JPH0147157B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はデオキシコール酸及び／又はその塩か
ら微生物により12α−ヒドロキシプレグナ−１，
４−ジエン−３−オン−20α−カルボン酸及び／
又はその塩を製造する方法に関し、詳しくはシユ
ードモナス・アルビラＤ−235（Pseudomonas
arvilla Ｄ−235）菌株（微工研究条寄第181号）
を、デオキシコール酸及び／又はその塩を含む培
地に培養して12α−ヒドロキシプレグナ−１，４
−ジエン−３−オン−20α−カルボン酸及び／又
はその塩を生成せしめ、これを採取することを特
徴とする12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジ
エン−３−オン−20α−カルボン酸及び／又はそ
の塩の製造方法に関する。 従来、デオキシコール酸に微生物を作用させて
12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３
−オン−20α−カルボン酸を得る方法はいくつか
知られている。まずバルネス（P.J.Barnes）らに
よつて、シユードモナス・エスピーNCIB 10590
（Pseudomonas sp.NCIB 10590）菌株を用いる
方法が報告されている〔J.Chem.Soc.Chem.
Commun，（1974年），115〜116頁及び
Tetrahedron，32巻、89〜93頁（1976年）参照〕。
この方法は、デオキシコール酸を0.1％含む無機
塩培地10でシユードモナス・エスピーNCIB
10590菌株を14時間好気的に培養し、デオキシコ
ール酸10ｇから12α−ヒドロキシプレグナ−１，
４−ジエン−３−オン−20α−カルボン酸657mg
及び12β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジ
エン−３，17−ジオン960mgを主生産物として得、
さらに12α−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−
ジエン−３，17−ジオン、12β−ヒドロキシ−４
−アンドロステン−３，17−ジオン及び12ξ，
17ξ−ジヒドロキシ−４−アンドロステン−３−
オンを微量成分として得るものである。この方法
は12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−
３−オン−20α−カルボン酸の収率が７％未満と
低い点、アンドロスタン系の副生物が多い点、及
び基質であるデオキシコール酸の濃度が0.1％と
低い点で実用的ではない。なお、この方法で使用
されているシユードモナス・SP.NCIB 10590菌
株については、この菌株が動物糞便から採取され
たシユードモナス属に属する細菌であること以外
には全く報告されていない。また、テネソン
（M.E.Tenneson）らによる、嫌気性大腸菌を用
いてデオキシコール酸から12α−ヒドロキシプレ
グナ−１，４−ジエン−３−オン−20α−カルボ
ン酸及び12β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４
−ジエン−３，17−ジオンを得る方法
〔Biochem.Soc.Trans.，５巻、1758〜1760頁
（1977年）参照〕；オーエン（R.W.Owen）らによ
る、バクテロイデス・フラギリスXF23
（Bacteroides fragilis XF23）菌株又はバクテロ
イデス・フラギリス・サブスピーシーズ・セタイ
オタオミクロンE59（Bacteroides fragilis subsp.
thetaiotaomicron E59）菌株を用いてデオキシ
コール酸から12α−ヒドロキシプレグナ−１，４
−ジエン−３−オン−20α−カルボン酸、12β−
ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジエン−３，
17−ジオン、12α−ヒドロキシアンドロスタ−
１，４−ジエン−３，17−ジオン及び12β−ヒド
ロキシ−４−アンドロステン−３，17−ジオンを
得る方法〔Biochem.Soc.Trans，５巻、1711〜
1713頁（1977年）参照〕が知られているが、これ
らの方法はいずれも嫌気性菌を用いており、用い
る基質が低濃度となること、培養に長期間を要す
ること、目的物の収率が低いことなど工業的に発
酵生産するに当り種々の問題点を有する。 本発明者らはデオキシコール酸及び／又はその
塩を基質として12α−ヒドロキシプレグナ−１，
４−ジエン−３−オン−20α−カルボン酸及び／
又はその塩を生産する微生物の探索を長期間行な
つた結果、シユードモナス・アルビラに属する特
定の細菌がデオキシコール酸及び／又はその塩を
基質として12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−
ジエン−３−オン−20α−カルボン酸及び／又は
その塩を高選択率、高収率で生産することを見出
し、本発明を完成するに至つた。 本発明者らが得た上記のシユードモナス・アル
ビラに属する細菌としては、シユードモナス・ア
ルビラＤ−235（Pseudomonas arvilla Ｄ−235）
菌株（微工研条寄第181号）がある。この菌株は
デオキシコール酸及び／又はその塩を含む培地で
培養された場合、培養期間のいずれの時期におい
ても12β−ヒドロキシアンドロスタ−１，４−ジ
エン−３，17−ジオンをほとんど生産しない点で
前記のバルネスらの方法で用いられたシユードモ
ナス・エスピーNCIB 10590菌株とは区別され
る。 本発明者らが得たシユードモナス・アルビラＤ
−235菌株の菌学的性質を列挙すると次表のとお
りである。

【表】

【表】

【表】 上記の表に示した菌学的性質の基づき、シユー
ドモナス・アルビラＤ−235菌株の同定を行なつ
た。シユードモナス・アルビラＤ−235菌株は、
桿菌であること、極鞭毛を有していること、グラ
ム染色が陰性であることなどの顕微鏡的所見並び
にオキシダーゼ反応及びカタラーゼ反応がともに
陽性であること、好気性であること、Ｏ−Ｆテス
トの結果が酸化的（Oxidative）であることなど
の生理学的性質からバージエイズ・マニユアル・
オブ・デイターミネイテイブ・バクテリオロジ−
第７版及び第８版に基づき、シユードモナス属に
属する細菌であると同定した。さらにシユードモ
ナス・アルビラＤ−235菌株は、菌体の大きさが
0.3〜0.7×1.5〜2.4μである点、寒天平板上の集落
の色が白色でかつその表面が扁平状で湿光を呈す
る点、色素を生成しない点、ゼラチンを液化しな
い点、硝酸塩を還元しない点及びグルコースから
酸を生成する点から、シユードモナス属のアルビ
ラ種に属する細菌であると同定した。 本発明の方法による12α−ヒドロキシプレグナ
−１，４−ジエン−３−オン−20α−カルボン酸
及び／又はその塩の生産は、デオキシコール酸及
び／又はその塩を基質として12α−ヒドロキシプ
レグナ−１，４−ジエン−３−オン−20α−カル
ボン酸及び／又はその塩を生産するシユードモナ
ス・アルビラに属する細菌を、デオキシコール酸
及び／又はその塩を含む培地に培養することによ
り行なわれる。デオキシコール酸の塩としては具
体的にはデオキシコール酸のナトリウム、カリウ
ムなどのアルカリ金属の塩又はカルシウム、マグ
ネシウムなどのアルカリ土類金属の塩である。デ
オキシコール酸及び／又はその塩の濃度は通常約
１〜200ｇ／の範囲でよいが、生産される12α
−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オ
ン−20α−カルボン酸及び／又はその塩の収量、
培養条件及び操作性などの経済的観点から約10〜
100ｇ／の範囲が好ましい。培養方法は原則的
には一般微生物の好気培養で採用される方法と同
じであるが、通常は液体培地による振盪培養法又
は通気撹拌培養法が用いられる。培地としては上
記のデオキシコール酸及び／又はその塩を基質と
して12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン
−３−オン−20α−カルボン酸及び／又はその塩
を生産するシユードモナス・アルビラに属する細
菌が資化利用できる栄養源を含有するものであれ
ばよい。炭素源としてはデオキシコール酸及び／
又はその塩を単一炭素源としてもよく、或いはデ
オキシコール酸及び／又はその塩にアラビノース
などのペントース類；グルコース、マンノース、
フラクトース、ガラクトースなどのヘキソース
類；シユークロース、マルトースなどの二糖類；
澱粉分解物；糖アルコール類、グリセリンなどの
多価アルコール類；又はポリペプトン、ペプト
ン、肉エキス、麦芽エキス、コーンステイープリ
カー、酵母エキス、各種アミノ酸、有機酸などを
併用してもよい。また窒素源としては、例えば硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、燐酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝
酸カリウムなどの無機窒素源、又はポリペプト
ン、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源が用い
られる。また、この他に燐酸水素２カリウム、燐
酸２水素カリウム、硫酸マグネシウムなどの無機
塩類が添加される。培養条件に特徴はないが、通
常25〜35℃で10時間〜７日間振盪培養又は通気撹
拌培養を行なう。 このようにして培養液中に蓄積された12α−ヒ
ドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−
20α−カルボン酸及び／又はその塩は、既知の方
法により分離採取することができる。例えば、培
養液中の菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心分
離などにより分離除去して得られた培養濾液又は
上清に、塩酸、硫酸などの酸を加えて酸性とした
のち、上記カルボン酸を溶解しかつ水と相分離す
る有機溶媒、例えば酢酸エチル、クロロホルム、
クロロホルムとメタノールの混合液などを用いて
抽出する。得られた抽出液を集め、これより溶媒
を溜去することによつて目的とする12α−ヒドロ
キシプレグナ−１，４−ジエン−３−オン−20α
−カルボン酸を回収することができる。この有機
溶媒による抽出操作は培養濾液又は上清について
のみでなく、培養液そのものについて行なうこと
ができ、またこれらの培養液、培養濾液又は上清
に予め酸を加えることなしに行なうこともでき
る。上記において培養濾液又は上清を酸性とした
場合には12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジ
エン−３−オン−20α−カルボン酸が沈澱物とし
て得られるため、これをそのまま濾過又は遠心分
離などにより回収することもできるが、これに続
く精製等の処理の操作性を考慮すれば上記の抽出
操作を行なうことが好ましい。上記の方法で得ら
れた抽出物又は沈澱物中には12α−ヒドロキシプ
レグナ−１，４−ジエン−３−オン−20α−カル
ボン酸の他に残存基質のデオキシコール及び／又
はその塩並びに副生物が含まれており、その抽出
物又は沈澱物を例えばシリカゲルカラムに吸着さ
せ、クロロホルムとエタノールの混合液で溶出さ
せることにより12α−ヒドロキシプレグナ−１，
４−ジエン−３−オン−20α−カルボン酸を取得
することができる。 本発明の方法により得られる12α−ヒドロキシ
プレグナ−１，４−ジエン−３−オン−20α−カ
ルボン酸は、その20位のカルボン酸を脱離させる
ことによつてプレドニゾンなどのホルモン系ステ
ロイドの合成原料となる12α−ヒドロキシプレグ
ナ−１，４−ジエン−３，20−ジオンに誘導する
ことができる〔Ｈ，Ruschig et al.，Chem.
Bar.，88巻、883頁（1955年）参照〕。 以下実施例によつて本発明をさらに詳細に説明
する。 実施例 １ シユードモナス・アルビラＤ−235菌株（微工
研条寄第181号）を次に示す方法で培養した。デ
オキシコール酸5.0ｇ、硝酸アンモニウム0.2ｇ、
燐酸２水素カリウム0.1ｇ、燐酸水素２カリウム
0.25ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物0.02ｇ、酵
母エキス0.01ｇ及び水酸化ナトリウム0.5ｇに水
道水を加えて容量を100ml（PH：7.2）に調整し、
これを培地とした。この培地を500ml容坂口フラ
スコに入れ、120℃で15分間、蒸気殺菌を行なつ
た。予め上記の培地と同じ培地で試験管振盪機に
て２日間増殖させた種菌10mlを上記の500ml容坂
口フラスコに添加し、30℃で５日間振盪培養し
た。培養後、この培養液を集め、遠心分離機で菌
体を除去後、得られた培養液上清に塩酸を加える
ことにより、この培養液上清のPHを２とした。こ
の培養液上清をクロロホルムメタノールの２／１
容量比の混合液300mlで抽出し、ロータリー・エ
バポレーターでクロロホルム／メタノール混合液
を溜去することにより、2.9ｇのデオキシコール
酸の酸化生成物及び未変換のデオキシコール酸の
混合物を得た。 上記の混合物の極く一部と取り、これにメタノ
ールを加えて１％溶液とし、この溶液20μをミ
クロボンダパツクＣ−18カラムを備えた高速液体
クロマトグラフイー（米国ウオーターズ社製、
HLC−GPC−244型）に注入した。移動相として
PH4.0に調整した水／メタノールの25／75容量比
の混合液を流速１ml／分で流し、検出を屈折率方
式で行なつたところ第１図のクロマトグラムが得
られた。このクロマトグラムにおけるピークＡ、
ピークＢ、ピークＣ、ピークＤ、ピークＥ及びピ
ークＦは標準品のピークと照合することにより
各々12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン
−３−オン−20α−カルボン酸、12α−ヒドロキ
シ−３−ケト−４−コレン酸、12α−ヒドロキシ
−３−ケト−5β−コラン酸、12α−ヒドロキシ−
３−ケト−コラ−１，４−ジエン酸、12α−ヒド
ロキシ−３−ケト−5β−プレグナン−20α−カル
ボン酸及びデオキシコール酸のものと一致した。 上記の混合物2.8ｇを少量のクロロホルム／エ
タノールの99／１容量比の混合液に溶解させ、50
ｇのシリカゲルカラムに吸着させた。このカラム
をクロロホルム／エタノールの99／１容量比の混
合液500mlで洗滌後、クロロホルム／エタノール
の97／３容量比の混合液１をカラムに流し、得
られた溶出液からロータリー・エバポレーターで
溶媒を溜出することによりデオキシコール酸の酸
化生成物の混合物を310mg得た。次に、上記のカ
ラムにクロロホルム／エタノールの95／５容量比
の混合液500mlを流し、溶出液を10ml宛フラクシ
ヨンチユーブに分取し、薄層クロマトグラフイー
により単一スポツトを与える画分を集め、ロータ
リー・エバポレーターで溶媒を溜去することによ
り乾固物650mgを得た。これを酢酸エチルで再結
晶することにより12α−ヒドロキシプレグナ−
１，４−ジエン−３−オン−20α−カルボン酸を
450mg得た。さらに上記のカラムにクロロホル
ム／エタノールの90／10容量比の混合液200mlを
流し、この溶出液から未変換のデオキシコール酸
を1.2ｇ回収した。 先に得られたクロロホルム／エタノールの97／
３容量比の混合液による溶出画分からのデオキシ
コール酸の酸化生成物の混合物310mgを少量のク
ロロホルム／エタノールの99／１容量比の混合液
に溶解させ、20ｇのシリカゲルカラムに吸着させ
た。このカラムにクロロホルム／エタノールの容
量比が98／２及び97／３の各々の混合液300mlを
この順序で流し、溶出液を10ml宛フラクシヨンチ
ユーブに分取し、薄層クロマトグラフイーにより
単一スポツトを与える画分をそれぞれ合わせ、ロ
ータリー・エバポレーターで溶媒を溜去した。そ
の結果、クロロホルム／エタノールの98／２容量
比の混合液による前半の溶出画分から12α−ヒド
ロキシ−３−ケト−5β−コラン酸を80mg得、そ
の後半の溶出画分から12α−ヒドロキシ−３−ケ
ト−４−コレン酸を10mg得た。クロロホルム／エ
タノールの97／３容量比の混合液による前半の溶
出画分から12α−ヒドロキシ−３−ケト−5β−プ
レグナン−20α−カルボン酸を５mg得、その後半
の溶出画分から12α−ヒドロキシ−３−ケト−コ
ラ−１，４−ジエン酸を10mg得た。 得られた各々の化合物を下記の方法で同定し
た。 12α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３
−オン−20α−カルボン酸 マススペクトルｍ／ｚ：358〔Ｍ〕₊

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナス・アルビラＤ−235
   （Pseudomonas arvilla Ｄ−235）菌株（微工研
   条寄第181号）を、デオキシコール酸及び／又は
   その塩を含む培地に培養して12α−ヒドロキシプ
   レグナ−１，４−ジエン−３−オン−20α−カル
   ボン酸及び／又はその塩を生成せしめ、これを採
   取することを特徴とする12α−ヒドロキシプレグ
   ナ−１，４−ジエン−３−オン−20α−カルボン
   酸及び／又はその塩の製造方法。