JPH0314291B2

JPH0314291B2 -

Info

Publication number: JPH0314291B2
Application number: JP57172178A
Authority: JP
Inventors: Masanobu Komya; Hiroshi Hayashi
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1982-09-28
Filing date: 1982-09-28
Publication date: 1991-02-26
Also published as: JPS5959625A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ガン壊死因子（以下、TNFと略記
する）の安定化法、詳しくは保存時、分離精製、
凍結乾燥などの操作を行なう際のTNFの安定化
法に関するものである。本発明におけるTNFとは、「網内系賦活化作用
を有する物質の１種または２種以上を哺乳動物に
投与し、次いでグラム陰性菌由来のエンドトキシ
ンを注射することによつて、または哺乳動物由来
の活性化マクロフアージを含む組織培養系にグラ
ム陰性菌由来のエンドトキシンを加えることによ
つて誘発される生理活性物質で、担ガン動物に接
種することにより、ある種のガンを壊死せしめる
因子」と定義される物質である。TNFの特徴と
しては、ある種のガンを壊死せしめるばかりか、
その作用が種特異的でないことが知られている。
たとえば、ウサギより得られたTNFがマウスの
ガンを壊死せしめることができる。さらに、
TNFはin vitroで正常細胞にはほとんど有害な
作用を及ぼさず、ある種のガン細胞（たとえば、
マウスのガンに由来するＬ−Ｍ細胞）を殺す能力
をもつことが知られている。このようにTNFは
制ガン作用を有し、種に対し非特異的で、正常細
胞には作用しないことから制ガン剤として期待さ
れる。従来から、動物あるいは組織培養系中に誘発さ
れるTNFの量は、非常に微量であることが知ら
れている。TNFを制ガン剤として広く安全に使
用するためには、分離精製することが重要であ
り、また溶液あるいは凍結状態で長期保存した
り、凍結乾燥を行なうことは、TNFを大量に工
業的に製造する際に必須の操作である。ところが
発明者らは、高純度のTNF溶液を保存したり、
凍結あるいは凍結乾燥を行なうと、活性が著しく
低下することを見いだした。また、高純度の
TNFの安定性について検討した報告も今日まで
になされていない。このような実状では、その制
ガン効果にもかかわらず、高純度のTNFを効率
よく安定的に工業的規模で提供することは不可能
である。本発明者らは、これらの現状に鑑み、TNFの
安定化について鋭意研究を行なつた結果、ある種
の糖類および糖類関連化合物をTNFに添加する
ことにより、相当の期間保存しても、または、分
離精製、凍結乾燥などの操作を行なつても、
TNFの活性が保持されることを見いだし、本発
明を完成した。本発明は、TNFにＤ−グルコース、Ｄ−ガラ
クトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、
トレハロース、デキストランおよびヒドロキシエ
チルデンプンから選ばれた少なくとも１種の物質
を添加することを特徴とするTNFの安定化法に
関するものである。本発明に用いられるTNF原料は、公知の方法
で生産される。そのようなものとして、たとえ
ば、Matthewsら，Br.J.Cancer，42（1980）416
や、Greenら、J.Natl.Cancer Inst.，59（1977）
1518の方法が挙げられる。以下、その方法を説明
する。すなわち、哺乳動物（たとえば、マウス、ウサ
ギ、モルモツトなど）に網内系賦活化作用を有す
る物質の１種または２種以上を静脈内または腹腔
内に注射する。網内系賦活化作用を有する物質と
しては、通常グラム陽性菌、原生動物または酵母
が用いられ、生菌状態、死菌状態（たとえば、熱
処理やホルマリン処理後）または菌体抽出成分と
して投与される。ここでグラム陽性菌としては、たとえば、
Propionibacterium acnes（Corynebacterium
parvum）、Propionibacterium granulosum
（Corynebacterium granulosum）のような
Propionibacteria、Bacillus Calmette−Gue´rin
（BCG）、Mycobacterium Smegmatisのような
Mycobacteria、Nocardia erythropolis、
Nocardia gardneriのようなNocardiasが挙げら
れる。原生動物としては、たとえばマラリア原
虫、トキソプラズマが挙げられる。酵母の場合、
通常Saccharomyces cerevisiaeなどから抽出し
たZymosanが用いられる。また、ピランコーポ
リマーのような合成高分子化合物を用いることも
できる。網内系賦活化作用を有する物質の投与後７〜14
日後にグラム陰性菌より得られたエンドトキシ
ン、たとえば、大腸菌、緑膿菌、チフス菌由来の
リポポリサツカライドを該哺乳動物の静脈内に注
射する。注射後1.5〜２時間後に該哺乳動物の体
液（たとえば、腹水、リンパ液など）および／ま
たは血清もしくは血漿を得るか、または該動物の
肝臓、脾臓等の臓器を均一に破砕し、生理食塩水
で抽出してTNF原料を得る。本発明に用いられるTNF原料の生産方法は、
上記に限られるものではない。すなわち、細胞培
養法のようなTNF原料生産法も採用できる。このようにして生産されたTNF原料は、通常
の生化学的分離精製方法を組み合わせて分離精製
される。そのようなものとしては、たとえば、硫
酸アンモニウムによる塩析法、陰イオン交換樹脂
によるイオン交換クロマトグラフイー、ゲル過
法、電気泳動法などが挙げられる。これらの方法
を組み合わせて、分離精製工程を進めて精製度を
上げていくと、TNFは次第に不安定となる。た
とえば比活性（１mgの総蛋白質中に含まれる
TNFの活性、活性の単位は後述）50万単位／mg
まで精製したTNF試料は、実施例に示すように
非常に不安定である。比活性がこれより低い
TNF試料も程度の差はあるが、保存したり、凍
結、凍結乾燥などの操作により、その活性が低下
する。本発明の対象となるものは、このように精
製度が上がり不安定となつたTNFであり、溶液
および粉末のいずれでもよいが、特にTNFを含
有する溶液である。本発明で用いられるTNFを含有する溶液のPH
は５〜10に保たれていることが好ましく、適当な
緩衝液で調整されていることがより好ましい。そ
のような緩衝液としては、たとえば、リン酸緩衝
液、トリス〔tris（hydroxymethyl）
aminomethane〕−塩酸緩衝液などが挙げられる。
目的によつては塩を加える場合もある。用いられ
る塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムな
どがあり、その濃度は目的によつて決定される。
たとえば、注射用として用いる場合には、塩化ナ
トリウムを0.15Mになるように加え等張液とす
る。本発明で用いられる物質（以下、本発明の物質
と記す）のうち、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクト
ース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸および
トレハロースの場合には、これらのリン酸エステ
ルまたはその塩、酢酸エステル、メチルエーテ
ル、メチル配糖体などの誘導体もまたTNF安定
化効果を有するので、本発明方法にはこれらの誘
導体を添加する方法も含まれる。また、Ｄ−グル
クロン酸の場合には、ナトリウム塩、カリウム塩
のようなアルカル金属塩およびカルシウム塩、マ
グネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩も含ま
れる。ヒドロキシエチルデンプンとしては、平均
分子量30000〜400000のものが用いられるが、平
均分子量200000のものが好ましい。デキストラン
としては、平均分子量10000〜80000のものが好ま
しく、たとえば、デキストラン10，40，70（それ
ぞれ平均分子量10000，40000，70000）が挙げら
れる。これらの物質のうちではトレハロースがも
つとも好ましい。本発明の物質は単独で、あるいは２種以上を適
宜組合わせて使用することができる。本発明の物質の添加濃度は、TNFを含有する
溶液１mlあたり10mg以上、より好ましくは100mg
以上である。添加濃度の上限は常識的、経済的観
点から決められ、同溶液１mlあたり500mgである。
なお、TNFを含有する粉末に添加する場合の本
発明の物質の添加量は、該粉末を溶解した際に、
上記の溶液濃度になるように選ばれる。添加方法は特に限定されないが、たとえば、本
発明の物質の粉末を直接TNF含有溶液に添加す
る方法、あらかじめ同粉末を水あるいは適当な緩
衝液に溶解して添加する方法、または同粉末を
TNF含有粉末と混合せしめて添加する方法が挙
げられる。添加時期は分離精製過程であつても、
製剤化工程であつてもよい。本発明の物質を２種以上添加する場合には、該
物質の合計量が、先に述べた添加濃度および量に
なるように調整すればよい。このように本発明の物質を添加したTNFを含
有する溶液は、溶液状態のままでは０〜30℃、よ
り好ましくは０〜10℃で保存あるいは分離精製、
製剤化操作をすることが好ましい。また、同溶液
を凍結状態で保存する場合は０℃以下、より好ま
しくは−20℃以下とすることが望ましい。本発明
の物質を添加したTNFを含有する溶液では、溶
液状態または凍結状態での保存中あるいは分離精
製、製剤化操作中にもTNFの活性は保持される。 TNFの活性測定には、in vivoで腫瘍壊死効果
を測定する方法と、in vitroでガン細胞を殺す効
果を測定する方法がある。 in vivo法としては、たとえば、Carswellらの
方法、Proc.Nat.Acad.Sci.USA，72（1975）
3666が挙げられる。この方法は、移植したMeth
Ａ sarcomaによる腫瘍をTNFが壊死させる効
果を測定するものである。すなわち、（BALB／
ｃ×C57BL／６）F₁マウスの腋下部皮内に２×
10⁵コのMeth Ａ sarcoma細胞を移植する。７
日後、移植した腫瘍の大きさが直径７〜８mmとな
り、出血性壊死などがなく良好な血行状態にある
マウスを選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した
0.5mlのTNF試料を注射し、24時間後に次の判定
基準により判定を行なう。（−）：変化なし（＋）：かすかな出血性壊死（）：中程度の出血性壊死（移植ガン表面の
真中から50％以上にわたつて壊死）（）：顕著な出血性壊死（移植ガンの中央部
が重度に壊死し、周囲のガン組織がわずか
に残つた状態） in vitro法によるTNF活性測定は、たとえば、
Ruffら〔Lymphokines，Vol.2.ed.by E.Pick，
Academic Press，N.Y.（1980）235〕、あるいは
Kullら〔J.Immunol.，126（1981）1279〕の方法
が挙げられる。本発明者らが用いている方法は、これらを改良
したものであり、TNFがＬ−Ｍ細胞（アメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン，CCL
1.2）を殺す効果を測定するものである。すなわ
ち、順次培地で希釈したTNF試料0.1mlと10⁵
コ／mlの濃度のＬ−Ｍ細胞の培地懸濁液0.1mlを
96穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラ
ボラトリー社）に加える。培地は10v／ｖ％のウ
シ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセン
シヤル培地（その組成は、たとえば「組織培養」
中井準之助他編集、朝倉書店、1967年に記載され
ている）を用いる。マイクロプレートを５％の炭
酸ガスを含む空気中、37℃で48時間培養する。培
養終了後、グルタルアルデヒド20μlを加え細胞を
固定する。固定後、マイクロプレートを洗浄、乾
燥して、0.05％メチレンブルー溶液を0.1ml加え、
生き残つた細胞を染色する。余分なメチレンブル
ーを洗い流し乾燥した後、残つたメチレンブルー
を３％塩酸溶液で抽出し、その665nmにおける吸
光度をタイターテツク・マルチスキヤン（フロ
ー・ラボラトリー社）で測定する。この吸光度
は、生き残つた細胞数に比例する。TNF試料を
加えない対照の吸光度は50％の値に相当する
TNF試料の希釈率を、グラフあるいは計算によ
つて求め、その希釈率を単位（Ｕ）／mlと定義す
る。以下、本発明におけるTNFのin vitro活性
は、すべてこの単位で表示される。本発明の方法によれば、制ガン剤として期待さ
れているTNFを溶液、凍結、凍結乾燥状態での
保存や、分離精製、製剤化操作の際にもその活性
は保持されるので、高純度のTNFを効率よく安
定的に工業的規模で提供することが可能となる。
また、人体に投与しても安全で、TNFを制ガン
剤として用いる際にきわめて有利である。次に、実施例によつて実施例をさらに詳細に説
明する。実施例１比活性500000U／mgであるウサギ由来のTNF
を用いて、1000U／mlの活性を有するTNF溶液
（0.15M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液
PH7.0）を調製した。このTNF溶液にＤ−グルコ
ース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロース、Ｄ−
グルクロン酸ナトリウム、トレハロース、デキス
トラン10、デキストラン70およびヒドロキシエチ
ルデンプン（平均分子量約200000）（HES，味の
素製）を100mg／mlおよび300mg／mlになるように
添加し、４℃で保存し、経時的（２日、７日、30
日目）に、本明細書中に記載したin vitroおよび
in、vivo評価法で残存活性を測定した。in vitro
法の場合は、得られた測定値より残存活性率
（％）を算出した。結果は、実施例２の結果と共
に表１に示す。なお、in vivo法の場合は、該処理溶液を限外
過濃縮装置、ミニモジユールNM−３（旭化成
工業製、ナフコシ薬品販売）で30倍濃縮した後、
１群５匹の担ガンマウスの尾静脈に１匹あたり
0.5ml投与し、投与後24時間目に判定基準に則り
評価した。ただし、デキストランおよびヒドロキ
シエチルデンプン添加の場合には、所定の濃度ま
で濃縮できないので残存活性は測定しなかつた。実施例２実施例１で用いたと同様の活性濃度を有する
TNF溶液に、実施例１で用いた各種本発明の物
質を100mg／mlおよび300mg／mlになるように添加
し、凍結（−70℃）と融解を繰り返し（１回、３
回）、その残存活性をin vitro評価法で測定した。
結果を残存活性率（％）の形で表１に示す。実施例３実施例１で用いたと同様の活性濃度を有する
TNF溶液に各種濃度のトレハロースを添加し、
４℃で７日間保存した後のTNF残存活性をin
vitro評価法で測定し、その値に基づいて残存活
性率（％）を算出した。結果を図面に示す。

【表】

【表】比較例本発明の物質として、Ｄ−グルコース、Ｄ−グ
ルクロン酸ナトリウム、トレハロースおよびヒド
ロキシエチルデンプンを用い、比較添加物とし
て、通常の生理活性物質の溶液安定化剤としてよ
く知られている各種糖類および糖類関連化合物を
用いた。実施例１で用いたと同様の活性濃度を有する
TNF溶液に、上記添加物を10mg／mlまたは200
mg／mlになるように添加し、４℃で７日間保存し
た後のTNF残存活性をin vitro評価法で測定し、
その値に基づいて残存活性率（％）を算出した。
結果を表２に示す。

【表】

【表】以上の実施例、比較例から明らかなように、本
発明の安定化法によれば、溶液状態での保存、凍
結、融解などの操作時において、TNFの活性を
安定的に保持することが可能である。

【図面の簡単な説明】

図面はトレハロースの各種添加濃度に対する４
℃７日間保存後のTNF in vitro残存活性率の関
係を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１ガン壊死因子にＤ−グルコース、Ｄ−ガラク
トース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルクロン酸、ト
レハロース、デキストランおよびヒドロキシエチ
ルデンプンから選ばれた少なくとも１種の物質を
添加することを特徴とするガン壊死因子の安定化
法。