JPH03197837A

JPH03197837A - Ｘ線顕微鏡用の試料ホルダ

Info

Publication number: JPH03197837A
Application number: JP1336471A
Authority: JP
Inventors: Takashi Matsubara; 隆松原
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 1989-12-27
Filing date: 1989-12-27
Publication date: 1991-08-29
Anticipated expiration: 2014-05-17
Also published as: JP2890579B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、生体の高倍率観察に威力を発揮する軟Ｘ線の
透過観察に用いられて好適な液封型の試料カプセル、特
にその破裂防止技術に関する。

［従来の技術］医学や生物工学等における、生体の高倍率観察に対する
要求の高まりに対応して、波長２〜５ｎｍ程度の軟Ｘ線
を用いるＸ線顕微鏡力匂主目されており、このＸ線顕微
鏡を用いて生体観察を行うため７つ試料カプセルとして
は、特開昭６３−２６３５００号や同６３−２９８２０
０号に示されるものが知られている。

第４図は、軟Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡の一例の構造を簡
単に示し、また、第５図　（ａ）、（ｂ）は、種々の材
料における軟Ｘ線の波長と線吸収係数の関係を示す。

軟Ｘ線は、Ｘ線と呼ばれる波長１ｐｍ〜１０ｎｍの領域
の電磁波のうち、通常は、２００ｐｍ以上の波長を有す
るものとされ、波長４００〜８００ｒ＋ｍの可視光線よ
りも２桁以上も短い波長の電磁波である。また、この軟
Ｘ線は、透過する物質に良く吸収され、種々の物質内に
おける光路単位長さ当りの吸収率、すなわち線吸収係数
は、物質の密度に比例し、一般的には波長が長くなるほ
ど高くなるが、第５図　（ａ）、（ｂ）にも示されるよ
うに、各物質の分子構造に応じた波長の、低い線吸収係
数の領域をいくつか有する。

第４図において、コンデンサー光学系Ｃと試料ホルダＨ
と結像光学系■と撮像装置には、Ｘ線発生器Ｇの出力光
軸上に直列に配置され、Ｘ線発生器Ｇから撮像装置Ｋま
でのＸ線光学系の光路長は約２ｍである。また、この光
学系全体は、排気系Ｖを有する真空槽Ｒ内に納められて
いる。

さて、観察試料を装填した試料カプセルＢを試料ホルダ
Ｈにセットした後、排気系Ｖを作動して真空槽Ｒ内を真
空排気し、真空度を４．８ｘ　１０−”Ｐａ以下に維持
した状態で観察を行う。Ｘ線発生器Ｇから射出された軟
Ｘ線ビームは、コンデンサー光学系Ｃにより収束され、
試料ホルダＨにセットされた試料カプセルＢを透過する
。透過した軟Ｘ線は、結像光学系■により撮像装置に上
に結像して真空、ｌＲ外のモニタ装置Ｍに観察像を与え
る。

軟Ｘ線を用いたＸ線顕微鏡は、軟Ｘ線に対し１気圧下で
２　Ｘ　ｔｏ−３μｍ−１程度の吸収率を有する大気に
よる吸収を避けるために、光学系全体をその光路長に応
じた高い真空度に保つ必要があり、軟Ｘ線の収束に係る
レンズ素子に性能の良いものが得にくい等の欠点を有す
るが、可視光線より格段に短い波長のＸ線を用いるため
、従来の光学顕微鏡よりも高い解像度を期待できる。ま
た、生体の直接観察を透過材料越しに行うことが可能で
、組織培養液とともに生体を液封した試料カプセルを用
いれば、生体試料を損傷することなく長時間にわたるそ
の生理観察を実行できる。従って、電子ビームを試料表
面に対して直接照射する電子顕微鏡の場合のような、試
料の乾燥や金属蒸着等、観察物にダメージを与える前処
理を不要とすることができる。

また、第５図（ａ）の水に対する線吸収係数においてｖ
字状に示されている、水の窓と呼はれる水に対し同係数
が低い波長領域（２，３ｎｍ〜４．４ｎｍ）においては
、第５図（ａ）に示されるように、軟Ｘ線の水に対する
吸収率と、生体を構成する蛋白質等に対する吸収率との
差が大きい。従って、この波長領域の軟Ｘ線を使用すれ
は、例えば細胞内に浮遊する小器官等を観察する場合に
、その観察画像のコントラストが良いという利点もある
。

ところで、上述したように軟Ｘ線は、種々の物質により
簡単に吸収されてしまうから、軟Ｘ線光路中に挿入され
る、観察試料を気密封入した試料カプセルにおいては、
その試料層の厚さを薄く採るとともに、密閉を兼ねた観
察窓材の軟Ｘ線の吸収量を極力小さくする必要がある。

従って、この窓材には、軟Ｘ線に対する線吸収係数が低
くて膜強度も高い材料、例えば第５図　（ｂ）の窒化シ
リコン３１３Ｎ　４等を薄膜形成したものが一般的に採
用されている。

第３図は、従来の試料カプセルの構造を説明するための
もので、　（ａ）は、試料カプセルに用いられるスペー
サの構造を、また　（ｂ）は、試料カプセルの断面構造
をその試料容器とともに示す。本従来例は、Ｘ線透過窓
ＩＣ１２Ｃを形成した２枚のチップ１．２の間にリング
状のスペーサ３Ｒを挿入し、スペーサ３Ｒの内側の密閉
空間に試料液を保持するものである。

第３図　（ａ）、（ｂ）において、チップ１．２は、シ
リコン板１ａ、２ａ上に窒化シリコン薄膜１ｂ、２ｂを
形成した後に、Ｘ線透過窓ＩＣ１２Ｃに相当する部分の
シリコン層をエツチングにより除去したものである。こ
こで、中央の矢印のようにＸ線を透過させるための、薄
膜１ｂ、２ｂの張られたＸ線透過窓１ｃ、２ｃは２００
μｍ角の正方形であり、その膜厚は、０．０５〜０．１
μｍである。

また、チップ１．２の対向する薄膜面の間に挿入される
円環状のスペーサ３Ｒは、試料層の厚さを保持するもの
で、用途に応じて１〜１５μｍの範囲で適切な厚さのも
のが選択される。例えば、軟Ｘ線の波長を２．３ｎｍに
選択して、窒化シリコン薄膜１ｂ、２ｂ＠厚をそれぞれ
Ｏ，ｌｔｌｍ、また試料層（水）の厚さを１０μｍとす
れば、それぞれの軟Ｘ線透過率は３９％、２７，３％と
なり、全体では約１１％の透過率が確保される。

一方、スペーサ３Ｒは、表裏両面にシール面を有し、２
枚のチップ１．２と密着して円環の内側の試料空間をの
密封を行う機能を兼ね備える。また、試料容器４Ｒ，５
Ｒは、ねじ６により相互に固定されるとともに、０リン
グ８を介してその内部に納めたチップ１．２を対向方向
に押圧するためのもので、この押圧力によりスペーサ３
Ｒとチップ１．２の接触面に、試料カプセルを真空中で
保持するために必要な密着性が付与される。

［発明が解決しようとする課題］従来例の試料カプセルにおいては、チップ１上にスペー
サ３Ｒを載置して、その内側に液状の観察試料、例えば
培養液中に浮遊させた細胞を滴定した後、チップ２をか
ぶせ、試料容器４Ｒ１５Ｒに納めねじ６で固定して試料
準備を完了する。ところが、このときチップ１．２とス
ペーサ３Ｒとで密閉された試料空間中の培養液も圧縮状
態となり、内圧を高めてＸ線透過窓１ｃ、２ｃの窒化シ
リコン薄膜１ｂ、２ｂを破裂させる事故が発生した。ま
た、試料装填時に破裂しなくても、後に第４図のＸ線顕
微鏡にセットして真空排気を行った際に破裂する可能性
があるため、窒化シリコン薄膜ｉｂ、２ｂ強度の安全率
を高く採り、その厚さを必要以上に厚く形成しておく必
要があった。

本発明は、観察試料を装填する際にその内圧が高まらな
い、安全確実な試料カプセルを提供することを目的とす
る。

［課題を解決するための手段］本発明に係る試料カプセルは、対向させた２枚のＸ線透
過窓付平板と、両平板間の距離を保持するスペーサとか
らなるＸ線顕微鏡用試料カプセルにおいて、従来は試料の密閉を兼ねて、試料を完全包囲していたス
ペーサの一部に試料の逃げ口を開けたことを特徴とする
ものである。

［作用］本発明に係る試料カプセルにおいては、スペーサを挟ん
で対向した平板間の、スペーサの内側の空間に液状の試
料を保持した状態で、一方のＸ線透過窓から他方の窓へ
軟Ｘ線を透過させて観察を行う。

一方、スペーサには、その一部に試料の逃げ口が開いて
いるから、試料の内圧が高まるとここから試料があふれ
出して内圧の上昇を緩和する。従って１０例えば試料装
填時に、両平板を対向方向に押圧してスペーサが変形す
るような場合においても試料内圧の上昇量は小さく、観
察窓に対する負荷もあまり大きくならない。ここで、ス
ペーサ自体は試料の密閉機能を持たないから、試料カプ
セルを真空中に保持するためには、スペーサの外部に密
閉手段を設ける必要があるが、これは、スペーサの外側
の基板間に設けた環状のシール部材としても良いが、両
平板の対向しない面をシール面とする密閉容器等として
も良い。この密閉手段とスペーサの間に形成された空間
が、あふれ出た観察試料を受は止めるとともに、スペー
サ内の試料空間における圧力上昇を緩和する。

［本発明の実施例］本発明の実施例を図面を参照して説明する。ここで、第
３図　（ａ）、（ｂ）の従来例の場合と同様な構造と機
能を有する部材には同一の符号を付してその説明を省略
する。

第１図は、本発明の第１実施例に係る試料カプセルの構
造を説明するためのもので、　（ａ）は、試料カプセル
に用いられるスペーサの構造を、また（ｂ）は、試料カ
プセルの断面構造をその試料容器とともに示す。本実施
例は、試料の逃げ道３ａを形成したスペーサ３およびチ
ップ１．２（平板）で構成される試料空間の密閉を、試
料容器４．５に備えた３つのＯリングシール８で行うも
のである。

第１図（ａ）　において、チップ１上に載置されたスペ
ーサ３は、Ｘ線透過窓１ｃ、２ｃに相当する部分を含む
面積の長方形の試料空間と、試料の逃げ道である溝部３
ａとを備える。

また、第１図　（ｂ）において、チップ１．２を収納し
た試料容器４．５は、Ｘ線透過窓ＩＣ１２Ｃを露出させ
る窓と、この窓に沿フた０リング８によるチップ１．２
に対する環状のシール面と、試料容器４．５相互間のＯ
リング８によるシール面とを有する。この３つのシール
面で閉じられた空間が、スペーサ３内部の試料空間を含
む、外部に対する密閉空間である。

ところで、本実施例において、チップ１．２の製作は次
の手順で行った。

まず、シリコン板１ａ、２ａ上にＬＰ−ＣＶＤ法により
窒化シリコン薄膜を形成した。プロセス条件は、減圧さ
れた雰囲気ガス（ＮＨ３ガスおよび５ＩＨ２Ｃ１２ガス
）中で７００〜９００℃に温度維持したシリコン板１ａ
、２ａの表裏両面に窒化シリコン５１３Ｎ４層を気相成
長させ、内部応力が１０９〜１０　”ｄｙｎ／ｃｍ２に
制御された薄膜１ｂ、２ｂを形成した。このＬＰ−ＣＶ
Ｄ法は、量産性に優れ、膜中の内部欠陥が少なく、膜の
内部応力のコントロールも容易である。

次に、裏面の窒化シリコン薄膜にフォトリソグラフィ法
により、Ｘ線透過窓１Ｃ１２Ｃに相当する孔を形成し、
この孔から異方性エツチングによりシリコン層を、表面
の窒化シリコン薄膜１ｂ、２ｂに達するまで除去した。

ここで、エツチング７夜にはエチレンジアミンとビロカ
テユールと水の混合液を用い、第１図（ｂ）のようなテ
ーパ面を形成するために、シリコン板の膜付は面は、そ
のエツチング容易面と４５度の角度を成すように選択さ
れている。

以上により、窒化シリコン薄膜１ｂ、２ｂの張られたＸ
線透過窓ＩＣ１２Ｃを有するチップ１．２を得た。

さて、チップ１上にスペーサ３を載置してその内側に液
状の観察試料を滴定し、チップ２をかぶせた後に、これ
を試料容器４．５に納めてねじ６で締付けると、Ｏリン
グ８による各シール面に必要なシール機能が付与される
とともに、圧縮された試料空間からスペーサ３の溝部３
ａを通って余分な試料があふれ出して、試料空間の圧力
上昇が緩和される。

ところで、スペーサは、この実施例の形状および材料に
限定されないから、スペーサは、金属、プラスチックス
、ガラス等の箔を貼付けても良いし、メツキや蒸着によ
り所定厚さの膜を形成しても良い。また、シリコンをエ
ツチングして所定厚さの段差を形成した後、窒化シリコ
ン膜を付け、スペーサとしても良い。簡単には、感光性
レジストまたは感光性ガラスを用いて、所定厚さに塗布
後、第２図にも示されるような形状に露光、現像して得
ることかできる。なお形状は第２図に示したものは一例
であり、これに限られないが、逃げ口の幅としては、０
．１〜１．５ｍｍが適当である。

第２図　（ａ）〜　（ｅ）は、本発明の別の実施例に係
る試料カプセルに用いられるそれぞれのスペーサの構造
を示す。

第２図　（ａ）のスペーサ３Ａは、その内側に、チップ
１．２のＸ線透過窓ＩＣ１２Ｃよりも格段に大きな試料
空間面積を形成するが、Ｘ線透過窓ＩＣ１２Ｃに相当す
る部分に受は部３ｂが設けられているから、この試料カ
プセルを縦型に保持した際に、培養液中の細胞等が沈降
してＸ線透過窓１ｃ、２ｃから外れることが避けられる
。

また、第２図　（ｂ）のスペーサ３Ｂは、Ｘ線透過窓１
ｃ、２Ｃに相当する試料空間から上下左右４方向に溝部
３ａが形成されている。これらの溝部３ａは細いので、
圧力がかった場合以外には液体の流動が無い。

また、第２図　（Ｃ）のスペーサ３Ｃは、Ｘ線透過窓Ｉ
Ｃ５２Ｃに相当する試料空間の上部に十分な培養液を蓄
えられるように、空間を設けたものである。

また、第２図　（ｄ）のスペーサ３は、試料空間を大き
く取ったものである。

また、第２図　（ｅ）のスペーサ３は、細い溝部３ａで
試料空間とその上下に設けた空気室を接続したもので、
周囲がシール面を形成しているので従来例のフレーム４
．５を用いることができる。

また、この他にも、例えばスペーサ３を多孔性の材料で
形成して圧力上昇分の液体を吸収させたり、スペーサ３
の一部分をダイアフラム状に形成して圧力上昇分を外部
にふくらませる構造としたりする等の変形が可能であり
、スペーサ３はチップ１に固定されたものでも良い。

［発明の効果］本発明に係る試料カプセルでは、内圧が上昇すると、ス
ペーサに形成された試料の逃げ口から余分な液体試料が
あふれ出て、内圧の上Ａ−を緩和するから、観察窓に対
する負荷はあまり大きくならない。従って、観察窓の厚
さは必要最小限とすることが可能で、これを薄くすれば
、軟Ｘ線の透過率が増してより鮮明な画像を得ることも
可能である。また、従来のようなスペーサ内に装填する
試料の量の厳密な制御が不要となり、試料装填後の試料
カプセル取扱いも自由となる。さらに、頻繁に試料の詰
替えや再使用を行っても試料カプセルおよび各構成部材
の寿命も伸び、信頼性も向上するから、観察作業全体に
おける能率化、材料費の低減を容易に達成できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例に係る試料カプセルの構造を
示し、　（ａ）は、試料カプセルに用いられるスペーサ
の平面図、　（ｂ）は、試料カプセルをその試料容器と
ともに示した断面図である。第２図　（ａ）〜　（ｅ）は、本発明の別の実施例に係
る試料カプセルにそれぞれ用いられるスペーサの平面図
である。第３図は、従来例の試料カプセルの構造を示したもので
、　（ａ）は、試料カプセルに用いられるスペーサの平
面図、　（ｂ）は、試料カプセルをその試料容器ととも
に示した断面図である。第４図は、一般的な、軟Ｘ線を用いるＸ線顕微鏡の構成
を示す模式図である。第５図　（ａ）　　（ｂ）は、各種物質の軟Ｘ線に対す
る線吸収係数を示す線図である。［主要部分の符号の説明コ１．２・・・チップ　　　３・・・スペーサ４．５・・
・試料容器　　３ａ・・・溝部１ｃ、２　Ｃ−Ｘ線通Ａ
窓

Claims

【特許請求の範囲】対向させた２枚のＸ線透過窓付平板と、両平板間の距離
を保持するスペーサとからなるＸ線顕微鏡用試料カプセ
ルにおいて、前記スペーサの一部に試料の逃げ口を開けたことを特徴
とする試料カプセル。