JPH0853498A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 生化学試薬や癌その他の疾病の診断薬、治療
薬として有用な、ヒト血管透過性因子に対する中和活性
を有するモノクロナール抗体を提供する。 【構成】 アミノ酸残基数が１２１のヒト血管透過性因
子と反応するが、該因子のアミノ末端から奇数番目のア
ミノ酸を起点とする連続した１０個のアミノ酸配列のペ
プチドのいずれとも反応しないモノクローナル抗体、こ
の血管透過性因子モノクローナル抗体を有効成分とする
制癌剤、およびこの血管透過性因子モノクローナル抗体
からのキメラ抗体またはひと化抗体を有効成分とする制
癌剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト血管透過性因子
（以下ＶＰＦという）に対するモノクローナル抗体に関
するものである。このモノクローナル抗体はＶＰＦに特
異的に反応し、ＶＰＦの生理活性を阻害することより、
ＶＰＦの生化学的解析、癌やその他の疾病の診断、治療
および疾病の進行や治療効果の判定などに広く利用する
ことができるものであり、医薬業界で利用されるもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】血管新生すなわち毛細血管内皮細胞の増
殖、移動及び組織への浸潤は胎児の生長、創傷治癒、癌
細胞の増殖などの生理的又は病理的現象において重要な
役割を果たしていることが知られている[(Folkman,J.,C
ancer Res.46:467(1986)]。血管新生を誘導する因子と
しては、直接的に血管内皮細胞に作用する物質として塩
基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth fac
tor,bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibroblas
t growth factor,aFGF)、血管内皮細胞増殖因子／血管
透過性因子(vascular endothelial cell growth factor
/ vascularpermeability factor,VEGF/VPF)、血小板由
来内皮細胞増殖因子(platelet-derived endothelial ce
ll growth factor,PD-ECGF)等が、又、間接的に血管内
皮細胞に作用する物質としてtransforming growth fact
or-α(TGF-α)、transforminggrowth factor-β(TGF-
β)、angiogenin、tumor necrosis factor-α(TNF-α)
等が知られている[Folkman,J. & Shing,Y.,J.Biol.Che
m.,267:10931(1992)]。

【０００３】血管透過性因子に関しては、マウス、ラッ
ト、モルモット、ウシ及びヒトの正常又は腫瘍細胞株で
分泌されていること、及び、組織別では脳、下垂体、腎
臓、卵巣に存在することが明らかにされている[(Ferrar
a, N., et. al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]。
又、ＶＰＦに関しては、乳癌の血管新生と転移[Weider,
N, et.al. N.Engl.J.Med. 324:1(1991)] や、腎細胞癌
の血管新生[医学のあゆみ,168:231(1994)]、あるいは網
膜疾患における血管新生[Adamis,A.P. et.al., Bioche
m. Biophys. Res. Comm., 193:631(1993)]に関与してい
ることが報告されている。さらに、血管透過性因子は標
的細胞表面に存在する受容体（flt, fms-like tyrosine
kinase)と結合することにより細胞内へシグナルを伝達
することも明らかにされているが[De Vies,C. et. al.
Science,255:989(1992)]、血管透過性因子とその受容体
との相互作用機構やシグナル伝達機構については詳細に
は解明されていない。

【０００４】ＶＰＦ遺伝子については、その cＤＮＡが
すでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列も
推定されている。このＶＰＦ遺伝子からアミノ酸残基数
の異なる４種類の蛋白（アミノ酸残基数が１２１個、１
６５個、１８９個、２０６個の４種類）が作られ、それ
らの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの(ＶＰＦ121)
と１６５個のアミノ酸残基数のもの(ＶＰＦ165)が、血
管内皮細胞に対する作用が強いと言われている[(Ferrar
a,N., et. al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]。ＶＰ
Ｆ121 はＶＰＦ165 のカルボキシル末端付近の４４個の
アミノ酸が欠損したものであるが、ＶＰＦ121 とＶＰＦ
165 の間で、血管内皮細胞に対する作用の違いがあるか
どうかについては明らかにはされていない。

【０００５】モノクローナル抗体は抗血清（ポリクロー
ナル抗体）に比べて特異性が高く、抗原決定基が単一で
あるため必要な親和性の抗体を選択でき、恒常的に均一
な品質のものを得ることができるという特長を有してい
るため、生化学的な解析や臨床面における種々の疾患の
診断に広く使用されている。又、マウスモノクローナル
抗体の作製技術はKohler & Milstein によりにすでに確
立されており[Kohler & Milstein, Nature 256:495(197
5)]、蛋白質やペプチドや糖質や脂質あるいは低分子化
合物に対するモノクローナル抗体の作製が可能である。
ＶＰＦに対するモノクローナル抗体もＶＰＦ165 につい
てはすでに取得されているが、その抗体のＶＰＦ中の反
応部位は明らかにはされてはおらず、もちろんＶＰＦ12
1 に対する反応性も不明である[Kim, K. J. et. al. Gr
owth Factors,7:53(1992)]。一方、ＶＰＦ121 はＶＰＦ
165 のアミノ酸配列の一部分のアミノ酸配列に相当する
ため、ＶＰＦ121 に対するモノクローナル抗体はＶＰＦ
165 に対しても反応する可能性が高い。したがって、Ｖ
ＰＦの抗体を作製する場合にはＶＰＦ121 を抗原として
用いるのが適当であると考えられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らはＶ
ＰＦ121 に対するモノクローナル抗体を作製し、ＶＰＦ
の生化学的解析、癌やその他の疾病の診断、治療および
疾病の進行や治療効果の判定などに広く利用するために
研究を行った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行った結果、遺伝子操作技術によ
りＶＰＦ121 をグルタチオンS-トランスフェラーゼ（Ｇ
ＳＴ）との融合蛋白として大腸菌で産生させ、この融合
蛋白を抗原としてマウスモノクローナル抗体の作製を試
みて、ＶＰＦ121 に対して反応性を有し、且つ中和活性
を有するが、ＶＰＦ121 のアミノ酸配列中の連続した１
０個のアミノ酸配列に相当するペプチドには反応性を有
しないモノクローナル抗体を見出し、本発明を完成させ
た。即ち、本発明は、アミノ酸残基数が１２１のヒト血
管透過性因子と反応するが、該因子のアミノ末端から奇
数番目のアミノ酸を起点とする連続した１０個のアミノ
酸配列を有するペプチドのいずれとも反応しないことを
特徴とするモノクローナル抗体に関するものである。更
に本発明は、前記ＶＰＦモノクローナル抗体、該血管透
過性因子モノクローナル抗体からのキメラ抗体またはひ
と化抗体を有効成分とする制癌剤に関するものである。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。 （１）モノクローナル抗体の製造 ＶＰＦモノクローナル抗体は、マウスをＶＰＦで免役
し、脾細胞を取り出し、これとマウスミエローマ細胞と
を融合して得たハイブリドーマ細胞を培養することによ
り製造することができる。このハイブリドーマの製造
は、例えばKohlerと Milstein の方法[Nature 256:495
(1975)]等により行うことができる。 抗体産生細胞の調整 免疫用マウスには、ＢＡＬＢ／Ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６系マ
ウス、Ｃ３Ｈ系マウス等が用いられる。そして、免疫マ
ウス１匹（８〜１２周齢）に対してＶＰＦ５０〜１００
μｇの量を抗原として２〜３週間ごとに２〜３回免疫を
行う。マウスの飼育及び脾細胞の採取は常法に従って行
われる。尚、免疫の際には、ＶＰＦに例えばグルタチオ
ンＳ−トランスフェラーゼ等を融合させ、得られた蛋白
質を抗原として用いることもできる。 ミエローマ細胞の調整 ミエローマ細胞としては、Ｓp2／0-Ａg１４(Ｓp2) 、Ｐ
3／ＮＳ1／1−Ａg4−1(ＮＳ−1)、Ｐ3×63Ａg8Ｕ.1等が
挙げられる。これら細胞の継代培養は、常法に従って行
われる。 細胞融合 脾細胞とミエローマ細胞と１：１〜１０：１の割合で混
合し、分子量１０００〜４０００のポリエチレングリコ
ール(以下ＰＥＧという)、ダルベッコ改変イーグル培地
中、両細胞を３０〜４０℃、１〜３分間インキュベート
することにより細胞融合を行うことができる。 ハイブリドーマの選択 融合細胞(ハイブリドーマ)の選択は、ヒポキサンチン
(１０^-3〜１０^-5Ｍ)、アミノプテリン(１０^-6〜１０^-7
Ｍ)、チミジン(１０^-5〜１０^-6Ｍ)、ペニシリン(１００
〜２００単位／ml)、牛胎児血清(１０〜２０％)、スト
レプトマイシン(１００〜２００μｇ／ml)、2-メルカプ
トエタノール(１０^-5〜１０^-6Ｍ)を含む基礎培地を用い
て培養し、生育してくる細胞をハイブリドーマとするこ
とにより行われる。基礎培地としては、動物細胞の培養
に一般に用いられるＲＰＭＩ１６４０培地、イーグルＭ
ＥＭ培地、イスコス改変ダルベッコ培地等が用いられ
る。 ハイブリドーマの培養 ハイブリドーマのクローン化は、限界希釈法により、少
なくとも２回繰り返して行う。ハイブリドーマを通常の
動物細胞の培養と同様にして培養すれば、培地中に本発
明の抗体が産生される。通常、５〜１０×１０⁵個／ml
のハイブリドーマ細胞を、牛胎児血清(１０％)、ペニシ
リン(１００単位／ml)、ストレプトマイシン(１００μ
ｇ／ml)、2-メルカプトエタノール(５×１０^-5Ｍ)を含
むＲＰＭＩ１６４０培地中で５％ＣＯ₂存在下、３７
℃、３〜４日間培養することによって培養液中に抗体が
分泌、蓄積される。又、ハイブリドーマ細胞をＢＡＬＢ
／Ｃ系マウスの腹腔内に移植して増殖することにより、
腹水中に本発明の抗体を蓄積させることもできる。 モノクローナル抗体の採取及び精製 ハイブリドーマ細胞の培養液中又は腹水中に蓄積したモ
ノクローナル抗体は、従来から用いられている硫安分画
法、ＰＥＧ分画法、陰イオン交換クロマトグラフィー及
びゲル濾過クロマトグラフィーを用いる方法で精製され
る。又、プロティンＡやプロティンＧ等のアフィニティ
ークロマトグラフィーによる方法も利用できる場合があ
る。モノクローナル抗体の選別には、酵素免疫測定法、
ウェスタンブロッティング法等が用いられる。又、モノ
クローナル抗体のＩｇＧアイソタイプの決定は、モノク
ローナル抗体の酵素免疫測定法又はオクタロニー法等に
よって行うことができる。 （２）モノクローナル抗体の反応部位の同定 ＶＰＦのアミノ酸配列の一部分に相当するペプチド
の作製 ＶＰＦ121 のアミノ末端からのアミノ酸残基数が奇数の
アミノ酸から、連続した１０個のアミノ酸を一つのペプ
チドとして、５７種類のペプチド(１種のみ９個のアミ
ノ酸からなる)を設計する。設計された各ペプチドは、
例えば、マルチピンペプチド合成法〔Maeji, N. J. et.
al., J. Immunol. method, 134:23(1990)〕等により合
成することができる。尚、合成したペプチドの定量はオ
ルトフタルアルデヒドを用いてアミノ基を定量すること
により行うことが可能である。 モノクローナル抗体と反応するペプチドの同定 以上のようにして合成した５７種のペプチドはＶＰＦ12
1 の全領域に対応するものである。したがって、５７種
のペプチドとモノクローナル抗体との反応性を調べるこ
とにより、当該モノクローナル抗体がＶＰＦのどの部位
に反応しているかを明らかにすることができる。反応性
の測定には、酵素免疫測定法、オクタロニー法、ウェス
タンブロッティング法等が用いられる。

【０００９】（３）モノクローナル抗体の制癌剤として
の使用 本発明のＶＰＦモノクローナル抗体またはそのキメラ抗
体またはひと化抗体を制癌剤として投与する場合には、
投与する対象を特に限定しない。例えば、個々の癌種の
予防あるいは治療することを特異目的として用いること
ができる。また、投与する方法は経口又は非経口でもよ
く、経口投与には舌下投与を包含する。非経口投与に
は、注射、例えば皮下、筋肉、静脈注射、点滴、座剤等
を含む。また、その投与量は動物か人間かによって、ま
た年令、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変
えることができる。この場合、本発明のＶＰＦモノクロ
ーナル抗体の有効量と適切な希釈剤及び薬学的に使用し
得る担体の組成物として投与される有効量は０.１〜１
００mg／kg体重／日であり、１日１回から数回に分けて
投与される。本発明のＶＰＦモノクローナル抗体を経口
投与する場合、それに適用される錠剤、顆粒剤、細粒
剤、散剤、カプセル剤等は、通常それらの組成物中に製
剤上一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢
剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加物を含有する。また、
経口用液体製剤としては、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シ
ロップ剤等いずれの状態であってもよく、また、使用す
る際に再溶解させる乾燥生成物であってもよい。更に、
その組成物は添加剤、保存剤のいずれを含有してもよ
い。

【００１０】また、非経口投与の場合には、安定剤、緩
衝剤、保存剤、膨張化剤等の添加剤を含有し、通常単位
投与量アンプル若しくは多投与量容器又はチューブの状
態で提供される。上記の組成物は使用する際に適当な担
体、例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉
体であってもよい。

【００１１】

〔実施例１〕

（１）ＶＰＦモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマの作製 単離したＶＰＦ cＤＮＡを、グルタチオンS-トランスフ
ェラーゼ(ＧＳＴ)との融合蛋白(ＧＳＴ−ＶＰＦ)として
大腸菌で発現させることにより、抗原として使用する蛋
白を得た。次いで、得られた蛋白を抗原として常法に従
ってマウスモノクローナル抗体を作製した。すなわちＧ
ＳＴ−ＶＰＦ(１００μｇ)をフロイント完全アジュバン
トと等量混合し、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に０日、
１４日後、２５日後の３回投与することにより免疫した
マウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞(ＳＰ2)をＰＥ
Ｇ存在下で、１分間インキュベーションすることにより
細胞融合させた。得られた細胞をＨＡＴ培地〔組成：ヒ
ポキサンチン(１×１０^-4Ｍ)、アミノプテリン(４×１
０^-7Ｍ)、チミジン(１.６×１０^-5Ｍ)、ペニシリン(１
００単位／ml)、牛胎児血清(２０％)、ストレプトマイ
シン(１００μｇ／ml)、2-メルカプトエタノール(２×
１０^-5Ｍ)を含むＲＰＭＩ１６４０培地〕中で培養する
ことによりハイブリドーマを選別した。得られたハイブ
リドーマは限界希釈法によりクローニングした。一方Ｖ
ＰＦを産生する酵母を、単離したＶＰＦ cＤＮＡを含む
環状ＤＮＡを酢酸リチウム法で酵母Ｓaccharomyces cer
evisiae に導入することにより作成し、この酵母の培養
液中から陽イオン交換クロマトグラフィー（東ソー株式
会社製ＴＳＫ−ＳＰ６５０）、硫安沈澱及びゲル濾過ク
ロマトグラフィー（ファルマシア社製Ｓuperdex-７５）
を用いて酵母由来のＶＰＦ（以下ＹＶＰＦとする）を調
製した。このＹＶＰＦとクローン化したハイブリドーマ
の培養上清の反応性を酵素免疫測定法により調べ、ＹＶ
ＰＦと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択した。又、このハイブリドーマが産生する
モノクローナル抗体をＭＶ101 と命名した。尚、得られ
たモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１４３４５として寄託されている。

【００１２】（２）ＶＰＦモノクローナル抗体の調製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水をプロテインＧアフィニティーカラム(MAbTrap
GII、ファルマシア社製)で処理することにより精製し
たモノクローナル抗体ＭＶ101 を得た。該ＭＶ101 抗体
のクラスを抗マウス免疫グロブリンサブクラス特異的抗
体を用いた酵素免疫測定法により調べた結果、ＩgＧ1
であった。また、下記の方法で測定したＶＰＦ121 に対
する解離定数は以下のとおりであり、従来のものに比較
して本発明のモノクローナル抗体は、ＶＰＦに対して強
い親和性を有することかせ判る。なお、ＶＰＦ165 を抗
原とする市販のモノクローナル抗体(R&D Systems Inc.
製Quantikine) は、ＶＰＦ121 との結合反応に異常が認
められ、解離定数を求めることはできなかった。 〇 １.０９×１０^-11M±０.０９×１０^-11M 解離定数の測定方法 モノクローナル抗体を０.１M塩化ナトリウムを含む２５
mM炭酸緩衝液(pＨ ９.０)で２μg/mlに調整し、取外し
可能な有穴プレートに１００μlずつ添加し、４℃で一
晩放置する。次に穴から溶液を除き、１％ＢＳＡ−ＰＢ
Ｓを３００μlずつ添加し、３７℃で４時間放置する。
１％ＢＳＡ−ＰＢＳを取り除いた後、０.１％ＢＳＡ−
ＰＢＳで調整したＶＰＦと¹²⁵Ｉ−ＶＰＦ(¹²⁵Ｉラベル
化はクロラミンＴ法による)反応混液を穴あたり２００
μl添加し、一晩放置する。この反応混液中のＶＰＦ濃
度は、ＶＰＦが０〜１ng/well、¹²⁵Ｉ−ＶＰＦが１００
００cpm/well(６２.０pg/ml)とする。穴から反応混液を
とり除き、０.１％ＢＳＡ−ＰＢＳ(-)で６回洗浄した
後、穴を１個ずつ切離して分析用チューブに入れ、ガン
マーカウンターにてカウントし、その結果から撒布図か
ら解離定数を求める。

【００１３】（３）抗ＶＰＦポリクローナル抗体の作製 ＧＳＴ−ＶＰＦを抗原として常法によりウサギを免疫し
た。抗体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオン
交換カラムクロマトグラフィーで処理することによりウ
サギ抗ＶＰＦポリクローナル抗体のＩgＧ画分を得た。
ＩgＧ画分の一部をペプシンで消化してＦ(ab')₂を調製
し、マレイミド法によりペルオキシダーゼと結合させ、
ペルオキシダーゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリクローナ
ル抗体を得た。

【００１４】（４）モノクローナル抗体とＹＶＰＦとの
反応性 ＭＶ101 抗体とＹＶＰＦとの反応の特性を酵素免疫測定
法により調べた。まず９６穴の酵素免疫測定用プレート
にＭＶ101 抗体(５μg/ml)を入れ４℃で一晩放置するこ
とによりＭＶ101 抗体をプレートに吸着させた。0.１％
ウシ血清アルブミン(以下ＢＳＡという)を含むリン酸緩
衝化生理的食塩水(以下ＰＢＳという)でプレートの穴を
６回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを穴一杯に入
れ室温で１時間放置した。穴から１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓを除いた後、種々の濃度のＹＶＰＦを入れ室温で１時
間放置した。0.１％ＢＳＡを含むＰＢＳで６回洗浄後ペ
ルオキシダーゼ標識したウサギ抗ＶＰＦポリクローナル
抗体（0.１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液）を入れ室温で１
時間放置した。0.１％ＢＳＡを含むＰＢＳで６回洗浄後
0.２mg/mlオルトフェニレンジアミンおよび0.０１５％
過酸化水素を含む0.１５Ｍクエン酸緩衝液(pH=５.0)を
入れて発色させた。反応は１０％硫酸を加えて停止させ
た後、吸光度(ＯＤ490/650)を測定した。以上の方法で
測定した結果をグラフにプロットし図１に示した。ＹＶ
ＰＦの濃度が２〜１００ng/ml の範囲で吸光度の増加に
直線性が認められ、ＭＶ101 抗体がＹＶＰＦと特異的に
反応すること及びこの測定系で２〜１００ng/ml のＹＶ
ＰＦが定量できることがわかった。

【００１５】（５）モノクローナル抗体の反応部位の同
定 （ａ）ＶＰＦのアミノ酸配列の一部分に相当するペプチ
ドの作製 ＶＰＦ121 のアミノ末端からのアミノ酸残基数が奇数の
アミノ酸から連続した１０個のアミノ酸を１つのペプチ
ドとして、５７種のペプチド(１種のみ９個のアミノ酸
からなる)を設計し、各ペプチドをマルチピンペプチド
合成法[Maeji,N,J, et.al. J.Immunol.method,134:23(1
990)]により合成した。まず９６穴アッセイプレート用
ピンブロックのピンの先端に導入された9-フルオレニル
メトキシカルボニル(Fmoc)-β-アラニンからピペリジン
によりFmoc基を除去した後、ジシクロヘキシカルボジイ
ミドとヒドロキシベンゾトリアゾール存在下でFmoc-ア
ミノ酸を縮合させた。N,N-ジメチルホルムアミドで洗浄
後、再びジシクロヘキシカルボジイミドとヒドロキシベ
ンゾトリアゾール存在下でFmoc-アミノ酸を縮合させ、
この操作を繰り返すことにより目的のペプチドを合成し
た。縮合反応終了後、無水酢酸でアセチル化を行い、さ
らにトリフルオロ酢酸で側鎖保護基を除去した。ピン上
で合成したペプチドはピンを中性溶液中に浸すことによ
り切り出した。合成したペプチドの定量はオルトフタル
アルデヒドを用いてアミノ基を定量することにより行っ
た。合成した５７種のペプチドのアミノ酸配列を以下の
表１、表２及び表３に示す。

【００１６】

【表１】

【００１７】

【表２】

【００１８】

【表３】

【００１９】表中、１から５７までの数字はヘプチド識
別番号を示す。尚、「配列場所」に記載した番号（m-n)
は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち何番目(m番
目）から何番目(n番目）までの位置に相当するものであ
るかを意味する。例えば、識別番号１の配列場所は、配
列番号１記載のアミノ酸配列のうち、第１番目から第１
０番目までを意味し、括弧内はそのアミノ酸の表示（第
１番目のアラニン〜第１０番目のアスパラギン）であ
る。

【００２０】（ｂ）ＭＶ101 抗体と反応するペプチドの
同定 以上のようにして合成した５７種のペプチドはＶＰＦ12
1 の全領域に対応するものである。したがって５７種の
ペプチドとＭＶ101 抗体との反応性を調べることにより
ＭＶ101 抗体がＶＰＦのどの部位に反応しているかを明
らかにすることができる。そこで酵素免疫測定法により
５７種のペプチドとＭＶ101 抗体との反応性を調べた。
９６穴スミロンＡプレート（住友ベークライト社製）に
２％グルタルアルデヒドを入れ室温で２時間放置した後
水で洗浄し、５７種の１０μＭペプチド溶液を入れ４℃
で一晩放置した。0.１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液でプレ
ートの穴を６回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを
入れ室温で１時間放置した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳを
除いた後、ウサギ抗ＶＰＦ抗体(0.１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。0.１％ＢＳＡ
を含むＰＢＳで６回洗浄後ペルオキシダーゼ標識したヒ
ツジ抗ウサギＩgＧ(カッペル社)(0.１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳ溶液）を入れ室温で１時間放置した。0.１％ＢＳＡ
を含むＰＢＳで６回洗浄後0.２mg/mlオルトフェニレン
ジアミンおよび0.０１５％過酸化水素を含む0.１５Ｍク
エン酸緩衝液(pH=５.0)を入れて発色させた。反応は１
０％硫酸を加えて停止させた後、吸光度（ＯＤ490/650)
を測定した。以上の方法で測定した結果、５７種のペプ
チドはすべて本モノクローナル抗体と特異的には反応し
なかった。

【００２１】（６）ＶＰＦの生理活性に対するモノクロ
ーナル抗体の作用 ＭＶ101 抗体がＶＰＦの生理活性を阻害するかどうかを
血管内皮細胞の細胞増殖促進活性に対する本モノクロー
ナル抗体の作用を調べることにより行なった。まず、本
発明者等がクローン化し通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託した、ＶＰＦを産生する細胞Ｈe
Ｌa/v5（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３１８５）の調製
培地を作製し、モノクローナル抗体を加えて室温で30分
静置した。この溶液のＶＰＦ活性を測定するために予め
１２穴プレートに培養しておいた１０⁴個のヒト臍帯由
来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に、モノクローナル抗体
−ＨeＬa/v5調製培地混合液を混ぜ合わせ、ＲＰＭＩ１
６４０ ４５％、ＤＭＥＭ ４５％、ＦＢＳ １０％、
ウシインシュリン １０mg/l、ヒトトランスフェリン
５mg/l、2-メルカプトエタノール 0.０１mM、2-アミノ
エタノール 0.０１mM、亜セレン酸ナトリウム １０nM
（以下この溶液をアッセイ培地という）が１mlとなるよ
うにし、３７℃、５％ＣＯ₂ で５日間培養し細胞数を比
較した。ＨeＬa/v5調製培地0.４ml中には約１.5ngのＶ
ＰＦが含有されていることから[Kondo,S. et.al. Bioch
em. Biophys. Res. Commun. 194:1234(1993)]、この値
をもとにしてアッセイ培地中のＶＰＦ分子数を求めた。
このＶＰＦに対して加える抗体分子を０、１、６、３
６、２１６倍に設定して実験を行ない、５日間培養した
後の細胞数を測定し、抗体を添加しなかった場合の細胞
数に対する百分率をグラフにプロットした(図２)。ＭＶ
101 抗体は添加量に依存してＶＰＦによるＨＵＶＥＣの
増殖を抑制する作用がみられた。一方ＶＰＦとは全く異
なる蛋白であるアルファフェトプロテインに対するモノ
クローナル抗体では、ＭＶ101 抗体でみられたようなＨ
ＵＶＥＣ細胞の増殖抑制効果はみられなかった。このこ
とより、本モノクローナル抗体はＶＰＦの活性を特異的
に阻害する作用(中和活性)を持っていることがわかっ
た。

【００２２】（７）ＶＰＦモノクローナル抗体の薬理試
験 ＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＨＴ−１０８０のヌードマウス
腫瘍系を用いて本発明のモノクローナル抗体の抗腫瘍実
験及び毒性試験を以下の通り行った。予め、腫瘍細胞Ｐ
ＬＣ／ＰＲＦ／５又はＨＴ−１０８０をマウス（ヌード
マウス）に接種し、腫瘍塊ができるまで飼育した。次い
で、腫瘍塊を２mm角程度に切り取り、これを別のヌード
マウスの腹部皮下に移植した。移植翌日より本発明のモ
ノクローナル抗体を、１００μg／マウス／日の投与量
で合計１０回投与した（投与日は、移植後１〜４、７〜
１１及び１４日目とした）。また、モノクローナル抗体
を投与しないもの、本発明のものではないモノクローナ
ル抗体（ＭＶ415 抗体）を投与したものを対照とした。
尚、実験に使用したマウスは、それぞれの腫瘍系につい
て、本発明のモノクローナル抗体投与群、対照群共に４
匹で行った。各群と腫瘍の形成及び腫瘍の大きさ（体
積）を比較した結果、図３及び図４に示す通り、いずれ
の腫瘍塊を移植した場合でも、無投与のものと比較した
場合は勿論、本発明のもの以外のＶＰＦモノクローナル
抗体を投与したものに比較しても、本発明のＶＰＦモノ
クローナル抗体は優れた腫瘍増殖抑制活性が確認され
た。 図３はＰＬＣ／ＰＲＦ／５系を、図４はＨＴ−１
０８０系の腫瘍塊を移植した場合の結果を示す。また、
図３及び図４中、白丸印は本発明のＶＰＦモノクローナ
ル抗体ＭＶ101 投与群、四角印は本発明のものではない
モノクローナル抗体ＭＶ415 投与群、黒丸印は無投与群
を表す。さらに、本発明のモノクローナル抗体をヌード
マウスに投与しても体重減少は認められず、また、毛並
みや行動も正常なヌードマウスと差がないことから、本
発明のモノクローナル抗体は毒性の非常に低いものと考
えられる。

【００２３】以上に明らかにしました様に本発明のモノ
クローナル抗体は、ＶＰＦの生化学的な解析や、癌やそ
の他の疾病の診断および疾病の進行や治療効果の判定な
どに広く利用することができるうえ、腫瘍の抑制剤とし
ても非常に有望なものである。

【００２４】

【発明の効果】ＶＰＦは固形癌の増殖や転移あるいは目
の網膜疾患における血管新生などに関与していることか
ら、ＶＰＦ121 に対するモノクローナル抗体であるＭＶ
101 抗体はＶＰＦの生化学的解析、癌やその他の疾病の
診断、治療および疾病の進行や治療効果の判定などに広
く利用することができる。

【００２５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列： Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser 121 115 120

【図面の簡単な説明】

【図１】ＭＶ101 抗体のＹＶＰＦに対する認識特性を示
す図である。

【図２】ＶＰＦの血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ) への増殖
促進作用に対するモノクローナル抗体の作用を示す図で
ある（ＭＶ101抗体：〇、抗アルファフェトプロテイン
モノクローナル抗体：□）。

【図３】ＭＶ101 抗体の抗腫瘍活性を示す図である（Ｍ
Ｖ101 抗体：○、ＭＶ415 抗体：□、無投与：●）。

【図４】ＭＶ101 抗体の抗腫瘍活性を示す図である（Ｍ
Ｖ101 抗体：○、ＭＶ415 抗体：□、無投与：●）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 浅野 誠 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 松本 友恵 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 松尾 克彦 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 大森 巌 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノ酸残基数が１２１のヒト血管透過
   性因子と反応するが、該因子のアミノ末端から奇数番目
   のアミノ酸を起点とする連続した１０個のアミノ酸配列
   を有するペプチドのいずれとも反応しないことを特徴と
   するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 請求項１記載の血管透過性因子モノクロ
   ーナル抗体を有効成分とする制癌剤。
3. 【請求項３】 請求項１記載の血管透過性因子モノクロ
   ーナル抗体からのキメラ抗体またはひと化抗体を有効成
   分とする制癌剤。