JPH0571232B2

JPH0571232B2 -

Info

Publication number: JPH0571232B2
Application number: JP61004187A
Authority: JP
Inventors: Juzo Udaka; Hideo Kamyama; Junichi Taniguchi; Keiji Adachi
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-01-14
Filing date: 1986-01-14
Publication date: 1993-10-06
Also published as: JPS62164629A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規な抗腫瘍性成分SPF10−12及び
その製法に関するものである。従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）
の生菌体を弱毒化して製剤化したものは、すでに
制癌剤として使用されている。また、溶連菌の菌体を破砕後水または塩類溶液
で有効成分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍
性成分を沈澱として、回収する方法（特公昭38−
1647）、溶連菌を溶菌酵素リゾチーム、セルラー
ゼまたは蛋白質分解酵素により、溶菌し、活性画
分を水溶性区分として分画する方法（英国特許
1163865号）、溶連菌の菌体を破砕後水不溶性物質
を採取し、核酸分解酵素および蛋白分解酵素で処
理する方法（特開昭55−7014）などが知られてい
る。このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水溶性もしくは水不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。このような処理では、精製は複雑となり、有効
成分の単離はきわめて困難であつた。実際に分離
し、有効成分として測定された例では分子量
200000の蛋白質（特公昭48−43841、特開昭51−
44617）及び分子量150000の糖蛋白質（特開昭58
−22026）が知られている程度である。本発明者らは、先に溶連菌の培養液中に抗腫瘍
性成分を溶出させる方法を鋭意研究したところ、
培養中にペニシリン又はその関連物質を添加する
ことによつて抗腫瘍性成分が培養液中に溶出する
ことを見出し（特開昭60−30677号）、培養液中か
ら生理活性物質SPF−１を分離するに至つたので
ある。（特開昭60−30689号）本発明者らは、更に、溶連菌の培養濾液中から
より有効な成分を分離する目的で研究したとこ
ろ、本発明において、癌化白血球培養細胞L1210
（以下培養細胞L1210という）の生育を阻害し、
かつ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性の画
分であることにより特徴づけられる抗腫瘍性成分
SPF10−12を分離するに至つた。本発明の抗腫瘍性成分SPF10−12は元素分析、
呈色反応および赤外線吸収スペクトル等から糖を
含むペプチド様物質と考えられるが、紫外線吸収
スペクトルおよび赤外線吸収スペクトルから、既
知の抗腫瘍性物質とは、相違する新規な物質と認
められるものである。本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性成分SPF10−12生産菌を培養し、培養物から
抗腫瘍性成分SPF10−12を採取することを特徴と
する抗腫瘍性成分SPF10−12の製造法を包含する
ものである。本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性成分SPF10−12生産菌が広く使用で
きる。次に抗腫瘍性成分SPF10−12生産菌を記載
する。ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes） ATCC21060 ストレプトコツカス・エスピー
（Streptococcus sp.） ATCC21597 ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogens） ATCC21546 ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes） ATCC21547 ストレプトコツカス・ピオゲネス
（Streptococcus pyogenes） ATCC21548 培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌の生育に適した培地であれば
任意の培地を使用できる。培養は、PH5.0〜8.0、好ましくは、6.1〜7.2で
あり、培養温度は、30〜40℃、好ましくは、35〜
37℃であり、嫌気的に静置培養または、撹拌培養
を行なうことができる。本発明においては、培養中に適当な時期に、ペ
ニシリンまたは、その関連物質を添加すること
が、抗腫瘍性成分SPF10−12の採取に重要な役割
をはたすことになる。ペニシリンまたは、その関連物質の添加時期
は、35〜37℃の培養で、対数増殖期にかかつて
後、３〜20時間の間、特に５〜10時間が好まし
い。その後１〜20時間、好ましくは３〜15時間培
養を継続することにより、培養中に抗腫瘍性成分
SPF10−12を多量蓄積させることができる。ペニシリンまたはその関連物質としては、すで
に知られたペニシリンと類似の作用をもつ関連物
質であればいかなるものでもよいが、ペニシリン
Ｇが普通用いられる。添加量は、ペニシリンＧで
100〜7000単位／ml、好ましくは、300〜5000単
位／ml培養液程度で十分である。ストレプトコツカス属細菌のペニシリンまた
は、その関連物質の添加培養によつて得られた培
養液は遠心分離によつて菌体を除去し、濾液を得
る。濾液は、硫安を添加し、50〜90％飽和度の画
分を分取するか、もしくは、濾液は、限外濾過膜
を用いて濃縮する。得られた抗腫瘍性成分SPF10−12を含む硫安塩
析物は凍結状態で保存することもできる。この硫安塩析物から抗腫瘍性成分SPF10−12を
抽出するには、塩析物を緩衝液に溶解して用い
る。又、限外濾過膜を用いて得た濃縮液を、その
まま用いることもできる。この水溶液をDEAEセ
ルロースカラムに吸着させ、燐酸緩衝液を用いて
段階的に溶出させ、培養細胞L1210の生育を阻害
する活性画分を分取し、この活性画分をDEAEセ
フアデツクスＡ−25カラムに吸着させ、燐酸緩衝
液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇させつ
つ溶出し、その非吸着部分及び塩化ナトリウム低
濃度部分を分取し、この分画部分を緩衝液に対し
て透析し、ゲル濾過材トヨパールHW−50Fカラ
ムに吸着させ、0.1M NaClを含む燐酸緩衝液で
溶出させ、アンスロン硫酸法による呈色反応及び
培養細胞L1210に対する活性を調べる。ここで培
養細胞L1210に対して強い活性を示す画分すなわ
ち、トヨパールHW50Fの排除限界（以下Voと略
す）付近のアンスロン硫安法による呈色反応でピ
ークを形成する画分を得る。この画分を濃縮し、
トヨパールHW60Fカラムに吸着させ、0.1M
NaClを含む燐酸緩衝液で溶出させる。SPF10−
12はトヨパールHW60Fカラムクロマトグラフイ
ーにおいて280nmの吸収が強く、かつアンスロン
硫酸法に弱い呈色を示す画分として得ることが出
来る。次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF10
−12の凍結乾燥標品は、次の理化学的性質を示
す。１元素元析Ｃ 41.3〜43.5％Ｈ 5.9〜6.7％Ｎ 14.2〜16.6％Ｏ 37.9〜31.4％ Ash 0.7〜1.8％２分解点本物質は165℃で褐変し240℃になる
と黒色となり分解する。３比旋光度〔α〕²⁰ _D＝−80゜〜−95゜（Ｃ＝1.00）４紫外線吸収スペクトル本物質0.1％の水溶
液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示され
る。５赤外線吸収スペクトル第２図に示される。
3300cm^-1付近及び1650cm^-1付近のペプチドによ
る吸収が認められ特徴的である。６塩基性、酸性、中性の区別本物質0.1％の
水溶液のPHは5.5〜6.0である。７物質の色淡褐色８呈色反応ローリー反応＋ビユーレツト反応＋ニンヒドリン反応＋アンスロン硫酸反応＋モーリツシユ反応＋システイン硫酸反応＋オルシン塩酸反応 − ９分子量ゲルル濾過法による測定では分子量
約10000〜40000である。 10 溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ア
セトン、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロ
ロホルム、酢酸エチル等の溶剤には難溶又は不
溶である。次にインビトロにおける培養細胞L1210に対す
る抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法
による呈色反応の方法を示す。抗腫瘍活性の測定方法抗腫瘍活性の測定は、培養細胞L1210の生育阻
止率（IR％）の測定により行つた。 L1210細胞を10％FBS添加RPMI1640培地（５
mg／カナマイシン含有）に懸濁した。この培養
液0.5mlをフアルコン2058チユーブに注加し、細
胞数が１×10⁵cells／tubeになるようにした。次
いでこの培養液に所定量の標品（抗腫瘍性成分
SPF10−12）を目的濃度になるように培養液に溶
解した0.5mlを注加して、37℃で５％CO₂存在下
に培養した。標品を添加して48時間後にトリパン
ブルーによる染色をおこない、次式によりIR
（％）を算出した。 IR（％）＝(A)−各実験群の生細胞数／対照群の生細
胞数×100 ここで(A)とは対照群の生細胞数を示す。対照は標品を含まない培養液0.5mlを用い同時
に行つた。アンスロン硫酸法による呈色反応脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１mlに
２mlのアンスロン試薬（0.20grのアンスロンを
100mlの濃硫酸に溶解したもの）を注加し、混合
30分後、標品１mlに代えて脱イオン水１mlに２ml
のアンスロン試薬を注加した液を対照として
620nmで吸収を測定する。定量値はグルコースを
用いて同様に測定して得た検量式より求める。次に本発明の実施例を示す。実施例１ストレプトコツカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ATCC21060を
BHI培地100mlに接種して37℃、８時間静置培養
をおこなつて得た種培養液を第１表に示す培地
A1lに接種し、種培養と同一条件で嫌気的に前培
養を行つた。第１表培地Ａマルトース 0.25％肉エキス 1.0％ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.25％酸性第一燐酸カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.8 10ジヤーフアーメンターに培地A8を投入
して120℃、10分間加熱殺菌後、37℃まで冷却し
て、前培養液１を接種し、37℃、15.5時間、PH
6.8、300回転／分で撹拌しながら嫌気的に培養す
る。次いでペニシリンG1000単位／ml培養液にな
るように添加して、培養を更に５時間継続した。
得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去し
た。培養濾液は、分画分子量10000の限外濾過膜
（米国、ロミコン社）を用いて、1.5に縮濃し
た。この濃縮液を、DEAEセルロースカラム（５
×70cm）に吸着させた後、10mM、PHを7.0の燐
酸緩衝液を用いて、洗浄し、次いで0.3M塩化ナ
トリウムを含む上記燐酸緩衝液を用いて、段階的
に溶出させ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽
性でかつ培養細胞L1210の生育を阻害する活性画
分を分取した。この活性画分をDEAEセフアデツクスＡ−25カ
ラム（7.5×50cm）に吸着させ、次いで上記燐酸
緩衝液で洗浄後塩化ナトリウム濃度を直線的に上
昇させて溶出を行い、培養細胞L1210に対して活
性のある部分を分取する。この溶出曲線は第３図
に示される。第３図において点線部分は非吸着部
分で、実線部分は塩化ナトリウム添加部分であ
る。Ａは培養細胞L1210生育阻害活性画分で、
MP−２（特開昭60−30689）生育阻害非活性画分
であり、Ｂは培養細胞L1210生育阻害非活性画分
で、MP−２生育阻害活性画分である。Ａの活性画分の溶出液を分画分子量10000の限
外濾過膜（ミリポア社）で30mlに濃縮する。この
濃縮液をトヨパールHW50Fカラム（5.0×100cm）
に吸着させ、次いで、上記燐酸緩衝液中に塩化ナ
トリウム0.1Mを含む溶液で溶出させ、アンスロ
ン硫酸法による呈色反応陽性の画分を分取した。
この溶出曲線は第４図に示される。第４図におい
て実線は全体の溶出曲線を示し、点線はアンスロ
ン硫酸法による呈色反応陽性部分の溶出曲線を示
している。ここでＣはアンスロン硫酸法による呈
色反応陽性画分であるが、培養細胞L1210に対す
る生育阻止活性を調べ活性の強いVo付近の、ア
ンスロン硫酸法でピークを形成するＤ画分を得
る。Ｄ画分は凍結乾燥する。この凍結乾燥標品を
溶解しトヨパールHW60Fカラム（2.6×100cm）
に吸着させ次いでトヨパールHW50Fの場合と同
じ溶出液で溶出する。この溶出曲線は第５図に示される。第５図にお
いて実線は全体の溶出曲線を示し、黒丸付の実線
はアンスロン硫酸法による呈色反応陽性部分の溶
出曲線を示している。ここでアンスロン硫酸法に
よる呈色反応で強い呈色を示すＦの画分をSPF10
−11とし、Ｇの画分をSPF10−12とした。Ｇの画分を凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は
抗腫瘍性成分SPF10−12であり、0.68grを得た。実施例２ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは300単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を10
時間継続した。この培養濾液に硫安を添加し50〜
90％飽和度の画分を分取する。透析により硫安を除き実施例１と同様に精製し
て抗腫瘍性成分SPF10−12 0.34grを得た。実施例３ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは3000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を３
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−12 0.73grを得た。実施例４ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第２表に示した培地Ｂを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−12 0.46grを得た。第２表培地Ｂマルトース 0.1％肉エキス 0.5％ポリペプトン 1.0％酵母エキス 0.25％塩化ナトリウム 0.1％ PH＝7.2 実施例５ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第３表に示した培地Ｃを用いて実施例１と同様
に35℃で培養した。この場合、ペニシリンＧは
1000単位／ml培養液となるように添加し、更に培
養を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と
同様に精製して抗腫瘍性成分SPF10−12 0.32gr
を得た。第３表培地Ｃマルトース 0.1％肉エキス 0.5％ポリペプトン 0.5％カザミノ酸 0.3％酵母エキス 0.5％酸性第一燐酸カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.5 実施例６ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第４表に示した培地Ｄを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−12 0.29grを得た。第４表培地Ｄマルトース 0.25％カザミノ酸 0.3％酵母エキス 1.0％酸性第一燐酸カリウム 0.1％硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.9 実施例７ストレプトコツカス・エスピーATCC21597を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF10−12 0.55grを得た。実施例８ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21546
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−12 0.61grを得た。実施例９ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21547
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−12 0.64grを得た。実施例 10 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21548
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10−12 0.48grを得た。実施例 11 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、セフアロスポリンＣは
600μｇ／ml培養液となるように添加し、更に培
養を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と
同様に精製して抗腫瘍性成分SPF10−12 0.64gr
を得た。実験例１実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF10−12の
インビトロにおける抗腫瘍活性試験は、本文中に
記載した抗腫瘍活性の測定方法により行い、その
結果を第５表に示す。第５表 SPF10−12の抗腫瘍活性の結果 SPF10−12（mg／ml） IR％ 0.5 87.9 0.25 56.1 0.125 32.6 実験例２実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF10−12の
インビボにおける抗腫瘍活性試験は、Crj；CD−
１（ICR系、雌性７週齢）マウスを使用して実施
した。腫瘍細胞としては、Sarcoma−180腹水癌
細胞を用いこれを生理食塩水に浮遊させ、マウス
の腹腔内に５×10⁵cells／マウス接種した。癌細胞接種24時間後から１日１回５日間連続し
てSPF10−12を腹腔内に投与してその生存数を観
察しその結果を第６表に示す。【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は抗腫瘍性成分SPF10−12の紫外線吸収
スペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収ス
ペクトルを示す。第３図は実施例１における活性
画分のDEAEセフアデツクスＡ−2365カラムの溶
出曲線を示す図で、第４図はこのＡ画分をトヨパ
ールHW50Fカラムに吸着させ、0.1M NaCl含有
燐酸緩衝液による溶出曲線を示す図で、第５図は
このＤ画分をトヨパールHW60Fカラムに吸着さ
せ、0.1M NaCl含有燐酸緩衝液による溶出曲線
を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性成分
SPF10−12。１元素元析Ｃ 41.3〜43.5％Ｈ 5.9〜6.7％Ｎ 14.2〜16.6％Ｏ 37.9〜31.4％ Ash 0.7〜1.8％２分解点本物質は165℃で褐変し240℃になる
と黒色となり分解する。３比旋光度〔α〕²⁰ _D＝−80゜〜−95゜（Ｃ＝1.00）４紫外線吸収スペクトル本物質0.1％の水溶
液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示され
る。５赤外線吸収スペクトル第２図に示される。
3300cm^-1付近および1650cm^-1付近のペプチドに
よる吸収が認められ特徴的である。６塩基性、酸性、中性の区別本物質0.1％の
水溶液のPHは5.5〜6.0である。７物質の色淡褐色８呈色反応ローリー反応＋ビユーレツト反応＋ニンヒドリン反応＋アンスロン硫酸反応＋モーリツシユ反応＋システイン硫酸反応＋オルシン塩酸反応 − ９分子量ゲル濾過法による測定では分子量約
10000〜40000である。 10 溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メ
タノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ア
セトン、エチルエーテル、ｎ−ヘキサン、クロ
ロホルム、酢酸エチル等の溶剤には、難溶又は
不溶である。２ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF10−12生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
成分SPF10−12を採取することを特徴とする抗腫
瘍性成分SPF10−12の製法。３ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF10−12生産菌を培養するに際し、培養中の適
当な時期にペニシリン又はその関連物質を添加し
て培養することを特徴とする特許請求の範囲第２
項に記載の抗腫瘍性成分SPF10−12の製法。４ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF10−12生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍性
成分SPF10−12を採取するに当たり、培養細胞
L1210の生育を阻害し、又は／及びアンスロン硫
酸法による呈色反応陽性の画分を分取することを
特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍
性成分SPF10−12の製法。