JPH0276596A - ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子誘導体及びこれを生産するための発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
（以下、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆという）誘導体及びそれを生
産するための発現ベクターに関する。本発明のヒｌ−Ｇ
Ｍ−Ｃ：ＳＦ誘導体は、白血球減少又は骨髄低形成を伴
う疾患、例えば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、制
カン剤の副作用あるいは放射線障害等に対する治療薬と
しての用途を右する。

［従来の技術］ ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆはヒト骨髄中の未分化な血球前駆細胞
の増殖を惺進し、分化を誘導する作用を有する分子量約
２万３千の糖タンパク質である。ワンらかヒトＴ細胞株
Ｍｏ細胞より初めてｃＤＮＡをクローン化した［サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　２２８：　８］０（１！１
８５）］。成熟（Ｊ−Ｃ３Ｆタンパク質はこのようにし
て得られたｃＤＮＡを用いて、動物細胞（ワンら、」二
記文献）、酵母（特開昭６１−１９９７８７号）、大腸
菌（特開昭６２−１６４６！１５号）等を用いて発現さ
れているか、コストや生産量において問題を有する。ま
た、ＧＭ−Ｃ３Ｆを培養器に固定化して使用する例はま
た報告されていない。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、ヒトＧ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆの生理活性を
有するポリペブチ１−であって、大腸菌等の微生物中て
大量に産生ずることかできる新規なヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ誘
導体を提供するととである。さらにまた、本発明の目的
は、この新規なヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ誘導体を生産するだめ
の発現ベクターを提供することである。

［問題点を解決するだめの手段］ 本願発明者らは鋭意研究の結果、メタピロカブカーゼの
Ｎ末端側のポリペプチドのＣ末端にヒ）　ＧＭ−Ｃ３Ｆ
活性を有するポリペプチドか結合された融合ポリペブチ
１−か、遺伝子工学的手法により、大腸菌内て大量に生
産させることかできることを見出しこの発明を完成した
。

すなわち、この発明は、メタピロカブカーゼのＮ末端側
のポリペプチドのＣ末端にヒｈＧＭ−（：ＳＦ活性を右
するポリペブチ１へか結合された、ヒ１−　（Ｊ−Ｃ３
Ｆの生物活性を有するヒトＧＭ−Ｃ：ＳＦ、ｄ導体を提
供する。

さらにまた、この発明は、−Ｉ−配本発明のヒトＧＭ−
Ｃ８Ｆ誘導体をコートするＤＮＡ領域を有し、該誘導体
を発現することかできる発現ベクターを提供する。

［発明の効果］ この発明により、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ活性を有する新規な
融合ポリペプチドか提供された。本発明のヒ１−ＧＭ−
Ｃ３Ｆ誘導体は、大腸菌中て大量に生産されるメタピロ
カブカーゼのＮ末端部分を含んでいるのて、遺伝子工学
的手法により、犬■揚菌等の宿主微生物中で、大量に生
産することかできる。従って、この発明により、白血球
減少又は骨髄低形成を伴う疾患、例えば後天性免疫不全
症候群（ＡＩＤＳ）、制ガン剤の副作用あるいは放射線
障害等に対する治療薬としての用途を有するヒトＧＭ−
Ｃ５Ｆ誘導体を大量に、安価に提供することか可能にな
り医療上大いに貢献する。ざらに、本発明のヒトＧＭ−
Ｃ８Ｆ誘導体は架橋剤を用いてヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ活性を
保持したまま固定化することかてきるのて、骨髄移植の
際等に、これを固定化した培養器中で骨髄細胞を陪養し
た後体内に移植する等の応用も可能になる。また、本発
明により、本発明のヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ誘導体を生産する
ための新規な発現ベクターか提供された。

［発明の詳細な説明］ 本発明のヒ１〜Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ　、ｌ導体は、上述
したように、メタピロカブカーゼのＮ末端側のポリペプ
チドのＣ末端にヒＩ−ＧＭ−１１：ＦＳ活性を右するポ
リペブチ１へか直接に又はリンカ−ペプチドを介して結
合されたものである。

メタピロカブカーゼはカテコール−２，３−シオキシケ
ナーセとも呼ばれ、微生物シュードモナス・プチダ（Ｐ
ｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）か産生ずるカブ
コール耐化酵素である［野崎ら、ビオヘミッシェツアイ
トシュリフト（ｌｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｃＺｅｉｔｏｓ
ｃｌ＋ｒｉｆＬ）　３３８：　５８２　（１９６３）］
。そのアミノ酸配列及び塩基配列を第２図に示す。メタ
ピロカブカーゼは、構造遺伝子を、その」−流に存在す
るシャインータルガノ配列（ＳＤ配列）と共に大腸菌用
発現プラスミドに組み込むことにより、大腸菌内で大量
に発現させることかてきる（特開昭６ｌ−７０９８８）
。本発明のヒトＧＭ−ＣＦＳ誘導体は、大腸菌内て大量
に発現されるメタピロカブカーゼのＮ末端側のポリペプ
チドとの融合ペプチドであるのて、大腸菌等の宿主微生
物内で遺伝子工学的手法により大量に生産される。すな
わち、メタピロカブカーゼのＮ末端側は、本発明のポリ
ペプチドを宿主細胞内て大量に生産せしめる機能を有す
る。

メタピロカブカーゼのＮ末端側のポリペプチドは１本発
明の融合ペプチドを大量に生産せしめる機能を有するも
のであれば、そのアミノ酸数は特に限定されない。すな
わち、メタピロカブカーゼのＮ末端から始まる２個以上
のアミノ酸を有していればよい。後述する実施例では、
メタピロカブカーゼのＮ末端第１番目のメチオニンから
第１２番目のグルタミンまでのアミノ酸から成るポリペ
プチド及びＮ末端第１番目のメチオニンから第９４番目
のグルタミンまでのアミノ酸から成るポリペプチドを用
いているか、これらに限定されるものてはなく、融合ペ
プチドを大量に生産せしめる機能を有するものてあれば
いかなる大きさのものてあってもよい。また、一般に、
ペプチドの生理活性は、一部のアミノ酸か置換し、欠落
し又は少数のアミノ酸か付加された場合でも維持される
ことがあることは当業者によってよく認識されていると
ころである。従って、本発明の融合ベブヂトのメタピロ
カブカーゼのＮ末端側ポリペブチＩζにおいても、一部
のアミノ酸か置換し、欠落し又は付加されたものてあっ
ても融合ベプチ１−を大量に生産せしめる機能な有する
ものは特許請求の範囲で言う［Ｎ末端側のポリペブチ１
〜」という語に包含される。従って、例えば、メタピロ
カブカーゼのＮ末端側のポリペプチドは必ずしもＮ末端
第１番目のアミノ酸から始まる必要はなく、ペプチドを
大量に生産させる機能か維持されるならば第２番目又は
それ以降のアミノ酸をその端部とするポリペプチドであ
ってもよい。

ヒトＧＭ−Ｃ８ＦのｃＤＮＡは第３図に示すアミノ酸配
列をコードしているか、Ｎ末端１７アミノ酸は分泌シグ
ナルであり、成熟タンパク質は第１８番［１から第１４
４番目までの１２７個のアミノ酸から成る。後述の実施
例では上記成熟タンパク質の全アミノ酸を有するものを
用いているか、ヒ）〜ＧＭ−Ｃ８Ｆ活性を有するもので
あれば完全な成熟タンパク質である必要はない。すなわ
ち、一般に、ペプチドの生理活性は、−・部のアミノ酸
か置換し、欠落し又は少数のアミノ酸かイ１加された場
合ても維持されることがあることは当業者によってよく
認識されているところである。従って、ヒ１〜ＧＭ−Ｃ
３Ｆの成熟タンパク質の一部のアミノ酸か置換し、欠落
し又は少数のアミノ酸か付加されたものてあっても、ヒ
トＧＭ−（：ＳＦ活性を有するものは本発明のヒトＧＭ
−Ｃ８Ｆ誘導体に採用することかできる。

本発明のヒトＧＭ−Ｃ：ＳＦＭ導体ては、ト記したメタ
ピロカブカーゼのＮ末端側のポリペプチドのＣ末端に」
二記ヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ活性を有するポリペブチ１〜か結
合されている。後述するように、本発明のヒトＧＭ−Ｃ
３Ｆは大腸菌等の微生物を宿主とする遺伝子工学的手法
により生産することかてきるか、この場合、メタピロカ
ブカーゼのＮ末端側のポリペプチドをコートするＤＮＡ
領域と、ヒトＧＭ−Ｃ：ＳＦ活性を有するポリペプチド
をコー１へするＤＮＡ領域とのフレームを合わせるため
に、これらの間にリンカ−を介在させる必要か生しるこ
とがある。この場合には１本発明のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ誘
導体において、ヒｌ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ活性をイ１するポリ
ペプチドは、メタピロカブカーゼのＮ末端側のポリペプ
チドのＣ末端にリンカ−ペプチドを介して結合されるこ
とになる。なお、この場合、リンカ−ペプチド中のアミ
ノ酸は親木性で柔軟な構造をとるもの、例えばクリシン
、セリン、スレオニンに富むものか女子ましい。一方、
リンカ−を用いてＤＮＡのフレームを合わせる必要かな
い場合にはヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ活性を有するポリペブチ１
〜は、メタピロカブカーゼのＮ末端側のポリペブチ）へ
のＣ末端に直接結合される。

この発明のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ誘導体は、全体としてヒト
ＧＭ−Ｃ３Ｆの生物活性を有する。すなわち、メタビロ
カテカーゼのＮ末端側のポリペプチドか結合された状態
においてヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ活性を有する。

従って、この発明のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ誘導体は、メタピ
ロカテカーゼ由来部分を切断することなくそのまま用い
ることかてきる。さらに、メタビロカテカーセ由来部分
を架橋剤等によりプレート等の固定物に固定することに
より、ヒトＧＭ−Ｃ５Ｆ活性を維持したまま固定化する
ことかできる。

この発明はまた、上記した本発明のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ誘
導体をコートするＤＮＡ領域を有し、該誘導体を発現す
ることかできる発現ベクターを提供する。この発現ベク
ターに組み込まれる、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ誘導体をコート
するＤＮＡ領域は、メタピロカテカーゼのＮ末端側のポ
リペプチドをコートする領域と、ヒトＧＭ−Ｃ：ＳＦ活
性を有するポリペプチドをコートする領域を有する。ヒ
トＧＭ−Ｃ：ＳＦ活性を有するポリペプチドをコートす
る領域は、公知の方法によりヒト由来細胞からｎＲＮＡ
を得、これから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、
さらにこれを二本鎖とすることにより得たものてあって
もよいし、合成されたものてあってもよい。また、同様
に、メタピロカテカーセのＮ末端側のポリペプチドもシ
ュードモナス・プチタ由来のものであってもよいし合成
したものてあってもよい。メタピロカテカーセのＮ末端
側のポリペプチドをコートする領域と、ヒトＧＭ−（：
ＳＦ活性を有するポリペプチドをコー１へする領域とは
、フレームか揃っている場合には直接、フレームか揃っ
ていない場合には適当なリンカ−を介して結合される。

本発明の発現ベクターはまた、従来の通常の発現ベクタ
ーと同様、複製に必要な複製開始点、制御可能なプロモ
ーター／オペレーター、リポソームか結合するためのＳ
Ｄ配列及び転写終結のためのターミネータ−を含む。こ
れらはそれぞれの機能を有するものてあれば公知のいず
れのものをも用いることかてきる。例えば、複製に必要
な複製開始点としてはｐＢＲ３２２やｐＵＣ系プラスミ
ドの複製開始点、プロモーター／オペレーターとしては
ＩａｃｌＪＶ５、ｔｒｐ、　ｔａｃ、　Ｐ、、、ｐ、、
Ｉｐｐ等を、ＳＤ配タリとしてはメタピロカテカーセの
ＳＤ配列やＩａｃのＳＤ配列等を、ターミネータ−とし
てはｒｒｎＢＴ＋７２等を採用することかできる。また
、薬剤耐性のような適当な選択マーカーを有しているこ
とが好ましい。

本発明の発現ベクターは、複製開始点、プロモーター／
オペレーター、ＳＤ配列、ターミネータ−及び好ましく
は選択マーカーを有するベクターにメタビロカテカーゼ
のＮ末端側めポリペプチドをコードする領域及びヒトＧ
Ｍ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペプチドをコードする領域
をクローニングすることにより構築することかできる。

後述の実施例ては、ｐｕｃｑの複製開始点、ｔａｃプロ
モーター／オペレーター、メタピロカテカーゼのＳＤ配
列とＮ末端１２アミノ酸、ｒｒｎＢターミネータ−を有
するプラスミドであるｐｔＫ３　（特願昭６３−１６４
９３５記載）、又はｐＢＲ３２２の複製開始点、ｔａｃ
プロモーター／オペレーター、メタピロカテカーゼのＳ
Ｄ配列とＮ末端９４アミノ酸及びカルシトニン遺伝子を
含むプラスミドであるｐＴＭＣ３２（特開昭６１−２５
７１８７　）に、ヒトＴ細胞白血病細胞株＋１１Ｊ　Ｔ
　−１０２のｍＲＮＡから調製したヒトＧＭ−（：ＳＦ
をコードするＤＮＡ領域をクローニングすることにより
本発明の発現ベクターを構築したが、構築方法はこれに
限定されないことは明らかである。

本発明のヒトＧＭ−ＣＦＳ誘導体は、上記した本発明の
発現ベクターで宿主微生物、好ましくは大腸菌、特に例
えば大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ−１２株に由来する
例えばＪＭＩＯＩ、　ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１
０９、ＲＲＩ、ＨＢｌｏｌ、ＲＲ７９１、Ｗ３１１０、
Ｃ６００等のような腸管寄生性のない大腸菌株を形質転
換し、該形質転換株を培養することにより形質転換株中
に産生ずることかてきる。形質転換はこの分野において
周知のカルシウム法又はハナハン法により行なうととか
てさる。また、形質転換株の培養も、従来の大腸菌の培
養と同様に行なうことかできる。

培養した形質転換株からの本発明のヒトＧＭ−Ｃ：ＳＦ
誘導体の回収、精製は、大腸菌の菌体中に生産されたポ
リペプチドを回収、精製するための常法を用いることか
てきる。例えば、菌体を遠心により回収し、これを適当
な手段により破砕して遠心分離により沈殿を集める。目
的とするポリペプチドはこの沈殿中に回収される。次に
この沈殿物を尿素又は塩酸グアニジンて処理することに
より目的ポリペプチドを可溶化する。次にこのポリペプ
チド溶液をタンパク質精製の常法、例えばイオン交換ク
ロマトグラフィー、液体クロマトクラフィー等を適宜組
み合わせることにより精製することかできる。この具体
例は下記実施例３及び４に記載されている。

上記したように、本発明のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ誘導体はメ
タビロカテカーゼ由来部分を切断することなくそのまま
白血球減少又は骨髄低形成を伴う疾患、例えば後天性免
疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、制ガン剤の副作用あるいは
放射線障害等に対する治療薬として用いることかてきる
。また、本発明のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ誘導体は遊離の状態
で用いることかてきることは言うまでもないか、架橋剤
を用いて架橋し、固定化して用いることかできる。架橋
剤としてはタンパク質の表面に存在するアミノ基やカル
ボキシル基に反応する試薬を用いることかてきる。この
ような試薬の例としてカルボジイミドを挙げることがて
きる。固定化は、例えばプラスチック性の細胞培養器等
のようなプラスチック怜のものに、本発明のヒトＧＭ−
ＣＦＳ誘導体及び架橋剤を含む水溶液を接触させ、例え
ば３０°Ｃて２時間反応させることにより行なうことか
できる。後述の実施例て明らかになるように、この発明
のヒトＧＭ−１１：ＳＦ、９導体は、このような固定化
された状態においてもヒトＧＭ−ＣＳＦ活性を有する。

本発明のヒトＧＭ−Ｃ８Ｆ誘導体を表面に固定化した培
養器中で骨髄細胞を培養すると、骨髄細胞を活性化する
ことかできる。従フて、骨髄移植の際等に、骨髄細胞を
この培養器て培養した後、体内に戻すことによって、活
性化された骨髄細胞を体内に戻すことかできる。

以下、実施例に基づき本発明をさらに具体的に説明する
か、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

［実施例］ ＤＮＡの組換えに関する以下の基本的な操作及び反応は
文献［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）、Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　　　（：］ｏｎｉｎｇ、　　　　八　　
Ｉａｂｏｒａｔ、ｏｒｙ　　　ｍａｎｕａｌ　″。

Ｃ０ＩＦ］　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙｌに従って行なった。制限酵素及び各種修飾
酵素は特に記載かない場合は宝酒造製のものを用いた。

制限酵素反応は付属の説明書に記載しである緩衝液組成
及び反１５条件で行なった。−競゛的には０．１１４−
ｇ〜１００ｇｇのＤＮＡを用い、１０倍濃度の緩衝液を
１０分の１量と酵素１〜１００　Ｕを加え、総量２０〜
↑００ｐ１て３７°Ｃ１１〜２４時間反応を行なった。

制限酵素で切断シタＤ　Ｎ　Ａ　１ｔＪｉ片（：ｌ：　
０．７Ｘ　〜］、５＄のアガロースゲル電気泳動にかけ
て分離した後、目的とする断片を含むハントをゲルから
切り出し、透析チューツ内て電気溶出させた後フェノー
ル抽出を行ないエタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収
した。ＤＮＡ末端の平滑末端化は文献（Ｌ掲）に従い、
大腸菌ＤＮＡポリメラーセＩクレノウ断片又はＴ４ＤＮ
Ａボリメラーセな用いて行なった。５°末端の脱燐酸化
は子ウシ腸アルカリホスファターセ（ＣｉＰ、ヘーリン
カーマンハイへ社製）により、またオリゴヌクレオチド
の５′端燐酸化はＴ４ボリヌクレオチ１〜キリー−ゼに
より、文献（−＋＝　１５）に準じて行なった。ライケ
ーション反応は宝酒造製うイケーションキットを用い付
属の説明書に従って総量２０川１て行なった。大腸菌の
形質転換は塩化カルシウム法又はハナハン法によって行
なった。

参考例１ １１ｔｌＴ−１０２ポリ（Ａ）”　ＲＮＡの調製ヒト成
人Ｔ細胞白血病細胞株＋１１１Ｔ−１０２（ＡＴＣＣ：
より入手可能）を５％ウシ胎児血清を含むＲＰ旧−１６
４０培地中で５％ＣＯ２気流下３７°Ｃて培養し、０．
９ｇの細胞を得た。総量ＲＮＡ及びポリ（Ａ）”ｌ１Ｎ
Ａのｔ’ａ離は−１−掲マニアチスらの文献に準じた。

すなわち、細胞ベレットをクアニシウム溶液（６Ｍクア
ニシウムイソチオシアネート、５ｍＭクエン酩ナトナト
リウムＨ７、ｏ　、　０．５％ザルコシル、０、Ｉ　Ｍ
β−メルカプトエタノール）５ｍ１に懸濁し、ホモシナ
イスした後、ベックマン８Ｗ５Ｓ川遠７１Ｊ竹内の５．
７　Ｍ　ＣｓＣ１，０，１Ｍ　１ｉＤＴ八、ｐ　１１７
　、５水溶液１．５１上に重層し、３５０００　ｒｐｍ
　、　　１５℃、２０時間遠心した。遠心管底部に沈殿
したｍＲＮＡを８０％エタノールで洗浄した後、１０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ　Ｈ７，５，５ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、［ＳＯ８２ｍｌに溶解した。次いてクロロホルム
−ｎ−ツタノール（４：ｌ）抽出、エタノール沈殿後、
水２１に溶解し、２６０　ｎｍの吸光度から［１ｌＲＮ
Ａの濃度を求めた。ｍＲＮＡの収量は２．２　ｒａｇで
あった。これを２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７
，６，０，５Ｍ　ＮａＣｌ、Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０
．］Ｘ　ＳＤＳて飽和したオリゴｄＴセルロース（コラ
ボティフ・リサーチ社製、０．５　ｇ）カラムにかけた
後、吸着したポリ（Ａ）”　ＲＮＡを１０　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５，］　ｍＭＥＤＴＡ、０．
０５Ｘ　ＳＤＳ溶液て溶出させた。これをエタノール沈
殿後、水５０ル１に溶解した。このようにして９３．ｇ
のポリ（Ａ）″ＲＮＡか得られた。

参考例２ ｃＤＮＡライフラリ−の作製 二本鎖ｃＤＮＡの作製はガブラーーホフマンの方法［０
，Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｂ、　Ｊ、　ｌｌｏｆｆｍａ
ｎ、　シーン（Ｇｅｎｅ）　２５：２６３　（１９８：
ｌ）］に準した。ＩＩ　Ｕ　Ｔ　−１０２のポリ（Ａ）
”　ＲＮＡ３　ｇｇから、オリゴ（ｄＴ）１２−１８　
　（ファルマシア社製）２ｋｇをプライマーとして逆転
写酵素（ライフサイエンス社製）　１２．５Ｕと３７°
Ｃて１時間反応させ、−末鎖ｃＤＮＡを合成した。これ
に大腸菌ＲＮａｓｃ　Ｈ（宝酒造社製）　０．８１Ｊ、
大腸菌ＤＮＡポリメラーセにニーインクラン１〜ハイオ
ラボス社製）３０Ｕ、大腸菌ＤＮＡリガーセにューイン
クラントハイオラボス社製）４Ｕを加えて１２°Ｃ，１
時間、続いて２２℃、１時間反応させ二本鎖ｃＤＮＡを
合成した。さらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製
）１．５　Ｕを加えて３７°Ｃ１１０分間反応させ、平
滑末端化した後、リン酸化したＥｃｏＲＩ　リンカ−（
ＧＧＡＡＴＴＣＣ１宝酒造社製）を付加し、ａｒｐ処理
したｐｕｃ９のＥｃｏＲＩ　ＰＪ片とライヶーション反
応を行なった。得られたライヶーション混合物て大腸菌
χ１７７６の形質転換を行ない、形質転換菌を５゜ｐ−
ｇ／ｒｎ！のアンピシリン含有χ培地３００　ｍｌ中て
３７℃て一晩培養して増幅した後、一部を１５％りリセ
ロール溶液として一８０℃て保存した。

参考例３ スクリーニング ｃＤＮＡ含有形質転換菌の凍結グリセリン保存液２０川
１を、χ１７７６用培地て５０００倍希釈し、希釈溶液
１００．１をアンピシリン含有χ１７７６用寒天培地プ
レート上に鐙いたニトロセルロースの上に広げ、３７°
Ｃで一晩培養した。ニトロセルロース上のコロニーを２
枚のニトロセルロース上に移した。このレプリカをχ１
７７６用培地上で３時間培養した後、２００　ｇ　ｇ／
ｌクロラムフェニコール含有培ｍ−ｈに移し、さらに−
晩培養した。フィルターを順次５分間づつ１０％ＳＤＳ
水溶液、アルカリ変性溶液（０，５Ｎ　Ｎａ０１１．１
．５　Ｍ　Ｎａ１ｌ）　、中和溶液（１，５Ｍ　ＮａＣ
ｌ、０．５　Ｍ　’ｒｒｉｓ−ＨＣ１，ｐＨ８，０）　
ｈに置いた後、８０°Ｃ１３時間加熱処理した。

スクリーニング用の合成オリゴヌクレオチトプローフと
して、５゛末端なＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い
て３２ｐ標識した５’−ＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡ
ΔＡＴＡＡＡＴ−３’を用いた。このプローブは、ヒト
・ＧＭ−Ｃ３Ｆ　ｃＤＮＡの３′非翻訳領域に存在する
ＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡという配
列とハイブリダイズする。このプローブを用いて先に調
製したレプリカフィルターとハイフリタイゼーションを
行なった。ハイフリタイゼーションの条件は５　ｘ　５
ＳＣ１１０ｘデンハルト溶液、０．１Ｘ　ＳＤＳ溶液中
３２°Ｃ１１６時間、洗浄の条件は６　ｘ　５ＳＣ１０
，１ｘ　ＳＤＳ溶液中、３２６Ｃ，１時間を採用した。

スクリーニングの結果得られた陽性クローンについて、
ジデオキシ法により塩基配列を決定した結果、５個のク
ローンかＧＭ−Ｃ３Ｆをコートしていた。これらの中て
−・番長いｃＤＮＡを有するクローンｐＴｌについてそ
の制限酵素地図と全塩基配列を第４図に示す。なお、プ
ラスミドＰＴＩを用いて形質転換した大腸菌ニジエリシ
ャ・コリＲＲＩ／ｐＴ１は工業技術院微生物工業研究所
（機工研）に寄託されており、その受託番号は機工研菌
寄第１０１６６号である。

実施例１ プラスミドｐＭＧＭｌの作製（第１図）プラスミドｐ７
１１０μｇを１．０ＯＵのＰｓｔｌ。

次いで１００ＵのＮｃｏＩて切断し、ヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ
をコートしている約５００　ｂｐのｃＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動にかけた後単離した。このＤＮＡ断
片２１１．ｇをＴ４ＤＮＡポリメラーゼて平滑末端化し
た後Ｃ１ａＩリンカ−（ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧ、ファル
マシア社製）を付加し、さらにフレノウ断片て平滑末端
とした。

一方、メタピロ力テカーゼのＮ末端１２アミノ酸残基を
含む発現ベクターｐＭＫ３　（特願昭６：ｌ−１６４９
３５号記載）Ｉｇｇを、ＩＯＵの５Ｉｌａ１．次いてＩ
ＯＵのＰｓｔｌて切断した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
処理し、セルフライゲーションを行ないｐＭＫ６を作製
した。ｐＭＫ６０．２＃ｇを２ＵのＥｃｏＲＶて切断し
た後ＣＩＰ処理し、これと上記て作製したＧＭ−Ｃ３Ｆ
を含むｃＤＮＡ断片０．１　ｐｇをライゲーションさせ
た後、大腸菌ＪＭＩ０３の形質転換を行ない、１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリン含有寒天培、＃！！１で培養し
た。形質転換体コロニーをＬフロス中で培養してから、
アルカリリシス法によりプラスミドを単離し、制限酵素
切断（ＥｃｏＲｌ　、　ｔ（ｉｎｄｍ　）により目的と
するプラスミドであることを確認したち・のについて、
さらに融合部分の塩基配列を決定して、フレームか合っ
ていることを確認した。融合部の塩基配列及びアミノ酸
配列を第５図に示す。

なお、融合部以外の部分は、第２図に示したメタピロカ
テカーゼのＮ末端第１番目から第１２番目までのアミノ
酸をコートする塩基配列及び第３図に示したヒトＧＭ−
Ｃ３Ｆの第１８番目から第１４４番目のアミノ酸をコー
ドする塩基配列を有していた。このようにして得られた
プラスミドをｐＭＧＭｌと命名した。なお、この工程は
第１図に示されている。

上記から明らかなように、このプラスミドｐＭＧＭ１は
、メタピロカテカーゼのＮ末端１２アミノ酎、７アミノ
酎から成るリンカ−ペプチド、１２７アミノ酸から成る
成熟ＧＭ−Ｃ３Ｆポリペプチドの計１４６アミノ酸から
成る融合ポリペプチドをコートする遺伝子を、ｔａｃプ
ロモーター／オペレーター、メタビロカテカーゼＳＤ配
列の制御のもとて、大腸菌内て発現することのてきるプ
ラスミドである。

実施例２ ｐＭＧＭ３の作製（第１図） ｐＴＭＣ３２（特開昭６１．−２５７１８７）　２ＪＬ
ｇを２０１ＪのＸｈｏｌて切断し、フレノウ断片で平滑
末端化した後、ＣＩＰ処理してベクタープラスミドを作
製した。これと実施何重て作製したＧＭ−Ｃ８Ｆを含む
ｃＤＮＡ断片［＋、Ｉ　ＩＬｇをライゲーションさせた
後、実施例１と同様にＪＭ１０３株の形質転換を行ない
、目的とするプラスミドを得た。融合部の塩基配列及び
アミノ酸配列を第５図に示す。なお、融合部以外の部分
は、第２図に示したメタピロカテカーゼのＮ末端第１番
目から第９４番目までのアミノ酸をコートする塩基配列
及び第３図に示したヒトＧＭ−Ｃ３Ｆの第１８番目から
第１４４番目のアミノ酸をコートする塩基配列を有して
いた。得られたプラスミドをｐＭＧＭ３と命名した。な
お、この工程は第１図に示されている。

なお、上記から明らかなように、プラスミドｐＭＧＭ３
は、メタピロカテカーゼのＮ末端９４アミノ酸、８アミ
ノ酸から成るリンカ−ペプチド、１２７アミノ酸から成
る成熟ＧＭ−Ｃ３Ｆポリペプチドの計２２９アミノ酸か
ら成る融合ポリペプチドをコートする遺伝子を、ｔａｃ
プロモーター／オペレーター、メタピロカテカーゼＳＤ
配列の制御のもとて、該ポリペプチドを大腸菌内て発現
することのてきるプラスミドである。なお、プラスミド
ｐＭＧＭ３を含有する大腸菌ニジエリシャ・コリＪＭ１
０３／ｐＭＧＭ３は機工研に寄託されており、その受託
番号は機工研菌寄第１０１６５号である。

比較例１ ｐＭＧＭ３ａの作製（第１図） ｐＭＧＭ３１　ＪＬｇをＩＯＵのＡｐａｌ及びＩＯＵの
５ａｉｌて処理して、フレノウ断片を処理後、セルフラ
イゲーションを行なった。この結果、成熟ＧＭ−Ｃ３Ｆ
の７４番目以降のアミノ酸配列か欠失し、代わりにＴｒ
ｐＴｈｒΔｒｇＡｓｎＳｅｒの５個のアミノ酸が加わっ
た融合ポリペブチ１〜を発現するプラスミドｐＭＧＭ３
ａが得られた。なお、この工程は第１図に示されている
。

実施例３ 遺伝子産物の発現 実施例１、実施例２、比較例１て作製した大腸菌形質転
換体ＪＭ１．Ｄ３／ｐＭＧＭ１、ＪＭｌ［１３／ｐＭＧ
Ｍ３、Ｊ旧０３／ｐＭＧＭ３ａを１００　ｇｇ／＋ｕｌ
アンピシリン含有Ｍ９ｎ＋Ｅ培地（０、６％　ＮａＨＰ
Ｏ４，０，３Ｘ　ＫＨ２ＰＯ４，０，［］５５％Ｎａ１
ｌ、（］、１１％ＮＨＪＩ、　２　’ｍＭ　’ＭｇＳＯ
４，０，２ｚグルコース、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ２．０
．ｌＸ酵母エキス）４ｍｌに植菌し、３７０Ｃて一晩振
盪培養した。この培養液２１を４０＋ｎｌの１．００　
ＪＬｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地（１％ハクトド
リプトン、０．５ｚハクト酵母エキス、１％ＮａＣ１）
に加え、３７℃て１時間振盪培養し、さらにこの４０ｍ
１の培養液のうち１０ｍ１を５００ｍ１の同培地に加え
３７℃て振盪培養した。４時間後、終濃度か１ｍＭにな
るようにＩＰＴＧを添加し、さらに５時間培養した。培
養液を５０００　ｒｐｍ、　　ｌ　０分間、４°Ｃて遠
心分離することにより菌体を集めた。沈殿を５１１　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ｆｌ：ｌ、５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、
１５％ショ糖、２　ｍＭ　ＰＭＳＦ（フェニルメチルス
ルホニルフロリド）　、　ｐＨ８，０（以ド、ＴＳＢと
略す）に溶かして再び遠心した後、少量のＴＳＢに溶か
して超音波処理を行ない菌体を破砕した。破砕液を１２
０００ｒｐｍ　、　４°Ｃ１３０分間遠心分離を行ない
沈殿物（不溶画分）と」二清（可溶画分）を得た。沈殿
物は、８Ｍ尿素を加えて室温で５〜６時間攪拌すること
により可溶化した。沈殿物と上清について５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行なった。得られたゲル
パターンを第６図（Ａ）に示す。いずれも不溶画分てあ
り、士、−はＩＰＴＧ誘導の有無を表わす。沈殿物にの
み、融合ポリペブチ１〜に期待される分子量の位置にハ
ントか認められた。第６図（Ａ）に示すように、これら
のハン）〜はＩ　ＰＴＧを添加して誘導をかけた場合に
現われることから、このバンドは融合ポリペプチドに由
来するものであることか示された。このようにしてＩＩ
Ｌの培養液当り約３００　［１１ｇの融合ポリペブチ１
〜か得られた。

実施例４ 融合タンパク質の精製 実施例３て得られた沈殿物を８Ｍ尿素で可溶化した後、
タンパク質濃度が０］〜１１．５　ｍｇ／＋ｎｌになる
ように、リフォールデインク溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−
）１ｃＩ、］　ｍＭ　ＥＤＴＡ、２　ｍＭ還還元型クル
タイオン０．２　ｍＭ酸化型タルタチオン、３Ｍ尿素、
ｐｌ＋８．０）で希釈し、２５°Ｃ２２４時間マクネチ
ックスターラーて攪拌した。この溶液を、リフオールデ
、インク溶液て平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−
６Ｂ　　（ファルマシア社製）カラムに吸着させた。同
カラムをりフォールディング溶液で十分洗浄した後、０
〜０．３ＭのＭａｉｌの濃度勾配をかけた溶出液て溶出
を行なった。目的とする融合ポリペプチドは０　、１５
〜０．２５　Ｍ　ＮａＣ１の濃度範囲て溶出されてきた
。溶出液をアミコンで濃縮した後、５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動にかけ、クマシーフルーで染色し
た。得られたゲルパターンを第６図（Ｂ）に示す。いず
れも期待される分子量の位置にハンドか認められた。こ
の図かられかるように、精製されたものは、融合ポリペ
ブチ１〜９０％以］−から成る標品であることか示され
た。

実施例５ 融合タンパク質の骨髄細胞増殖促進活性ヒ１〜ＧＭ−Ｃ
３Ｆによって増殖促進を起こすことか知られているヒ１
へ細胞株ＫＧ−１細胞（文献及び入手先：　Ｋｏｅｆｆ
ｌｅｒ、　１１．Ｐ、及びＧｏｌｄｃ、　Ｄ、Ｗ、、　
５ｃｉｅｎｃｅ２［］０；　１１５：ｌ−１１５４（１
９７８）　、　Ａ　Ｔ　ＣＣより入手）を、１２．５％
ウシ胎児血清を含むＲＰＭＴ−１６４０培地に］　ｘ　
１０”／ｍｌの濃度の調製し、９６六マイクロタイター
プレートに］　ｘ　１０’／ウエルになるように蒔いた
。各ウェルに５倍希釈系列の試料を加え、液量を１２５
．１　として３７°Ｃ１５％Ｃｏ２−９５％空気、湿度
１００ｚて４８時間培養を行なった。培養終了の１時間
前に０．２５ルＣｉ／ウエルの３Ｈ標識チミジンてパル
スして、　ＫＧ−１細胞に取り込まれる放射活性を測定
した。結果を第７図に示す。第７図中、縦軸は′］Ｈ−
チミジン取り込み量を、横軸は試料の希釈度を示す。（
Ａ）は遊離の融合ボリベプチトの、（Ｂ）は後述する固
定化融合ボソベブチ１へについての結果を示す。第７図
（Ａ）に示すように、融合ポリペプチドＭＧＭ３はＫＧ
−］のチミジン取り込みを増強した、すなわち増殖促進
活性を示したか、ＧＭ−Ｃ８Ｆ部分を欠失したＭＧＭ３
ａにはそのような活性はみられなかった。また、融合ポ
リペプチドＭＧＭＩもＭＧＭ３と同様の増殖促進活性を
示した。

実施例６ 融合ポリペプチドの分化誘導活性 」二記て得られた各融合ポリペプチドか、前骨髄細胞の
分化誘導能を有しているかどうかを調べるため、前骨髄
性白血病細胞株旧、−６０細胞（文献及び入手先　Ｃｏ
１１ｉｎｓ、　Ｓｌ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　２７０゜３４
７−３４９　（１９７７）、ＡＴＣＣより入手可能）を
用いたアッセイを行なった。ＩＩＬ−６０細胞株は分化
誘導因子を作用させると活性酸素発生能を有する細胞へ
と分化することか知られている。活性酸素発生能はニト
ロブルーテトラゾニウム（ＮＥＴ）の遺元能を測定する
ことによって調べることかできる６９６穴マイクロタイ
タープレートに１０％つシ胎児血清、ＲＰＭＩ培地中終
濃度］　ｘ　１０’／ｎｌの濃度に調製し、５倍希釈系
列の試料を加えて、液量を１２５　川ｌとして、３７８
Ｃ１５％Ｃ０２〜９５％空気、湿度１００ｚて７２時間
培養を行なった。

７２時間後終濃度１４ｇ／ｍｌのホルボールミリステー
１〜アセテートを加えてさらに２時間、次いて終濃度］
　Ｂ／ｍｌのＮＢＴを加えて３０分間培養を行なった。

第８区にＮＢＴて染色された細胞、すなわち分化して活
性酸素を発生ずるようになった細胞の割合を示す。第８
図中、縦軸はＮＢＴ還元能を示す細胞の割合を、横軸は
試料の希釈度を示す。また、（Ａ）は遊離の融合ポリペ
プチドについての結果を、（Ｂ）は後述する固定化融合
ポリペプチドについての結果を示す。第８図（Ａ）に示
すように、の融合ポリペプチドＭＧＭＩとＭＧＭ３はＨ
Ｌ−６０の分化誘導能を有していたが、ＧＭ−Ｃ８Ｆ欠
失体ＭＧＭ３ａはこの活性を示さなかった。

実施例７ ＧＭ−Ｃ３Ｆ融合ポリペプチドの固定化融合ポリペブチ
ｌ＝：ＭＧＭ３を含む水溶液（９０μｇ／ｍｌ）から１
０倍希釈系列の溶液を調製し、９６穴マイクロプレート
ウエルに分注した。各々ニ１３０　ｇｇ／ｌとなるよう
にｌ−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）
−カルボジイミトメ）−ｐ−）ルエンスルホネート水溶
液を加え、３０°Ｃ１２時間反応させた。ウェルな水で
２回洗浄してから、水をよく切り、減圧乾燥させた後、
紫外線ランプ照射により殺菌し、ＧＭ−Ｃ５Ｆ融合ポリ
ペプチド固定化培養器を調製した。

実施例８ ＧＭ−Ｃ３Ｆ融合ポリペプチド固定化培養器を用いた細
胞培養 実施例７て調製したＧＭ−Ｃ３Ｆ融合ポリペプチド固定
化培養器の各ウェルに、培地１００Ｊｉｌに懸濁した］
　ｘ　１０’個のＫＧ−１細胞を分注し、３７６Ｃ１５
％ＣＯ２存在下４８時間培養した。実施例５と同様の方
法で　３Ｈ−チミジン取り込みを測定し、第７図（Ｂ）
のような結果を得た。次に同し培養器を用いて細胞を除
去後十分洗浄し、新しいＫＧ−１細胞を入れ、同様に３
Ｈ−チミジン取り込みを測定したところ、若干取り込み
量は減少するものの同様の取り込みか認められた。すな
わち、固定化された融合ポリペプチドもＫＧ−１細胞の
増殖促進活性を有すること、また、固定化培養器は繰り
返し使用可能であることか示された。

また、固定化培養器の各ウェルにＨＬ−６０細胞１　ｘ
　１０’個を入れ、実施例６と同様の方法でＮＢＴ還元
能を測定したところ、第８図（Ｂ）に示すように融合ポ
リペプチドと同様の活性を示し、固定化したものてもＩ
ＩＬ−６０の分化誘導能を有することが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例のプラスミドｐＭＧＭ］及び
ｐＭＧＭ３並びに比較例のプラスミドｐＭＧＭ３ａの作
製法を示す図、 第２図はメタピロカテカーセ構造遺伝子の塩基配列とコ
ートするポリペプチドのアミノ酸配列を示す図、 第３図はヒトＧＭ−Ｃ８ＦのｃＤＮＡの塩基配列とコー
ドするポリペプチドのアミノ酸配列を示す図、 第４図はプラスミドｐＴ１の構造を示す図、第５図はメ
タピロカテカーゼとＧＭ−Ｃ３Ｆの融合部分の塩基配列
及びアミノ酸配列を示す図、第６図は、大腸菌による発
現産物及び精製標品の５ｔ）Ｓ−ＰＡＧＥによるゲルパ
ターンを示す図、第７図は、ＫＧ−］細胞の増殖促進活
性を示す図、 第８図はＩＩＬ−６０細胞の分化誘導活性を示す図であ
る。 特許出願人　財団法人相模中央化学研究所ＤＫＬ Ｅ：　Ｅｃｏ　１：２１ ＴへＡΔＧＴＴＣＴＣＴＧＧへＧＧ ＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＡＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧ
ＡＴＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＣＴＧＡＧ
ＧＡＴＧ（ＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡ
ＧＣＴＴ（：Ｔ＾ＡＧＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＣＧＧＧ
ＧＡＧＣＴＧＣＴＣＴＣＴＣＡＴ：ＴＣＡＴＣＴＴＧＧ
ＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＧＧＴＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣ合 卑　叔 ４　敗

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）メタピロカテカーゼのＮ末端側のポリペプチドの
   Ｃ末端にヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子活
   性を有するポリペプチドが結合された、ヒト顆粒球マク
   ロファージコロニー刺激因子の生物活性を有するヒト顆
   粒球マクロファージコロニー刺激因子誘導体。 （２）メタピロカテカーゼのＮ末端側のポリペプチドが
   メタピロカテカーゼのうちＮ末端から始まる２個以上の
   アミノ酸残基から成るポリペプチドである請求項１記載
   の誘導体。（３）メタピロカテカーゼのＮ末端側のポリ
   ペプチドがメタピロカテカーゼのＮ末端第１番目のメチ
   オニンから第１２番目のグルタミンまでのアミノ酸から
   成る請求項２記載の誘導体。 （４）メタピロカテカーゼのＮ末端側のポリペプチドが
   メタピロカテカーゼのＮ末端第１番目のメチオニンから
   第９４番目のグルタミンまでのアミノ酸から成る請求項
   ２記載の誘導体。 （５）ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子活性
   を有するポリペプチドは、ヒト顆粒球マクロファージコ
   ロニー刺激因子の第１８番目から第１４４番目までのア
   ミノ酸から成る請求項１ないし４のいずれか１項に記載
   の誘導体。 （６）固定化された形態にある請求項１ないし５のいず
   れか１項に記載の誘導体。 （７）請求項１ないし５のいずれか１項に記載のヒト顆
   粒球マクロファージコロニー刺激因子誘導体をコードす
   るＤＮＡ領域を有し、該誘導体を発現することができる
   発現ベクター。 （８）ｔａｃプロモーター／オペレーター及びメタピロ
   カテカーゼのＳＤ配列を含有する請求項７記載の発現ベ
   クター。 （９）ｐＭＧＭ１又はｐＭＧＭ３である請求項８記載の
   発現ベクター。