JPH0314320B2

JPH0314320B2 -

Info

Publication number: JPH0314320B2
Application number: JP58075607A
Authority: JP
Inventors: Shigeo Kuzuki; Ko Morita; Hiroshi Matsunaga; Toshio Matsumoto; Etsuro Ogata
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1983-04-28
Filing date: 1983-04-28
Publication date: 1991-02-26
Also published as: JPS59204159A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規なヒト副甲状腺ホルモン
（hPTH）ペプチド誘導体に関する。さらに詳し
くは、本発明は〔Met（Ｏ）^8,18〕hPTH−（１−
34）ペプチドまたはその塩である。上記ペプチド
は、式Ｈ−₁ Ser −₂ Val −₃ Ser −₄ Glu −₅ Ile −₆ Gln −₇ Leu −₈ Met（Ｏ） −₉ His −₁₀ Asn −₁₁ Leu −₁₂ Gly −₁₃ Lys −₁₄ His −₁₅ Leu −₁₆ Asn −₁₇ Ser −₁₈ Met（Ｏ） −₁₉ Glu −₂₀ Arg −₂₁ Val −₂₂ Glu −₂₃ Trp −₂₄ Leu −₂₅ Arg −₂₆ Lys −₂₆ Lys −₂₈ Leu −₂₉ Gln −₃₀ Asp −₃₁ Val −₃₂ His −₃₃ Asn −₃₄ Phe −OH 〔１〕で表わされ、公知のhPTH−（１−34）ペプチド
〔Proc・Nat.Acad.Sci.U.S.A.，71，384（1974）、
Endocrinology，98，1294（1976）、Hoppe−
Seyler's Z.Physiol.Chem.，335，415（1974）〕の
８位および18位のメチオニン（Met）が酸化され
た誘導体である。 hPTHは84ケのアミノ酸よりなるポリペプチド
で、その生物学的活性は、血中カルシウム上昇作
用、血中リン低下作用、尿中カルシウム低下作
用、尿中リン上昇作用、尿中Ｃ−AMP上昇作用、
腎でのビタミンＤの１位水酸化酵素活性の上昇な
どの作用を有するが、hPTH−（１−34）ペプチ
ドは、これらのすべての作用を併せもつ。しかしながら、本発明の〔Met（Ｏ）^8,18〕
hPTH−（１−34）ペプチドは上記各作用のうち
尿中カルシウム低下作用のみを有し、他の作用を
有しない特徴を有し、尿中カルシウム低下作用の
みを必要とする病症に有用な物質である。本発明のペプチド〔１〕は、その方法の条件に
より塩基またはその塩の形で得られる。塩として
は無機酸塩、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコ
ール酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸
などの有機酸との塩である。また本ペプチド
〔１〕はある種の無機物質または有機物質を付加
して錯体を形成し得る。この錯体とは、添加した
時に生成し、ペプチドに特続作用を与える化合物
を意味する。本発明のペプチド〔１〕を製造するには、公知
のhPTH−（１−34）ペプチド〔Hoppe−
Seyler's Z.Physiol.Chem.，335，415，（1974）〕
を水溶液中、緩和な酸化剤、例えば過酸化水素水
で酸化することにより行われる。上記の酸化反応
は、通常室温で充分に進行する。得られた反応液
に水を加え、凍結乾燥することにより目的とする
ペプチド〔１〕が得られる。また、本発明のペプチド〔１〕は、式〔１〕で
示されるアミノ酸順序に個々の保護されたアミノ
酸および（または）保護された低級ペプチドを液
相合成法により縮合し、縮合反応の最終段階でＮ
末端のアミノ基の保護基および側鎖の官能基の保
護基を酸分解により脱離する別法によつても得ら
れる。縮合反応自体はペプチド合成のための常法
手段に従つて、保護基の着脱、縮合反応を繰り返
すことにより行われる。即ち、本ペプチド〔１〕
の原料ならびにすべての中間体の製造において使
用される各種保護基はペプチド合成で既知な保護
基が用いられる。このような保護基はペプチド合
成化学の分野の文献ならびに参考書に記載されて
いる。例えば、α−アミノ基の保護にｔ−ブチル
オキシカルボニル基を用い、Ｎ末端のα−アミノ
基の保護にベンジルオキシカルボニル基を用い、
リジンのε−アミノ基の保護にＯ−クロロベンジ
ルオキシカルボニル基を用い、α−カルボキシル
基の保護にメチルエステル基、ベンジルエステル
基を用い、側鎖のカルボキシル基の保護にベンジ
ルエステル基を用い、セリンの水酸基の保護にベ
ンジル基を用い、アルギニンのグアニジノ基中の
アミノ基の保護にメシチレン−２−スルホニル基
を用いるのが好ましい。本目的化合物〔１〕の合成においては、個々の
アミノ基および（または）低級ペプチドの縮合
は、例えば、保護されたα−アミノ基および活性
化末端カルボキシル基をもつアミノ酸またはペプ
チドと遊離のα−アミノ基および保護された末端
カルボキシル基をもつアミノ酸またはペプチドと
を反応させることにより実施することができる。この場合、カルボキシル基は、例えば酸アジ
ド、酸無水物、酸イミダゾリドまたは活性エステ
ル、例えばシアノメチルエステル、ｐ−ニトロフ
エニルエステル、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド
エステル、２，４，５−トリクロロフエニルエス
テルなどに変換することによつて活性化すること
ができる。またカルボジイミド、例えばＮ，
N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エ
チル−N′−３−ジメチルアミノプロピルカルボ
ジイミド、Ｎ，N′−カルボニルジイミダゾール、
イソオキゾリウム塩、例えばウツドワード反応剤
などの縮合剤を使用して反応させることによつて
活性化することができる。本発明において好ましい縮合方法は、アジド
法、活性エステル法、ビユンシユ法〔Z.
Naturforsch.，216，426（1966）〕またはガイガー
法〔Chem.Ber.，103，788（1970）〕などを用いる
のが適する。縮合順序は式〔１〕で示されるアミ
ノ酸順序であれば、如何なる順序からも合成し得
るが、Ｃ末端側から順次アミノ酸および（また
は）ペプチドを連結させるのが好ましい。メチオニンはそれ自体で酸化してから使用して
もよいし、メチオニンを含む適当なペプチドフラ
グメントを得た段階で酸化してもよい。上記の縮合反応におけるα−アミノ基の保護
基、例えばｔ−ブチルオキシカルボキシル基はト
リフルオロ酢酸で脱離される。α−カルボキシル
基の保護基、例えばメチルエステルはこれを希薄
な水酸化ナトリウム溶液で分解して遊離のカルボ
キシル基にできる。またはヒドラチドあるいはト
リクロロエトキシカルボニルヒドラチドのような
保護ヒドラチドに変えることができる。こうして保護されたＮ末端α−アミノ基、ε−
アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基、側鎖カルボキ
シル基、グアニジノ基および（または）水酸基を
有するテトラトリアコンタペプチドが得られる。
これらの保護基は、好ましくは酸分解、例えば無
水弗化水素によつて一段階で脱離される。このようにして得られたペプチド〔１〕は、ペ
プチドまたは蛋白質を精製する公知の手段によつ
て分離精製することができる。例えば、セフアデ
ツクスＧ−25、セフアデツクスＧ−50、セフアデ
ツクスLH−20などのゲル過剤を用いるゲル
過、カルボキシメチルセルロース、イオン交換樹
脂などを用いるカラムクロマトグラフイーなどに
より行うことができる。次に、本発明のペプチド〔１〕の生物学的活性
について述べる。 (1) hPTH−（１−34）および〔Met（Ｏ）^8,18〕
hPTH−（１−34）の血中カルシウム、リン、尿
中カルシウム、リンおよびＣ−AMPに及ぼす影
響試験方法標準食で飼育した体重300ｇのSprangue−
Dawley（S.D.）ラツト（オス）の大腿動脈にカニ
ユーレを挿入し、４％グルコース、5mMCaCl₂、
5mMMgCl₂、20mMNaCl、2.5mMKClを含む栄
養液を３ml／時間の速度で各々hPTH−（１−34）
ペプチドおよび〔Met（Ｏ）^8,18〕hPTH−（１−
34）ペプチド2μｇ／時間と共に持続的に注入し
た。両ペプチドの投与は各１時間行い、血中およ
び尿中のカルシウム濃度は原子吸光計（日立208）
で測定し、血中および尿中の無機リン量は
GoldenbergおよびFernandeyの方法〔Clinical
Chemistry，12，871（1966）〕で測定し、また尿
中のＣ−AMPはHonmaらの方法〔Biochem.
Med.，18，257（1977）〕で測定した。測定結果 hPTH−（１−34）における血中カルシウム、
リン、尿中カルシウム、リンおよびＣ−AMPを
測定した結果は、第１図の通りであつて、血中カ
ルシウム上昇作用、血中リン低下作用、尿中カル
シウム低下作用、尿中リン上昇作用および尿中Ｃ
−AMP上昇作用を有する。これに対し〔Met
（Ｏ）^8,18〕hPTH−（１−34）における血中カルシ
ウム、リン、尿中カルシウム、リンおよびＣ−
AMPを測定した結果は、第２図の通りであつて、
尿中カルシウム低下作用のみを有し、他の作用を
有しない特徴を有する。 (2) hPTH−（１−34）および〔Met（Ｏ）^8,18〕
hPTH−（１−34）の腎における25−ヒドロキシ
ビタミンD₃−１位水酸化酵素に及ぼす影響試験方法体重50ｇのウイスターラツト（オス）をビタミ
ンＤ欠乏食（0.45％カルシウム、0.3％リンを含
む）にて飼育し、６週目にペントバルビタール
（50mg／Kg体重）を静脈注射して麻酔させ、甲状
腺、副甲状腺摘除術を行つた。次に左大腿動脈に
カニユーレを挿入し、前記栄養液を３ml／時間の
速度で各々hPTH−（１−34）および〔Met（Ｏ）^8,
^１８〕hPTH−（１−34）1.5μｇ／時間と共に持続
的に注入した。両ペプチドの投与は各１時間行
い、注入開始24時間後に〔³H〕25−ヒドロキシ
ビタミンD₃（9Ci／mM）0.5μCiを静注し、その６
時間後に大腿動脈カニユーレより採血した。血液
は血漿分離し、BlighおよびDyerの方法（Can.J.
Biochem.physiol.，37，911（1959）〕に従い、血
中〔³H〕１，25−ジヒドロキシビタミンD₃の量
を求めた。測定結果測定した結果は第１表の通りであつて、hPTH
−（１−34）は腎でのビタミンＤの１位水酸化酵
素活性の上昇作用を有するが、〔Met（Ｏ）^8,18〕
hPTH−（１−34）は上記作用を有しない。

【表】次に、実施例を挙げて本発明の製造例について
述べる。実施例１〔Met（Ｏ）^8,18〕hPTH−（１−34）；Ｈ−Ser−
Val−Ser−Glu−Ile−Gln−Leu−Met（Ｏ）−His
−Asn−Leu−Gly−Lys−His−Leu−Asn−Ser
−Met（Ｏ）−Glu−Arg−Val−Glu−Trp−Leu
−Arg−Lys−Lys−Leu−Gln−Asp−Val−His
−Asn−Phe−OH hPTH−（１−34）；Ｈ−Ser−Val−Ser−Glu
−Ile−Gln−Leu−Met−His−Asn−Leu−Gly
−Lys−His−Leu−Asn−Ser−Met−Glu−Arg
−Val−Glu−Trp−Leu−Arg−Lys−Lys−Leu
−Gln−Asp−Val−His−Asn−Phe−OH10mg水
2.5mlに溶かし、これに約１％過酸化水素水250μ
を加え、37℃で30分間撹拌した。反応液に水
2.25mlを加え凍結乾燥して〔Met（Ｏ）^8,18〕hPTH
−（１−34）を得た。収量アミノ酸分析：10mg (1) 酸加水分解（２％チオグリコール酸を含む
6N塩酸0.5mlでの105℃、24時間加水分解）；
Asp4.11(4)、Ser2.46(3)、Glu5.10(5)、Gly1.02
(1)、Val2.83(3)、Met1.97(2)、Ile0.97(1)、
Leu5.00(5)、Phe0.95(1)、Lys3.11(3)、His2.44
(3)、Arg1.97(2)、Trp0.85(1) (2) 酵素分解（トリプシンで37℃、１時間、アミ
ノペプチダーゼＭで37℃、24時間酵素分解）；
Asp1.25(1)、Asn3.29(3)、Ser2.82(3)、Glu3.00
(3)、Gln1.27(2)、Gly1.26(1)、Val3.27(3)、Met
（Ｏ）2.57(2)、Ile1.15(1)、Leu5.00(5)、Phe1.10
(1)、Lys3.22(3)、His2.35(3)、Arg1.90(2)、
Trp0.71(1) 薄層クロマトグラフイー〔担体；メルク社製セ
ルロース、展開溶媒；ブタノール−ピリジン−酢
酸−水（15：10：３：12）；Rf＝0.50〔hPTH−
（１−34）；Rf＝0.59〕

【図面の簡単な説明】

第１図は公知のhPTH−（１−34）ペプチドの
血中カルシウム、血中リン、尿中カルシウム、尿
中リンおよび尿中Ｃ−AMPに及ぼす影響を示す
曲線を表わし、第２図は本発明の〔Met（Ｏ）^8,18〕
hPTH−（１−34）ペプチドの血中カルシウム、
血中リン、尿中カルシウム、尿中リンおよび尿中
Ｃ−AMPに及ぼす影響を示す曲線を表わす。

Claims

【特許請求の範囲】１式Ｈ−Ser−Val−Ser−Glu−Ile−Gln−Leu−Met
（Ｏ）−His−Asn−Leu−Gly−Lys−His−Leu−
Asn−Ser−Met（Ｏ）−Glu−Arg−Val−Glu−
Trp−Leu−Arg−Lys−Lys−Leu−Gln−Asp−
Val−His−Asn−Phe−OH で表わされるペプチドまたはその塩。