JPH0318879B2 - - Google Patents
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- JPH0318879B2 JPH0318879B2 JP57040366A JP4036682A JPH0318879B2 JP H0318879 B2 JPH0318879 B2 JP H0318879B2 JP 57040366 A JP57040366 A JP 57040366A JP 4036682 A JP4036682 A JP 4036682A JP H0318879 B2 JPH0318879 B2 JP H0318879B2
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- JP
- Japan
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- protoplasts
- medium
- cells
- fusion
- solution
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
- C12N15/03—Bacteria
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明はブレビバクテリウム属又はコリネバク
テリウム属細菌の効果的なプロトプラスト融合法
に関する。 従来、プロトプラスト融合法による有用微生物
の育種方法としては酵母の品種改良法が開発され
（特開昭54−163883）、アミノ酸発酵工業で重要な
微生物であるブレビバクテリウム属、及びコリネ
バクテリウム属の微生物についてもプロトプラス
ト融合方法が報告又は開発されている（Agr.
Biol.Chem.、43(5)、1007〜1013、1979、特開昭
56−109587）。しかしながら、従来のブレビバク
テリウム又はコリネバクテリウム属細菌のプロト
プラスト融合方法は融合頻度が５×10-6程度と低
く、今後プロトプラスト融合法により有用微生物
を効率良く育成するためには更に融合頻度の高い
プロトプラスト融合法の開発が急務となつて来て
いる。そこで本発明者等は高い頻度でプロトプラ
スト融合する方法を開発することを目的として
種々研究を重ねた結果、細菌のプロトプラストを
ポリエチレングリコールと10ｍＭ以上のカルシウ
ムイオンを含むPH8.0〜12.0の高張液中で融合せ
しめると融合頻度が飛躍的に向上することを発見
し本発明を完成するに至つた。 本発明は(1)ブレビバクテリウム属細菌のプロト
プラストとブレビバクテリウム属又はコリネバク
テリウム属細菌のプロトプラストを、又は(2)コリ
ネバクテリウム属細菌のプロトプラストとコリネ
バクテリウム属細菌のプロトプラストを、10ｍＭ
以上のカルシウムイオン及び細胞融合促進剤を含
むPH8.0〜12.0の高張液中で細胞融合せしめるこ
とを特徴とする細菌のプロトプラスト融合法であ
る。 本発明で使用するブレビバクテリウム属、又は
コリネバクテリウム属の細菌としては野性株、薬
剤耐性、栄養要求性等を有する変異株、アミノ酸
生産性の有無を問わずすべて使用することができ
る。 栄養細胞を得るために使用する培地は微生物が
充分生育できるものであれば良く、例えばCM培
地（酵母エキス1.0％、ペプトン1.0％、食塩0.5
％、グルコース0.5％）等の完全栄養培地が使用
される、この培地に、ブレビバクテリウム属、又
はコリネバクテリウム属の微生物を培養し、リゾ
チーム感受性の細胞を得るため、対数増殖期にペ
ニシリン等の細胞壁合成阻害剤を添加する、添加
量は微生物の生育を抑制しないか又は半抑制する
程度が望ましくプニシリンの場合には１〜20μ
ｇ／10ml程度が望ましい。添加後、更に30〜120
分程度培養を継続して数世代増殖せしめてリゾチ
ーム感受性の栄養細胞を得る。 培養液から細胞を分離し、これを高張液で洗滌
後、それぞれの高張量少培地に懸濁し、これにリ
ゾチームを0.1〜10mg／ml添加し、30〜40℃に保
持して細胞のプロトプラスト化を行う。プロトプ
ラスト化は時間と共に進行し、約３〜24時間で完
了する。 上記高張液としては公知のものを使用すれば良
く、例えば、0.25Mシユークロース、0.25Mコハ
ク酸２ナトリウム、20ｍＭリン酸１カリウム、
100ｍＭリン酸２カリウム及び５ｍＭのEDTAか
ら成るHP高張液が使用される。又高張培地とし
ては夫々の最少培地に0.41Mシユークロースと
0.01M硫酸マグネシウムを加えたものが使用され
る。 このようにして得られたプロトプラストは高張
寒天培地で培養するとコロニーを形成し、栄養細
胞に再生する。この寒天培地としては0.3〜0.8M
のコハク酸２ナトリウムを含む完全栄養培地ある
いは最少培地が用いられる。 上記の方法で得られたプロトプラストと細胞融
合せしめる対象のプロトプラストを約等量の割合
で混合し、これを充分遠心分離する。遠心分離し
たプラストプラスト混合物を100ｍＭ以上のカル
シウムイオンを含むPH8.0〜12.0のHP高張液に懸
濁し、これにポリエチレングリコール溶液を約10
倍量加え。30〜37℃に10〜90分間保持する。 ポリエチレングリコールとしては平均分子量
7000〜8000のポリエチレングリコール6000が使用
される。カルシユウムイオンの供給源は、溶解性
の良いカルシユウム塩であれば良く、通常塩化カ
ルシユウム用いる。 カルシユウムイオン濃度は、10ｍＭ以上必要で
あり10ｍＭ以下では融合頻度を充分高めることは
できない。 高張液のPHは8.0〜12.0に調整することが必要
であり、単に10ｍＭ以上のカルシウムイオンの存
在のみでは融合は促進されず、PH8.0〜12.0のア
ルカリ性でかつ10ｍＭ以上のカルシウムイオン及
びポリエチレングリコールの共存下で融合するこ
とによつてはじめて効果が発揮され、10-3〜10-5
の頻度で細胞融合せしめることができる。このよ
うにして融合されたプロトプラストの栄養細胞へ
の再生は公知の方法（Agr.Biol.Chem.、43(5)、
1005〜1013、1979）に従つて行えば良く、前記の
プロトプラストの再生と同様の方法によつて行わ
れる。組み換え株の選択は、薬剤耐性、栄養要求
性目的とする性質を有する融合株を常法に従つて
分離すれば良い。 以下、実施例にて詳細に説明する。 実施例 １ ペプトン1.0ｇ／dl、酵母エキス1.0ｇ／dl、塩
化ナトリウム0.5ｇ／dl及びシユークロース0.5
ｇ／dlを含むPH7.2の完全栄養培地（CM培地）10
mlを大型試験管に分注し加熱滅菌した。 この培地に、ブレビバクテリウム・ラクトフエ
ルメンタムAJ3445 FERM−P1944（Ｓ−（２−ア
ミノエチル）システイン耐性（AECr））を接種し
31.5℃で振盪培養を行つた。対数像殖中期（菌体
濃度108個／ml）にペニシリンＧを３単位／10ml
添加し、更に90分間培養を続けた。培養液から菌
体を回収し、PH7.0のHP液（高張希釈液）で洗浄
した。 菌体を遠心分離し、得られた菌体を5000μｇ／
mlリゾチーム0.41Mシユークローズおよび0.01M
硫酸マグネシウムを含む最少培地（第１表）に再
懸濁し、3.15℃に静置した。
テリウム属細菌の効果的なプロトプラスト融合法
に関する。 従来、プロトプラスト融合法による有用微生物
の育種方法としては酵母の品種改良法が開発され
（特開昭54−163883）、アミノ酸発酵工業で重要な
微生物であるブレビバクテリウム属、及びコリネ
バクテリウム属の微生物についてもプロトプラス
ト融合方法が報告又は開発されている（Agr.
Biol.Chem.、43(5)、1007〜1013、1979、特開昭
56−109587）。しかしながら、従来のブレビバク
テリウム又はコリネバクテリウム属細菌のプロト
プラスト融合方法は融合頻度が５×10-6程度と低
く、今後プロトプラスト融合法により有用微生物
を効率良く育成するためには更に融合頻度の高い
プロトプラスト融合法の開発が急務となつて来て
いる。そこで本発明者等は高い頻度でプロトプラ
スト融合する方法を開発することを目的として
種々研究を重ねた結果、細菌のプロトプラストを
ポリエチレングリコールと10ｍＭ以上のカルシウ
ムイオンを含むPH8.0〜12.0の高張液中で融合せ
しめると融合頻度が飛躍的に向上することを発見
し本発明を完成するに至つた。 本発明は(1)ブレビバクテリウム属細菌のプロト
プラストとブレビバクテリウム属又はコリネバク
テリウム属細菌のプロトプラストを、又は(2)コリ
ネバクテリウム属細菌のプロトプラストとコリネ
バクテリウム属細菌のプロトプラストを、10ｍＭ
以上のカルシウムイオン及び細胞融合促進剤を含
むPH8.0〜12.0の高張液中で細胞融合せしめるこ
とを特徴とする細菌のプロトプラスト融合法であ
る。 本発明で使用するブレビバクテリウム属、又は
コリネバクテリウム属の細菌としては野性株、薬
剤耐性、栄養要求性等を有する変異株、アミノ酸
生産性の有無を問わずすべて使用することができ
る。 栄養細胞を得るために使用する培地は微生物が
充分生育できるものであれば良く、例えばCM培
地（酵母エキス1.0％、ペプトン1.0％、食塩0.5
％、グルコース0.5％）等の完全栄養培地が使用
される、この培地に、ブレビバクテリウム属、又
はコリネバクテリウム属の微生物を培養し、リゾ
チーム感受性の細胞を得るため、対数増殖期にペ
ニシリン等の細胞壁合成阻害剤を添加する、添加
量は微生物の生育を抑制しないか又は半抑制する
程度が望ましくプニシリンの場合には１〜20μ
ｇ／10ml程度が望ましい。添加後、更に30〜120
分程度培養を継続して数世代増殖せしめてリゾチ
ーム感受性の栄養細胞を得る。 培養液から細胞を分離し、これを高張液で洗滌
後、それぞれの高張量少培地に懸濁し、これにリ
ゾチームを0.1〜10mg／ml添加し、30〜40℃に保
持して細胞のプロトプラスト化を行う。プロトプ
ラスト化は時間と共に進行し、約３〜24時間で完
了する。 上記高張液としては公知のものを使用すれば良
く、例えば、0.25Mシユークロース、0.25Mコハ
ク酸２ナトリウム、20ｍＭリン酸１カリウム、
100ｍＭリン酸２カリウム及び５ｍＭのEDTAか
ら成るHP高張液が使用される。又高張培地とし
ては夫々の最少培地に0.41Mシユークロースと
0.01M硫酸マグネシウムを加えたものが使用され
る。 このようにして得られたプロトプラストは高張
寒天培地で培養するとコロニーを形成し、栄養細
胞に再生する。この寒天培地としては0.3〜0.8M
のコハク酸２ナトリウムを含む完全栄養培地ある
いは最少培地が用いられる。 上記の方法で得られたプロトプラストと細胞融
合せしめる対象のプロトプラストを約等量の割合
で混合し、これを充分遠心分離する。遠心分離し
たプラストプラスト混合物を100ｍＭ以上のカル
シウムイオンを含むPH8.0〜12.0のHP高張液に懸
濁し、これにポリエチレングリコール溶液を約10
倍量加え。30〜37℃に10〜90分間保持する。 ポリエチレングリコールとしては平均分子量
7000〜8000のポリエチレングリコール6000が使用
される。カルシユウムイオンの供給源は、溶解性
の良いカルシユウム塩であれば良く、通常塩化カ
ルシユウム用いる。 カルシユウムイオン濃度は、10ｍＭ以上必要で
あり10ｍＭ以下では融合頻度を充分高めることは
できない。 高張液のPHは8.0〜12.0に調整することが必要
であり、単に10ｍＭ以上のカルシウムイオンの存
在のみでは融合は促進されず、PH8.0〜12.0のア
ルカリ性でかつ10ｍＭ以上のカルシウムイオン及
びポリエチレングリコールの共存下で融合するこ
とによつてはじめて効果が発揮され、10-3〜10-5
の頻度で細胞融合せしめることができる。このよ
うにして融合されたプロトプラストの栄養細胞へ
の再生は公知の方法（Agr.Biol.Chem.、43(5)、
1005〜1013、1979）に従つて行えば良く、前記の
プロトプラストの再生と同様の方法によつて行わ
れる。組み換え株の選択は、薬剤耐性、栄養要求
性目的とする性質を有する融合株を常法に従つて
分離すれば良い。 以下、実施例にて詳細に説明する。 実施例 １ ペプトン1.0ｇ／dl、酵母エキス1.0ｇ／dl、塩
化ナトリウム0.5ｇ／dl及びシユークロース0.5
ｇ／dlを含むPH7.2の完全栄養培地（CM培地）10
mlを大型試験管に分注し加熱滅菌した。 この培地に、ブレビバクテリウム・ラクトフエ
ルメンタムAJ3445 FERM−P1944（Ｓ−（２−ア
ミノエチル）システイン耐性（AECr））を接種し
31.5℃で振盪培養を行つた。対数像殖中期（菌体
濃度108個／ml）にペニシリンＧを３単位／10ml
添加し、更に90分間培養を続けた。培養液から菌
体を回収し、PH7.0のHP液（高張希釈液）で洗浄
した。 菌体を遠心分離し、得られた菌体を5000μｇ／
mlリゾチーム0.41Mシユークローズおよび0.01M
硫酸マグネシウムを含む最少培地（第１表）に再
懸濁し、3.15℃に静置した。
【表】
プロトプラストの形成を、光学顕微鏡で観察す
るとともに、この細胞をPH7.0HP液で遠心洗浄
後、２つに分け一つはPH7.0HP液で希釈して
0.5Mコハク酸２ナトリウムを含有した最少培地
へ接種し、さらに0.8ｇ／dl軟寒天を含む同培地
で重層した。もう一つは、リン酸緩衝液で希釈し
てCM培地に接種し、さらに0.8ｇ／dl軟寒天を含
む同培地で重層し31.5℃で培養した。プレート上
に出現するコロニーは、各々高張条件で生育する
コロニー（栄養細胞とプロトプラスト）、低張条
件で生育するコロニー（栄養細胞のみ）を示し、
その実験結果を第２表に示した。
るとともに、この細胞をPH7.0HP液で遠心洗浄
後、２つに分け一つはPH7.0HP液で希釈して
0.5Mコハク酸２ナトリウムを含有した最少培地
へ接種し、さらに0.8ｇ／dl軟寒天を含む同培地
で重層した。もう一つは、リン酸緩衝液で希釈し
てCM培地に接種し、さらに0.8ｇ／dl軟寒天を含
む同培地で重層し31.5℃で培養した。プレート上
に出現するコロニーは、各々高張条件で生育する
コロニー（栄養細胞とプロトプラスト）、低張条
件で生育するコロニー（栄養細胞のみ）を示し、
その実験結果を第２表に示した。
【表】
リゾチーム処理21時間で、ペニシリン処理細胞
はプロトプラスト化された。 全く同様の方法で、ブレビバクテリウム・フラ
バムAJ11784 FERM−6407（イソロイシン要求
性、α―アミノ―β―ヒドロキシ吉草酸耐性
（AHVr））を培養してプロトプラスト化した。 AJ3445及びAJ11784のプロトプラストを０〜
2.0Mの塩化カルシウムを含むPH6.0〜12.0のHP高
張液0.5mlに等量宛懸濁し、これに4.5mlの33％ポ
リエチレングリコール−6000の水溶液を加えて36
℃に30分間保持して、細胞融合せしめた。プロト
プラストの融合は時間と共に進行した。融合反応
液を遠心分離して融合プロトプラストを集め、こ
れをPH10.5の100ｍＭの塩化カルシユウムを含む
HP高張液に懸濁し、次いでＬ−イソロイシン30
mg／dl、α―AHV5000μｇ／ml、AEC5000μｇ／
ml及び0.5Mコハク酸２ナトリウムを含む第１表
の高張最少寒天プレート上に接種し、その土面を
同寒天培地で薄層状に覆い31.5℃にて10日間培養
を行つた。 プレート上に出現した組み換え株（Ｌ−イソロ
イシン要求性、AEC耐性及びα―AHV耐性株）
の出現頻度と融合PH又は添加カルシユムイオン
（塩化カルシユウム）濃度との関係を第３表及び
第４表に示す。
はプロトプラスト化された。 全く同様の方法で、ブレビバクテリウム・フラ
バムAJ11784 FERM−6407（イソロイシン要求
性、α―アミノ―β―ヒドロキシ吉草酸耐性
（AHVr））を培養してプロトプラスト化した。 AJ3445及びAJ11784のプロトプラストを０〜
2.0Mの塩化カルシウムを含むPH6.0〜12.0のHP高
張液0.5mlに等量宛懸濁し、これに4.5mlの33％ポ
リエチレングリコール−6000の水溶液を加えて36
℃に30分間保持して、細胞融合せしめた。プロト
プラストの融合は時間と共に進行した。融合反応
液を遠心分離して融合プロトプラストを集め、こ
れをPH10.5の100ｍＭの塩化カルシユウムを含む
HP高張液に懸濁し、次いでＬ−イソロイシン30
mg／dl、α―AHV5000μｇ／ml、AEC5000μｇ／
ml及び0.5Mコハク酸２ナトリウムを含む第１表
の高張最少寒天プレート上に接種し、その土面を
同寒天培地で薄層状に覆い31.5℃にて10日間培養
を行つた。 プレート上に出現した組み換え株（Ｌ−イソロ
イシン要求性、AEC耐性及びα―AHV耐性株）
の出現頻度と融合PH又は添加カルシユムイオン
（塩化カルシユウム）濃度との関係を第３表及び
第４表に示す。
【表】
第３表の結果は、100ｍＭの塩化カルシウムの
共存下で融合せしめた場合の出現頻度であり、
CM培地に生育したコロニー数に対する頻度で示
した。
共存下で融合せしめた場合の出現頻度であり、
CM培地に生育したコロニー数に対する頻度で示
した。
【表】
このような融合処理条件のもとで得られた組換
え株の出現頻度は各親株の復帰変異率より103倍
以上高かつた。このようにして得られた融合株
AJ11785 FERM−P6408および親株をＬ−イソ
ロイシンを要求株物質として生育度およびAHV
又はAECに対する耐性度を第５表に示した。第
５表に示すように、この菌株は両親株の表現型
（Ile要求性、AHV耐性、AEC 耐性）を有し、
その表現型は継代培養しても安定であつた。
え株の出現頻度は各親株の復帰変異率より103倍
以上高かつた。このようにして得られた融合株
AJ11785 FERM−P6408および親株をＬ−イソ
ロイシンを要求株物質として生育度およびAHV
又はAECに対する耐性度を第５表に示した。第
５表に示すように、この菌株は両親株の表現型
（Ile要求性、AHV耐性、AEC 耐性）を有し、
その表現型は継代培養しても安定であつた。
【表】
第５表に示す生育度は次のようにして測定し
た。 第１表の最少培地にＬ−イソロイシンを30mg／
dl添加した培地（実験区(1)で使用）、Ｌ―イソロ
イシン30mgにAHVを5.0mg／dl（実験区(2)で使
用）又はAECを5.0mg／ml（実験区(3)で使用）添
加した培地4.0mlを試験官に分注し、試験菌を一
定量宛接種し、31.5℃で24時間振盪培養し、562n
ｍに於る吸光度を測定し生育度を求めた。 第６表の組成の培地を20ml宛、500ml容振盪フ
ラスコに入れ110℃で10分間蒸気殺菌した。これ
にあらかじめCMスラントで生育せしめた第７表
に示す菌株を一白金耳づつ接種し31.5℃にて72時
間振盪培養した。
た。 第１表の最少培地にＬ−イソロイシンを30mg／
dl添加した培地（実験区(1)で使用）、Ｌ―イソロ
イシン30mgにAHVを5.0mg／dl（実験区(2)で使
用）又はAECを5.0mg／ml（実験区(3)で使用）添
加した培地4.0mlを試験官に分注し、試験菌を一
定量宛接種し、31.5℃で24時間振盪培養し、562n
ｍに於る吸光度を測定し生育度を求めた。 第６表の組成の培地を20ml宛、500ml容振盪フ
ラスコに入れ110℃で10分間蒸気殺菌した。これ
にあらかじめCMスラントで生育せしめた第７表
に示す菌株を一白金耳づつ接種し31.5℃にて72時
間振盪培養した。
【表】
培養中に生成されたＬ−スレオニン及びＬ−リ
ジンの量を常法に従つて定量した。その結果を第
７表に示す。
ジンの量を常法に従つて定量した。その結果を第
７表に示す。
【表】
AJ11785の培養液を集めて遠心分離し、菌体及
び固形物を除去した。得られた上清液500mlを強
カチオン交換樹脂（「Amderlite IR−120」〔Ｈ
型〕）のカラムに流した。３％アンモニア水で溶
出し、アミノ酸画分を集め、脱塩及び脱色を行
い、減圧濃縮した。アルコールを添加し、冷却下
に保存後、生成した結晶を集めて乾燥した結果、
濃度98％以上のＬ−スレオニン結晶5.4ｇが得ら
れた。 実施例 ２ コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
AJ3858 FERM−P2786（AEC及びAHV耐性）及
びコリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ3792 FERM−P2650（AEC耐性、β―ハイド
ロキシロイシン（βHL）耐性）を実施例１と同
様の方法で培養し、プロトプラスト化した。
AJ3858及びAJ3792のプロトプラストを塩化カル
シウム50ｍＭ及びPEG 6000 33％を含む、PH10.0
のHP高張液に等量づつ懸濁し36℃に30分間保持
してプロトプラスト融合を行つた。融合プロトプ
ラストを遠心分離して集め、これをβ―
HL1000μｇ／ml、AHV2000μｇ／mlAEC2000μ
ｇ／ml及びコハク酸２ナトリウム13.5ｇ／dlを含
むPH7.2の第１表の高張最少寒天プレートに接種
し、実施例１と同様の方法で培養した。プレート
上に出現したコロニーを組み換え株として分離
し、その内の１株AJ11795 FERM−Ｐ 6418株
について実施例１と同様の方法で薬剤耐性度を測
定した。 その結果を第８表に示す。
び固形物を除去した。得られた上清液500mlを強
カチオン交換樹脂（「Amderlite IR−120」〔Ｈ
型〕）のカラムに流した。３％アンモニア水で溶
出し、アミノ酸画分を集め、脱塩及び脱色を行
い、減圧濃縮した。アルコールを添加し、冷却下
に保存後、生成した結晶を集めて乾燥した結果、
濃度98％以上のＬ−スレオニン結晶5.4ｇが得ら
れた。 実施例 ２ コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
AJ3858 FERM−P2786（AEC及びAHV耐性）及
びコリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
AJ3792 FERM−P2650（AEC耐性、β―ハイド
ロキシロイシン（βHL）耐性）を実施例１と同
様の方法で培養し、プロトプラスト化した。
AJ3858及びAJ3792のプロトプラストを塩化カル
シウム50ｍＭ及びPEG 6000 33％を含む、PH10.0
のHP高張液に等量づつ懸濁し36℃に30分間保持
してプロトプラスト融合を行つた。融合プロトプ
ラストを遠心分離して集め、これをβ―
HL1000μｇ／ml、AHV2000μｇ／mlAEC2000μ
ｇ／ml及びコハク酸２ナトリウム13.5ｇ／dlを含
むPH7.2の第１表の高張最少寒天プレートに接種
し、実施例１と同様の方法で培養した。プレート
上に出現したコロニーを組み換え株として分離
し、その内の１株AJ11795 FERM−Ｐ 6418株
について実施例１と同様の方法で薬剤耐性度を測
定した。 その結果を第８表に示す。
【表】
尚、このような組み換え株（βHLr、AHVr、
AECr）の出現頻度は10-4〜10-5であつた。 実施例 ３ コリネバクテリウム・グルタミカム
AJ3420FERM−Ｐ 1709（AECr、11e-）及びブ
レビバクテリウム・フラバムATCC21269
（AHVr）を実施例１と同様の方法で培養した後、
プロトプラスト化を行つた。AJ3420及び
ATCC21269のプロトプラストを塩化カルシウム
200ｍＭ及びPEG−6000 33ｇ／dl含むPH10.5の
HP高張液に等量宛懸濁し35℃に30分間保持して
融合せしめた。 融合反応液を遠心分離して細胞を集め、これを
AEC3000μｇ／ml、AHV3000μｇ／ml、Ｌ−イソ
ロイシン40mg／dl及びコハク酸２ナトリウム13.5
ｇ／dlを含む第１表の最少寒天プレートに接種し
実施例１と同様の方法で培養した。プレート上に
出現したコロニーを組み換え株として分離した。
コロニーの出現頻度はCM完全培地に出現するコ
ロニー数に対して10-4であつた。 分離したコロニーの内から１株、
AJ11811FERM−P6406を選び実施例１と同様の
方法でＬ−イソロイシン要求性及び薬剤耐性度を
測定した。 その結果を第９表に示す。
AECr）の出現頻度は10-4〜10-5であつた。 実施例 ３ コリネバクテリウム・グルタミカム
AJ3420FERM−Ｐ 1709（AECr、11e-）及びブ
レビバクテリウム・フラバムATCC21269
（AHVr）を実施例１と同様の方法で培養した後、
プロトプラスト化を行つた。AJ3420及び
ATCC21269のプロトプラストを塩化カルシウム
200ｍＭ及びPEG−6000 33ｇ／dl含むPH10.5の
HP高張液に等量宛懸濁し35℃に30分間保持して
融合せしめた。 融合反応液を遠心分離して細胞を集め、これを
AEC3000μｇ／ml、AHV3000μｇ／ml、Ｌ−イソ
ロイシン40mg／dl及びコハク酸２ナトリウム13.5
ｇ／dlを含む第１表の最少寒天プレートに接種し
実施例１と同様の方法で培養した。プレート上に
出現したコロニーを組み換え株として分離した。
コロニーの出現頻度はCM完全培地に出現するコ
ロニー数に対して10-4であつた。 分離したコロニーの内から１株、
AJ11811FERM−P6406を選び実施例１と同様の
方法でＬ−イソロイシン要求性及び薬剤耐性度を
測定した。 その結果を第９表に示す。
Claims (1)
- １ ブレビバクテリウム属の細菌のプロトプラ
ストとブレビバクテリウム又はコリネバクテリウ
ム属の細菌のプロトプラストを、又はコリネバ
クテリウム属細菌のプロトプラストとコリネバク
テリウム属細菌のプロトプラストを、10ｍＭ以上
のカルシウムイオン及びポリエチレングリコール
を含むPH8.0〜12.0の高張液中で細胞融合せしめ
ることを特徴とする細菌のプロトプラスト融合
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57040366A JPS58158184A (ja) | 1982-03-15 | 1982-03-15 | 細菌のプロトプラスト融合法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57040366A JPS58158184A (ja) | 1982-03-15 | 1982-03-15 | 細菌のプロトプラスト融合法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58158184A JPS58158184A (ja) | 1983-09-20 |
| JPH0318879B2 true JPH0318879B2 (ja) | 1991-03-13 |
Family
ID=12578635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57040366A Granted JPS58158184A (ja) | 1982-03-15 | 1982-03-15 | 細菌のプロトプラスト融合法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58158184A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59113894A (ja) * | 1982-12-17 | 1984-06-30 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 |
| JPS6274293A (ja) * | 1985-09-28 | 1987-04-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
-
1982
- 1982-03-15 JP JP57040366A patent/JPS58158184A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58158184A (ja) | 1983-09-20 |
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