JPH0156076B2 - - Google Patents
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- JPH0156076B2 JPH0156076B2 JP60170575A JP17057585A JPH0156076B2 JP H0156076 B2 JPH0156076 B2 JP H0156076B2 JP 60170575 A JP60170575 A JP 60170575A JP 17057585 A JP17057585 A JP 17057585A JP H0156076 B2 JPH0156076 B2 JP H0156076B2
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- culture
- reaction
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な抗腫瘍性成分SPF10CAP2及
びその製法に関するものである。 従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）
の生菌体を弱毒化して製剤化したものは、すでに
制癌剤として使用されている。 また、溶連菌の菌体を破砕後水または塩類溶液
で有効成分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍
性成分を沈澱として、回収する方法（特公昭38―
1647）、溶連菌を溶菌酵素リゾチーム、セルラー
ゼまたは蛋白質分解酵素により、溶菌し、活性画
分を水溶性区分として分画する方法（英国特許
1163865号）、溶連菌の菌体を破砕後水不溶性物質
を採取し、核酸分解酵素および蛋白分解酵素で処
理する方法（特開昭55―7014）などが知られてい
る。 このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水溶性もしくは水不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。 このような処理では、精製は複雑となり、有効
成分の単離はきわめて困難であつた。実際に分離
し、有効成分として測定された例では分子量
200000の蛋白質（特公昭48―43841、特開昭51―
44617）及び分子量150000の糖蛋白質（特開昭58
―22026）が知られている程度である。 本発明者らは、先に溶連菌の培養液中に抗腫瘍
性成分を溶出させる方法を鋭意研究したところ、
培養中にペニシリン又はその関連物質を添加する
ことによつて抗腫瘍性成分が培養液中に溶出する
ことを見出し（特開昭60―30677号）、培養液中か
ら生理活性物質SPF―１を分離するに至つたので
ある。（特開昭60―30689号）。 本発明者は、更に、溶連菌の培養濾液中からよ
り有効な成分を分離する目的で研究したところ、
本発明において、癌化白血球培養細胞L1210（以
下培養細胞L1210という）の生育を阻害し、か
つ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性の画分
であることにより特徴づけられる抗腫瘍性成分
SPF10CAP2を分離するに至つた。 本発明の抗腫瘍性成分SPF10CAP2は元素分
析、呈色反応等から糖を含むペプチド様物質と考
えられるが、紫外線吸収スペクトルから、既知の
抗腫瘍性物質とは、相違する新規な物質と認めら
れるものである。 本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性成分SPF10CAP2生産菌を培養し、培養物か
ら抗腫瘍性成分SPF10CAP2を採取することを特
徴とする抗腫瘍性成分SPF10CAP2の製造法を包
含するものである。 本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性成分SPF10CAP2生産菌が広く使用
できる。次に抗腫瘍性成分SPF10CAP2生産菌を
記載する。 ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC21060 （Streptococcus pyogenes） ストレプトコツカス・エスピー ATCC21597 （Streptococcus sp.） ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC21546 （Streptococcus pyogenes） ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC21547 （Streptococcus pyogenes） ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC21548 （Streptococcus pyogenes） 培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌の生育に適した培地であれば
任意の培地を使用できる。 培養は、PH5.0〜8.0、好ましくは、6.1〜7.2で
あり、培養温度は、30〜40℃、好ましくは、35〜
37℃であり、嫌気的に静置培養または、撹拌培養
を行なうことができる。 本発明においては、培養中に適当な時期に、ペ
ニシリンまたは、その関連物質を添加すること
が、抗腫瘍性成分SPF10CAP2の採取に重要な役
割をはたすことになる。 ペニシリンまたは、その関連物質の添加時間
は、35〜37℃の培養で、対数増殖期にかかつて
後、３〜20時間の間、特に５〜10時間が好まし
い。その後１〜20時間、好ましくは３〜15時間培
養を継続することにより、培養中に抗腫瘍性成分
SPF10CAP2を多量蓄積させることができる。 ペニシリンまたはその関連物質としては、すで
に知られたペニシリンと類似の作用をもつ関連物
質であればいかなるものでもよいが、ペニシリン
Ｇが普通用いられる。添加量は、ペニシリンＧで
100〜7000単位／ml、好ましくは、300〜5000単
位／ml培養液程度で十分である。 ストレプトコツカス属細菌のペニシリンまた
は、その関連物質の添加培養によつて得られた培
養液は遠心分離によつて菌体を除去し、濾液に硫
安を添加し、50〜90％飽和度の画分を分取する。 得られた抗腫瘍性成分SPF10CAP2を含む硫安
塩析物は凍結状態で保存することもできる。 この硫安塩析物から抗腫瘍性組成物
SPF10CAP2を抽出するには、塩析物を緩衝液に
溶解し、この水溶液をDEAEセルロースカラムに
吸着させ、燐酸緩衝液を用いて段階的に溶出さ
せ、培養細胞L1210の生育を阻害する活性画分を
分取し、この活性画分をDEAEセフアデツクスＡ
―25カラムに吸着させ、燐酸緩衝液中の塩化ナト
リウム濃度を直線的に上昇させつつ溶出し、その
非吸着部分及び塩化ナトリウム低濃度部分を分取
し、この分画部分を緩衝液に対して透析し、ゲル
濾過材トヨパールHW―50Fカラムに吸着させ、
0.1M NaClを含む燐酸緩衝液で溶出させ、アン
スロン硫酸法による呈色反応陽性部分を分取し、
次いでこの分画部分を燐酸緩衝液に対して透析脱
塩後、ハンドロキシアパタイトカラムに吸着さ
せ、１×10-2Mリン酸緩衝液でSPF10CAP1を溶
出させ、その後１×10-1Mリン酸緩衝液で溶出
し、これを凍結乾燥することによつて得ることが
できる。 次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分
SPF10CAP2の凍結乾燥標品は、次の理化学的性
質を示す。 １ 元素分析 Ｃ 40.0〜44.5％ Ｈ 5.8〜6.5％ Ｎ 12.9〜15.4％ Ｏ 31.1〜40.0％ Ash 1.3〜2.5 ２ 分解点 本物質は165℃で褐変し240℃になる
と黒色となり分解する。 ３ 比旋光度〔α〕20 D＝−72゜〜−88゜ （Ｃ＝1.00） ４ 紫外線吸収スペクトル 本物質0.1％の水溶
液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示され
る。 275mmに吸収極大が認められ、260mmまで同一
吸収値を示す。 ５ 赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 3300cm-1、3070cm-1、2970cm-1、1640cm-1、 1540cm-1、1440cm-1、1390cm-1、1120cm-1、 684cm-1 に吸収が認められる。 ６ 塩基性、酸性、中性の区別 本物質1.0％の
水溶液のPHは6.5である。 ７ 物質の色 淡褐色 ８ 呈色反応 ローリー反応 ＋ ビユーレツト反応 ＋ ニンヒドリン反応 ＋ アンスロン硫酸反応 ＋ モーリツシユ反応 ＋ システイン硫酸反応 ＋ オルシン塩酸反応 − ９ 分子量 ゲル濾過法による測定では分子量約
２×104〜５×105である。 10 溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタ
ノール、エタノール、ｎ―プロパノール、アセ
トン、エチルエーテル、ｎ―ヘキサン、クロロ
ホルム、酢酸エチル等の溶剤には、難溶又は不
溶である。 11 イオン交換体に対する挙動 ハンドロキシアパタイトに吸着され、１×
10-1Mリン酸緩衝液により溶出される。 次にインビトロにおける培養細胞L1210に対す
る抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法
による呈色反応の方法を示す。 抗腫瘍活性の測定方法 抗腫瘍活性の測定は、培養細胞L1210の生育阻
止率（IR％）の測定により行つた。 L1210細胞を10％FBS添加RPMI1640培地（５
mg／カナマイシン含有）に懸濁した。この培養
液0.5mlをフアルコン2058チユーブに注加し、細
胞数が１×105cells／tubeになるようにした。次
いでこの培養液に所定量の標品（抗腫瘍性組成物
SPF10CAP2）を目的濃度になるように培養液に
溶解した0.5mlを注加して、37℃で５％CO2存在
下に培養した。標品を添加して48時間後にトリパ
ンブルーによる染色をおこない、次式によりIR
（％）を算出した。 IR（％）＝(A)−各実験群の生細胞数／対照群の生細
胞数×100 ここで(A)とは対照群の生細胞数を示す。 対照は標品を含まない培養液0.5mlを用い同時
に行つた。 アンスロン硫酸法による呈色反応 脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１mlに
２mlのアンスロン試薬（0.20grのアンスロンを
100mlの濃硫酸に溶解したもの）を注加し、混混
合30分後、標品１mlに代えて脱イオン水１mlに２
mlのアンスロン試薬を注加した液を対照として
620nmで吸収を測定する。定量値はグルコースを
用いて同様に測定して得た検量式より求める。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ ストレプトコツカス・ピオゲネス （Streptococcus pyogenes）ATCC21060を
BHI培地100mlに接種して37℃、８時間静置培養
をおこなつて得た種培養液を第１表に示す培地
A1lに接種し、種培養と同一条件で嫌気的に前培
養を行つた。 第 １ 表 培地Ａ マルトース 0.25％ 肉エキス 1.0％ ポリペプトン 1.0％ 酵母エキス 0.25％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.8 10ジヤーフアーメンターに培地A8を投入
して120℃、10分間加熱殺菌後、37℃まで冷却し
て、前培養液１を接種し、37℃、15.5時間、PH
6.8、300回転／分で撹拌しながら嫌気的に培養す
る。次いでペニシリンG1000単位／ml培養液にな
るように添加して、培養を更に５時間継続した。
得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去し
た。 培養濾液には硫酸アンモニウムを添加し、50〜
90％飽和度で沈澱する画分を分取した。この硫安
塩析標品を１×10-2M、PH７・０の燐酸緩衝液
（KH2PO4―Na2HPO4）300mlに溶解し、この水
溶液をDEAEセルロースカラム（５×70cm）に吸
着させた後、0.3M塩化ナトリウムを含む上記燐
酸緩衝液を用いて、段階的に溶出させ、アンスロ
ン硫酸法による呈色反応陽性でかつ培養細胞
L1210の生育を阻害する活性画分を分取した。 この活性画分をDEAEセフアデツクスＡ―25カ
ラム（2.6×70cm）に吸着させ、次いで上記燐酸
緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇さ
せて溶出を行い、培養細胞L1210に対して活性の
ある部分を分取する。この溶出曲線は第３図に示
される。第３図において点線部分は非吸着部分
で、実線部分は塩化ナトリウム添加部分である。
Ａは培養細胞L1210生育阻害活性画分で、MP―
２（特開昭60―30689）生育阻害非活性画分であ
り、Ｂは培養細胞L1210生育阻害非活性画分で、
MP―２生育阻害活性画分である。 Ａは活性画分の溶出液を硫酸アンモニウムを90
％飽和度まで添加し沈澱画分とし、上記燐酸緩衝
液に溶解し透析膜を用いて脱塩後凍結乾燥する。
この凍結乾燥標品を燐酸緩衝液に溶解しトヨパー
ルHW50Fカラム（2.6×100cm）に吸着させ、次
いで、上記燐酸緩衝液中に塩化ナトリウム0.1M
を含む溶液で溶出させ、アンスロン硫酸法による
呈色反応陽性の画分を分取した。この溶出曲線は
第４図に示される。第４図において実線は全体の
溶出曲線を示し、点線はアンスロン硫酸法による
呈色反応陽性部分の溶出曲線を示している。ここ
ではＣをアンスロン硫酸法による呈色反応陽性画
分とした。 Ｃの画分は燐酸緩衝液に対して透析脱塩後ハイ
ドロキシアパタイトカラム（2.64×45cm）に吸着
させ、最初１×10-2M燐酸緩衝液で溶出し、次い
で１×10-1M燐酸緩衝液で溶出した。この溶出曲
線は第５図に示される。第５図において実線は全
体の溶出曲線を示し、点線はアンスロン硫酸法に
よる呈色反応陽性部分の溶出曲線を示している。
ここでＤの画分をSPF10CAP1とし、Ｅの画分を
SPF10CAP2とした。 Ｅの画分を凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は
抗腫瘍性成分SPF10CAP2であり、0.89grを得た。 実施例 ２ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは300単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を10
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.5grを得た。 実施例 ３ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは3000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を３
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.75grを得
た。 実施例 ４ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第２表に示す培地Ｂを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.63grを得た。 第 ２ 表 培地Ｂ マルトース 0.1％ 肉エキス 0.5％ ポリペプトン 1.0％ 酵母エキス 0.25％ 塩化ナトリウム 0.1％ PH＝7.2 実施例 ５ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第３表に示す培地Ｃを用いて実施例１と同様に
35℃で培養した。この場合、ペニシリンＧは1000
単位／ml培養液となるように添加し、更に培養を
５時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様
に精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.57grを得
た。 第 ３ 表 培地Ｃ マルトース 0.1％ 肉エキス 0.5％ ポリペプトン 0.5％ カザミノ酸 0.3％ 酵母エキス 0.5％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.5 実施例 ６ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第４表に示す培地Ｄを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.36grを得た。 第 ４ 表 培地Ｄ マルトース 0.25％ カザミノ酸 0.3％ 酵母エキス 1.0％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.9 実施例 ７ ストレプトコツカス・エスピーATCC21597を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.45grを得た。 実施例 ８ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21546
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.59grを得
た。 実施例 ９ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21547
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.61grを得
た。 実施例 10 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21548
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.30grを得
た。 実施例 11 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、セフアロスポリンＣは
600μg／ml培養液となるように添加し、更に培養
を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と同
様に精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.8grを
得た。 実験例 １ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF10CAP2
のインビトロにおける抗腫瘍活性試験は、本文中
に記載した抗腫瘍活性の測定方法により行い、そ
の結果を表―５に示す。 表５ SPF10CAP2の抗腫瘍活性の結果 SPF10CAP2（mg／ml） IR％ 0.5 100.0 0.25 98.3 0.125 91.0 実験例 ２ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF10CAP2
のインビボにおける抗腫瘍活性試験はCRJ―CD
―１（ICR系、雌性７週齢）マウスを使用して実
施し腫瘍細胞としてはSarcoma―180腹水癌細胞
を用いこれを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹
腔内に５×105cells／マウス接種した。 癌細胞接種24時間後から１日１回５日間連続し
てSPF10CAP2を腹腔内に投与してその生存数を
観察しその結果を表―６に示す。 【表】
びその製法に関するものである。 従来、溶血性連鎖状球菌（以下溶連菌という）
の生菌体を弱毒化して製剤化したものは、すでに
制癌剤として使用されている。 また、溶連菌の菌体を破砕後水または塩類溶液
で有効成分を抽出し、有機溶媒を加えて、抗腫瘍
性成分を沈澱として、回収する方法（特公昭38―
1647）、溶連菌を溶菌酵素リゾチーム、セルラー
ゼまたは蛋白質分解酵素により、溶菌し、活性画
分を水溶性区分として分画する方法（英国特許
1163865号）、溶連菌の菌体を破砕後水不溶性物質
を採取し、核酸分解酵素および蛋白分解酵素で処
理する方法（特開昭55―7014）などが知られてい
る。 このように、ストレプトコツカス属細菌そのも
のもしくはその菌体成分に抗腫瘍活性があること
は広く知られているのであるが、従来知られたも
のは、菌体もしくは水溶性もしくは水不溶性高分
子細胞構成物質であるに過ぎなかつた。菌体もし
くは菌体内から有効成分を単離しようとすれば、
菌体を溶菌したり、機械的に破砕したりして全体
を分画しなければならなかつた。 このような処理では、精製は複雑となり、有効
成分の単離はきわめて困難であつた。実際に分離
し、有効成分として測定された例では分子量
200000の蛋白質（特公昭48―43841、特開昭51―
44617）及び分子量150000の糖蛋白質（特開昭58
―22026）が知られている程度である。 本発明者らは、先に溶連菌の培養液中に抗腫瘍
性成分を溶出させる方法を鋭意研究したところ、
培養中にペニシリン又はその関連物質を添加する
ことによつて抗腫瘍性成分が培養液中に溶出する
ことを見出し（特開昭60―30677号）、培養液中か
ら生理活性物質SPF―１を分離するに至つたので
ある。（特開昭60―30689号）。 本発明者は、更に、溶連菌の培養濾液中からよ
り有効な成分を分離する目的で研究したところ、
本発明において、癌化白血球培養細胞L1210（以
下培養細胞L1210という）の生育を阻害し、か
つ、アンスロン硫酸法による呈色反応陽性の画分
であることにより特徴づけられる抗腫瘍性成分
SPF10CAP2を分離するに至つた。 本発明の抗腫瘍性成分SPF10CAP2は元素分
析、呈色反応等から糖を含むペプチド様物質と考
えられるが、紫外線吸収スペクトルから、既知の
抗腫瘍性物質とは、相違する新規な物質と認めら
れるものである。 本発明は、ストレプトコツカス属に属する抗腫
瘍性成分SPF10CAP2生産菌を培養し、培養物か
ら抗腫瘍性成分SPF10CAP2を採取することを特
徴とする抗腫瘍性成分SPF10CAP2の製造法を包
含するものである。 本発明においては、ストレプトコツカス属に属
する抗腫瘍性成分SPF10CAP2生産菌が広く使用
できる。次に抗腫瘍性成分SPF10CAP2生産菌を
記載する。 ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC21060 （Streptococcus pyogenes） ストレプトコツカス・エスピー ATCC21597 （Streptococcus sp.） ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC21546 （Streptococcus pyogenes） ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC21547 （Streptococcus pyogenes） ストレプトコツカス・ピオゲネス ATCC21548 （Streptococcus pyogenes） 培養液は、肉エキス培地、酵母エキス培地、ブ
レイン・ハート・インフユージヨン培地（BHI
培地）等の天然培地がよく用いられるが、ストレ
プトコツカス属細菌の生育に適した培地であれば
任意の培地を使用できる。 培養は、PH5.0〜8.0、好ましくは、6.1〜7.2で
あり、培養温度は、30〜40℃、好ましくは、35〜
37℃であり、嫌気的に静置培養または、撹拌培養
を行なうことができる。 本発明においては、培養中に適当な時期に、ペ
ニシリンまたは、その関連物質を添加すること
が、抗腫瘍性成分SPF10CAP2の採取に重要な役
割をはたすことになる。 ペニシリンまたは、その関連物質の添加時間
は、35〜37℃の培養で、対数増殖期にかかつて
後、３〜20時間の間、特に５〜10時間が好まし
い。その後１〜20時間、好ましくは３〜15時間培
養を継続することにより、培養中に抗腫瘍性成分
SPF10CAP2を多量蓄積させることができる。 ペニシリンまたはその関連物質としては、すで
に知られたペニシリンと類似の作用をもつ関連物
質であればいかなるものでもよいが、ペニシリン
Ｇが普通用いられる。添加量は、ペニシリンＧで
100〜7000単位／ml、好ましくは、300〜5000単
位／ml培養液程度で十分である。 ストレプトコツカス属細菌のペニシリンまた
は、その関連物質の添加培養によつて得られた培
養液は遠心分離によつて菌体を除去し、濾液に硫
安を添加し、50〜90％飽和度の画分を分取する。 得られた抗腫瘍性成分SPF10CAP2を含む硫安
塩析物は凍結状態で保存することもできる。 この硫安塩析物から抗腫瘍性組成物
SPF10CAP2を抽出するには、塩析物を緩衝液に
溶解し、この水溶液をDEAEセルロースカラムに
吸着させ、燐酸緩衝液を用いて段階的に溶出さ
せ、培養細胞L1210の生育を阻害する活性画分を
分取し、この活性画分をDEAEセフアデツクスＡ
―25カラムに吸着させ、燐酸緩衝液中の塩化ナト
リウム濃度を直線的に上昇させつつ溶出し、その
非吸着部分及び塩化ナトリウム低濃度部分を分取
し、この分画部分を緩衝液に対して透析し、ゲル
濾過材トヨパールHW―50Fカラムに吸着させ、
0.1M NaClを含む燐酸緩衝液で溶出させ、アン
スロン硫酸法による呈色反応陽性部分を分取し、
次いでこの分画部分を燐酸緩衝液に対して透析脱
塩後、ハンドロキシアパタイトカラムに吸着さ
せ、１×10-2Mリン酸緩衝液でSPF10CAP1を溶
出させ、その後１×10-1Mリン酸緩衝液で溶出
し、これを凍結乾燥することによつて得ることが
できる。 次に、実施例１で得られた抗腫瘍性成分
SPF10CAP2の凍結乾燥標品は、次の理化学的性
質を示す。 １ 元素分析 Ｃ 40.0〜44.5％ Ｈ 5.8〜6.5％ Ｎ 12.9〜15.4％ Ｏ 31.1〜40.0％ Ash 1.3〜2.5 ２ 分解点 本物質は165℃で褐変し240℃になる
と黒色となり分解する。 ３ 比旋光度〔α〕20 D＝−72゜〜−88゜ （Ｃ＝1.00） ４ 紫外線吸収スペクトル 本物質0.1％の水溶
液の紫外線吸収スペクトルは第１図に示され
る。 275mmに吸収極大が認められ、260mmまで同一
吸収値を示す。 ５ 赤外線吸収スペクトル 第２図に示される。 3300cm-1、3070cm-1、2970cm-1、1640cm-1、 1540cm-1、1440cm-1、1390cm-1、1120cm-1、 684cm-1 に吸収が認められる。 ６ 塩基性、酸性、中性の区別 本物質1.0％の
水溶液のPHは6.5である。 ７ 物質の色 淡褐色 ８ 呈色反応 ローリー反応 ＋ ビユーレツト反応 ＋ ニンヒドリン反応 ＋ アンスロン硫酸反応 ＋ モーリツシユ反応 ＋ システイン硫酸反応 ＋ オルシン塩酸反応 − ９ 分子量 ゲル濾過法による測定では分子量約
２×104〜５×105である。 10 溶剤に対する溶解性水に可溶であるが、メタ
ノール、エタノール、ｎ―プロパノール、アセ
トン、エチルエーテル、ｎ―ヘキサン、クロロ
ホルム、酢酸エチル等の溶剤には、難溶又は不
溶である。 11 イオン交換体に対する挙動 ハンドロキシアパタイトに吸着され、１×
10-1Mリン酸緩衝液により溶出される。 次にインビトロにおける培養細胞L1210に対す
る抗腫瘍性活性の測定方法及びアンスロン硫酸法
による呈色反応の方法を示す。 抗腫瘍活性の測定方法 抗腫瘍活性の測定は、培養細胞L1210の生育阻
止率（IR％）の測定により行つた。 L1210細胞を10％FBS添加RPMI1640培地（５
mg／カナマイシン含有）に懸濁した。この培養
液0.5mlをフアルコン2058チユーブに注加し、細
胞数が１×105cells／tubeになるようにした。次
いでこの培養液に所定量の標品（抗腫瘍性組成物
SPF10CAP2）を目的濃度になるように培養液に
溶解した0.5mlを注加して、37℃で５％CO2存在
下に培養した。標品を添加して48時間後にトリパ
ンブルーによる染色をおこない、次式によりIR
（％）を算出した。 IR（％）＝(A)−各実験群の生細胞数／対照群の生細
胞数×100 ここで(A)とは対照群の生細胞数を示す。 対照は標品を含まない培養液0.5mlを用い同時
に行つた。 アンスロン硫酸法による呈色反応 脱イオン水に溶解し目的濃度にした標品１mlに
２mlのアンスロン試薬（0.20grのアンスロンを
100mlの濃硫酸に溶解したもの）を注加し、混混
合30分後、標品１mlに代えて脱イオン水１mlに２
mlのアンスロン試薬を注加した液を対照として
620nmで吸収を測定する。定量値はグルコースを
用いて同様に測定して得た検量式より求める。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ ストレプトコツカス・ピオゲネス （Streptococcus pyogenes）ATCC21060を
BHI培地100mlに接種して37℃、８時間静置培養
をおこなつて得た種培養液を第１表に示す培地
A1lに接種し、種培養と同一条件で嫌気的に前培
養を行つた。 第 １ 表 培地Ａ マルトース 0.25％ 肉エキス 1.0％ ポリペプトン 1.0％ 酵母エキス 0.25％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.8 10ジヤーフアーメンターに培地A8を投入
して120℃、10分間加熱殺菌後、37℃まで冷却し
て、前培養液１を接種し、37℃、15.5時間、PH
6.8、300回転／分で撹拌しながら嫌気的に培養す
る。次いでペニシリンG1000単位／ml培養液にな
るように添加して、培養を更に５時間継続した。
得られた培養液を遠心分離にかけて菌体を除去し
た。 培養濾液には硫酸アンモニウムを添加し、50〜
90％飽和度で沈澱する画分を分取した。この硫安
塩析標品を１×10-2M、PH７・０の燐酸緩衝液
（KH2PO4―Na2HPO4）300mlに溶解し、この水
溶液をDEAEセルロースカラム（５×70cm）に吸
着させた後、0.3M塩化ナトリウムを含む上記燐
酸緩衝液を用いて、段階的に溶出させ、アンスロ
ン硫酸法による呈色反応陽性でかつ培養細胞
L1210の生育を阻害する活性画分を分取した。 この活性画分をDEAEセフアデツクスＡ―25カ
ラム（2.6×70cm）に吸着させ、次いで上記燐酸
緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を直線的に上昇さ
せて溶出を行い、培養細胞L1210に対して活性の
ある部分を分取する。この溶出曲線は第３図に示
される。第３図において点線部分は非吸着部分
で、実線部分は塩化ナトリウム添加部分である。
Ａは培養細胞L1210生育阻害活性画分で、MP―
２（特開昭60―30689）生育阻害非活性画分であ
り、Ｂは培養細胞L1210生育阻害非活性画分で、
MP―２生育阻害活性画分である。 Ａは活性画分の溶出液を硫酸アンモニウムを90
％飽和度まで添加し沈澱画分とし、上記燐酸緩衝
液に溶解し透析膜を用いて脱塩後凍結乾燥する。
この凍結乾燥標品を燐酸緩衝液に溶解しトヨパー
ルHW50Fカラム（2.6×100cm）に吸着させ、次
いで、上記燐酸緩衝液中に塩化ナトリウム0.1M
を含む溶液で溶出させ、アンスロン硫酸法による
呈色反応陽性の画分を分取した。この溶出曲線は
第４図に示される。第４図において実線は全体の
溶出曲線を示し、点線はアンスロン硫酸法による
呈色反応陽性部分の溶出曲線を示している。ここ
ではＣをアンスロン硫酸法による呈色反応陽性画
分とした。 Ｃの画分は燐酸緩衝液に対して透析脱塩後ハイ
ドロキシアパタイトカラム（2.64×45cm）に吸着
させ、最初１×10-2M燐酸緩衝液で溶出し、次い
で１×10-1M燐酸緩衝液で溶出した。この溶出曲
線は第５図に示される。第５図において実線は全
体の溶出曲線を示し、点線はアンスロン硫酸法に
よる呈色反応陽性部分の溶出曲線を示している。
ここでＤの画分をSPF10CAP1とし、Ｅの画分を
SPF10CAP2とした。 Ｅの画分を凍結乾燥した。この凍結乾燥標品は
抗腫瘍性成分SPF10CAP2であり、0.89grを得た。 実施例 ２ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは300単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を10
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.5grを得た。 実施例 ３ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは3000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を３
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.75grを得
た。 実施例 ４ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第２表に示す培地Ｂを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.63grを得た。 第 ２ 表 培地Ｂ マルトース 0.1％ 肉エキス 0.5％ ポリペプトン 1.0％ 酵母エキス 0.25％ 塩化ナトリウム 0.1％ PH＝7.2 実施例 ５ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第３表に示す培地Ｃを用いて実施例１と同様に
35℃で培養した。この場合、ペニシリンＧは1000
単位／ml培養液となるように添加し、更に培養を
５時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様
に精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.57grを得
た。 第 ３ 表 培地Ｃ マルトース 0.1％ 肉エキス 0.5％ ポリペプトン 0.5％ カザミノ酸 0.3％ 酵母エキス 0.5％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.5 実施例 ６ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第４表に示す培地Ｄを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.36grを得た。 第 ４ 表 培地Ｄ マルトース 0.25％ カザミノ酸 0.3％ 酵母エキス 1.0％ 酸性第一燐酸カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム 0.05％ PH＝6.9 実施例 ７ ストレプトコツカス・エスピーATCC21597を
第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様に
培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単位／
ml培養液となるように添加し、更に培養を５時間
継続した。この培養濾液を実施例１と同様に精製
して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.45grを得た。 実施例 ８ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21546
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.59grを得
た。 実施例 ９ ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21547
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.61grを得
た。 実施例 10 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21548
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、ペニシリンＧは1000単
位／ml培養液となるように添加し、更に培養を５
時間継続した。この培養濾液を実施例１と同様に
精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.30grを得
た。 実施例 11 ストレプトコツカス・ピオゲネスATCC21060
を第１表に示した培地Ａを用いて実施例１と同様
に培養した。この場合、セフアロスポリンＣは
600μg／ml培養液となるように添加し、更に培養
を５時間継続した。この培養濾液を実施例１と同
様に精製して抗腫瘍性成分SPF10CAP2 0.8grを
得た。 実験例 １ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF10CAP2
のインビトロにおける抗腫瘍活性試験は、本文中
に記載した抗腫瘍活性の測定方法により行い、そ
の結果を表―５に示す。 表５ SPF10CAP2の抗腫瘍活性の結果 SPF10CAP2（mg／ml） IR％ 0.5 100.0 0.25 98.3 0.125 91.0 実験例 ２ 実施例１で得られた抗腫瘍性成分SPF10CAP2
のインビボにおける抗腫瘍活性試験はCRJ―CD
―１（ICR系、雌性７週齢）マウスを使用して実
施し腫瘍細胞としてはSarcoma―180腹水癌細胞
を用いこれを生理食塩水に浮遊させ、マウスの腹
腔内に５×105cells／マウス接種した。 癌細胞接種24時間後から１日１回５日間連続し
てSPF10CAP2を腹腔内に投与してその生存数を
観察しその結果を表―６に示す。 【表】
第１図は抗腫瘍性成分SPF10CAP1の紫外線吸
収スペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収
スペクトルを示す。第３図は実施例１における活
性画分のDEAEセフアデツクスＡ―25カラムの溶
出曲線を示す図で、第４図はこのＡ画分をトヨパ
ールHW50Fカラムに吸着させ、0.1M NaCl燐酸
緩衝液による溶出曲線を示す図で、第５図はこの
Ｃ画分をハロイドロキシアパタイトカラムに吸着
させて、１×10-2M燐酸緩衝液及び１×10-1M燐
酸緩衝液によつて溶出させた溶出曲線を示す。
収スペクトルを示し、第２図は同じく赤外線吸収
スペクトルを示す。第３図は実施例１における活
性画分のDEAEセフアデツクスＡ―25カラムの溶
出曲線を示す図で、第４図はこのＡ画分をトヨパ
ールHW50Fカラムに吸着させ、0.1M NaCl燐酸
緩衝液による溶出曲線を示す図で、第５図はこの
Ｃ画分をハロイドロキシアパタイトカラムに吸着
させて、１×10-2M燐酸緩衝液及び１×10-1M燐
酸緩衝液によつて溶出させた溶出曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する抗腫瘍性成分
SPF10CAP2。 １ 元素分析 Ｃ 40.0〜44.5％ Ｈ 5.8〜6.5％ Ｎ 12.9〜15.4％ Ｏ 31.1〜40.0％ Ash 1.3〜2.5％ ２ 分解点 本物質は165℃で褐変し、240℃になると黒色
となり分解する。 ３ 比旋光度 〔α〕20 D＝−72゜〜−88゜（Ｃ＝1.00） ４ 紫外線吸収スペクトル 本物質の0.1％の水溶液の紫外線吸収スペク
トルは、275nmに吸収極大が認められ、260nm
まで同一吸収値を示す。 ５ 赤外線吸収スペクトル 3300cm-1、3070cm-1、2970cm-1、 1640cm-1、1540cm-1、1440cm-1、 1390cm-1、1120cm-1、684cm-1、 に吸収が認められる。 ６ 塩基性、酸性、中性の区別 本物質の1.0％の水溶液のPHは6.5である。 ７ 物質の色 淡褐色 ８ 呈色反応 ローリー反応 ＋ ビユーレツト反応 ＋ ニンヒドリン反応 ＋ アンスロン硫酸反応 ＋ モーリツシユ反応 ＋ システイン硫酸反応 ＋ オルシン塩酸反応 − ９ 分子量 ゲル濾過法による測定では、分子量約２×
104〜５×105である。 10 溶剤に対する溶解性 水に可溶であるが、メタノール、エタノー
ル、ｎ―プロパノール、アセトン、エチルエー
テル、ｎ―ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチ
ル等の溶剤には難溶又は不溶である。 11 イオン交換体に対する挙動 ハンドロキシアパタイトに吸着され、１×
10-1Mリン酸緩衝液により溶出される。 ２ ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF10CAP2生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍
性成分SPF10CAP2を採取することを特徴とする
抗腫瘍性成分SPF10CAP2の製法。 ３ ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF10CAP2生産菌を培養するに際し、培養中の
適当な時期にペニシリン又はその関連物質を添加
して培養することを特徴とする特許請求の範囲第
２項に記載の抗腫瘍性成分SPF10CAP2の製法。 ４ ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF10CAP2生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍
性成分SPF10CAP2を採取するに当り、培養細胞
L1210の生育を阻害し、又は／及びアンスロン硫
酸法による呈色反応陽性の画分を分取することを
特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の抗腫瘍
性成分SPF10CAP2の製法。 ５ ストレプトコツカス属に属する抗腫瘍性成分
SPF10CAP2生産菌を培養し、培養物から抗腫瘍
性成分SPF10CAP2を採取するに当り、培養細胞
L1210の生育を阻害し、かつ、アンスロン硫酸法
による呈色反応陽性でハイドロキシアパタイトに
吸着され、１×10-1Mリン酸緩衝液により溶出さ
れる画分を分取することを特徴とする特許請求の
範囲第２項に記載の抗腫瘍性成分SPF10CAP2の
製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60170575A JPS6233121A (ja) | 1985-08-03 | 1985-08-03 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０ｃａｐ２及びその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60170575A JPS6233121A (ja) | 1985-08-03 | 1985-08-03 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０ｃａｐ２及びその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6233121A JPS6233121A (ja) | 1987-02-13 |
| JPH0156076B2 true JPH0156076B2 (ja) | 1989-11-28 |
Family
ID=15907377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60170575A Granted JPS6233121A (ja) | 1985-08-03 | 1985-08-03 | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０ｃａｐ２及びその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6233121A (ja) |
-
1985
- 1985-08-03 JP JP60170575A patent/JPS6233121A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6233121A (ja) | 1987-02-13 |
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