー第７版及び第８版に基づき７／Ｌ／スロ
バクター・シンプレツクスに近縁の菌であると同定され
た。

なお、対照菌として挙げたアルスロバクター・シンプレ
ックスＩＡＭ１６６０菌株はコール酸塩の１ｏｔ／ｌ濃
度の培地で生育しないので、本発明におけるアルスロバ
クターＣＡ−３５菌株はコール酸塩に対する態度におい
て明らかにアルスロバクター・シンプレックスＩＡＭ１
６６０菌株と異なる 一方、ブレビバクテリウムＣＡ−
６菌株はそのダラム染色などの顕微鏡的所見及び生埋学
的性質などからパージエイズ・マニュアル・オブ・デイ
ターミネイティブ・バクテリオロジー第７版及び第８版
に基づき、プレビバクテリウム属に属する細菌と同定さ
れた。

しかしながら、プレビバクテリウム属に属する細菌が周
鞭毛を有しているのに対し、本発明におけるプレビバク
テリウムＣＡ−６菌株は極単鞭毛を有するなど、本発明
におけるプレビバクテリウムＣＡ−６菌株はプレビバク
テリウム属に属する細菌とは若干異なる性質を有する。

本発明の方法による７α−ヒドロキシ−３・１２−ジケ
トー５β−コラン酸及び／又はその塩の生産は、高濃度
コール酸塩を基質として７α一ヒドロキシ−３・１２−
冫ケトー５β−コラン酸及び／又はその塩を生産する細
菌を、コール酸塩を高濃度で含む培地に培養することに
より行なわれる。

コール酸塩は具体的にはコール酸のナトリウム、カリウ
ムなどのアルカリ金属の塩又はカルシウム、マグネシウ
ムなどのアルカリ土類金属の塩であるが、好まし《はコ
ール酸のアルカリ金属塩である。

コール酸塩はそのまま所定濃度の水溶液に調整してそれ
を基質として用いてもよいし、或いは水に予めコール酸
と塩を形成し得る所定量のアルカリ金属化合物又はアル
カリ十類金属化合物を溶かしたのち、その水溶液にコー
ル酸を加えて所定濃度に調整したコール酸塩を基質とし
て用いてもよい。

コール酸塩の濃度は代謝生産される７α−ヒドロキシ−
３・１２−ジケトー５β−コラン酸及び／又はその塩の
収量、培養条件及び操作性などの経済的観点から約２０
〜５ ０ ０ ？／１の範囲が好まし《、さらに５０〜
３ ０ ０ ？／ｌの範囲がより好ましい。

培養方法では原則的には一般微生物の培養で採用される
方法と同じであるが、通常は液体培地による振盪培養法
又は通気攪拌培養法が用いられる。

培地としては上記の高濃度コール酸塩を基質として７α
−ヒドロキシ−３・１２−ジケトー５β−コラン酸及び
／又はその塩を生産する細菌が資化利用できる栄養源を
含有するものであればよい。

炭素源としてはコール酸塩を単一炭素源としてもよく、
或いはコール酸塩にアラビノースなどのベントース類；
グルコースマンノース、フラクトース、ガラクトースな
どのヘキソース類；マルトースなどの二糖類；澱粉分解
物、糖アルコール類、グリセリンなどの多価アルコール
類；又はポリベプトン、ペプトン、肉エキス、麦芽エキ
ス、コーンステイープリカー、酵母エキス、各種アミノ
酸などを併用してもよい。

また窒素源としては、例えば硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、燐酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝
酸ナトリウム、硝酸カリウムなどが用いられる。

また、この他に燐酸水素２カリウム燐酸２水素カリウム
、硫酸マグネシウムなどの無機塩が添加される。

培養条件に特徴はないが、通常２５〜３５℃で６時間〜
５日間振盪培養又は通気攪拌培養を行なう。

このようにして培養液中に蓄積された７α−ヒドロキシ
−３・１２−ジケトー５β−コラン酸及び／又はその塩
を分離・採取するには、まず培養液中の菌体その他の不
溶成分を濾過又は遠心分離などにより分離除去し、得ら
れた培養濾液又は上清に例えば塩酸を加える。

このようにして培養濾液又は上清を酸性とすることによ
り７α−ヒドロキシ−３・１２−ジケトー５β−コラン
酸をはじめとするコール酸塩の変換物が沈澱する。

なお、この際未変換のコール酸塩はコール酸として沈澱
する。

沈澱物を除去した液に例えば酢酸エチルを加えて残存す
る上記のコール酸塩の変換物並びに未変換のコール酸及
び／又はその塩を抽出し、しかるのち酢酸エチルを溜去
することによりほぼ完全に７α−ヒドロキシ−３・１２
−ジケトー５β−コラン酸をはじめとするコール酸塩の
変換物を採取し、未変換のコール酸及び／又はその塩を
回収することができる。

このようにして得られたコール酸塩の変換物並びに未変
換のコール酸及び／又はその塩を例えばメチルエステル
に変換後、シリカゲル力ラムに吸着させ、クロロホルム
、クロロホルム／エタノールの９９７１容量比の混合液
及びクロロホルム／エタノールの９７／３容量比の混合
液により順次溶出させる。

すなわち、クロロホノレムにより目的とする７α−ヒド
ロキシ−３・１２−ジケトー５β−コラン酸メチルエス
テルを溶出させ、クロロホルム／エタノールの９ ９７
１容量比の混合液によりまず７α・１２α−ジヒドロキ
シ−３一ヶ｝−５β−コラン酸メチルエステルを溶出さ
せ、ついで３α・７α−ジヒドロキシ−１２−ケトー５
β−コラン酸のメチルエステルを溶出させる。

さらにクロロホルム／エタノールの９７／３容量比の混
合液によりコール酸メチルエステルを溶出させる。

得られた７α−ヒドロキシ−３・１２−ジケトー５β−
コラン酸メチルエステルは常法により加水分解すること
により７α−ヒドロキシ−３・１２−ジケトー５β−コ
ラン酸とすることができる。

本発明の方法により得られる７α−ヒドロキシ−３・１
２−ジケトー５β−コラン酸は常法により脱水反応つい
で水素添加反応に供することによよりグロゲステロン又
は副腎皮質ステロイド誘導体の原料として有用なデオキ
シコール酸に容易に変換できる。

以下実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例 １ アルスロバクターＣＡ−３５菌株（工業技術院微生物工
業技術研究所、菌寄第５１４５号）を次に示す方法で培
養した。

コール酸１００ｖ、硝酸アンモニウム２．０ク、燐酸２
水素カリウム２．０１、燐酸水素２カリウム５．０ク、
硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｆ、酵母エキス０．
１ｆ及び水酸化ナトリウム１０グに蒸留水を加えて容量
を１ｌに調整し、これを培地とした。

この培地を５００ＴＬｌ容坂口フラスコに１００ｍｌ宛
１０本に分注し、１２０℃で１５分間、蒸気殺菌を行な
った。

予め上記の培地と同じ培地で試験管振盪機にて２日間増
殖させた種菌を上記の５００ｗＬｌ容坂口フラスコあた
り１０ｒｆＬｌ宛添加し、２日間振盪培養した。

培養後、これらの培養液を集め、遠心分離機で菌体を除
去後、得られた培養上清に塩酸を添加して該上清を塩酸
酸性にするとコール酸塩の変換物及び采変換コール酸が
沈澱した。

この沈澱物を採取し、残りの溶液を酢酸エチル１ｌで抽
出し、ロータリー・エバポレーターで酢酸エチルを溜去
後、得られた残存物を先の沈澱物と合わせることにより
、８５グのコール酸塩変換物及び未変換コール酸の混合
物を得た。

この混合物の極《一部を取り、これにメタノールを加え
て１％溶液とし、この溶液１０μｌをミクロボンダパツ
クＣ−１８カラムを備えた高速液体クロマトグラフイー
（米国ウォーターズ社製、ＨＬＣ−ＧＰＣ−２４４型）
に注入した。

移動相としてｐＨ２．５に調整した水／メタノ・；−ル
の３０／７０容量比の混合液を流速１ｍｌｌ分で流し、
検出を屈折率方式で行なったところ第１図のクロマトグ
ラムが得られた。

このクロマトグラムにおけるピークＡ、ピークＢ、ピー
クＣ及びピークＤは標準品のピークと照合することによ
り各々７α−ヒドロキシ−３・１２−ジケトー５βーコ
ラン酸３α・７α−ジヒドロキシ−１２−ケトー５β−
コラン酸、７α・１２α−ジヒドロキシ−３−ケトー５
β−コラン酸及びコール酸のものと一致した。

また、これらのピークＡ、ピークＢ及びピークＣの各々
の部分に相当する化合物を分取し、マススペクトル、赤
外線吸収スペクトル及びＮＭＲスペクトルにより化合物
の構造確認を行なったところ、それぞれ上記の７α−ヒ
ドロキシ−３・１２−ジケトー５β−コラン酸、３α・
７α−ジヒドロキシ−１２一ケトー５β−コラン酸及び
７α・１２α−ジヒドロキシ−３−ケトー５β−コラン
酸であった。

なお、ピークＡ、ピークＢ及びピークＣの各々の部分に
相当する化合物の赤外線吸収スペクトル（Ａ，Ｂ及びＣ
）はメチルエステル化後の化合物についてのものであり
、それらを標準品の赤外線吸収スペクトル（ Ａ’、Ｂ
′及びＣ／）と対比してそれぞれ第２図、第３図及び第
４図に表示する。

さらに分取したクロマトグラムのピークＡ、ピークＢ及
びピークＣの部分に相当する及びそれらのメチルエステ
ルの融点化合物を測定すると次表に示すとおりであった
。

第１図のクロマトグラムの面積比から得られたコール酸
塩変換物の収量及び未変換コール酸の残存量を算出する
と次表に示すとおりである。

実施例 ２ アルスロバクターＣＡ−３５菌株（前述に同じ）を用い
、実施例１における培地にグルコース５．０１を添加す
る以外は実施例１と同じ方法により培養を行なったとこ
ろ、培養液からコール酸塩変換物及び未変換コール酸の
混合物を９１．Ｏｒ得た。

この混合物９１．Ｏｒをメタノール２７０ｍｌに溶解せ
しめ、これに濃塩酸９麻を加えたのち２０分間還流煮沸
することにより、混合物中に含まれるコール酸塩変換物
及び未変換コール酸のメチルエステル化を行なった。

シリカゲルＣ −２ ０ ０の１５００１をカラム（直
径７０朋Ｘ１２０ｏ＋ｔｍ）に充填し、これに上記のメ
チルエステル化物を吸着させたのち、クロロホルムで溶
出すると７α一ヒドロキシ−３・１２−ジケトー５β−
コラン酸〕メチルエステルが得られた。

ついで、クロロホルム／エタノール９９／１容量比の混
合液で溶出するとまず７α・１２α−ジヒドロキシー３
〜ケトー５β−コラン酸メチルエステルが得られ、つい
で３α・７α−ジヒドロキシ−１２−ケトー５β一コラ
ン酸メチルエステルが得られた。

各々の化合物の収量は７α−ヒドロキシ−３・１２−ジ
ケトー５β−コラン酸メチルエステルが２５．１ｆ？、
７α・１２α−ジヒドロキシ−３一ケトー５β一コラン
酸メチルエステルが１．４０ｆＩ１３α・７α一ジヒド
ロキシ−１２一ケトー５β−コラン酸メチルエステルが
５６．４ｆ！であった。

これらを各々加水分解することによりそれぞれ７α−ヒ
ドロキシ−３・ｌ２−ジケトー５β−コラン酸を２４．
８１、７α・１２α−ジヒドロキシ−３−ケトー５β−
コラン酸を１．３８ｆ、３α・７α−ジヒドロキシ−１
２一ケトー５β−コラン酸を５６．Ｏｆ得た。

実施例 ３ アルスロバクターＣＡ−３５菌株（前述に同じ）を用い
、実施例１におけるコール酸の濃度を変化させ、かつ水
酸化ナトリウムを使用するコール酸の１／１０重量加え
る以外は実施例１と同様の方法により培養を行ない、各
々の基質濃度における３α・７α−ジヒドロキシ−１２
−ケトー５β−コラン酸、７α−ヒドロキシ−３・１２
−ジケトー５β−コラン酸及び７α・１２α−ジヒドロ
キシ−３−ケトー５β−コラン酸の収量並びに未変換コ
ール酸の残存量を求めて次表に示した。

実施例 ４ プレビバクテリウムＣＡ−６菌株（工業技術院微生物工
業技術研究所、菌寄第５１４４号）を用いる以外は実施
例１と同じ方法で培養し、同様の処理によって得られた
コール酸塩変換物及び未変換コール酸の混合物を実施例
１と同様にして高速液体クロマトグラフイーにかげたと
ころ、第５図に示すクロマトグラムが得られた。

このクロマトグラムにおけるピークＥ、ピークＡ、ピー
クＢ及びピークＤの各々の部分に相当する化合物を分取
し、マススペクトル、赤外線吸収スペクトル及びＮＭＲ
スペクトルにより化合物の構造確認を行ない、それぞれ
７α−ヒドロキシ−３・１２−ジケトー△４ コレン酸
、７α−ヒドロキシ−３ ・１２−ジケトー５β−コラ
ン酸、３α・７α−ジヒドロキシ−１２一ケトー５β−
コラン酸及びコール酸と同定した。

なお、ピークＸ及びピークＹの各各の部分に相当する化
合物は未同定物質である。

第５図のクロマトグラムにおいて、ピークＸ及びピーク
Ｙを除いた残りのピークの面積比はＥ：Ａ：Ｂ：Ｄ：−
１２．２：２２．２：４４．９：２０．７であった。

実施例 ５ アルスロバクターＣＡ−３５菌株（前述に同じ）を用い
、実施例２において２４時間増殖させた種菌を５００ｍ
ｌ容坂口フラスコあたり２０ｍｌ宛添加し２４時間振盪
培養した以外は実施例２と同様の方法により操作を行な
ったところ、培養液からコール酸塩変換物及び未変換コ
ール酸塩の混合物が１１７．Ｏｆ得られた。

この混合物を実施例１と同様にして高速液体クロマトグ
ラフイーによりその組成及び組成比を求めた結果を次に
示す。

参考例 １ ２００ｍｌ容三つ口フラスコ中で７α−ヒドロキシー３
・１２−ジケトー５β−コラン酸３ｖをピリジン７０ｍ
ｌに溶解させ、この溶液にトシルクロライド１モルを添
加して０℃で１時間反応させ、さらに５時間還流した。

還流後、この反応液に３規定の塩酸水溶液を注入し、つ
いでエーテル１００ｍｌで抽出した。

エーテル層から減圧蒸溜によりエーテルを溜去して△６
及び／又は△７ −３・１２−ジケトーコレン酸を２．
５１得た。

ついで、得られた△６及び／又は△７ −３・１２−ジ
ケトーコレン酸２グを１規定の水酸化ナトリウム１０ｍ
ｌに溶解し、この溶液にラネー・ニッケル０．１１を添
加したのち、水素ガス０．０１モルを注入し、一夜反応
させることにより、３α・１２α−ジヒドロキシ−５β
−コラン酸（テオキシコール酸）及び３α・１２β−ジ
ヒドロキシ−５β−コラン酸を得た（収率：９０％）。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたコール酸塩変換物及び未変
換コール酸の液体クロマトグラムを表わし、第２〜４図
はそれぞれ第１図のクロマトグラムのピークＡ、ビーク
Ｂ及びピークＣの各々の部分に相当する化合物をメチル
エステル化したもの赤外線吸収スペクトル（Ａ Ｂ及
びＣ）を標準品の赤外線吸収スペクトル（ ａ／， Ｂ
／及びＣりと対比して表示したものである。 第５図は実施例４で得られたコール酸塩変換物及び未変
換コール酸の液体クロマトグラムを表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 高濃度コール酸塩を基質として７α−ヒドロキシ−
   ３・１２−ジケトー５β−コラン酸及び／又はその塩を
   生産するアルスロバクター属又はプレビバクテリウム属
   に属する細菌を、コール酸塩を高濃度で含む栄養培地に
   培養して上記のコラン酸及び／又はその塩を生成せしめ
   、これを採取することを特徴とする７α−ヒドＣｌ キ
   シ− ３ ・１２−ジケトー５β−コラン酸及び／又は
   その塩の製造方法。 ２ 培地中のコール酸塩の濃度が約２０〜５００ｆｌ／
   ｌである特許請求の範囲第１項記載の製造方法。