JPH0279976A - α−エンドルフィン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、α−エンドルフィンの遺伝子組換え法による
新規な製造方法およびそれに係わる組換えプラスミド、
形質転換株、融合タンパク質に間する。

α−エンドルフィンは、１６個のアミノ酸より構成され
るモルヒネ様生理活性を有するペプチドであり、下記ア
ミノ酸配列を有する。

α−エンドルフィン：　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈ
ｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
−Ｇｌ　ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａ　ｌ　−Ｔ
ｈｒ本発明の新規組換えプラスミドｐＥＮＤＡ１は。

第１図において示されるＤＮＡ配列を有する０本発明は
２発酵工業、医薬品工業等の分野に好適である。

［従来の技術］ α−エンドルフィンは２モルヒネ様生理活性を示すエン
ドルフィン類に属するペプチドであり。

ロイシンエンケファリンの約８倍、メチオニンエンケフ
ァリンの約５倍の鎮痛活性を示す興味深い生理活性ペプ
チドである。

本発明の技術的背景としては、いわゆる遺伝子操作技術
がある。しかしながら、遺伝子操作を利用した効率のよ
いα−エンドルフィンの製造方法に関しては、知られて
いない。

既に１本発明者らは、大腸菌由来のジヒドロ葉現用プラ
スミドベクターｐＴＰ７０−１　（特願昭６１−３１２
８３６＞と、それを利用した融合遺伝子の作成方法（特
願　昭６２−３０２１５３）を開発している。また、ｐ
ＴＰ７０−１にメチオニンエンケファリン（、以下、Ｍ
ＥＫと略す、）を暗号化する化学ＤＮＡを組み込んで、
ＭＥＫの効率よい生産方法を開発している（特願　昭６
３−７９６８０）、効率のよいＭＥＫの生産方法を開発
する際に得られた組換えプラスミドｐＭＥＫ２は、制限
酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏ１部位の間の配列を異種ＤＮＡ
と取り替えるだけで、ＤＨＦＲとの融合遺伝子を容易に
作成できる。また、ｐＭＥＫ２を利用して融合遺伝子を
作成した場合、融合遺伝子の発現の結果得られる融合タ
ンパク質の大Ｉｌｌ菌菌体の蓄積量としては、全閉体タ
ンパク質の約２０％が期待される。しかしながら、α−
エンドルフィンの生産に上記発現ベクターを用いた例は
ない。

［発明の目的コ 本発明の目的は、遺伝子操作の手法を用いたα−エンド
ルフィンの大量生産方法を開発することにある。

本発明者らは、上記の知見を利用し、鋭意研究の結果、
α−エンドルフィンを暗号化する遺伝子を設計・化学合
成し、　　ｐＭＥＫ２に組み込むことにより、α−エン
ドルフィン遺伝子とＤＨＦＲ遺伝子との融合遺伝子を作
成し、融合遺伝子を大腸菌で発現させることにより、Ｄ
ＨＦＲ−α−エンドルフィン融合タンパク質（以下、融
合タンパク質と略す。）を大量に生産できることを見い
だし。

さらに、融合タンパク質を用いることにより効果的にα
−エンドルフィンを作成できることを明らかにし９本発
明を完成させた。

［発明の構成］ 本発明は、（１）融合タンパク質の大量発現を可能にす
る新規組換えプラスミドｐＥＮＤＡ１゜ｐ　Ｅ　Ｎ　Ｄ
　Ａ−１を含有する大腸菌が生産する融合タンパク質、
（４）ｐＥＮＤＡｌを含有する大Ｉｌｌ菌からの融合タ
ンパク質の分離精製方法、および（５）融合タンパク質
を用いたα−エンドルフィンの製造方法、の発明により
構成される。

（１）新規組換えプラスミドｐ　ＥＮＤＡ　１第１図は
２本発明のｐＥＮＤＡｌの全塩基配列を示している。図
は、２本鎖環状ＤＮＡのうち片方のＤＮＡｆｉ配列だけ
を、プラスミド中に２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａ１部
位のうち制限酵素Ｈｉｎｄｍ部位に近い方の切断認識部
位、　５’−ＡＴＣＧＡＴ−３’、の最初の゛Ａ″を１
番として数えて、５′末端から３”末端の方向に記述し
ている。本発明のｐＥＮＤＡＩは、新規な組換えプラス
ミドである。

ｐＥＮＤＡＩは、４８７３塩基対の大きさであり。

宿主である大腸菌にトリメトプリムおよびアンピシリン
耐性を付与することができる。ｐＥＮＤＡｌは、ｐＭＥ
Ｋ２　（特願　昭６３−７９６８０に記載。）のＢａｍ
ＨＩとＸｈｏ１部位の間のＭＥＫを暗号化する配列を含
む２６塩基対の配列を。

α−エンドルフィンを暗号化する配列を含む５９塩基対
の化学合成りＮＡと置き換えた構造をしている。第１図
において、５３３番目から５９１番目迄の配列が化学合
成りＮＡ由来の配列である。

それ以外の配列がｐＭＥＫ２由来の配列である。

第１図の５７番目から５８８番目まで配列は。

ＤＨＦＨのカルボキシ末端側にα−エンドルフィンがア
ルギニン（Ａｒｇ）を介して結合した融合タンパク質を
暗号化している。

融合タンパク質を暗号化する配列の上流には。

遺伝子の発現を効率良く行わせる配列が存在する（特願
　昭６１−３１２８３６＞　、即ち、４３番目から５０
番目までの配列がＳＤ配列と呼ばれるもので、効率の良
い翻訳に、また、４６３１６３１番目６５９６５９番目
、コンセンサス転写プロモーターであり、効率の良い転
写に貢献する。このことから、ｐＥＮＤＡｌは、大腸菌
に導入された場合τ、１多量の融合タンパク質を作らせ
ることが１１「 積する。このことによって、ｐＥＮＤＡｌを含有する大
腸菌はトリメトプリム耐性を示すようになる。また、ｐ
ＥＮＤ八１はへｐＭＥＫ１由来の。

アンピシリン耐性遺伝子を有している。このことから、
ｐＥＮＤＡｌが導入された大腸菌は、アンピシリン耐性
をも示す、ｐＥＮＤＡｌは、大腸菌に導入されて安定状
態に保たれ、ｐＥＮＤＡｌを含有する大！ｌｉ菌は、微
工研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０２８として寄託されてい
る。

このような特長を有するｐＥＮＤＡｌは、実施例１に従
って作成することができるが１組換えプラスミドの作成
方法によって本発明が制限されるものではない。

（２）ｐＥＮＤＡｌを含有する大腸菌 ｐＥＮＤＡ１を含有する大腸菌は、トリメトプリム及び
アンピシリンに対して耐性を示す。ｐＥＮＤＡＩを含有
する大腸菌は、融合タンパク質遺伝子の効率のよい発現
の結果、融合タンパク質を菌体内に可溶性の状態で大量
に蓄積する。ｐＥＮＤＡＩを含有する大腸菌をＹ　Ｔ　
＋　Ａ　ｐ　ｔｆ！地（培地１１中に、５ｇのＮａＣ１
，８ｇのトリプトン。

５ｇのイーストエキス、及び５０ｍｇのアンとシリンナ
トリウムを含む液体培地）を用いて、３７℃で定常期ま
で培養した場合、蓄積する融合タンパク質は、菌体タン
パク質の約２０％に達する。

培養菌体を、リン酸緩衝液などの適当な緩衝液に懸濁し
、フレンチプレス法もしくは音波破砕法で破砕し、これ
を遠心分離法により上清と沈澱に分離した場合、全ての
融合タンパク質は上溝中に回収される。ｐＥＮＤＡｌを
含有する大腸菌は、微工研にＦＥＲＭ　　ＢＰ−２０２
８として寄託されている。

（３）！！に合タンパク質 第２図は、　融合タンパク質を暗号化する部分のＤＮＡ
配列とそれから作られると予想されるタン″′Ｉｔ バク質の、アミノ酸配列を示している。融合タンパ９番
目までの配列が、大腸菌の野生型ＤＨＦＲに１箇所アミ
ノ酸置換置換が起こった（　Ｃｙｓ−１５２（ｖｉＩｄ
　ｔｙｐｅ）　→Ｇｌｕ−１５２）配列であり、１６２
番目から１７７番目までがα−エンドルフィンの配列で
ある。α−エンドルフィンの配列の直前のアミノ酸はア
ルギニン（Ａｒｇ）である、α−エンドルフィンはアル
ギニンを含まない。このことから。

融合タンパク質をフルギニルエンドペブチダーゼ（Ａｒ
ｇｉｎｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、市販品として
人手可能）で処理することにより特異的に切り出すこと
ができる。１６０と１６１番目のイソロイシン（Ｉｔｅ
）−ロイシン（Ｌｅｕ）の配列は、ｐＭＥＫ２の９ｇｍ
Ｈ１部位にα−エンドルフィンを暗号化するＤＮＡを導
入する際に、遺伝暗号の読み取り枠を合わせるために生
じた配列である（ｐＭＥＫ２のもとどなったｐＴＰ７０
−１が作るＤＨＦＲは、１６２個のアミノ酸よりなり、
第２図の融合タンパク質のアミノ酸配列のうち、アミノ
末端側から数えて、ｌから１６０番目までの配列に、　
Ｇｌｎ−ｌ　１ｅの２個のアミノ酸配列が結合した配列
をしている。）、融合タンパク質およびα−エンドルフ
ィンの分子量は、それぞれ２０，０２２およびｌ。

７４５である。

融合タンパク質は、新規なタンパク質である。

融合タンパク質はＤＨＦＲのカルボキシ末端側に。

α−エンドルフィンが融合した構造をしているにもかか
わらず、ＤＨＦＲ酵素活性を有する。このため、大腸菌
が融合タンパク質を多量につくると。

ＤＨＦＲの阻害剤であり抗細苗剤であるトリメトプリム
に対して、耐性を示すようになる。

（４）融合タンパク質の分離精製 本発明の融合タンパク質の分離精製法は、■面体の培養
、■菌体の破砕、■ＤＥＡＥ−）ヨパール力うム処理、
■メソトリキセー）　（ＭＴＸ）結合アフィニティクロ
マトグラフィー、および■Ｄ■面体の培竺１ ｐＥＮＤＡｌを含有する大腸菌の培養は、　　ＹＴ＋Ａ
ｐ培地（培地１１中に、５ｇのＮａＣ１，８ｇのトリプ
トン、５ｇのイーストエキスおよび５０ｍｇのアンピシ
リンナトリウムを含む液体培地。

）で培養することができる。培地としては、この他にＳ
Ｔ＋Ａｐ培地（培地ｌｌ中に、２ｇのグルコース、１ｇ
のリン酸２カリウム、５ｇのポリペプトン、５ｇのイー
ストエキスおよび５０ｍｇのアンピシリンナトリウムを
含む液体培地。）など。

菌体が成長する培地であれば、どの様な培地でも用いる
ことができるが、調べた限りでは、ＹＴ＋Ａｐ培地が最
適であった。

ｐＥＮＤＡｌを含有する大腸面を、培地に接種し、３７
℃で対数成長期の後期もしくは定常期まで培養する。培
養した菌体は、５，０００回転／分の遠心分離により集
める。培地１１より湿重量２から５ｇの菌体が得られる
。

ＥＡＥ−）ヨパール力ラムクロマトグラフィーの過程よ
り成り！立っている。

川 て行う。

■菌体の破砕 培養して得られた菌体を、湿重量の３倍の緩衝液１　（
０，１ｍＭ　　エチレンジアミン４酢酸ナトリウム（Ｅ
ＤＴＡ）を含む］０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７
，０）に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体な破砕す
る。菌体破砕液を、３５゜０００回転、１時間超遠心分
離し、上清を得る（無細胞抽出液）。

■ＤＥＡＥ−トヨバールカラム処理 無細胞抽出液を、あらかじめ５０ｍＭのＫＣＩを含む緩
衝液ｌで平衡化したＤＥＡＥ）ヨパール力ラムにかけ、
カラム容量の５０ｍＭのＫＣＩを含む緩衝液１でカラム
を洗う、酵素の溶出は、緩衝液１を用いて０．１Ｍから
０．３ＭのＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行い、溶出液
を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分画する
。酵素の溶出は、０．３ＭのＫＣＩを含む緩衝液１を用
いて行う。溶出液を一定量ずつフラクションコレ集菌お
よびこれ以後の操作は、特に断わらない限り低温（０か
ら１０℃の間、４℃が望ましい）■ＭＴＸ結合アフィニ
ティクロマトグラフィー上記の操作により得られた酵素
液を、あらかじめ緩衝液１で平衡化したＭＴＸＭ合アガ
ロース−７フイニテイカラムに吸着させる。吸着後、Ｉ
ＭのＫＣＩを含む緩衝液２　（０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８゜５）で
洗う、洗いは、カラムからの溶出液の２８０ｎｍの吸光
度を測定し、吸光度が０．１以下になるまで同緩衝液を
流し続ける。酵素の溶出は。

ＩＭのＫＣＩと３ｍＭの葉酸を含む緩衝液２を用いて行
い、溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用い
て分画する０分画した溶出液についてＤＨＦＲ活性を測
定し、酵素活性が含まれる画分を集める。得られた酵素
液を、緩衝液ｌに対して、３回透析する。この段階で、
純度９５％以上の融合タンパク質が得られる。

■ＤＥＡＥ−）ヨバール力ラムク口マトグラフィ透析し
た酵素液を、あらかじめ緩衝液１で平衡化したＤＥＡＥ
−）ヨパール力ラムに吸着させる。

吸着後、５０ｍＭＫＣＩを含む緩衝液ｌて洗う。

酵素の溶出は、！１衝液ｌを用いて５０ｍＭから０．３
ＭのＫＣＩの直線濃度勾配を用いて行い。

溶出液を一定量ずつフラクションコレクターを用いて分
画する０分画した溶出液について２８０ｎｍの吸光度と
ＤＨＦＲＨＦ上を測定する。

酵素活性／２８０　ｎｍの吸光度の値が、一定な画分を
集める。

以上の操作により、融合タンパク質の高度精製均一化を
、再現性良く行うことができる。

本発明に従うと、融合タンパク質の精製は９Ｍ体の培養
を含めて一週間以内に行うことができ。

回収率５０％以上で、均一な酵素標品を得ることができ
る。

ＤＨＦＲ酵素活性は２反応液　（０，０５ｍＭのジヒド
ロ葉酸、０．０６ｍＭのＮＡＤＰＨ，１２ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール、、５０ｍＭのりン酸１１衝液（’
可Ｈ７，０））を、１ｍｌのキュベ１′；川 トリルの濃度勾配を用いて溶出・分離する。溶出ｌユニ
ットは、上記反応条件において、１分間に１マイクロモ
ルのジヒドロ葉酸を還元するのに必要な酵素量として定
義する。この測定は９分光光度計を用いて容易に行うこ
とができる。

（５）融合タンパク質を用いたα−エンドルフィンの製
造 精製した融合タンパク質からのα−エンドルフィンの切
断・分離は、アルギニルエンドペプチダーゼ（Ａｒｇｉ
ｎｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、市販品として入手
可能）で処理することにより行う。精製した融合タンパ
ク質１重量に対して、アルギニルエンドペプチダーゼ０
．０１重量の割合で加え、３７℃で５０ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＭＣＩ緩衝液、ｐ）（８，５中。

２４時間処理する。反応液に等量の６０％酢酸を加える
。この試料を、ＨＰＬＣ装置（島津ＬＣ−４Ａ、１ｎｅ
ｒｔｓｉｌ−００５カラム）を用いて、０．１％トリフ
ルオロ酢酸中、１５％から５０％のアセトニ後Ｉ　ＨＰ
　Ｌ　、ｐ、、ｑ分離・精製することにより、約Ｏ０出
することができる。第３図は、アルギニルエンドペプチ
ダーゼ処理した融合タンパク質試料の高速液体クロマト
グラムを示している。試料注入後約１５分後のピークが
α−エンドルフィンである。

このピーク画分を分離する０分離した溶出液をエバボレ
ーターで乾燥後、少量の水を加え凍結乾燥し溶媒を除き
、α−エンドルフィンを得ることができる。また、得ら
れたペプチドを酸加水分解後。

アミノ酸分析することによりアミノ酸組成を確かめるこ
とができる。

本発明の実施例においては、３１の培地から湿重量的１
０ｇの菌体が得られ、この菌体く計算上。

約２３０ｍｇの融合タンパク質、約２０．０ｍｇのα−
エンドルフィンを含む、）から、約１２６ｍｇの融合タ
ンパク質（収率、５５％、計算１約１１ｍｇのα−エン
ドルフィンを含む、）を精製して得ることができ、この
うち、２０ｍｇの融合た。

［発明の効果コ 本発明の、新規プラスミドｐＥＮＤＡ１およびｐＥＮＤ
Ａｌを含有する大腸菌を用いることにより、融合タンパ
ク質を容易にかつ高収率で分離精製することが得られる
こと、また、タンパク質分解酵素で処理することにより
融合タンパク質から効率よくα−エンドルフィンを切り
出すことができることからモルヒネ様生理活性を有する
ことが知られているα−エンドルフィンの生産に有効で
ある。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ ｐＥＮＤＡｌの作成 α−エンドルフィンを暗号化するＤＮＡとしては。

１、５’−ＧＡＴＣＣＧＣＴＡＣＧＧＣＧＧＴＴＴＣＡ
ＴＧＡＣＣＴＣＡＧ−３’２、５’−ＡＡＡＡＡＴＣＡ
ＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧ−３’３、５’−ＴＣＧＡＧ
ＴＴＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧ−３’４、５’−Ｔ
ＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＡＴＧＡＴＴＧ−３’５、５’
−ＧＴＧＡＣＴＴＡＡＣ−３’６、５’−ＴＣＧＡＧＴ
ＴＡＡＧＴＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧＧ−３’の６本のＤＮ
Ａをホスホアミダイト法に従って化学合成い精製後、ポ
リヌクレオチドキナーゼを用いて、各ＤＮＡの５′末端
をリン酸化した。リン酸化したＤＮＡを約０．１ｍｌ　
（約０．０１ｇｇのＤＮＡを含んでいる。）ずつ取り、
これを６０°Ｃでインキュベートすることによって両Ｄ
ＮＡをアニールさせた（これをＤＮＡＩと呼ぶ）。

約１μｇのｐＭＥＫ２を、ＢａｍＨＩおよびＸ素タンパ
ク質を変性除去し、その後エタノールでＤＮＡを沈澱さ
せた。沈澱したＤＮＡを７０％エタノールで洗った後、
エタノールを除き、減圧下に沈澱を乾燥させたａ　Ｂ　
ａ　ｒｎ　ＨＩおよびＸｈｏ　１によるＤＮＡの切断、
アルカリホスファターゼ処理、フェノール処理、および
エタノール沈澱の各操作は、いずれも、　”Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＡＬｏｂｏｒａｔｏｒｙ　
Ｍａｎｕａｌ”　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ、
Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｄｓ、　
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒしａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　（１９Ｂ２）＋以下２文献ｌと呼ぶ。）に記載
している方法に従って行った。乾燥させたＤＮＡを５０
μｍのリガーゼ用反応液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃ
Ｉ。

ｐＨ７，４，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオトレ
イトール、５ｍＭ　ＡＴＰ）に溶解後、５μｌのＤＮＡ
Ｉを加え、これに１ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼを
加えて。

１０”Ｃで、１２時間ＤＮＡの連結反応を行わせた。こ
の反応物を、形質転換法（ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎｍｅｔｈｏｄ、上記文獣１に記載）に従って、大腸
菌Ｈ８１０１株に取り込ませた。この処理をした菌体を
、５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムおよび１０
ｍｇ／ｍｌのトリメトプリムを含む栄養寒天培地（培地
１１中に、２ｇのグルコース。

１ｇのリン酸２カリウム、５ｇのイーストエキス。

５ｇのポリペプトン、１５ｇの寒天を含む。）上に塗布
し、３７°Ｃで２４時間培養することにより、６個のコ
ロニーを得ることができた。これらのコロニーを、１．
５ｍｌのＹＴ＋Ａｐ培地く培地１１中に、５ｇのＮａＣ
１，５ｇのイーストエキス、８ｇのトリプトン、５０ｍ
ｇのアンピシリンナトリウムを含む、）で、３７℃、１
晩、菌体を培養した。培養液を、各々エッペンドルフ遠
心管にとり、１２，０００回転／分で１０分間遠心分離
し、菌体を沈澱として集めた。これに、０゜１ｍｌの電
気泳動用サンプル調製液（０，０６２５ＭのＴｒｉｓ−
ＨＣＩ、　ｐＨ６，８，２％のラウリル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）　、　１０！（７）グリセリン、　５％０）
２−ｙｌ）Ｌ、カプトエタノール、　Ｏ，０ＯＩＸのブ
ロムフェノールブルーを含む、）キ珈え１面体を懸濁し
、これを沸騰水気泳動法（Ｕ、に、Ｌａｍｍ１ｉ；　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、２２７．　ｐ、６８０（１９７
０））に従って分析した。標準サンプルとしてｐＭＥＫ
２を含有する大腸菌に同様な処理をしたもの、および分
子量マーカーとしてラクトアルブミン（分子量１４，２
００）　、　　）リブシンインヒビター（分子ｆｉ２０
，１００）　、　）リブシノーゲン（分子量２４゜００
０）　、カルボニックアンヒドラーゼ（分子＠２９，０
００〉、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ（分子量３６，０００）　、卵アルブミン（分子１ｌ
ｋ４５．０００）　、および牛血清アルブミン（分子ｊ
１６６　、０００）を含むサンプルをポリアクリルアミ
ド濃度の１０から２０！濃度勾配ゲルで泳動した。その
結果。

すべてのコロニーにおいて、ｐＭＥＫ２のＤＨＦＲ−Ｍ
ＥＫｄ合タンパク質のバンドが消失し、それより明らか
に分子量が大きくなったタンパク質（分子盟約２４，０
００と推定される。）が認められた。

ｐＭＥＫ２のＤ　ＨＦ　Ｒ−ＭＥ　Ｋ融合タンパク質（
分子量、　１８，９６３）ハ、コ（７）条件で分子盟約
２２，０００（７）りンバク質として泳動する。得られ
た６個のコロニーから適当に一株を選び、これをＹＴ＋
Ａｐ培地で培養し、　ＴａｎａｋａとＷｅ　ｉｓｂ　ｌ
ｕｍの方法（Ｔ、Ｔａｎａｋａ。

Ｂ、Ｗｅｉｓｂｌｕｍ；　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ、　ｖｏｌ、Ｉ２１．ｐ、３５４（１９７５））に
従って、プラスミドを調製した。得られたプラスミドを
ｐＥＮＤＡｌと名づけた。ｐＥＮＤＡｌは、ｐＭＥＫ２
のＢａｍＨＩとＸｈｏ　Ｉとの間の配列が、化学合成し
たＤＮＡ配列と置き変わった構造をしているはずである
。ｐＥＮＤＡｌのＥｃｏＲＩ　（第１図の４７１−４７
６番目の配列）と５ａ１（第１図の８８９−８９５番目
の配列）による切断によって得られる約４００ヌクレオ
チド長のＤＮＡについて２Ｍ１３フアージを用いたジデ
オキシ法（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ；　Ｍｅｈｔｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、１０１゜ｐ、２
０（１９８３））に従って、塩基配列を決定した。その
結果、第１図に示す配列の４７１番目から約８９５番目
迄の配列が確かめられた。塩基配列を検討することによ
り、ｐＥＮＤＡｌが融合タンパク質を暗号化することが
明らかとなった。

断によって得られる約４．２キロ塩基対のＤＮＡは、Ｐ
ｓ　ｔ　Ｉ、Ｈ７ｎｄｌ１１．Ｈｐａｌ、ＡａｔＩＩ。

ＰｖｕＩＩ、Ｂｇｌ■、およびＣ１ａｌを用いた制限酵
素による切断実験の結果、ｐＭＥＫ２のＥｃｏＲＩ−３
ａｌｌ切断によって得られる約４．２キロ塩基対のＤＮ
Ａと全く同一であることが示された。

以上の結果から、ｐＥＮＤＡｌの全塩基配列が第１図に
示した配列であることが決められた。

実施例２ ｐＥＮＤＡｌを含有する大ＲＭが作る融合タンパク質 ｐＥＮＤＡｌを含有する大腸菌が作る融合タンパク質の
アミノ酸配列は、遺伝子の塩基配列から予想することが
できる。第１図の５７番目から５８８番目の配列が融合
タンパク質を暗号化していることから、トリブレット暗
号表を用いて、アミノ酸配列を推定した。その結果第２
図に示すアミノ酸配列が得られた。

ｐＥＮＤＡｌを含有する大腸菌から、エンドルフィン融
合タンパク質を分離精製し、精製したタンパク質の性質
を調べた。

融合タンパク質の精製 Ａ、用イタＥＩ体ｊｌ　：　湿Ｍ＊　　１０　ｇＢ、酵
素精製表 表における精製過程は■無細胞抽出液、■ＤＥＡＥ−ト
ヨバールカラム処理、■メソトリキセート結合アフィニ
ティクロマトグラフィー、および■ＤＥＡＥ−）ヨバー
ル力ラムクロマトグラフィーを表す。

精製　酵素液　回収タンパ　回収酵素　収率過程　の量
（ｍｌ）り質（ｍｇ）　　　活性（ユニット）（χ）■ ５．６３１ ■　　　　５６　　　　　１５４　　　３，９８６　　
　７０．８■　　　　２８　　　　　１２６　　　３，
０９０　　　５４．９得られた酵素タンパク質をＳＤＳ
電気泳動法（上記実施例に記載の方法）により分析した
ところ。

分子量的２４　、０００の単一なタンパク質バンドが示
され、得ら、れた酵素標品が均一であることが示された
。

分離精製した融合タンパク質の性質 精製したＤＨＦＲ活性を示すタンパク質をエンザイムイ
ムノアッセイにより検討したところ、α−エンドルフィ
ンに対する抗体と反応することが示された。即ち、精製
して得られたタンパク質は免疫学的にα−エンドルフィ
ンと同等の構造を含んでいることが明らかとなった。

精製して得られたタンパク質のカルボキシ末端側のアミ
ノ酸配列を明らかにするために、カルボキシペプチダー
ゼＹを、精製タンパク質に時間を変化させて作用させ、
遊離してくるアミノ酸を定量した（カルボキシペプチダ
ーゼ法によるカルボキシ末端側のアミノ酸配列の決定法
）。その結果。

−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｔｈｒ　（カルボキシ末端）である
ことが予想された。また、精製して得られたタンパク質
を酸加水分解した後、アミノ酸分析したところ、塩基配
列の結果予想されるアミノ酸組成と一致した結果が得ら
れた。

実施例３ 精製分離した融合タンパク質からのα−エンドルフィン
の分離 実施例２で得られた２ｍｌの精製均一化した融合タンパ
ク質の溶液（緩衝液１中、約２０ｍｇ。

約１．ＯＯＯｎｍｏ　１　ｅの融合タンパク質を含む）
に、０．２ｍｇのアルギニルエンドペプチダーゼを加え
、３７℃で２４時間反応させる０反応後。

１ｍｌの酢酸を加える。そのうちの、０．５ｍ１（約１
６７ｎｍｏ　ｌ　ｅの融合タンパク質を含むはず）をと
り、高速液体クロマドグフィー装置（島ＩＩ　Ｌ　Ｃ−
４Ａ’＋！）を用い１ｎｅｒｔｓｉｌ−００Ｓ５．ｕｍ
カラム、１／１ ノ ％）をかけることにより行った。０から２分までは、１
５％のアセニトリルを用い、２分から３２分までは、１
５％から５０％のアセトニトリルの直線濃度勾配をかけ
た。その結果、第３図に示すような溶出曲線が得られた
。試料注入後約１５分後のピーク画分を分離し２分離し
た溶出液をエバボレーターで乾燥後、少量の水を加え凍
結乾燥し溶媒を除き、ペプチドを得た。得られたペプチ
ドを酸加水分解後、その１０分の１をアミノ酸分析に用
いた。その結果、グルタミン＋グルタミン酸。

ロイシン、グリシン、リジン、メチオニン、フェニルア
ラニン、プロリン、セリン、スレオニン。

チロシン、およびバリンがそれぞれ、２０．２゜９．７
，１９．０，９．０，８．９，９．０，９゜３．１８．
４，２６．３，８．８および９．３ｎｍｏｌｅずつ検出
された。アミノ酸組成は、α−エンドルフィンのそれと
一致した。また、アミノ酸分析に用いた標品は、約９．
３μｍｏ　ｌ　ｅ　（約１６．２μｇ）のα−エンドル
フィンを含んでいたことになる。この結果から、精製均
一化した融合タンパク質を用いて、アルギニルエンドペ
プチダーゼ処理した標品をＨＰＬＣを用いて分離するこ
とにより収率的５６％でα−エンドルフィンを回収でき
ることが明かとなった。融合タンパク質の精製の収率が
約５５％であり、融合タンパク質からのα−エンドルフ
ィンの分離の収率が約５６％であることから、大腸菌が
つくるα−エンドルフィンの単離収率が約３１％である
と計算される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＥＮＤＡｌの全塩基配列を示した図であり
、２本鎖ＤＮＡのうち片方のＤＮＡ鎖配列配列を、５′
末端から３′末端の方向に記述している０図中符号は、
核酸塩基を表し、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇ
はグアニンを、Ｔはチミンを示している０図中番号は、
ｐＥＮＤＡｌに２箇所存在する制限酵素Ｃ１ａＩ切断認
識部位を示している。 第２図は、ｐＥＮＤＡｌ中に存在するエンドルフィン融
合タンパク質を暗号化する部分の塩基配列およびタンパ
ク質のアミノ酸配列を示す図である。図中符号は、核酸
塩基およびアミノ酸を表し。 Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、Ｔ
はチミンを、Ａｌａはアラニンを、Ａｒｇはアルギニン
を、Ａｓｎはアスパラギンを、Ａｓｐはアスパラギン酸
を、Ｃｙｓはシスティンを。 Ｇｌｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を。 Ｇｌｙはグリシンを、）ｌｉｓはヒスチジンを、ｌｌｅ
はイソロイシンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｌｙｓはリジ
ンを、Ｍｅｔはメチオニンを、Ｐｈｅはフェニルアラニ
ンを、Ｐｒｏはプロリンを、Ｓｅｒはセリンを、Ｔｈｒ
はトレオニンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｔｙｒは
チロシンを、Ｖａｌはバリンを示している０図中番号は
、１番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号化するＡＴ
ＧコトンのＩＴ　Ａ　＋＋ を１番として数えた番号を示してい 第３図は。 アルギニルエンドペプチダーゼ処理 した融合タンパク質試料の高速液体クロマトグラムを示
している。 横軸は試料注入後の時間を分車 位で。 縦軸は。 表現している。 ２２０ｎｍの吸光度を任意単位で 矢印で示したピークがα−エンド ルフィンの溶出ピークである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌において安定に複製され、宿主である大腸菌
   にトリメトプリム耐性およびアンピシリン耐性を与える
   ことができ、４６７３塩基対の大きさを有し、第１図に
   おいて示されるＤＮＡ配列を有する新規組換えプラスミ
   ドｐＥＮＤＡ１。 ２、ｐＥＮＤＡ１を含有する大腸菌。 ３、ｐＥＮＤＡ１を含有する大腸菌が生産し、第２図に
   よって示されるアミノ酸配列を有するジヒドロ葉酸還元
   酵素−α−エンドルフィン融合タンパク質。 ４、ｐＥＮＤＡ１を含有する大腸菌を培養し、ジヒドロ
   葉酸還元酵素活性を目安に、ジヒドロ葉酸還元酵素−α
   −エンドルフィン融合タンパク質を、培養菌体の無細胞
   抽出液から、メソトリキセート結合アフィニティカラム
   クロマトグラフィー、および陰イオン交換カラムクロマ
   トグラフィーを用いて精製することを特徴とするジヒド
   ロ葉酸還元酵素−α−エンドルフィン融合タンパク質の
   分離精製方法。 ５、ｐＥＮＤＡ１を含有する大腸菌の生産するジヒドロ
   葉酸還元酵素−α−エンドルフィン融合タンパク質を分
   離精製し、単離したジヒドロ葉酸還元酵素−α−エンド
   ルフィン融合タンパク質をタンパク質分解酵素で消化し
   た後、α−エンドルフィンを分離精製することを特徴と
   するα−エンドルフィンの製造方法。