JPH0375531B2

JPH0375531B2 -

Info

Publication number: JPH0375531B2
Application number: JP57149890A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Hayashi; Masanobu Komya
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1982-08-31
Filing date: 1982-08-31
Publication date: 1991-12-02
Also published as: JPS5939829A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ガン壊死因子（以下、TNFと略記
する）の安定化法、詳しくは保存時、分離精製、
凍結乾燥などの操作を行なう際のTNFの安定化
法に関するものである。本発明におけるTNFとは、「網内系賦活化作用
を有する物質の１種または２種以上を哺乳動物に
投与し、次いでグラム陰性菌由来のエンドトキシ
ンを注射することによつて、または哺乳動物由来
の活性化マクロフアージを含む組織培養系にグラ
ム陰性菌由来のエンドトキシンを加えることによ
つて誘発される生理活性物質で、担ガン動物に接
種することにより、ある種のガンを壊死せしめる
因子」と定義される物質である。TNFの特徴と
しては、ある種のガンを壊死せしめるばかりかそ
の作用が種特異的でないことが知られている。た
とえば、ウサギより得られたTNFがマウスのガ
ンを壊死せしめることができる。さらに、TNF
はin vitroで正常細胞にはほとんど有害な作用を
及ぼさず、ある種のガン細胞（たとえば、マウス
のガンに由来するＬ−Ｍ細胞）を殺す能力をもつ
ことが知られている。このようにTNFは制ガン
作用を有し、種に対し非特異的で、正常細胞には
作用しないことから制ガン剤として期待される。従来から、動物あるいは組織培養系中に誘発さ
れるTNFの量は、非常に微量であることが知ら
れている。TNFを制ガン剤として広く安全に使
用するためには、分離精製することが重要であ
り、また溶液あるいは凍結状態で長期保存した
り、凍結乾燥を行なうことは、TNFを大量に工
業的に製造する際に必須の操作である。ところが
本発明者らは、高純度のTNF溶液を保存したり、
凍結あるいは凍結乾燥を行なうと、活性が著しく
低下することを見いだした。また、高純度の
TNFの安定性について検討した報告も今日まで
になされていない。このような実状では、その制
ガン効果にもかかわらず、高純度のTNFを効率
よく安定的に工業的規模で提供することは不可能
である。本発明者らは、これらの現状に鑑み、TNFの
安定化について鋭意研究を行なつた結果、安価
で、しかも入手しやすい非イオン界面活性剤を
TNFに少量添加することにより、長期保存して
も、または分離精製、凍結乾燥などの操作を行な
つても、TNFの活性が保持されることを見い出
し、本発明を完成した。本発明は、TNFに非イオン界面活性剤を添加
することを特徴とするTNFの安定化法に関する
ものである。本発明の方法で用いられる非イオン界面活性剤
は、TNFの精製度検定に何ら悪影響を及ぼさず、
正確な精製純度が測定できるので、本発明の方法
は、カラムクロマトグラフイー、濃縮等の精製操
作時あるいは溶液保存時におけるTNFの安定化
に特に適している。本発明に用いられるTNF原料は、公知の方法
で生産される。そのようなものとしては、たとえ
ば、Matthewsら，Br.J.Cancer，42（1980）416
や、Greenら，J.Natl.Cancer Inst.，59（1977）
1519の方法が挙げられる。以下、その方法を説明
する。すなわち、哺乳動物（たとえば、マウス、ウサ
ギ、モルモツトなど）に網内系賦活化作用を有す
る物質の１種または２種以上を静脈内または腹腔
内に注射する。網内系賦活化作用を有する物質と
しては、通常グラム陽性菌、原生動物または酵母
が用いられ、生菌状態、死菌状態（たとえば、熱
処理やホルマリン処理後）または菌体抽出成分と
して投与される。ここでグラム陽性菌としては、たとえば、
Propionibacterium acnes（Corynebacterium parvum）、
Propionibacterium granulosum
（Corynebacterium granulosum）のような
Propionibacteria、Bacillus Calmette−Gue´rin
（BCG）、Mycobacterium smegmatisのような
Mycobacterria、Nocardia erythropolis、
Nocardia gardneriのようなNocardiasが挙げら
れる。原生動物としては、たとえばマラリア原
虫、トキソプラズマが挙げられる。酵母の場合、
通常Saccharomyces cerevisiaeなどから抽出し
たZymosanが用いられる。また、ピランコーポ
リマーのような合成高分子化合物を用いることも
できる。網内系賦活化作用を有する物質の投与後７〜14
日後にグラム陰性菌より得られたエンドトキシ
ン、たとえば、大腸菌、緑膿菌、チフス菌由来の
リポポリサツカライドを該哺乳動物の静脈内に注
射する。注射後に該哺乳動物の体液（たとえば、
腹水、リンパ液など）および／または血清もしく
は血漿を得るか、または該動物の肝臓、脾臓等の
臓器を均一に破砕し、生理食塩水で抽出して
TNF原料を得る。本発明に用いられるTNF原料の生産方法は、
上記に限られるものではない。すなわち、細胞培
養法のようなTNF原料生産法も採用できる。このようにして生産されたTNF原料は、通常
の生化学的分離精製方法を組み合わせて分離精製
される。そのようなものとして、たとえば、硫酸
アンモニウムによる塩析法、陰イオン交換樹脂に
よるイオン交換クロマトグラフイー、ゲル過
法、電気泳動法などが挙げられる。これらの方法
を組み合わせて、分離精製工程を進めて精製度を
上げていくと、TNFは次第に不安定となる。た
とえば比活性（１mgの総蛋白質中に含まれる
TNFの活性、活性の単位は後述）50万単位／mg
まで精製したTNF試料は、実施例に示すように
非常に不安定である。比活性がこれより低い
TNF試料も程度の差はあるが、保存したり、凍
結、凍結乾燥などの操作により、その活性が低下
する。本発明の対象となるものは、このように精
製度が上がり不安定となつたTNFであり、特に
TNFを含有する溶液である。本発明で用いられるTNFを含有する溶液のPH
は５〜10に保たれていることが好ましく、適当な
緩衝液で調整されていることがより好ましい。そ
のような緩衝液としては、たとえば、リン酸緩衝
液、トリス〔tris（hydroxymethyl）
aminomethane〕−塩酸緩衝液などが挙げられる。
目的によつては塩を加える場合もある。用いられ
る塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムな
どがあり、その濃度は目的によつて決定される。
たとえば、注射用として用いる場合には、塩化ナ
トリウムを0.15Mになるように加え等張液とす
る。本発明で用いられる非イオン界面活性剤として
は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオ
キシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチ
レンアルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチ
レンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチ
レングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチ
レン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンヒマシ
油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンア
ルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシ
プロピレンブロツクポリマー、ソルビタン脂肪酸
エステル、シヨ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂
肪酸エステルが挙げられる。分散性および溶解性
の点からは、HLB（Hydrophile Lipophile
Balance）価９〜20のものが好ましく、より好ま
しくはHLB価13〜18のものが用いられる。これ
らは単独で、あるいは２種以上を適宜組み合わせ
て使用することができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルは炭素原子
数８〜20の飽和または不飽和脂肪酸残基を有し、
エチレンオキシド（以下、E.O.と略記する）付加
モル数が約４〜50のものが好ましく、たとえば、
ポリオキシエチレンステアレート、ポリオキシエ
チレンラウレート、ポリオキシエチレンオレエー
トが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルエーテルは炭素原
子数８〜20の飽和または不飽和アルキル基を有
し、E.O.付加モル数が約５〜55のものが好まし
く、たとえば、ポリオキシエチレンラウリルエー
テル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリ
オキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシ
エチレンオレイルエーテルが挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル
は炭素原子数５〜10の飽和または不飽和アルキル
基を有し、E.O.付価モル数が約５〜55のもが好ま
しく、たとえば、ポリオキシエチレンｐ−オクチ
ルフエニルエーテル、ポリオキシエチレンｐ−ノ
ニルフエニルエーテルが挙げられる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル
は炭素原子数８〜20の飽和または不飽和脂肪酸残
基を有し、E.O.付加モル数が約５〜50のものが好
ましく、たとえば、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノステアレート、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソル
ビタントリステアレートが挙げられる。ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル
は炭素原子数８〜20の飽和または不飽和脂肪酸残
基を有し、E.O.付加モル数が約５〜50のものが好
ましく、たとえば、ポリオキシエチレングリセリ
ンステアレート、ポリオキシエチレングリセリン
モノオレエートが挙げられる。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油およびポリオ
キシエチレンヒマシ油は、E.O.付加モル数が約20
〜150のものが好ましい。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアル
キルエーテルは炭素原子数12〜18の飽和または不
飽和アルキル基を有し、E.O.含量が約65〜85％の
ものが好ましく、たとえば、ポリオキシエチレン
ポリオキシプロピレンエーテルが挙げられる。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロ
ツクポリマーは平均分子量が約3000〜15000で、
E.O.含量が約65〜85％のものが好ましい。ソルビタン脂肪酸エステルは炭素原子数８〜20
の飽和または不飽和脂肪酸のモノまたはセスキエ
ステルが好ましく、たとえば、ソルビタンモノラ
ウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビ
タンセスキオレエートが挙げられる。シヨ糖脂肪酸エステルは炭素原子数８〜20の飽
和または不飽和脂肪酸のモノエステルが好まし
く、たとえば、シヨ糖モノパルミテート、シヨ糖
モノステアレートが挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルは炭素原子数８〜20
の飽和または不飽和脂肪酸のモノエステルが好ま
しく、たとえば、グリセリンモノステアレート、
グリセリンモノオレエートが挙げられる。上記の非イオン界面活性剤のうちでは、毒性の
比較的低いポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸
エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポ
リオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン
ポリオキシプロピレンブロツクポリマーが特に好
ましく、なかんずく、ポリオキシエチレン（20）
ソルビタンモノオレエート、E.O.付加モル数60の
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、および平均分
子量が約8350でE.O.含量が80％であるポリオキシ
エチレンポリオキシプロピレンブロツクポリマー
が好ましい。界面活性剤の添加濃度は、TNFを含有する溶
液１mlあたり1μg〜１mg、より好ましくは5μg〜
100μg、さらに好ましくは10μg〜100μgである。
添加方法は特に限定されないが、たとえば、界面
活性剤を直接TNF含有溶液に添加する方法、ま
たはあらかじめ界面活性剤を水または適当な緩衝
液もしくはエタノールのような有機溶剤に溶解し
て添加する方法が挙げられる。添加時期は、分離
精製過程であつても、製剤化工程であつてもよ
い。２種以上の界面活性剤を添加する方法もまた本
発明の方法に含まれる。その場合は、界面活性剤
の合計量が、先に述べた添加濃度になるように調
整すればよい。このような非イオン界面活性剤を添加した
TNFを含有する溶液は、溶液状態のままでは０
〜30℃、より好ましくは０〜10℃で保存あるいは
分離精製、製剤化操作をすることが好ましい。ま
た、同溶液を凍結状態で保存する場合は０℃以
下、より好ましくは−20℃以下とすることが望ま
しい。本発明における界面活性剤を添加したTNF含
有溶液では、溶液状態または凍結状態での保存中
あるいは分離精製、製剤化操作中にもTNFの活
性は保持される。これに対して陰イオン界面活性
剤は、TNFに対する変性作用が強く、また、陽
イオン界面活性剤はそれ自身強い細胞毒性を示す
ので、TNFの正確な活性測定ができず、したが
つて、これらはTNFの安定化剤として使用する
ことができる。 TNFの活性測定には、in vivoで腫瘍壊死効果
を測定する方法と、in vitroでガン細胞を殺す効
果を測定する方法がある。 in vivo法としては、たとえば、Carswellらの
方法，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，72（1975）
3666が挙げられる。この方法は、移植したMeth
Ａ sarcomaによる腫瘍をTNFが壊死させる効
果を測定するものである。すなわち、（BALB／
ｃ×C57BL／６）F₁マウスの腋下部皮内に２×
10⁵コのMeth Ａ sarcoma細胞を移植する。７
日後、移植した腫瘍の大きさが直径７〜８mmとな
り、出血性壊死などがなく良好な血行状態にある
マウスを選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した
0.5mlのTNF試料を注射し、24時間後に次の判定
基準により判定を行なう。（−）：変化なし（＋）：かすかな出血性壊死（）：中程度の出血性壊死（移植ガン表面の
真中から50％以上にわたつて壊死）（）：顕著な出血性壊死（移植ガンの中央部
が重度に壊死し、周囲のガン組織がわずか
に残つた状態） in vitro法によるTNF活性測定は、たとえば、
Ruffら〔Lymphokine Reports Vol.，ed.by
E.Pick，Academic Press，N.Y.（1980）235〕、
あるいはKullら〔J.Immunol.，126（1981）
1279〕の方法が挙げられる。本発明者らが用いている方法は、これらを改良
したものであり、TNFがＬ−Ｍ細胞（アメリカ
ン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン，
CCL1.2）を殺す効果を測定するものである。す
なわち、順次培地で希釈したTNF試料0.1mlと
10⁵コ／mlの濃度のＬ−Ｍ細胞の培地懸濁液0.1ml
を96穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・
ラボラトリー社）に加える。培地は10v／ｖ％の
ウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセ
ンシヤル培地（その組成は、たとえば、「組織培
養」中井準之助他編集、朝倉書店、1967年に記載
さされている）を用いる。マイクロプレートを５
％の炭酸ガスを含む空気中、37℃で48時間培養す
る。培養終了後、グルタルアルデヒド20μを加
え細胞を固定する。固定後、マイクロプレートを
洗浄、乾燥して、0.05％メチレンブル−溶液を
0.1ml加え、生き残つた細胞を染色する。余分な
メチレンブルーを洗い流し乾燥した後、残つたメ
チレンブルーを３％塩酸溶液で抽出し、その
665nmにおける吸光度をタイターテツク・マルチ
スキヤン（フロー・ラボラトリー社）で測定す
る。この吸光度は、生き残つた細胞数に比例す
る。TNF試料を加えない対照の吸光度の50％の
値に相当するTNF試料の希釈率を、グラフある
いは計算によつて求め、その希釈率を単位
（Ｕ）／mlと定義する。以下、本発明における
TNFのin vitro活性は、すべてこの単位で表示
される。本発明の方法によれば、制ガン剤として期待さ
れているTNFを溶液、凍結、凍結乾燥状態での
保存や、分離精製、製剤化操作の際にもその活性
は保持されるので、高純度のTNFを効率よく安
定的に工業的規模で提供することが可能となる。次に、実施例によつて本発明をさらに詳細に説
明する。実施例１比活性500000U／mgであるウサギ由来のTNF
を用いて、1000U／mlの活性を有するTNF溶液
（0.15M塩化ナトリウムを含む0.1Mリン酸緩衝液
PH7.0）を調製した。該TNF溶液に各種非イオン
界面活性剤を10μg／mlになるように添加し、４
℃で保存し、経時的（２日，７日，30日目）に、
本明細書中に記載したin vitroおよびin vivo評
価法で残存活性を測定した。in vitro法の場合
は、得られた測定値より残存活性率（％）を算出
した。結果は、実施例２の結果と共に表１に示
す。なお、in vivoの場合は、該処理溶液を限外
過濃縮装置，ミニモジユールNM−３（旭化成工
業製，フナコシ薬品販売）で30倍濃縮した後、１
群５匹の胆ガンマウスの尾静脈に１匹当り0.5ml
投与し、投与後24時間目に判定基準に則り評価し
た。実施例２実施例１で用いたと同様の活性濃度を有する
TNF溶液に、各種非イオン界面活性剤を10μg／
mlになるように添加し、凍結（−70℃）と融解を
繰り返し（１回、３回）、その残存活性をin
vitro評価法で測定した。結果を残存活性率（％）
の形で表１に示す。

【表】

【表】実施例３実施例１で用いたと同様の活性濃度を有する
TNF溶液に、各種濃度のポリオキシエチレン
（20）ソルビタンモノオレエート（Tween80，和
光純薬製）、ポリオキシエチレン(6)ステアレート
（ニツサンノニオンＳ−６，日本油脂製）、ポリオ
キシエチレン（23）ラウリルエーテル（Brij35，
和光純薬製）、ポリオキシエチレン（60）硬化ヒ
マシ油（NIKKOL HCO−60，日光ケミカルズ
製）およびポリオキシエチレンポリオキシプロピ
レンブロツクポリマー（平均分子量約8350，E.O.
含量80％）（Pluronic F68，旭電化製）をそれぞ
れ添加し、４℃で７日間保存した後のTNF残存
活性をin vitro評価法で測定し、その値にもとづ
いて残存活性率（％）を算出した。結果をそれぞ
れ第１〜５図に示す。比較例本発明の非イオン界面活性剤として、
Tween80，NIKKOLHCO−60および
PluronicF68を用い、比較添加物として、陰イオ
ン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム、陽
イオン界面活性剤であるセチルトリメチルアンモ
ニウムブロミド、および通常の生理活性物質の溶
液安定化剤としてよく知られている各種アルコー
ル類を用いて試験した。安定化効果実施例１で用いたと同様の活性濃度を有する
TNF溶液に、界面活性剤の場合には、0.005％と
0.05％になるように添加し、アルコール類の場合
には、エタノールについては0.5％、他のアルコ
ールについては10％になるように添加した後、実
施例１と同様にしてTNF残存活性を測定した。細胞毒性添加物自身の細胞毒性を試験するために、上記
濃度の溶液を調製し、培地で100倍希釈した後、
TNF活性のin vitro評価法と同様の方法で、Ｌ
−Ｍ細胞に対する毒性を調べた。その際、Ｌ−Ｍ
細胞に対して50％以上の致死毒性を示したものを
細胞毒性有りと判定した。），）の結果を表２に示す。

【表】以上の実施例、比較例から明らかなように、本
発明の安定化法によれば、溶液状態での保存、凍
結、融解などの操作時において、TNFの活性を
安定的に保持することが可能であり、TNF製造
時の精製工程、製剤化工程などへの応用はもちろ
んのこと、製品化した際の製品安定性をも保証す
るものである。

【図面の簡単な説明】

第１〜５図は、各種非イオン界面活性剤の添加
濃度に対する４℃７日間保存後のTNF in vitro
残存活性率の関係を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

１ガン壊死因子に非イオン界面活性剤を添加す
ることを特徴とするガン壊死因子の安定化法。